Протеинкиназа-С хлопчатника. Выделение и изучение физико-химических характеристик и каталитических свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

' «Г; >

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им, академика САДЫКОВА А. С.

УДК 577.152.2 На правах рукописи

КИМ ВИКТОРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ПРОТЕИНКИНАЗА-С ХЛОПЧАТНИКА. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК И КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

02.00.10—био^дганинеская химия, химия природньг и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕ НТ — 1996

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академика Садьткова А. С. АН РУз, в лаборатории химии белков и пептидов.

Научные руководители: академик АН РУз. Салихов Ш. И.,

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Абдурахманова Ж. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Ахунов А. А., кандидат химических наук, Мавлянов Г. Т.

Ведущая организация: Институт биохимии АН РУз

Защита диссертации состоится « 1996 года в — часов на заседании специализированного Совета Д 015.21.01 при Институте биоорганической химии имени академика А. С. Садыкова АН РУз по адресу: 700143, Ташкент, проспект X. Абдуллаева, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии АН РУз.

Автореферат разослан «__» _ 1996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

доктор химических наук Н. И. Барам

Актуальнссть проблемы. В растительных клетках так же, как и в животных, локализованы определенные химические структуры, специфически связывающие гормоны и являющиеся исходной точкой в цепи процессов, участвующих в реализации гормонального действия и ответа клетки на это воздействие.

Ведущую роль в процессах, протекающих в живой клетке, играет обратимое фосфорилирование - дефосфорилирование белков, катализируемое протеинкиназами и протеинфосфатазами. Накапливающиеся экспериментальные данные все более обосновывакзт ключевую роль протеинкиназ в регуляции процессов, происходящих внутри клетки. Несмотря на накопленный фактический материал, свидетельствующий о значении фосфорилирования - дефосфорилиро-вания белков для контроля метаболических процессов в высших растениях, исследования в згой области находятся в начальной стадии. Поэтому идентификация компонентов сигнальных систем, принимающих участие в формировании ответа клепки на внешние воздействия, их выделение и характеристика свойств является актуальным.

Цель я задачи исследования. Целью настоящей работы бьшо выделение, изучение свойств и роли протеинкиназы С из проростков хлопчатника в клеточных процессах, что является частью исследований, проводимых в лаборатории химии* белков и пептидов Института биоорганической химии АН РУ по программе 5Ф: "Исследовать фундаментальные основы гормональной регуляции физиологических процессов в клетке зукариотов с целью создания теоретических предпосылок конструирования высокоактивных препаратов для сельского хозяйства к медицины."

В процессе работы решались следующие задачи:

-4- выделение протеинкиназы С из проростков хлопчатника в гомогенном виде,

- определение ее структурных характеристик, аминокислотной специфичности,

- определение физико-химических констант и выявление эндогенных субстратов фосфорилирования,

- установление роли протеинхиназы .С в гормональной регуляции в клетке растений.

Научная новизна н практическая значимость работы. Впервые в гомогенном виде выделена высокоактивная протеинкиназа С хлопчатника. Изучены физико-химические и каталитические характеристики протеинхиназы С (молекулярная масса, константа Михазлиса). Показано, что активность выделенной протеинхиназы С выше активности протеинкиназ животных хдетох. Ы-концевой аминокислотой явдяетея мспионин. С помощью определения М-концевой аминокислоты, а также иммунологическими методами сделано предположение, что протеинкиназа С хлопчатника обладает консерватизмом по структурным характеристикам и иммунным детерминантным участкам. Определена аминокислотная специфичность: выделенная протеинкиназа С является серин-треонин специфичной протеинкиназой. Показано, что активность протеинхиназы С хлопчатника зависит от концентрации ионов

Изучена активация РНК-полимеразы и протеинхиназы С, а также синтез белка от присутствия экзогенных бензиламинопурина (БАП) и цитокинин связывающего белка (ЦСБ). Показано, что все три процесса регулируются фитогормоном, что указывает на их взаимозависимость и сопряженность друг с другом в силу функциональной или структурной связи, а также вероятность участия протеинкиназы С (ПКС) в

восприятаи. трансформации и реализации гормональных сигналов в растительной клетке.

Совокупность полученных данных может служить основой для. дальнейшего изучения путей реализации гормонального действия в хлопчатнике, что даст возможность регуляции таких важных процессов, как созревание, дефолиация и рост урожайности.

Апробация работы н публикации. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 2-й конференции биохимиков Узбекистана (ноябрь 1995т,), на 1-м Международном симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент, 1994 г), на 3-м Международном симпозиуме по биоорганической химии (гДагомыс, 1995 г.). По теме диссертации опубликованы 3 статьи и тезисы 2 докладов.

Структура н объем работы. Диссертация изложена на IП страницах машинописного текста и состоит го введения, литературного обзора, экспериментальной части, включающей дае главы, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа содержит 11 рисунков и _8_ таблиц. Список литературы включает 152 ссылки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В лаборатории были получены предварительные данные, свидетельствующие о том, что в гомогенате проростков хлопчатника присутствует ряд протеинкиназ: сАМР-зависимые (ПКА), Са2+-зависимые, Са2+-фосфолипидзависимые (ПКС) и Са2+-кальмодулин-завнснмые протеинкнназы. Налажены радиометрические методы количественного определения ферментативной активности про-

теинкиназ, аминокислотной и субстратной специфичности. Нашей задачей являлось выделение, изучение физико-химических свойств ПКС хлопчатника; детальное исследование каталитических характеристик, субстратной к аминокислотной специфичности, а также изучение ее роли в передаче гормонального сигнала в клетках растений.

Во всех исследованиях был использован сорт хлопчатника С-

2465.

При выяснении вопроса о локализации протеинкиназы С б различных фракциях гомогената трех-дневных проростков хлопчатника (цитозольная, ядерная н мембранная фракции) Са2+-фосфолипидзависимаа протеинкиназа была обнаружена во всех исследуемых фракциях (табл.1). -

Для того, чтобы предотвратить связывание протеинкиназы С с мембраной, а также чтобы оградил, фермент от ограниченного протеолкза Са2+-заВисимой нейтральной протеазой, при очистке фермента были использованы относительно высокие концентрации металлокомгиексонов. Так, для гомогенизации и экстракции ферментов был использован буфер, содержащий 3 мМ ЭГТА.

Таблица !.

Фракция Удельная активность ПКС, имп/мин Активность ПКС (имп/мйн )

сЗмМЭГГА без ЭГТА

цитозольная 2200 1530

ядерная 1460 1380

мембранная 1200 1850

Как видно из таблицы I, наибольшая протеинкинаэная активность при гомогенизации в этом буфере обнаружена в цитозольной фракции, которая в дальнейшем использовалась в работе по выделению протеинкиназы С.

Первичную очистку фермента и его концентрирование проводили методом солевого осаждения насыщенным раствором сульфата аммония. Наиболее ахтивной оказалась фракция, осаждаемая при концентрации соли 80% насыщения, nie наблюдался наибольший выход фермента.

Дальнейшее выделение протеинкиназы С провозили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефарозой CL-6B з линейном градиенте концентраций NaCl от 0 до 0.5 М а трис-HCi буфере при pH 7,5. (Рис.1). Протеинхиназной активностью обладала фракция, элюируемая при молярности NaC! 0,21-ОД4 М.

Tlie.'l ПсвоаВшзтля зршгалафш Як ДЗДБ-еефагм* СИ8 Размер wwn ж В ш. Сафасп, imBl 31 ияччю Грыютт КлО iDJS» Tta«-na т б tu 43 St

Полученную активную фракцию после ионсбменной Хроматографии затем подвергали дальнейшей очистке методом гидрофобной хроматографии на колонке с фенилсгфарозой CL-4B в 0,03 М трис-НС1 буфере при pH 7,5. Первоначальную злюцию провопили обратным градиентом концентрации NaCl от 0,3 до 0 М, а затем линейным градиентом изопропанола от 0 до 70%. (рис 2). Ахтивной сказалась

фрахцня, элкшруемая 30% изопропанолом . При электрофорез; в ПААГв пнсутствин ДДС-Ма она проявлялась в виде одной полосы."

Риак^ тптаггт ЬА а«, спушяь ^шшп Я млЧчих

смюп №□ > ю и тис-аа »ол л о м.

гцяваенщнанв* <яОт Я> I

М.м. определяли, сравнением злехтрофсретическон подвижности фермента с подвижностью белхов-маркеров на параллельном треке в 10% ПААГ в присутствии ДДС-Иа. Для выделенного нами фермента была определена М.м. равная 57 кДа.

Для выделенной протеинкиназы С определен аминокислотный состав, который приведен в таблице 2.

Методом Грея была определена N-концевая аминокислота -метнонин. Анализ выделенной протеинкиназы показал, что изоэлехт-рическая точка его равна 5,34.

Полученные экспериментальные данные: одна белковая полоса при электрофорезе и изофокусировании, единственная аминокислота при Н-хонцевом анализе и стабильность аминокислотного состава я о и после рехроматографии, позволили предположить, что выделенный нами белок является гомогенным.

Таблица 2

№ Аминокислота • Количество остатков Jb г -......... Аминокислота ■ Количество остатков

1. ! Аго 60 • с Met 13

2. Thr 26 10 Pro 31

3. Ser 58 Ii Phe 23

4. Glu 62 12 Ile 24

5. Gly 41 13 Leu 34

б. Ala 38 14 Iiis 14

7. Tvr 14 15 Lys 29

8. Val 37 16 Arp 23

Изучение влияния специфических активаторов для ПКС животных, __таких как Са2+ и фосфолипиды, на протеинкиназную активность вьщеленного нами фермента показало, что в присутствии только ионов Са2+ фермент активируется в незначительной степени, фосфолипид (фосфатидилхолин) не акпшировал фермент в отсутствии ионов Са2+ (табл.3). Однако, при суммарном действии Са^+ и фосфатидилхолина фермент активировался более чем в 5 раз больше, по сравнению с акшвностью наблюдаемой в присутствии одного из кофакторов.

Таблица 3.

Актнсатор Активность ПКС (имп'мин)

контроль- 450

Са2+ 470

фос&атилнлх олин 480

Са2++¡Ьосфатнд] шх олин 2S00

- ю-

Таким образом, эффект этих ионов проявляется лишь в том случае, если они образуют тройной комплекс фермент - фосфолипид -СаН

Изучение действия различных фосфолипндов, входящих в тройной комплекс, показало, что наиболее выраженным стимулирующим действием на фермент обладает фосфатндилхолин (табл. 4 ). Активирующий эффект других фосфолипндов снижается в следующей последовательности: фосфатндилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитоп. Кардиолнпин, лизофосфатиднлхолнн.

Таблица 4.

Активатор Активность ПКС (имп/мин)

Фосфатндилхолин 2800

Фосфатидилсерин 2450

ФосФатидилинозитол 1680

Кардиолипик 1430

ЛнзсхЬосфатидшколин 1020

По данным литературы, диацилпшцерин - один из продуктов распада мембранных фосфолипндов, повышает сродство фермента к кофакторам, увеличивая этим активность ПКС. Поэтому было исследовано влияние глицерол-1,2-диолеина на протеинкиназкую активность (таблица 5).

Таблица 5.

Активатор Активность ПКС (имп/мин)

Са^++фосфолипид (фосфатндилхолин) 2800

Са^++фосфзтидилхолин+глицерол-1,2 ди олеин (2мкг) 9500

Как видно из таблицы 5, активность фермента увеличивается а «сколько раз при добавлении 2 мкг диолеииа в реакционную смесь.

Поскольку ионы кальция оказывают влияние на активность ПКС, то необходимо было выявить ту оптимальную концентрацию, при которой наблюдается наибольшее повышение активности фермента ;рис.З).

РисЗ Зависимость протеинкиназной активности от концентрации

1.- контроль

2.- концентрация ионов Са~т . 10-9 М

3.- концентрация ионов Са-+ - 10-8 М

4.- концентрация ионов - 10-7 М

5.- концентрация ионов Са2+ - 10-6 VI

6.- концентрация ионов Са2+ - 10-5 М

7.- концентрация ионов Са2+ - ¡0-4 М

Как видно из рисунка 3, максимальная протеинкиназная активность проявляется при концентрации ионов Са-+ 10"^ М. Необходимо отметить, '¡то эта концентрация иснсв Са-^ была использована во всех дальнейших экспериментах по определению активности ПКС хлопчатника.

Представляло интерес изучить изменение активности прстеин-киназы С хлопчатника при фосфоритгровании различных субстратов с

ионов кальция

целью выбора среди известных белков подходящего субстрата для изучения свойств выделенного фермента (таблица 6).

Таблица б

Субстраты .......... . 1 . Удельная активность ПКС |

имп/мин в % к гистону Н 1 |

Гнстон Н1 350 100 1

Казеин 320 9! 1

БСА 220 62 !

Глобулин хлопчатника 326 93 |

""Концентрация для всех субстратов - 50 мкг/мп.

Как видно из таблицы 6, наибольшая активность наблюдается при фосфорилировании гисгона Н1, который был в дальнейшем использован в качестве рабочего субстрата, причем ПКС фосфорилирует нет^лько гистон НI, но и другие субстраты, в том числе и кислый белок казеин.

Большой интерес представляло обнаружение и эндогенных субсгратоз фосфоршшровання ПКС. Методами электрофореза и радиоавтсграфии в присутствии белков -маркеров, с определенными молекулярными массами было показано, что эндогенными субстратами фосфорилирования ПКС. хлбпчатника являются белки с Мы. 23.30,38,41,46 кДа. Идентификация выявленных субстратов не проведена, однако для белка с молекулярной массой 23 кДа можно сделать предположение, что этот белок является защитным белком -осмотином, который имеет такую же молекулярную массу и который синтезируется в клетке в ответ на различные стрессовые воздействия.

Опрелелена аминокислотная специфичность ПКС хлопчатника. Фракционирование продуктов частичного . кислотного гидролиза фосфорилированного субстрата проводили высоковольтным электрофорезом. Результаты электрофореза и автораянографии позволили сделать вывод о том, что выделенная нами ПКС является сернн-треонин специфичной протеинкиназой (рис 4 ).

——I,... ■---■ |- 1,1 ........... щ 1111 1111ГШТ 41 I | ЯГ

2

Рис.4. Определение аминокислотной специфичности ПКС хлопчатника

Известно, что ферменты обладают высокой степенью консерватизма в структуре, что возможно н обусловило общность механизма их действия независимо от объектов, из которых они выделены. Представляло интерес сравнить полученные нами данные о ПКС хлопчатника с ПКС животных тканей, для которой японскими учеными была определена полная первичная структура. По молекулярному весу имеются некоторые различия, а Ы-концевые аминокислоты идентичны и представлены остатками метноннна. С помошью электрофореза и иммуноблотинга протеннкиназы С хлопчатника и моноклинальных антител к ПК С из мозга быка показано, что оба фермента обладают сходными дегермннантнымн участками. В этом эксперименте были использованы моноклональные антитела клока МС 5 ЯР N 536, представленные для С.Е.Северина Сильвией Касоблан. Иммуноблот ПКС из гомогената проростков

хлопнатника показал, что моноклональные антитела обнаруживают полипептид с М.м. 57 кД .

На основании данных иммуноблотинга н Ы-кониевого анализ; можно предположить наличие в молекулах обоих ферментов животмогс и растительного происхождения некоторых общих структурны; признаков.

В гормон-зависимых процессах полиамины, такие как путресцнн спермин и спермидин принимают активное участие. В связи < имеющимися литературными данными о регулирующем влиянир полиаминов на протеинхнназу С животных клеток, представлялс интерес изучение влияния полиаминов спермина и спермидина на активность выделенного нами фермента (табл. 7).

Таблица 7.

Полиамины Активность ПКС (имп/мин)

1. Контроль 2021

2. Спермин 8941

3. Спермидин 18416

Известно, что спермин и спермидин подавляют

фосфорилирующую активность ПКС животных клеток. Исследование влияния этих полиаминов на ПКС хлопчатника показало, что спермин и спермидин значительно увеличивали ее ферментативную активность. При этом спермидин повышал активность фермента почти на порядок , а спермин - более чем в четыре раза по отношению к контролю.

Сравнение литературных и полученных нами данных позволило обнаружить резкое различие между ПКС животных и растительных тканей по их отношению к полиаминам, которые можно отнести к неспйцифическим активаторам ПКС хлопчатника.

- 15В связи с тем. что ионы магния оказывают стимулирующее действие на прстеинкиназы животных тканей, представляло интерес изучить их влияние на активность ПКС хлопчатника (рис.6).

(П*сгогт»ыыв зависимости активности про-! I

j - TCT«QMW с от »ОВДятааая шопот leg J j

J00

Рис.б. Гистограмма зависимости активности (%) протеинкинаэы С от концентрации ионов М§2+. Как видно из рисунка 6, При увеличении концентрации ионов магния активность ПКС достигает максимума при концентрации 50 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации ионов магния приводит к падению активности на 67% от максимального значения. Полученные данные свидетельствуют о том, что протеинкинаэы С растений и животных однотипно реагируют на ионы

Для выделенного фермента определены каталитические характеристики, такие как рН-, температурный оптимумы, зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (гистон Н1), определена константа Михаэлиса, равная 42 мкг/мл (рис.5). Для животных тканей эта константа, приведенная в литературе, равна 50 мкг\мл, что свидетельствует о большей активности протеинхиназы С хлопчатника. Это, возможно, обусловлено более быстрыми процессами

Каталнтические характеристики протеинкииазы С.

Вшшж ттотриуры ва скорость ревы

Эвгасвкеп. прсттавизеаяй еетияксга ст рй

с 1» а ш <8 ьс ео те ю » икот» с

»»17114:!

Рис.5 б. Зависимость Риоа. Влияние температурь, акпшносП1 протеинкнназы С от на скорость реак-ции. рД

-10

о Э < 8 ь

Iе

N

с

« а

м I"

о

ймевеаае гооросга ферхевгагагвсй реахцмЕ ст вргагш! ивху4ад>а

О »¡В»«5ВЮТВЮ» • Пий

кпслаш Мишехст У.С1ГК

ста; же к» ю во

ХМОТрОЦЯ! ^ 9 МО1

Рис.5в .Кинетика фермента- Рис.5д. Зависимость скорости тивной реакции. ферментативной реакции от кон-'

центрации субстрата. Определение констатнты Михаэлнса-Мен-

тена

метаболизма з растительной клетке, связанных с периодом вегетации. Проведенные эксперименты показали, что оптимальной температурой для протеинкиназы С оказалась температура 35-нО|;С. Фермент проявляет максимальную активность при рН 7,3 - 7,5. Изучение кинетики ферментативной реакции показало, что повь;шение протеинкиназнсй активности происходит в первые минуты и достигает максимума через 30 мин (рис.5).

Таким образом выделена и охарактеризована ПКС хлопчатника.

Следующим этапом наших исследований было изучение роли ПКС з передаче гормонального сигнала в растительной клетке.

Исходя из эволюционной и структурной общности жизстнсй :: растительной клеток, можно предположить, что з реализации гормонального действия растительной клетки участвуют те же ферменты и вторичные мессенлжеры, что и в животных клетках.

Рис.7. Изучение процесса передачи гормонального сигнала а

системе iri vitro.

1. Хроматин (Хр)-контроль 5. Хр*БАП-ЦСБ-гПКС

2. Хр+БАП б. Хр+БАПтЦСБ+ПКС+?нфампицин

3. Хр+БАП+ЦСБ 7. Хр+БАП+ЦСБ+ПКС+спепмиднн

4. Хр+ПКС 3. ар+5АП*ЦСБтПКС+?мБ

Из литературы известно, что фитогормоны, в частности, цитокинин, оказывают влияние на активность протеинкиназ, а также на РНК-полимеразную активность н матричную активность хроматина в клгтках растений. Поэтому нами исследована регуляция активности протеинкиназы С, а также РНК-полимеразы и синтеза белка в системе с изолированным хроматином под воздействием цитокинина. Поскольку действие фитогормона реализуется через его рецептор, то мы изучали действие хак самого цитокинина так и его хомлекса с рецептором -цитокинин-связьгвающим белком (ЦСБ) . В экспериментах был использован синтетический аналог цитокинина - бензиламинопурин (БАП) (Рис. 7).

Эта часть работы была выполнена совместно с с.н.с. ИБОХ АН РУ Вешкуровой О.Н.

Как видно из гистограммы , добавление БАП резко увеличивало активность протеи^иназы С и РНК-полимеразы и незначительно, по сравнению с ними, синтез белка.

Изучение влияния как фитогормона, так и его предполагаемого рецептора - цитокиннн-связывающего белка показало , что добавление рецептора еще сильнее увеличивало- тенденцию к увеличению протеинкиназной и РНК-полимеразной активностей (рис.7). По-видимому, регуляция активностей этих ферментов реализуется с участием не только фитогормона, но и комплекса цитокинина с его специфическим белковым рецептором. Синтез белка по сравнению с активностями протеинкиназы и РНК-полимеразы изменяется та.'сже незначительно. Почти такое же увеличение матричной активности хроматина мы получили при добавлении к хроматину экзогенной протеинкиназы С. При этом наблюдается резкое увеличение общей протеинкиназной активности, которая в совокупности с действием

эндогенной протеинкиназы дала повышение активности на 67%, активность РНК-полимеразы возросла на 30%, а синтез белка на (9%, относительно контроля.

Следует подчеркнуть, что добавление только протеинкиназы С увеличивает все три активности почти так же, как и при добавлении БАП и цитокинин-связывющего белка. По-видимому, экзогенная протеиикиназа индуцирует эти процессы без добавления фитогормонов и его предполагаемого рецептора. Таким образом, для активации хроматина достаточно индуцирование ее либо протеинкииазой, либо комплексом фитогормона и рецептора.

Еще большее увеличение матричной активности хроматина мы наблюдаем при совместном добавлении БАП, ЦСБ и ПКС, хотя наблюдаемые эффекты не были аддитивными.

Селиванкиной С.Ю. с соавт. изучено влияние цитокиннна на активность протеинкиназы, связанной с хроматином и РНК-полимеразой листьев ячменя, и высказано предположение, что РНК-полимераза является субстратом фосфорилирования протеинкиназы. Полученные нами результаты и приведенные выше литературные данные позволяют сделать вывод, что в механизме действия как фитогормонов, так и гормонов животных модификация белков при помощи протеинкиназ может играть важную роль в передаче гормонального сигнала.

Судить о корреляции этих'активностей можно, ннгибируя один из этих ферментов, поэтому было • проверено действие следующих ингибиторов: рифампицина - ингибитора РНК-полимеразы, пермексина Б - ингибитора ПКС и спермидина, регулирующего активность ПКС животных клеток, а также участвующего в

сгруктурировашш хроматина, г, следовательно, - к в процессах изменения матричной активности хроматина.

Нами показано, что добавление пермексинг Б вызвало резкое снижение всех трех активностей, причем пермексин Б. снижая активность ПКС, снижал уровень РНК-полимеразы и синтеза белка даже ниже контроля, т.е. он интибировал не только экзогенную , но и эндогенную протеинкиназную активность.

При добавлении рифампишша, также наблюдается снижение всех трех исследуемых активностей.

Добавление в систему активатора ПКС хлопчатника -спермидина вызывает резкое увеличение всех трех активностей, причем синтез белка увеличивается в 2 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать вывод, что фитогормоны, е частности, цитокинин, реализуют свое действие через протеинкиназы, активность которых сопряжена с активностью РНК-полимеразы и синтезом белка в сил**' функциональной или структурной связи.

Воздействие на клетку фитогормонов, очевидно, реализуется посредством процесса фосфорилирования-дефосфорилирования, т.е. для подобной активации важно лишь увеличение протеинкиназной активности. Возможно, действие фитогормона и его рецепторе ответственно только за увеличение активности фермента, а дальнейшая реализация гормонального действия возлагается на протеинкиназу I! цепь последующих реакций.

ВЫВОДЫ

]. Впервые в гомогенном виде выделена высокоактивная протеинкиназа С хлопчатника, активность которой зависит от ионов

Сд2-г и фосфолипидов. Показано, что ее активность модулируется ионами магния.

2. Изучены физико-химические и каталитические характеристики протеинкиназы С. Установлено, что молекулярная масса ее равна 57 хДз, Км=42 мхМ/мл. Определен аминокислотный состав , N-концевая аминокислота - мегаонин и изоэлектрическзя точка разная 5,34.

3. На основании данных по определению N-концевой аминокислоты, а тахже иммуноблотинга сделано предположение о наличии в молекулах ПКС хлопчатника и ПКС из мозга быка некоторых общих структурных признаков.

4. Определена аминокислотная специфичность: выделенная протеинкиназа С является серин-треонин специфичной протгнн-киназон. Выявлены модельные и эндогенные субстраты фосфорилирозания ПКС.

5. Показана активация РНК-полимерззы, протеинкиназы С, а также синтеза белка от присутствия экзогенных БАП и ЦСБ, что указывает на их функциональную и структурную взаимозависимость. Показано, что рифампицин и пермекснн В одинаково подавляют see три процесса.

Список работ опубликованных по материалам дяссартзпли.

1. Солихов Ш.И., Абдусалямова Л.Н. Абяурахманова Ж А., Ким З.В. Са2+-фосфолипидзависимая протеинкиназа из проростков хлопчатаиха.' Химия природных соединений, 1994 г., I.e. ¡00-104.

2. Салихсв Ш.И.. Ким В.В.. Асдурахмансва Ж. А., Талтобин К.С. Фосфолнрирозание селхсз изолированных хлоро пластов хлопчатника под воздействием различных <зитсгормонов. - Хим. природ, соед, ! 995. ib ¡.с. 129-132. 5

-223. Ким В.В., Абдурахманова Ж. А., Тахтобин К.С., Салихов ШЛ. Некоторые характеририсгаки протеинкиназы С хлопчатника- - Хим. природ, соед, 1995, № 1,с. 132-136

4. Абдурахманова Ж А., Салихов Ш.И., Ким В.В. цАМФ-зависимая протеиикиназа хлопчатника. 2 Конференция биохимиков Узбекистана. Ташкент, 1993, с. 135.

5. Salikhov Sh J., Abdurakhmanova .¡Л., Kim V.V. Phosphorilation of proteins From cotton chloroplasts in vitro. 3 International Symposium on Bioorganick Chemistry. Dagomys, Russia, 1995.

АННОТАЦИЯ F&3A С ПРОТЕИНКИНАЗАСИ. УНИНГ' АЖРАТИБ ОЛИНИШИ ВА ФИЗИК-КИМЁВИЙ ТАЪРИФЛАРИ, ХАМДА КАТАЛИТИК ХУСУСИЯТЛАРИНИ УРГАНИШ.

Кии В.В. .

Биринчи г^рта гуза усимлигидан, ион алмашинув ва гидрофоб хроматографиялари ёрдамида, фаоллиги фос фолил ид ва Са2+ нондарининг ипггирокяга боглщ булган ю^ори фаол протеиикиназа С гомогея холда ажратиб олшзди.

Протевшашаэа С шшг физик — химёвий хусусшгглари урганилди. Шу жумладан,унинг молекуляр огирлига 57 кДа булиб, Км= 42 мкМЧмл дир. Курсахилдихи, ажратиб олинган протеивкнназа С нинг фаоллиги, данной хуж айр алар идая ажратилгаа протеинкиназаларнинг фаоллигига нисбатан 20 % га юкрра булиб, унинг N—охирги амннокнслотасн метиониндир. N —охирги амииохислотани аянвдаш ва иммунологах услублар ёрдамида, гузадан ажратилган протеиикиназа С нинг структурасд ва иммунодетерминант ^исмларининг, аввал фанга маълум булган прспеинхиназалар билан ухшадглиги исботланди. Шушшдек,

шинокислота махсуслиги хам аницланди : ажратилган протеинкиназа С, серии — треонин махсус протеинкиназа тисобланади.Тузадан ажратилган протеинкиназа С нинг фаоллиги ионларининг концентр ад ияс ига боглшушги курсатилди.

Яна шунингдек экзоген БАП ва ЦСБ иштирокида РНК — аолимераза окснл синтез ва протеинкиназа С нинг фаолланшпи фганилди. Учта жараённинг фитогормонлар билан бошцарилншн, ►'ларнинг узаро ва бир —бири билан функция жихатдая ёки ггруктуравий боглизушга ва шунингдек усимлнх хужайрасидагн ~ормонал снгналларни Едбул вузлиш, трансформацнялаш ва >ошк,аршпда к,атнашиш эхтимоллиги курсатилди,

PROTEIN KINASE С OF COTTON. ISOLATION AND STUDY OF PHYSICAL AND CHEMICAL CHARACTERISTICS AND KATALYTIC PROPERTIES.

, Kim V.V.

First highly active homogeneous protein kinase С has been isolated rom shot seeds of cotton by the methods of ionoexchange and lydrophobic chromatography the activity of which depended on the presence of Ca+2 ions and the phospholipid.

First physical and chemical characteristics of the proteinkinase С lave been studied. It has been established that its mojecular weight was S7kD, Km=42mM/ml. The activity of the isolated protein kinase С has been ;hown to be 20% as great as animal protein kinases. Methionine is a N-erminal amino acid. Ptotein kinase С of cotton has been proved to have ;onservatism in structural characteristics and in immune determinant ■egions by the method of the detection of N-terminal amino acid and mmunologica! techniques. The amino acid specificity has been determined:

the isolated proteinkinase C "was serine-threonine specific protein kinase. The activity of cotton proteinkinase C has been shown to depend on ion Mg+2 concentration.

First the activity of RN A-polymerase and protein kinase C and the synthesis of the protein in the presence and the absence of benzyl-aminopurine and cytokinin have been studied. All three processes have been shown to be controlled by the phytohorrnone that indicated their interdependency and coordination between each other due to functional and structural connections between these processes and probability of the participation of protein kinase C in perception, transformation and realization of hormone signals in plant cell as well.

gk