Рентгеноструктурное исследование фосфорибозиламиноимидазолсукцинокарбоксамид синтазы (Saigar-синтазы) из дрожжей Saccharomyces cerevisiae при разрешении 1,9 А тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А.В.ШУБНИКОВА

РГО ол На правах рукописи

- 3 ОПТ 1935

, ЛЕВДИКОВ

Владимир Михайлович

УДК 548.737

РЕНТГЕГЮСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФОСФОРИБОЗИДАМШ!ОШ1ИДАЗОЛСУКЦИНОКАРБОКСАЛШД СИНТАЗЫ (ЗАГСАК-СИНТАЗЫ) ИЗ ДРОЖЖЕЙ ЕАССНАПОМУСЕБ СЕВЕМ81АЕ ПРИ РАЗРЕШЕНИИ 1.9 А.

Специальность 01.04.18 - Кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Инсттуте кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН

Научный руководитель: доктор физико-математических наук

В.Р. Мелик-Адамян

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

В.Ю. Лунин (НИВЦ РАН)

кандидат физико-математических наук Л.В. Малинина (ИМБ РАН)

. Ведущая организация: Институт биоорганической химии РАН.

I Г , ■у

Зашита диссертации состоится ^Fe^cfiJ) 1995 г. в на

заседании Специализированного совета Д.002.58.01 при Институте кристаллографии им. A.B. Щубшщова РАН по. адресу:. 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Института кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

Автореферат разослан "S3" СсияЫ^чЛ1996 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат физико-математических наук В.М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. SAICAR-синтаза из дрожжей Saccharomyces revisiae - фермент, катализирующий седьмую стадию синтеза пуриноновых тслеотидов. Бкосинтез пуриноновых нуклеотидов является жизненно важный кшессом в метаболизме живых клеток, в связи с чем хорошо изучен гохимически и генетически. Однако, до настоящего времени единственным из грментов биосинтеза, для хоторого методом рентгенострухтурного анализа была щучена трехмерная атомная модель, является аденилсукцинат синтетаза, нггролирующая одиннадцатую стадию синтеза в Е. coli.

SAICAR-синтазы выделены более чем из десяти различных источников, для большинства из них определена аминокислотная последовательность. ADE1 н, кодирующий SAICAR-синтазу в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, тонирован и экспрессирован, но структурно-функциональные исследования ермента, в частности, методом направленого мутагенеза, не проводились из-за гсутствия данных о его пространственной структуре.

Данное ренггеяоегрукгуряое исследоваЕше SAiCAR-синтазы юсобствует изучению механизма ферментативных реакций синтеза, проходящих образованием амидной связи, выявлению структурных мотивов, отвечающих за зязывание нуклеотидов в нукпеотвд-зависимых белках, а также исследованию AICAR-синтаз из других организмов с помощью метода молекулярного (мещения.

ЦЕЛЬ. ЕАЕШЫ заключалась в определении пространственной груктуры SAICAR-синтазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae методом ентгеноструктурного анализа с разрешением 1.9 А.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ состоит в следующем:

Впервые определена пространственная структура SAICAR-синтазы, проведен нализ вторичной и третичной структуры молекулы.

Проведено сравнение 11 первичных структур SAICAR-синтаз из различных сточников. Выделены 24 эволюционно консервативных аминокислотных остатка ! определено их расположение в молекуле фермента.

Проведено сравнение пространственной структуры SAICAR-синтазы с ¡звестными структурами других нуклеотид-зависимых белков.

. На основе анализа полученной пространственной структуры определено [аиболее вероятное расположение субстратов в молекуле SAICAR-синтазы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАРОТЫ заключается в том, что юлученные результаты являются основой для изучения механизма действия фермента путем исследования структур, его комплексов с субстратами и их анало-

хами. Необходимость детального понимания механизма действия фермент обуславливается потребностью в разработке терапевтических препарате] способных влиять на скорость деления живых клеток.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы сек< научных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, пяти гла выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Она изложена на. страницах, содержит рисунков и таблиц.

АПРОВАТ1ИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на Х\ Международном кристаллографическом конгрессе (Китай, 1993), \ Международной конференции по кристаллизации биологических макромолек) (Япония, 1995), XVII Международном кристаллографическом конгрессе (С1Ш 1993).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

RRFFfF.HHE. Во введении на основе анализа места SAICAR-синтазы метаболизме живой клетки обоснована актульность темы, приводится обзе литературных данных биохимического и гинетического исследования биосинте: пуршовых нуклеотидов, содержится постановка задачи и сформулирована uej работы.

ГЛАВА ! SAICAR-синтаза.

Эта глава посвящена обзору имеющихся в литературе данных о физик* химически* свойствах SAICAR-синтазы, экспрессированию ADE1 гена и очисп фермента, кристаллизации фермента и получению тяжелоатомных производных.

Исследуемая дрожжевая SAICAR-синтаза является мономерным белке с молекулярной массой 36 кДа. Первичная структура SAICAR-синтаз] определенная по нуклеотидной последовательности кодирующего ее ADE1 ген включает 306 аминокислотных остатков [I.].

Фермент участвует в биосинтезе пуриновых нуклеотидов, когорь

заключается в десятистадийном преобразовании фосфорибозил пирофосфата

инозин монофосфат. Встраивание одного из атомов азота в гиперцикл пуриново

ядра происходит на седьмом этапе синтеза, который контролируется SAICA]

синтазой. Реакция представляет собой синтез 5"-фосфорибозил 4-(1

сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазола (SAICARa) из 5Ч-фосфорибозил-

аминоимидазот карбоксилата (CAIRa) и аспарагиновой кислоты. Реакция вд 2+

вприсутствии ионов Mg и сопровождается гидролизом АТР до ADP неорганического фосфата. Схема реакции представлена на Рис. 1.

CQ-ИИ-СН

<31РОЯ1С / \ W

hV И/1

CAR W

кш I I

C^ (

M,

* COOB-CH -CH-COOH ♦ ATP

1 .1AICAR

ИН. iratHiH

HO OB HO OH

Рис. 1. Схема реакции, катализируемой SAICAR-синтазой дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Оптимальные условна реакции и субстратная специфичность фермента ьши установлении в работах [2.,3.]. Скорость ферментативного образования AICAR максимальна при рН 8.0 и концентрации хлорида магния 5 мМ. Однако, оны магния, необходимые для протекания реакции, ингибируют ферментативную ктивность при концентрациях, превышающих 30 мМ. У выделенной AICAR-синтазы определены величины констант Михазлиса для трех субстратов еакции: CAIR - 1.6 мкМ, АТР - 14 мкМ и аспарагиновой кислоты - 960 мкМ.

Препарат белка, содержащий SAICAR-сингазу ~70% чистоты, был юбезно предоставлен А. Н. .Мясниковым, работавшим в Биологическом !нституте при Санкт-Петербургском Университете. Там методами генной [нженерии был создан штамм, продуцирующий SAICAR-синтазу на уровне 0-50% от общего клеточного белка [4.3. • -

Окончательная очистка препарата для кристаллизации проводилась

5. В. Барыниным в Институте кристаллографии РАН.

- »

Крупные кристаллы SAICAR-синтазы, пригодные для рентгеновского ^следования, были выращены А. И. Гребенко в Институте кристаллографии 'АН. Кристаллы были выращены методом диффузии паров в висячей капле и (остигали размера 1.5 мм. Кристаллизация проводилась при комнатной емпературе. Кристаллы SAICAR-синтазы получены из растворов,, содержащих !-15 мг/мл белка, 1 М сульфата аммония, 0.04 М аспарагиновой кислоты и 1.05 М Tris-HCl буффера (рН 7.0). Осаждающий противорасгвор содержал 1.2-2.3 М сульфата аммония.

Кристаллы SAICAR-синтазы принадлежат к пространственной группе ¡имметрии P2i2\2\ и содержат одну молекулу в асимметричной части ячейки... *азмеры элементарной ячейки составляют 62.6, 63.7 и 81.2 А.

Тяжелоатомные производные также были получены А. И. Гребенко методом вымачивания кристаллов в1 растворах тяжелоатомных соединений на эснове урана и золота.,Использовались растворы соединений Cs3U02(CNS)5 и

KAü(CN)2 с концентрацией 2,5-5,0 мМ. Настаивание проводилось в течении 10-45 дней.

ГЛАВА 2 Экспериментальная часть.

Наборы интенсивностей рентгеновских дифракционных отражений от кристаллов нативного белка до разрешения 1.9 А и двух изоморфных тяжелоатомных производных до разрешения 2.5 А были получены на синхротронном излучении' с использованием "Imaging Plate" в качестве детектора. Измерения проводились в EMBL в Гамбурге. Первичная обработка данных была выполнена с помощью программы DENSO [5.]. Дополнительный набор дифракционных данных от тяжелоатомной производной на основе KAu(CN)2 был собран на многоканальном дифрактометре KARD-4 в Институте кристаллографии до разрешения 2.5 А. Статистические характеристики экспериментальных данных представлены в Таблице 1.

Таблица 1.

Статистические характеристики собранных наборов дифракционных данных.

Кристалл Дифрак- Длина Разрешение R(I)merge Полнота

тометр волны (А) (А) (%) набора (%)

Нативный СИ 1.01 10.-1.91 5.0 96.9

CS3U02(CNS)5 СИ 1.01 10.-2.46 4.9 98.9

KAU(CN)2 СИ . 1.01 10.-2.55 5.9 65.6

KAu(CN)2 КАРД-4 • Г.54 • -10.-2.49- ' 5.-3 ■ 91.6

Здесь К(1)тег£е = 22 ¡1ц,; - <1>ь! ! 2<1>к, <1>ь = Дь; / Иь, Ь = (11,к,1) - " индексы Мкиигера, 1 = N1, - число измеренных эквивалентов, -измеренная интенсивность, СИ - синхротронное излучение.

Начальные фазы структурных факторов до разрешения 2.5 А был! определены методом полиизоморфных замещений. Координаты основных мес присоединения тяжелых атомов для каждой производной определялис: независимо по харкеровским сечениям разностной функции Патерсона Параметры мест присоединения тяжелых атомов уточнялись совместно с учето» аномальной дисперсии. Для расчетов бьиа использована программа МЬРНАИ [6.] из комплекса кристаллографических программ ССР4 [7.]. Полученные фаз! структурных факторов использовались для вычисления разностных карт Фурье : определения более слабых мест присоединения тяжелых атомов. Параметр! новых мест присоединения уточнялись в следующих циклах уточнето Результата уточнения параметров тяжелых атомов приведены в Таблице ' Средний показатель достоверности изоморфных фаз равен 0.59 в облает разрешения от 10 до 2,5 А. Среднее отклонение изоморфных фаз (Дер) по оггно-

нию к фазам, рассчитанным от финальной модели, равно 42° (при разрешении А). Коэффициент корреляции карты электронной плотности, рассчитанной с гользованием изоморфных фаз по отношению к финальной карте, составил %. Расчет кс?ффиинента корреляции между двумя картами электронной зтности проводился по формуле:

Согге1аиоп=(1//у)5;[(ри-<р1»(/%-(рг»]/(о1-сз1),

! <р0 и (рг) - среднее значение электронной плотности сравниваемых карт, о\ п - средне-квадратичное значение плотностей и N - число узлов сетки.

Таблица 2.

1раметры мест присоединения тяжелых атомов и характеристики уточнения фаз

эединение х/а y/b z/c W В Re Rs fb/E (a) (b)

s3U02(CNS)5 0.519 0.520 0.099 0.627 0.138 0.086 0.373 0.128 0.043 0.113 0.050 0.029 4.127 3.005 3.282 2.602 26.49 25.03 20.72 23.19 .160 .082 1.1 0.8

Au(CN)2 0.102 0.471 0.111 7.467 17.51 .130 .066 2.0 1.3

Au(CN)2 0.102 0.212 0.471 0.316 0.112 0.101 8.880 2.257 17.31 31.39 .163 082 1.7 1.1

Здесь х/а, y/b, zJc -.координаты мест присоединения- тяжелых атомов в.долях иейки; W - заселенность места в относительной шкале; В - температурный фактор. Re =21 lFpol-|Fph0||/2lFpol I, R» =21 iFphol-lFphcl l/2l lFhol-lFp0I I, да Fp0 и Fph0 - наблюдаемые структурные факторы для нативного кристалла и тяжелоатомных производных соответственно; Fphc - расчетный структурный фактор для кристаллов тяжелоатомных производных; fh/E - мощность фаз (а) нецентросимметричных, (Ь) центросимметричных рефлексов;, fh среднеквадратичный вклад тяжелого атома; Е - среднеквадратичное значение незамкнутое™ фазового треугольника.

Дм улучшения фаз была применена процедур9 Вонга, основанная на ¡пользовании информации о постоянстве электронной плотности в области ементарной ячейки, занятой растворителем, и процедура приведения гистограмм :ектронной плотности - "Histogram matching", основанная на использовании 'атлетических характеристик синтезов Фурье электронной плотности. Для этого ала использована программа SQUASH [8.] из пакета кристаллографических юграмм ССР4. Средний показатель достоверности модифицированных фаз шен 0.71 в области разрешения от 10 до 2.5 А. Среднее отклонение инфицированных фаз <Дф) по отношению к фазам, рассчитанным от финаль-

ной модели, равно 37° (при разрешении 2,5 А). Коэффициент корреляции карты электронной плотности, рассчитанной с использованием модифицированных фаз, по отношению к финальной карте составил 69 %.,

Дальнейшее улучшение фаз и расширение области структурных амплитуд от 2.5 до 1.9 А проводилось с помощью автоматической процедуры уточнения ARP [9.]. Карта электронной плотности, рассчитанная с использованием фаз, полученных после поцедуры SQUASH, интерпретировалась с помощью 2800 эквивалентных атомов таким образом, что расстояния между соседними атомами лежали в пределах от 1.2 до 1.6 А. Полученная модель из эквивалентных атомов уточнялась с помощью программы PROLSQ без учета стереохимических ограничений. Каждый цикл уточнения сопровождался удалением атомов не удовлетворяющих критерию межатомных расстояний и находящихся в областях с уровнем электоронной плотности менее 1с. Одновременно с удалением проводился поиск новых атомов. Наибольшее число удаленных и вновь найденных атомов на каждом цикле не превышало 50. Среднее отклонение ARP фаз (Лср) по отношению к фазам, рассчитанным от финальной модели, равно 49° (при разрешении 1,9 А). Коэффициент корреляции карты электронной плотности по отношению к финальной карге - 72 %.

ГЛАВА 3 Построение и анализ атомной модели SAICAR-синтазы.

Фазы, вычисленные от ARP модели, использовались для построения карты электронной плотности • с разрешением 1.9 А, которая была интерпретирована в .терминах полипептидцой цепи. Качество харты электронной плотности позволило проследить полипептидную цепь и определить положения большинства боковых цепей аминокислотных остатков. Для построения и корректировки атомной модели молекулы фермента был использован комплекс графических программ FRODO [10.], установленный на интерактивной графической системе ESV 10/32.

Рис. 2. Фрагмент распределения электронной плотности с вписанной в нее атомной моделью SAICAR-clштaзы. Изолинии соответствуют уровню 1,5 а.

Атомная модель была уточнена методом наименьших квадратов (вместно с автоматизированным процессом модификации структуры 1Створителя - АЙР. Уточнение производилось в 7 этапов по 20 циклов с »следующей ручной корректировкой модели. Пример соответствия электронной готности и вписанной в нее конечной атомной модели ЗАГСАИ-синтазы эедставлен на Рис. 2. Параметры уточненной модели молекулы ЭАЮАК-синтазы статистические характеристики ее отклонения от идеальной приведены в аблице 3.

Таблица 3.

Статистические характеристики уточненной модели молекулы ЗАЮШ-синтазы.

Разрешение (А) 10.0 - 1.9

Число рефлексов 24879

И фактор (%) 15.4

Число атомов всего 2740

атомов белка 2358

молекул растворителя 352

атомов Б042" 30

Средний темп, фактор (А^) по всем атомам 24.5

по атомам белка 21.3

по молекулам растворителя 45.9

Зредне-квадратичные отклоне-

ния от идеальных значений . - -

(значение о - в скобках) межатомные расстояния 1-2 (А) 0.012 (0.020)

межатомные расстояния 1-3 (А) 0.043 (0.040)

- межатомные расстояния 1-4 (А) 0.047 (0.050)

отклонение от плоскости (А) 0.012 (0.020)

хиральные объемы (А^) 0.154(0.150)

Двугранные углы (с) пептидные о 2.2 (3.0)

алифатические % (+/-60,180) 18.8 (15.0)

ароматические %2 (+/-90) 30.7 (20.0)

Невалентные контакты (А^) одиночные торсионные ' 0.19 (0.30)

множественные торсионные 0.28 (0.30)

водородные связи 0.26 (0.30)

Изотропный В-фактор (А^). основная цепь (1-2 контакты) 3.7 (3.0)

основная цепь (1-3 контакты) 4.9 (4.0)

боковая цепь (1-2 контакты) 8.3 (5.0)

боковая цепь (1-3 контакты) 11.4(6.0)

. . г

Оценка средней ошибки в атомных координатах проводилась согласно ПГузатти [11.] по кривой зависимости Я-фактора от разрешения (Рис. 3). Значение

средней ошибки составляет величину около 0,20 А. Значения конформационнш -углов для всех, остатков попадают в области разрешенных значений на карте Рамачавдрана (Рис. 4) [12.].

ь.

о ».!» Е '

вс

4(5|л(6)Д)'

Рис. 3. Зависимость кристаллографического Я-фактора от разрешения для модел! SAlCAR-cинтaзы. Приведены теоретические кривые при средних ошибках в координатах атомов 0.10, 0.15 и 0.20 А

о

Ии (¿е£гее!)

Рис. 4. Диаграммы Рамачавдрана для уточненной модели ЗАГСАЯ-синтазы.

Всем атомам полипептидной цепи на карте электронной плотности ответствуют отчетливые пики с уровнем выше 1а. Исключения составляют N-•нцевой Metí и 7 остатков Lysl64 - ffisi70 в невидимой (по-видимому, гибкой) тле. Отсутствк- электронной плотности для Metí, по-видимому, является зультатом посттрансляционной модификации и последующего ацетилирования :г2. Ацетилированный Ser2 достаточно удовлетворительно вписывается в карту е¡стройной плотности.

Молекула SAtCAR-синтазы имеет общие размеры 70 х 60 х 40 А. и по орме напоминает согнутую ладонь. В средней части молекулы расположена шылая щелеобразная полость, размеры которой достаточно велики^ чтобы (повременно вместить молекулы SAICAR и АТР, являющиеся субстратами [иного фермента.

'ис. 5. Схема пространственнрго расположения полипептидной цепи и элементов вторичной' структуры в молекуле SAICAR-синтазы.

В молекуле можно выделить три домена, сформированных из епрерывных сегментов полипептидной цепи. Амино-концевой домен А состоит з 111 остатков (Ser2 - His 112), второй, наибольший по размеру домен В включа-

ет 142 остатка (Ьеи113 - Ип255) и третий, карбокси-концевой домен С, состоит из 51 остатка (А$р25б - ШвЗОб).,

Вторичная структура БАЮЛЛ-синтазы бьша определена на оснч анализа системы водородных связей между атомами основной цепи. Элемег вторичной структуры 5А1СА1?-синтазы схематически показаны на Рис. 5. и представлены в Таблице 4. Ядро доменов А и В доминируется пятицепочечными антипаралельнымн Р-слоями, прикрытыми со стороны раствора а-спиралями. .Кроме этого, в каждом из этих доменов есть по одному небольшому двухцепочечному антипараллельному Р-слою. Третий домен С состоит из двух следующих одна за другой спиралей, которые тесно контактируют между собой.

На последней стадии уточнения два наивысших пика на разностной карте электронной плотности были интерпретированы в виде двух ионов сульфата БА и БВ. Ион БВ уточнялся в двух положениях. Каждое из положений характеризуется своей независимой системой водородных связей. В первом положении ион сульфата БВг образует водородные связи с А^122 ЫНь Агд122 ИНг, А^242 N112, Бег128 ОС и Бег128 N. а также с двумя молекулами связанной воды. Во втором положении ион БВг связан водородной связью с А^122 и Бег128, а также тремя связями с Аг§242. Положение сульфат иона БА стабилизируется водородными связями с Аг^21 N и Уа120 N. а также с двумя молекулами связанной воды.

Таблица 4.

Элементы вторичной структуры SAICAR-синтазы.

Домен . Номера . остатков Элементы втор, структуры ч Примечания

А 8- 11 ß-поворот Г Asp9 и GlylO в конф. левой спирали

А 13 - 18 ß-цепь AI

А 20 - 27 ß-цепь А2

А 30 -36 ß-цепь A3

А 39 -41 ß-цепь A4

А 41 -44 ß-поворот Г Внутри ß-слоя. Туг42 и Gly43 в конформации левой Спирали

А 44 -46 ß-цепь А5

А 50 -53 ß-поворот II Glu52 в конформации левой спирали

■ А 52 - 72 а-спираль AI 3/10 Н-связь 69-66, 71-68

А 75 - 77 ß-цепь А6

А 80 - 83 ß-поворот И Gl у 82 в конформации левой спирали

А 84 - 88 3/10-сгшраль А2 3/10 Н-связь 87-84, 88-85

А 90 -95 3/10-спираль A3 ЗУ 10 Н-связь 93-90, 94-91, 95-92

А 95 103 а-спираль A4 3/10 Н-связь 98-95, 101-98, 102-99

А 105 -111 ' ß-цепь А7

В 113- 125 ß-цепь В1

в 128- 137 а-спираль В1 3/10 Н-связь 135-132

в 137- 139 ß-цепь В2

в 139- 142 ß-поворот Г Внутри Р-слоя. Ш140 и С1у141 в конформации левой спирали

в 142 - 144 ß-цепь ВЗ

в 149- 152 ß-поворот II ЭегШ в конформации левой спирали

в 151 - 163 ß-цепь В4

в 172 - 174 ß-цепь В5

в 175 - 184 а-спираль В2 •

в 184 - 210 а-спирапь ВЗ ЗЛО Н-связь 209-206, 210-207

в 206 - 211 я-контакт На конце а-спирали. С1у210 в

. конформации левой спирали

в 210 - 223 ß-цепь Вб

в 227 - 232 ß-цепь В7

в 237 - 240 ß-поворот I

в 242 - 246 ß-цепь В7'

-

с 260 - 271 а-спираль С1 3/10 Н-связь 271-268

с 267 - 272 я-контакт На конце а-спирали. Lys271 в

. конформации левой_спирали

с 272 - 275 ß-поворот II Gly274 в конформации левой спирали

с 281 - 301 а-спираль С2 3/10 Н-связь 284-281

ГЛАВА 4 Сравнение известных аминокислотных последовательностей iAICAR-синтаз и анализ расположения консервативных остатков.

Чтобы выделить остатки, являющиеся важными для функционирования фермента и дня сворачивания белковой молекулы, было проведено сравнение аминокислотных последовательностей SAICAR-синтаз из 11 про- и >укариотйческих организмов: Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Candida ilbicanus, Candida maltosa, Arabidopsis thaliana, Vigna aconitifolia, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Gallus ¿alius и Homo sapiens [13.]. Сравнение позволило выделить 24 эволюпиокно консервативных аминокислотных остатка (Таблица 5). Большинство из них оказались заряженными. Все они эасположены в полости ч»ежду доменами, что делает междоменную полость очевидным кандидатом на роль активного центра (Рис. 6).

Таблида 5.

Эволюционнохонсервативные аминокислотные остатки 8А1СА11-синтазы.

Положительно заряженные £уз19,1^53, АгЁ122, 1^135, 1^217, Аг§242, Ьув260, Агй264

Отрицательно заряженные С1и118, Азр215, С1и219,.А5р233, Абр239, АБр259

Незаряженный полярный 8ег128 ""

Гидрофобные Туг24, А1а41, РЬе220, Ьеи231, Тгр244

Конформационно важные ау18, РгоПб, ОХуШ, 01у221

Рис. б. Положение эволюционноконсервативных аминокислотных остатков в структуре БАГСАК-синтазы.

ГЛАВА.. 5 Сравнение пространственных структур 5А1САВ.-сшггазы и нуклеогид-связывагащих белков.

ЭАЮАИ-синтаза проявляет активность по отношению к АТР и САШ, который также содержит фосфорильную группировку, рибозу и недостроенный аденозиновый фрагмент. Кроме этого, ЗАЮЛИ-синтаза также ^ проявляет активность по отношению к СТР и 2'-<1АТР, а СТР и ЩР обнаруживают свойства слабых ингибиторов. Таким образом, очевидно, что в структуре 8А1САЛ-синтазы должны иметься центры связывания нуклеотидов. Поэтому было

роведено сравнение полученной структуры SAICAR-синтазы с известными труктурами других нуклеотид-связывающих. белков.

В ходе сравнения в структуре SAICAR-синтазы было выявлено тсутствие наиболее распространенной среди нуклеотид-связывающих белков 'оссмановской укладки цепи. Таким образом, SAICAR-синтаза не принадлежит к емейству нуклеотид-связывающих белков с классической укладкой цепи [14.].

Другое семейсво нуклеотид-связывающих белков включает в себя iTP-азный фрагмент белка HSC70, актин и ряд киназ Сахаров [14.]. Эти белки атасе имеют отличающуюся топологию, однако, в их структуре, имеется .арактерная фосфат-связывающая петля, связывающая два антипараллельных ß-тренда, расположенных в начале полипептидной цепи. Аналогичный мотив, дагако с другой аминокислотной последовательностью в фосфат-снязываюшей [етле, имеется в структуре SAICAR-синтазы. Совмещение петель показало ¡ысокое пространственное сходство этих структур. После пространственного 1аложения петель оказалось, что положение сульфата SA, обнаруженного в пгруктуре SAICAR-синтазы, соответствует поло'жению ß-фосфата АТР в актине и 1SC70. Более того, в ахтнне ß-фосфат образует водородные связи с амидами >ег 14 и Gly 15, в HSC70 с Thr 13 и Thr 14. Сульфат SA в структуре SAICAR-:интазы также образует две водородные связи с амидами основной цепи фосгранственно эквивалентных остатков Arg 21 и Val 20.

Другое семейсво нуклеотид-связывающих белков представлено тклической АМР-зависимой протеин киназой (сАРК) [14.]. Структурное ¡равнение SAICAR-синтазы с сАРК показало, что топология N-концевого домена >лизка топологии А домена SAICAR-синтазы (Рис. 7, Таблица 6.). В обоих яучаях их структура доминируется пятицепочечным антипараллельным ß-листом. Фосфат-связывающая петля в структуре сАРК, соединяющая стревды ßl и ß2, юответствует сульфат-связывающей петле в структуре SAICAR-синтазы, которая :вязывает стревды ßAl и ßA2. При этом следует отметить высокое фостранственное сходство этих петель. Однако имеется и рад различий. В сАРК !сть две дополнительные спирали: спираль а А, расположенная в начале юлипептидной цепи, и спираль аВ, расположенная между стрендами ß3 и ß4. В ггруктуре SAICAR-синтазы участок цепи, соединяющий стревды ßA4, ßA7, имеет юполнительные спирали аА2, аАЗ и аА4, и петля, соединяющая стренд ßA3 и :пираль аА1, имеет дополнительный короткий двухцепочечный штипараллельный ß-лист ßA4, ßA5.

Кроме вышеперечисленных семейств, имеется ряд белков пока ¡еклассифицированных в виде структурных классов. Среди них были выделены 1ва белка, глютатион сшгтетаза [15.] и 1>-аланин:0-аланин лигаза [16.], имеющие хжологию карбоксигконцевого домена близкую к топологии В домена SAICAR-¡интазы (Рис. 7, Таблица 6.). В карбокси-концевом домене GSHaabi расположен

пятистревдовый антипараляельный ß-лист (ВЫ, В13, В12, В15, В16), прикрытый со стороны раствора спиралью Н8. Петля, соединяющая стренды В13 и В14, невидима на картах электронной плотности. В DD лигазе этот мотив включает в себя ß-лист В11, BIO, В9, В12 н В13, прикрытый спиралью НЮ, однако петля, соединяющая стревды BIO и В11, видна з электронной плотности и содержит спираль Н9. Аналогичный мотив с незначительными топологическими отличиями имеется в В домене SAICAR-сшлгазы. Он содержит пятистрендовый антипараллельный ß-лист (ßB5, ßB4, ßBl, ßB6, ßB7), прикрытый спиралью аВЗ, и невидимую петлю, соединяющую стревды ßB4 и ßB5. Петля топологически соответствует невидимой петле GSHa3u. Отличия^ в топологии проявляются в наличии дополнительной спирали аВ1 и небольшого двухстренщового антипараллельного ß-листа ßB2, ßB3, расположенных в петле, соединяющей стренды ßBl и ßB4. Помимо этого, на участке цепи между стрендом ßB5 и

Рис. 7. Сравнительная топологическая диаграмма SAICAR-синтазы, сАРК, центральных и карбокси-концевых доменов GSHa3bi и DD лигазы.

Таблица 6.

Пространственное выравнивание SAICAR-синтазы и родственных белков.

Пространственно эгаившеншые-!участки;цепи и ИХ; у} . nepeif мая структура; •' Элемент вторичной ■' структуры

SAICAR-синтаза и ппотатион синтетаза Число остатков - 83; RMS С« (А) - 2.25

22 DIYEVD 27 169 SIFRVK 174 РА2 В10

29 GT1LEVAT 3 6 156 DIILKPLD 163 РАЗ В9

64 WFAFLS 69 127 FTAWFS 132 аА1 Н4

72 VRHHi 76 133 DLTPE 137 РА6 vfB8)

8 6 FDYL 8 9 _145 AQLK 148 А2 Н5

105 RSLLVHKHK 113 194 YCMAQNYLP 202 РА7 В11

115 IPLEV1VGR 123 207 GDKRV1WD 215 РВ1 В12

157 PIFT 160 216 GEPT 219 РВ4

188 SRRVAELAVKLYSKCK 203 247 LTESDWKIARQIGPTL 262 аВЗ Н8

212 IIADTKFEFGI 222 266 GLIFDVGLDII 276 рВ6 В15

229 IILVD 233 277 DRLTE 281 РВ7 В16

SAICAR-синтаза и циклическая АМР-зависимая протеин киназа Число остатков - 38; RMS Са (А) -1.98

12 LPLVARGKVRDIYEV 26 4 6 IKTLGTGSFGRVMLV 60 PAI, рА2 Р1, 32

30 TLLFVAT 3 6 69 YAMKILD 75 РАЗ 33

104 DRSLLVHK 111 115 NLYMVMEY 122 РА7 05

138 SRRVAELA 195 154 FEYLHSLD 161 аВЗ аЕ

SAICAR-синтаза и 1)-алашш:0-аланин лигаза Число остатков-99; RMS Са (А) - 2.07

21 RDIYEVD 21 ■ 152 VCMSKW 158 pA2 B7

29 GTLLEVA 35 139 LPVIVKP 145 РАЗ B6

106 SIJiVHKHKLIPlEVIVRG 123 177 VLIEKWLSGPEFTVAILG 194 PA7.PB1 B8, B9

157 PIFTP 161 195 ЕЕILT 199 РВ4 BIO

182 LVGEDLSRRVAELAVKLYSKCK 203 228 GbEASQEANLQALVLKAWTTLG 249 аВЗ НЮ

213 IADTKFEFGIDEfC 225 251 KGHGRIDVMLDSD 263 рвб • В12

227 NEIILV 232 264 GQFYIiL 2-69 РВ7 В13

Сингез молекулы SAICAR протекает с образованием амидной связи (C-N). На Рис. 8 представлен возможный механизм реакции [17.]. Карбоксильный углерод молекулы CAIR, несущий частичный положительный заряд, подвергается нуклеофильной атаке со стороны азота аспарагяновой кислоты. В то же самое время положительно заряженный концевой атом фосфора АТР вступает в электрофильное взаимодействие с одним из атомов кислорода карбоксильной группы молекулы - CAIR. -При 'этом атом фосфора ' переходит в пентакоординироваиое состояние. Далее в процессе реакции разрывается связь С-0 и образуется новая связь C-N. Одновременно АТР расщепляется на ADP и неорганический фосфат. В ходе реакции происходит удаление протона из аминогруппы аспарагиновой кислоты.

0

п

Ad—Р

1

О

о» а+ о — Р = о

о-

о- о- о

II

......р------ О-— с

I I

О- i— с

// с*

N4-

с о он

I

5+

н сн

I I

N — СН I I

н соон

— N'H,

PR

Рис. 8. Предполагаемая схема переходного состояния комплекса субстратов. А(1 -аденозин, РЯ - фосфорибозильная группа.

Молекула ATP, по-видимому, расположена в иежжоменной полости UCAR-синтазы аналогично расположению АТР в сАРК и DD лигазе. При этом вправление вытянутой конформации молекулы приблизительно совпадает с травлением вдоль фосфат-связывающей петли, ß-фосфат молекулы расположен позиции сульфат нона SA и фиксирован водородными связями с амидами :новной цепи консервативных остатков Arg 21 и Val 20. Адениновое основание шадает в гидрофобный карман, образованный остатками Leu 114, Val 232 с даой стороны междоменной полости,' и остатками Не 23, Leu 31, Phe 33, al 109 с другой стороны. Наиболее вероятное положение молекулы АТР в руктуре SAICAR-синтазы показано на Рис. 9.

Положение фосфата молекулы CAIR, по-видимому, соответствует эложению сульфат иона SB. При этом фосфат фиксируется водородными ¡язями с консервативными остатками Argl22, Serl28, и Arg242. Положение ггальной части молекулы CAIR и ее конформация однозначно определяется гобходимостью максимально сблизить карбоксильную группу CAIRa с ■фосфатом АТР. Это необходимо, чтобы обеспечить возможность протекания ;акции. При моделировании такого положения CAIRa с помощью FRODO, исстояние между атомом кислорода карбоксильной группы молекулы CAIR и гомом фосфора у-фосфата АТР составляет чуть более 3 Ä (Рис. 9).

Рис. 9. Вероятное расположение молекул АТР и CAIR в молекуле 4 SAICAR-синтазы.

Исхода из принципа близости амино группы аспарагиновой кислоты к области протекания реакции, можно расположить молекулу Asp таким образом, что гибкие боковые цепи двух-строго консервативных остатков Lys 19 и Lys 21*5 могут образовывать водородные связи с двумя карбоксильными группам* аспарагиновой кислоты.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОГТЫ.

1. Измерены интенсивности рентгеновских отражений от кристаллoi SAICAR-сингазы до разрешения 1.9 Â с использованием синхротронногс излучения и от кристаллов тяжелоатомных производных белка до разрешени 2.5 Â на диффрактометре КАРД-4 и синхротронном излучении.

2. Определены и уточнены параметры тяжелых атомов в тре; тяжелоатомных изоморфных производных. Методом изоморфных замещенш рассчитаны фазы структурных факторов белка до разрешения 2.5 А, которьк затем были улучшены и расширены до разрешения 1.9 А с помощью метода модификации карт электронной плотности.

3. Построена и уточнена атомная модель молекулы SAICAR-синтазы npi разрешении 1.9 А с R-фактором 0.154 и отклонением дайн связей от идеальны; 0.012 А. Модель молекулы SAICAR-синтазы содержит 2358 белковых атомов 352 молекулы воды и два иона сульфата.

4. На основе анализа водородных связей отределены ачементы вторично! структуры* молекулы и аминокислотные остатки; участвующие" межмолекулярном взаимодействии.

5. Сравнение одиннадцати известных аминокислотных последовательносте] SAICAR-синтаз из различных источников позволило выявить 24 эволюционн консервативных аминокислотных остатка, расположенных в междоменно! полости молекулы.

6. Сравнение пространственных структур SAICAR-синтазы и други нуклеотид-связывающих белков показало, что топология укладки полипептидно цепи первого домена SAICAR-синтазы похожа на топологию амино-концевог домена циклической AMP-зависимой протеин киназы с хороши] пространственным совпадением фосфат-связывающих петель. Пространственн подобные фосфат-связывающие петли были также обнаружены в молекула актина и АТРазного фрагмента белка HSC70, имеющих отличающуюс топологию. Показано, что топология второго домена SAICAR-синтазы похожа и топологию карбокси-концевых доменов гпютатион синтетазы В-аланишБ-аланин лигазы, •

7. На основе анализа расположения консервативных остатков и сульфг ионов в модели SAICAR-синтазы, а также результатов сравнения с нуклеотид- •

вязывающими белками, предложено возможное расположение субстратов фермента в междоменной полости молекулы SAICAR-синтазы.

МАТЕРИАЛЫ ЛИССКРТАНИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В ГЛКПУЮТПИХ

РАБОТАХ.

Grebenko, A.I., Levdikov, V.M., Barynin, V.V., Melik-Adamyan, W.R. & Myasnikov, A.N. (1992) Crystallization and preliminary X-ray investigation of phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Moi. Biol., 228, 298-299. !. Гребенко А. И., Левдиков B.M., Барынин B.B., Мелик-Адамян В.P., Мясников А.Н. (1992) Получение и предварительное рентгенографическое исследование кристаллов фермента фосфорибозил-аминоимидазол-сукцинокарбоксамид-синтетазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Кристаллография. 37, 1036-1038. Ï. Levdikov, V.M., Grebenko, АЛ., Baiynin, V.V., Melik-Adamyan, W.R. (1993) The structure of phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae at 3 À resolution. XVI Congress and Genera' Assembly IU of Cystallography, China, Collect. Abstracts, ps-03.05.41 t. Levdikov, V.M., Melik-Adamyan, W.R (1993)

Phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase. EMBL Research reports, p. 218.

5. Grebenko, A.I., Levdikov, V.M., Barynin, V.V., Melik-Adamyan, W.R. (1995) Crystallization of the phosphoribosylaminoimida2olesuccinocaxboxamide synthase from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Ps-T4B-14 VI Internat. Conference on Crystallization of Biological Macromolecules, Japan 5. Левдиков B.M., Гребенко А.И., Барынин B.B., Мелик-Адамян В.P., Ламзин B.C., Вильсон К.С. (1996) Пространственная структура SAICAR-синтазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae с разрешением 1,9 Â. Кристаллография. 41, 293-304.

7. V.M. Levdikov, V.V.Baiynin, A.I.Grebenko, W.R.Melik-Adamyan.V.S.Lamzin and K.S.Wilson (1996) Ciystal structure of SAICAR synthase from Saccharomyces cerevisiae. XVn Congress and General Assembly. USA Collect. Abstracts, p. C-169

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА,

1. Мясников, A.H., Плавник, Ю.А., Саснаускас, К.В., Гедминене, Г.К., Янулайтис, А.А.; Смирнов, М.Н. (1986) Нуоеотвдная последовательность гена ADE1 дрожжей Saccharomyces serevisiae. Биоорганическая химия. 12, 555-558.

2. Останин, К.В., Аленин, В.В., Домкин, В.Д., Смирнов, М.Н. (1989) Выделение и свойства фосфорибозил-шиноимидазол-сукцинокарбоксамид-синтазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 54, 1265-1273

3. Аленин, В.В., Останин, К.В., Костикова, Т.Р., Домкин, В.Д., Зубова, В.А., Смирнов, М.Н. (1992) Субстратная специфичность фосфорибозил-аминонмвдазол-сукцинокарбоксамвд-синтазы - N (САИКАР-синтетазы) дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 57, 845-855

4. Myasnikov, A.N., Sasnauskas, K.V., Janulaitis, A.A. & Smirnov, M.N. (1991) The Saccharomyces cerevisiae ADE1 gene: structure, overexpression and possible, regulation by general amino acid control. Gene 107, 143-147.

5. Otwinowski, Z. (1993) DENZO: an oscillation data processing program foi macromolecular crystallography. Yale University, New Haven, USA.

6. Otwinowski, Z. (1991) Isomorphous replacement and anomalous scateering, Proceedings of the CCP4 Study Weekend (Wolf, W., Evans, P.R. & Leslie, G.W. eds.), pp. 80-86. Warrington: SERC Daresbury Laboratory, UK.

7. CCP4 - Collaborative Computational Project, Number 4 (1994) The CCP4 suite programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. 50, 760-763.

8. Zhang, K.Y.J (1992) SQUASH - combining constraints for macrotnoleculai phase refinement and extension. Acta Cryst. D46, 213-222.

9. Lamzin, V.S. & Wilson, K.S. (1993) Automated refinement of protein models Acta Crystallogr. 49, 129-147.

10. Jones,' T.A. (1978) A graphics model building and" refinement system fo macromolecules. J. Appl. Crystallogr. 11, 268-272.

11. Luzzati, P.V.(1952) Traitment statistique des erreurs dans la determination de structures crystallines. Acta Cryst. 5, 802-810

12. Ramakrishnan, C. & Ramachandran, G.N. (1965) Stereochemical criteria fo polypeptide and protein chain conformations. Biophys. J. 5, 909-903.

13. Barioch, A. SwissProt Protein Sequence Databank User Manual. Relise 14.C EMBL Data Library, Heidelberg, FRG 1990.

14. Shulz, G.E. (1992) Binding of nucletides of proteins. Current Opinion i, Structural Biology 2, 61-67.

15. Yamaguchi, H., Kato, H., Hata, Y„ Nishioka, Т., Kimura, A., Oda, J. I Katsube, Y. (1993) Three-dimensional structure of the Glutathione syntethas from Escherichia coli В at 2.0 E resolution. J. Mol. Biol., 229, 1083-1100.

16. Fan, C., Moevvs, P.C., Walsh, C.T., Knox, J.R. (1994) Vancomycin Resistanci Structure of D-alanine:D-alanine ligase at 2.5 A resolution. Science, 266, 43$ 443.

17. Hartman, S.C., Buchanan, J.M., (1958) J. Biol. Chem., 233, 456