Радиолиз водных дисперсий липосом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.09 ВАК РФ

На правах рукописи

Парамонов Дмитрий Викторович

Радиолиз водных дисперсий липосом

02.00.09 - химия высоких энергий

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006 г.

Работа выполнена в лаборатории физических методов обработки биопрепаратов Научно-технического центра «Лекбиотех» и в лаборатории радиационной химии кафедры электрохимии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

профессор, доктор химических наук Бугаенко Леиар Тимофеевич

профессор, доктор химических наук Фельдман Владимир Исаевич профессор, доктор химических наук Шарпатый Валерий Андреевич

Российский химико-технологический

университет им. Д.И. Менделеева

Защита диссертации состоится "3" марта 2006 г. в 16 часов 15 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.90 по химическим наукам при МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет МГУ, аудитория 337.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "26" января 2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук — Бобылёва М.С.

0Ъе>

1

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Липосомы, имеющие высокую биосовместимость с тканями человека, являются одной из перспективных форм направленной доставки лекарственных препаратов в органы-мишени. Известно большое количество фармакологически активных веществ, включаемых как в сам липидный бислой липосом, так и во внутривезикулярный объем. За последние несколько лет запатентовано большое количество изобретений по получению и использованию липосомальных форм в медицине (создание липосомальных композиций, содержащих противовоспалительные, противогрибковые, противовирусные и противораковые соединения) и ветеринарии (антибактериальные средства при лечении сельскохозяйственных животных и птиц), в научных исследованиях и косметологии. Поскольку выпуск лекарственных препаратов тесно связан с обеспечением их надежной стерильности, а на сегодняшний день нет универсального способа достижения стерильности для всего спектра лекарственных препаратов и материалов, встает вопрос о разработке оптимального для данного лекарства или группы лекарств метода стерилизации или деконтаминации (частичного снижения микробного загрязнения). Одним из перспективных методов стерилизации и деконтаминации термолабильных препаратов является радиационная обработка. Основная задача при такой обработке - обеспечение надежной стерильности, с одной стороны, и максимальной сохранности препарата - с другой. Поскольку липосомы, являются в данном случае универсальной транспортной системой для широкого спектра лекарственных препаратов, исследование радиационно-химических процессов, происходящих при радиационном воздействии на такие дисперсные системы, составляет основную проблему, решение которой дает возможность находить надежные способы применения данного вида обработки.

С другой стороны, дисперсии липосом интересны с точки зрения исследования протекания конкурирующих химических процессов под действием излучения в дисперсных системах как внутри липидного бислоя, так и в объеме всей дисперсной системы. В связи с этим представляет интерес изучение лецитиновых липосом с точки зрения радиационной химии коллоидных систем (изучение влияния потоков активных частиц, образующихся при радиолизе воды, на липосомы; глубины проникновения активных частиц в липидную мембрану липосом; определение размера области вокруг липосомы, из которого она собирает активнь^чаздэды и т.д.)-----

Липиды являются важными компонентами клеточных мембран, поэтому изучение механизмов и кинетических закономерностей воздействия излучений на относительно простые (в сравнении со строением мембран клеток) модельные дисперсные водно-липидные системы дает возможность понять, кроме того, первичные процессы радиационного поражения мембран живых клеток.

Цель работы. Минимизация радиационно-химического поражения липидного бислоя липосом и повышение радиационной устойчивости дисперсии (химической и агрегативной) в целом решает основную проблему, связанную с применением радиационной стерилизации для таких систем. С другой стороны, в той же проблеме радиационной стерилизации существует задача повышения эффективности стерилизации путем снижения резистентности микроорганизмов при облучении. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось:

- количественное определение кинетических параметров взаимодействия активных продуктов радиолиза воды с липидным бислоем и включенными в него молекулами акцептора (служившими моделью включенного соединения и средством изучения радикальных реакций в бислое и выступающими как дополнительная защита липидного бислоя от поражения);

- экспериментальное определение роли активных продуктов радиолиза воды в радиационном поражении липосом и выявление механизмов основных процессов, вызывающих разрушение липидного бислоя и включенного в него акцептора.

Научная новизна работы. Определено влияние качественного и количественного состава радиолитических частиц, образующихся в объеме водной фазы дисперсии при облучении, на химические процессы, протекающие внутри липидного бислоя. Установлен размер области водной фазы вокруг липосомы (области сбора), из которой собираются активные радиолитические частицы, приводящие к химическим изменениям в липидном бислое. Установлено влияние потока активных частиц (определяемое размером области сбора) на химические процессы в липидном бислое. Построена математическая модель, описывающая распределение профиля концентраций радиолитических частиц по объему дисперсной фазы, липидного бислоя и внутривезикулярного ядра.

В исследованиях по низкотемпературному радиолизу (77 К) лецитиновых дисперсий с включенным в липидный бислой липосом акцептором установлено, что включенные молекулы эффективно акцептировали радикалы, дошедшие до поверхности липидного бислоя из объема водной фазы (подвижные при 77 К атомы водорода играли важную роль в образовании радикалов из акцептора). При разогреве облученных образцов наблюдали процессы эстафетного взаимодействия ОН" радикалов с акцептором через промежуточную стадию образования "лецитиновых" радикалов.

Определено на основе анализа кинетической схемы превращения молекул липидного бислоя соотношение констант скоростей (ингибирования к квадратичной гибели радикалов в бислое и фактор окисляемости липида) и кинетических параметров (скорости инициирования радикалов в липидном бислое) радиолиза водных дисперсий липосом. На основе экспериментальных данных и математического моделирования предложена схема защиты липосом в дисперсии от радиационного повреждения при облучении.

Практическое значение работы. Полученные в работе результаты о закономерностях протекания радиационно-химических процессов в дисперсиях липосом и зависимости их эффективности от параметров как липидной, так и водной фазы позволяют управлять процессом радиолиза липидного бислоя липосом, минимизировать разрушение бислойных структур и могут быть использованы для разработки технологии радиационной стерилизации инъекционных препаратов на основе липосом. Определенные в работе соотношения кинетических параметров радиолиза дисперсий липосом и данные об эстафетной передачи валентности в бислое важны для радиобиологических исследований механизмов поражения клеточных мембран.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Радиационные поражения в дисперсиях липосом вызваны в основном косвенным действием излучения - реакциями ОН*, Н", и Н02/02! (для аэрированных систем) с молекулами лецитина, составляющими липидный бислой липосом.

2. Состав водной фазы дисперсии (наличие или отсутствие растворимых в воде акцепторов, их концентрация) и концентрация липосомальных частиц определяют области сбора радикалов вокруг липосом.

3. Наиболее активные радикалы, инициирующие реакции внутри липидного бислоя (в неполярной углеводородной зоне) - Н02/0г?, а в полярной зоне -ОН*.

4. Радиационно-химические превращения включенных в бислой молекул могут происходить путем эстафетной передачи валентности с поверхности в объем липосомы через стадию образования «липидных» радикалов.

5. Предложенная на основании экспериментальных данных кинетическая модель радиолиза дисперсий липосом может использоваться для расчетов глубины поражения липидов и включенных в них молекул во всех областях их размещения в липосоме.

Апробация работы. Результаты диссертации докладывались на следующих конференциях и симпозиумах: V-я Всероссийская конференция "Физика и химия элементарных химических процессов", посвященная 80-летгоо акад. В.В. Воеводского, Черноголовка, 1997; 3-й Съезд по радиационным исследованиям, Москва, (14-17.10.97), Пущино, 1997; Ш-я Баховская конференция по радиационной химии, Москва, 2000; Всероссийская научная конференция посвященная 95-летию Уфимского НИИВС им. Мечникова ГУЛ "Иммунопрепарат" (5-7 июня 2000) Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов, Уфа, 2000; 1-я Всероссийская конференция "Прикладные аспекты химии высоких энергий" (30 октября - 2ноября 2001), Москва, 2001; IV-й Съезд по радиационным исследованиям (20-24. 11. 2001), Москва, 2001.

Публикации. Материалы работы были опубликованы в семи статьях в рецензируемых журналах: Химия высоких энергий, Вестник МГУ, Менделеевские сообщения (Mendeleev Communication).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы (содержащего 179 наименований). Общий объем диссертации составляет 162 страницы и содержит 47 рисунков и 7 таблиц.

Во введении определено научное направление исследований, обоснована актуальность темы работы и ее практическое значение. Первая глава посвящена описанию имеющихся в литературе данных о физико-химических свойствах природных и синтетических лецитинов, их способности образовывать липидные бислойные структуры, о свойствах самих бислоев и о радиационно-химических процессах в лецитинах. Сформулированы выводы обзора и дана постановка задачи исследования. Во второй главе описаны методы получения и

контроля дисперсий липосом, анализа продуктов превращения молекул в липосомах и условия проведения экспериментов. В третьей главе представлены результаты исследований радиационно-химических процессов в дисперсиях липосом и их диффузионно-кинетическое моделирование. Четвертая глава посвящена кинетическому анализу химических процессов, протекающих в липидном бислое, и способам повышения устойчивости дисперсии липосом при облучении.

Основное содержание работы Обзор литературы (глава 1). В начале обзора дано описание имеющихся в литературе данных о свойствах природных и синтетических лецитинов. Приведено описание физико-химических свойств как молекул фосфатидилхолинового ряда, и в частности, яичного лецитина, так и бимолекулярного слоя в целом: критическая концентрация мицеллообразования, рК фосфатной и четвертичной аммонийной групп, структура фосфатидилхолиновых молекул и подвижность связей в молекулах, интервалы температур фазовых переходов и конформации молекул в бимолекулярном слое, размер полярпой и неполярной частей молекул, параметры самого бимолекулярного слоя (толщина, средняя площадь на молекулу, подвижность молекул в бислое), проницаемость через бислой отдельных ионов и молекул. Показано, что на химические процессы, протекающие в липидном бислое, будет оказывать влияние физико-химическое состояние самого липидного бислоя, зависящее от многих параметров (длины углеводородных цепей лецитиновых молекул, степени ненасыщенности углеводородных цепей, степени гидратации полярных частей молекул, температуры, ионной силы водной фазы дисперсии, рН и т.д.). Рассматриваются общие принципы формирования липосом в водной дисперсии и интервалы размеров образующихся лецитиновых везикул при разных способах формирования дисперсии. Далее в обзоре приводятся данные о воздействии ионизирующего излучения на фосфолипиды, липиды и органические вещества, близкие по строению к фосфолипидам. Определено, что структура липидного бислоя липосом (фазово-агрегатное состояние липидного бислоя, степень ненасыщенности жирнокислотных остатков, наличие в липидном бислое молекул других веществ) влияет на набор продуктов, образующихся в дисперсии при воздействии активных частиц, генерированных как ионизирующим излучением, так и химическими агентами,

на липосомы. Описаны механизмы окисления и ингибирования окисления некоторыми природными и синтетическими антиоксидантами жирных кислот разной ненасыщенности, сложных эфиров и других карбонильных соединений. Приводятся данные о некоторых радикалах, образующихся при облучении тканей организма и пленок фосфатидилхолинов при низких температурах.

Материалы и методы проведения исследований (глава 2). В работе для приготовления липосом использовался лецитин-стандарт (Ь-а-фосфатидилхолин из яичного желтка марки "ч"), представляющий собой 10+0.5 % раствор лецитина высокой степени очистки в абсолютированном спирте. Содержание основного вещества - лецитина - в образце не менее 90%. В экспериментах с липосомами, содержащими в липидном бислое акцептор, использовался ионол (2.6-ди-третбутил-4-метилфенол) марки "ч", прошедший дополнительную очистку методом возгонки в вакууме. Применяемые для проведения аналитических, хроматографических, дозиметрических и радиационно-химических экспериментов реактивы имели марку не ниже "хч".

Для приготовления дисперсии липосом в круглодонную колбу вносили аликвотный объем спиртового раствора лецитина (примерно 10 мл). Колбу с раствором присоединяли к вакуумной установке. Удаление растворителя проводили до тех пор, пока масса колбы с лиофилизируемым лецитином не становилась постоянной при повторных взвешиваниях на аналитических весах. В ряде экспериментов в липидный бислой липосом вводили акцептор (акцептор вносили в колбу с лецитином в виде спиртового раствора). Затем в колбу добавляли либо бидистиллированнуго воду, либо водный раствор акцептора с заданной концентрацией (в зависимости от цели эксперимента), так чтобы концентрация лецитина в водной фазе составляла 48 мг/мл. Гидратацию проводили до полного перехода липида в водную фазу. Полученную дисперсию переносили в ячейку для последующей обработки ультразвуком (установка УЗДН-2Т работающая в кавитационном режиме с частотой 22±1.65 кГц, поглощенная мощность в озвучиваемой ячейке составляла 1.72.4 Вт/смЗ, объем обрабатываемой водно-лецитиновой смеси в ячейке 20±1.5 мл). После "озвучивания" дисперсию липосом подвергали

центрифугированию (15-20 мин. с угловой частотой вращения 5000 - 8000 об./мин, 2500-6400£) и разбавляли до нужной в последующих экспериментах концентрации. Хранили полученные таким образом дисперсии в темноте при 4°С (в холодильной камере). Непосредственно перед облучением в полученных

дисперсиях определяли методом турбидиметрии (снятия спектра мутности) средний размер липосом (размер определяли из расчета поперечника рассеяния по модифицированным уравнениям Ми).

Образцы водных дисперсий липосом как с включенным в их липидный бислой акцептором, так и пустые облучали на у-установке РЦ-100М с источниками ^Со с варьируемой мощностью дозы (диапазон от 10 до 130 Гр/мин) в барботажном (кислородом воздуха или закисью азота), дезаэрированом и низкотемпературном (в сосуде Дьюара с жидким азотом) режимах. Дозиметрию проводили ферросульфатным дозиметром Фрикке.

Анализ содержания акцептора и продуктов его превращения проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографах "Милихром" и "GILSON" (использовались колонки - С]8, элюенты - этанол-вода или ацетонитрил-этанол-вода). Наличие спектрофотометрического детектора позволяло записать ультрафиолетовый спектр вещества в момент прохождения его через кювету. За образованием продуктов деградации лецитина в дисперсии липосом следили химическими и физико-химическими методами (по реакции с 2-тиобарбитуровой, определению количества диеновых коньюгатов, определению индекса окисления лецитина, и измерению рН).

Для исследования образования и превращения радикалов в облученных (при температуре 77К) образцах использовался радиоспектрометр ЭПР-В (резонатор цилиндрического типа Нои, рабочая частота 9300 МГц, частота модуляции магнитного поля 100 кГц).

Радиолиз дисперсий липосом (глава 3). При воздействии ионизирующего излучения на водную фазу дисперсной системы в ней протекают процессы с образованием следующих основных радиолитических частиц:

Н20 H* OH-, eaq-, НО*2/02?, Н2, Н202, Н^, ОН^ , (1)

из которых наиболее важными из-за высоких радиационно-химических выходов образования и высокой реакционной способности являются: ОН", eaq", H* и радикалы НО*2/02? для систем, насыщенных 02. Для оценки вклада радикалов ОН* и НО*2/02! в радиационно-химические процессы в липосомальных дисперсиях в работе были исследованы четыре дисперсные системы, в которых качественный и количественный состав радикалов в среде

достигался варьированием насыщающего газа и водорастворимых акцепторов (ОН* и Н* - водная фаза насыщена М20; Н0*2/02! - водная фаза насыщена кислородом воздуха и содержит этанол; ОН* и Н02/02! - водная фаза насыщена кислородом воздуха; ОН*, Н* и ещ - дезаэрированная система).

Из экспериментальных данных следует, что в содержащих кислород системах процессы деструкции происходят более глубоко, чем в дезаэрированых и насыщенных закисью азота системах. Так, при измерении рН (рис.1) облученных в различных условиях дисперсий с одинаковыми концентрациями липидной фазы выход на плато кривых зависимостей (рН-доза) для аэрированных систем происходит при более низких значениях рН. Такой эффект для кислородсодержащих систем можно объяснить либо образованием новых карбонильных соединений при перекисном окислении липосом, либо разрывом сложноэфирных связей с образованием фосфорной кислоты или ее органических производных. Так, величина рКа для большинства алифатических карбоновых кислот имеет значение около 4.7±0.2, рКа', для Следовательно (анализируя данные по рКа), в малоновой кислоты - 2.75 (для большинства дикарбоновых кислот, за исключением щавелевой и малоновой, рКа1 находится в интервале 4.2-4.5), рКа1 для фосфорной кислоты -2.12, а для глицерол-2-фосфата - 1.33. дезаэрированных системах процессы радиолиза инициируют гидролиз сложноэфирных связей карбоновых кислот и не инициируют гидролиз фосфорно-эфирной связи, что видно из зависимостей рН - поглощенная доза. Радиационно-химический выход карбоновых кислот, оцененный по зависимости рН - поглощенная доза и рКа = 4.7, для дезаэрированных систем имеет значение ~0.1 молек/ЮОэВ. Присутствие акцептора в липидном бислое липосом снижает выход образования продуктов, дающих кислую реакцию. Так, по сравнению с дисперсией пустых липосом в нагруженных акцептором дисперсиях концентрация ионов водорода стремится к величине (выходит на плато рН) 4.5 - 4.2, что приближается к значениям рН для дезаэрированных систем и систем, насыщенных закисью азота. Принципиально отличаются и кривые изменения продуктов, дающих цветную реакцию с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные пробукты), с дозой для аэрированных и дезаэрированных систем (рис. 2). Так, для дезаэрированных систем и систем, насыщенных закисью азота, содержание таких продуктов линейно уменьшается с поглощенной дозой, в(-ТБК-активных продуктов)Ю.012 молек/ЮОэВ. Для кислородных систем кривая

ДкГр

Рис. 1. Изменение рН дисперсии липосом в зависимости от поглощенной дозы для разных систем: водная фаза дисперсии насыщена N20 (-•- без акцептора, + Со(ионола)=6»10'5 моль/Глщщда); дезаэрированная водная фаза (--■--без акцептора); водная фаза дисперсии насыщена воздухом (—о--без акцептора, х С0(ионола)=2.5• 10^ моль/г,ПИ1ТИда); водная фаза дисперсии содержит этанол (0.2 моль/л) и одновременно насыщена воздухом (-Д- без акцептора, Ж Со(ионола)=2.5« 1моль/Глищщ,).

с,

нмоль/(мг лип.)

ДкГр

Рис. 2. Изменение количества продуктов, дающих цветную реакцию с 2-тиобарбитуровой кислотой, в дисперсии липосом в зависимости от поглощенной дозы для разных систем (1-без акцептора, 2-е акцептором в липидном бислое): -•- водная фаза дисперсии насыщена N20; -о- водная фаза дисперсии насыщена воздухом; -Д- водная фаза дисперсии содержит этанол (0.2 моль/л) и одновременно насыщена воздухом; — ■— дезаэрированная водная фаза.

имеет нелинейный характер с максимумом в интервале доз 2-3 кГр. <3(ТБК-активных продуктов) для аэрированных систем составил 0.026 молек./100эВ. В случае присутствия акцептора в липвдном бислое для систем, насыщенных закисью азота, количество ТБК-активных продуктов не изменялось в пределах ошибки опыта, а в аэрированных системах наблюдали линейное увеличение ТБК-активных продуктов с увеличением поглощенной системой дозы, 0(ТБК-продукгов) для аэрированных кислородом воздуха систем составлял 0.007±0.002 молек./100эВ и 0.0032+0.0012 молекЛООэВ, что в 3-7 раз меньше, чем для дисперсии без акцептора при тех же условиях.

Схема превращений молекул фосфатидилхолина в неполярной (углеводородной) области липидного бислоя липосом.

-СН=СН-СН2--сн=сн-сн2-сн=сн-1-н I

(СН^-СН-^СН)'-

Аэрированные условия

1 + о,

оо*

-сн-сн=сн-

оо*

-сн=сн-сн-

оо*

-сн-сн=сн-сн=сн-ОСГ

-сн=сн-сн=сн-сн-оо*

-сн=сн-сн-сн=сн-

I +КН

Дезаэрированные условия кн'сн*)

ЩН)

-сн-сн=сн-

ВД)

I

-сн=сн-сн-

-сн-сн=сн-сн=сн-ЩН)

•сн=сн- сн-сн-сн-

Я(Н)

-сн=сн-сн-сн=сн-

сопряженные диены (диеновые коньюгаты)

оон

I

-сн-сн=сн-

оон

-сн=сн-сн-

оон

I

-сн-сн—сн-сн°=сн-

оон

I

-сн=сн-сн=сн-сн-оон

I

-сн=сн-сн-сн=сн-

согфяжекные диены (диеновые коньюгаты)

Образование альдегидов и кислот

о-нш •сн4-сн=сн-

о о

II + II

•с-н в-с-сн2-

о о

II + и

-с-он но-с-сн2-

о—(-он

-сн-1-сн=сн- сн=сн-

о о

II + II

-с-н н-с-снг-сн=сн-

Образованне диальдегидов и кислот

о оог

н-с-сн2- сн=сн- сн2- —»

н-с-(сн = сн= сн)"-сн2-

н-с-сн2- (сн-сн-сн)'-

А

н-с-сн=сн-сн- сн 2-о оо*

II I

н-с-сн2-сн-сн=сн-

9 ?оР

н-с-сн2 -сн=сн-сн-

о оон н-с-ск-сн=сн-сп2-

о

II

оон

I

+ 1Ш н-с-сн=сн-сн-сн2-

о оон

н-с-сн2-сн-сн=сн-

о оон

II I

н-с-сн2 -сн-сн-сн-

о ii

н-с-С-н

о о II II н-с-сп2-с-н

о о

п ii

н-с-сн2-с-н

° 9

II II

н-с-сн2-сн2-с-н

о

н-с-сн2-сн2-

о

II

н-с-сн2-о

н-с-сн2-о

II

н-с-

Вместе с тем, изменений в дисперсионном спектре суспензии липосом после облучения разных систем в интервале доз до 10-11 кГр обнаружено не

было (рис.3), для более высоких поглощенных доз (свыше 11-13 кГр) потеря агрегативной устойчивости наблюдается только для систем, насыщенных кислородом воздуха.

Варьируя концентрацией ионола в липидном бислое и концентрацией липосом в дисперсии для аэрированных и дезаэрированных условий облучения, наблюдали за протеканием радиационно-химических процессов в липидном бислое по зависимостям расхода акцептора от поглощенной дисперсией дозы. Радикалы из водной фазы инициируют в липидном бислое химические реакции, ингибитором которых выступает ионол. В процессе ингибирования происходит разрушение ионола, причем при увеличении начальной концентрации акцептора в липидном бислое возрастает и величина его радиационно-химического разложения (рис. 4). Для дезаэрированных систем рост величины С(-ионол) от начальной концентрации ионола в липидном бислое описывается линейной зависимостью для разных концентраций липосом в дисперсии, вплоть до максимальной концентрации ионола 2.6*10"4 моль/гЛИ11ИЛа, а для аэрированных систем пропорциональная зависимость наблюдалась только на начальном участке кривой.

Качественно показано, что набор продуктов превращения ионола зависит от условий облучения дисперсной системы. Для систем, насыщенных закисью азота, характерно накопление "тяжелых" продуктов (результат взаимодействия феноксильных и лецитиновых радикалов). Для систем, насыщенных кислородом воздуха, наблюдается образование продукта, относящегося либо к производным 1,4-бензохинонов, либо к метиленхинонам (спектр поглощения с двумя максимумами 230 и 274 нм).

Поскольку химические процессы в липидном бислое инициируются радикалами, диффундирующими из объема водной фазы (имеющими различную реакционную способность как по отношению к молекулам липидного бислоя, так и по отношению к акцептирующим молекулам самой водной фазы), то вокруг липосомы должна существовать область, из которой эти радикалы способны достичь поверхности липидного бислоя. Для математического описания таких процессов возможно применение представлений, развитых в диффузионно-кинетической модели (процессы диффузии радиолитических частиц подчиняются законам Фика, а их химические взаимодействия - кинетическим уравнениям различного порядка).

г, им

0-1-,-,---,---,-__,-,

0 5 10 15 20 25 30

О, кГр

Рис. 3. Зависимость среднего размера липосом в дисперсии от поглощенной системой дозы; -о- водная фаза дисперсии насыщена воздухом; -•- водная фаза дисперсии насыщена N20; -х- дезаэрированная водная фаза.

СК-ионол), мо лек/1 ООэВ

С(ионола), ммоль/г(липида)

Рис. 4. Зависимость радиационно-химического расхода ионола, включенного в липидный бимолекулярный слой липосом, от его концентрации для разных концентраций липосом в дисперсии (каждая точка - результат усреднения по 3-5 измерениям). Для систем насыщенных К20 (-•-Сжц.=4.8± 0.5 мг/мл, -■-Слец.=2.4+ 0.3 мг/мл, -Ж-Слса=1.2± 0.1 мг/мл). Для аэрированных систем (-о- СЛеЦ=4.8± 0.5 мг/мл, -Р- (^-2.4+ 0.3 мг/мл).

Общий вид такого уравнения для процессов с участием ¡-ой радиолитической частицы следующий:

яр

= цу2С, + ^ - к,С,С, (2)

5/

Здесь Б, - эффективный коэффициент диффузии частицы в среде (сумма коэффициентов диффузии 1-ой радиолитической частицы и акцептирующей молекулы), Р«С - скорость генерации ¡-ой радиолитической частицы (для водной фазы), в - радиационно-химический выход образования 1-ой радиолитической частицы, Р - мощность поглощенной дозы, к, - константа скорости химической реакции взаимодействия радиолитических частиц и акцептирующих молекул, С5 - концентрация акцептирующих молекул. Решение данного дифференциального уравнения в приближении метода стационарных концентраций дает выражение концентрационного профиля радиолитических частиц для трех областей:

- внутривезикулярногоядра С'(г) = — (е ^ (3)

Ь,г Ь,

- липидного бислоя

С"(г) = ~(А3е^ +А,е внутренний полярный слой, (4)

Сш(г) = -(А5е^~^ + А6е неполярный жирнокислотный слой, (5)

г

Ср/(г) = -(А7е^_4" +А,е внешний полярный слой, (6)

г

- внешней водной фазы Су(г) = ^-е (8)

Ь5г Ь5

где А2 - Аю - постоянные, определяемые из условий неразрывности потоков и

вР

концентрации радиолитических частиц на границах раздела слоев, ап = —

и

" о„

Полученная математическая модель, описывающая стационарные профили концентраций активных радиолитических частиц (в приближении однорадикальной модели), позволяет определить:

- размеры областей сбора радиолитических частиц вокруг липосом (экспериментальная проверка расчета размера областей сбора радикалов

показала, что полученные данные совпадают в удовлетворительных пределах);

- критическую концентрацию липосом (с известным средним размером), при которой суммарный объем областей сбора радикалов равен объему водной фазы;

- стационарную концентрацию радиолитических частиц в любой точке липидного бислоя, внутривезикулярного ядра и водной фазы окружающей липосому;

- максимальную скорость инициирования радиолитическими частицами радикалов в объеме липидного бислоя;

- глубину проникновения активных радиолитических частиц в объем липидного бислоя.

Из анализа экспериментальных результатов (накопления продуктов деградации липидов в присутствии и отсутствии ионола, продуктов превращения самого ионола) и математического моделирования диффузионно-кинетических процессов поведения радиолитических частиц (концентрационные профили активных частиц в липидном бислое) следует, что дезаэрированные системы должны принципиально отличаться от аэрированных по механизму инициирования химических процессов в липидном бислое. В системах с участием ОН* и Н* радикалов инициирование химических процессов идет через стадию образования лецитиновых радикалов с радикальным центром в области полярной части молекул с последующим их распространением (возможно, по механизму миграции радикального центра или латеральной и трансбислойной диффузии) в неполярную область, а для систем с участием НО^/Ог*, по всей видимости, процессы взаимодействия НО*2/Огг с молекулами лецитина протекают в объеме неполярной (гидрофобной) области липидного бислоя.

Для изучения процессов образования и превращения радикалов в липидном бислое использовали замороженные дисперсии липосом с введенным акцептором радикалов. Облучение замороженной (77К) водной дисперсии липосом с включенным в бислой акцептором (ионолом) приводило к образованию и накоплению набора радикалов. Анализ суммарного спектра путем разложения его на спектры отдельных радикалов (разложение проводили на основе экспериментальных данных о параметрах спектров ЭПР радикалов, полученных при радиолизе отдельных компонентов дисперсии) показал, что

основными парамагнитными частицами в замороженной и облученной дисперсии являются: гидроксилыше радикалы (локализованные, по-видимому, в объеме кристаллической водной фазы), феноксильные радикалы (локализованные в липидном бислое) и радикалы из лецитина (также локализованные в липидном бислое). Для замороженной водной дисперсии лецитиновых липосом с ионолом (соотношение концентраций вода/лецитин/ионол 176:18:1) начальные радиационно-химические выходы радикалов составляют 0.65 (гидроксильные), 0.1 (лецитиновые), 0.6 (феноксильные) радикала/1 ООэВ, а при пересчете на единицу массы компонента - 0.7,1.1 и 110 радикала/1 ООэВ соответственно. Непропорционально большое, в сравнении с содержанием акцептора, накопление феноксильных радикалов от дозы при облучении многокомпонентных систем указывает на протекание вторичных реакций. Поскольку при температуре 77К подвижными в замороженной матрице остаются, в основном, атомы водорода и электроны (непосредственный вклад электронов в разложение ионола и лецитина, по-видимому, мал, так как СКе"^) при 77 К составляет 10"3 -10*4 электронов/1 ООэВ), то, вероятно, увеличение радиационно-химических выходов образования радикалов из акцептора и, в меньшей степени, из лецитина связано с химическими реакциями молекул этих веществ с атомами водорода.

Другой, не менее интересный аспект, связанный с исследованием образовавшихся при низкотемпературном радиолизе радикалов, - это их эстафетное взаимодействие (за счет тепловой, а возможно, в ряде случаев и химической диффузии радикалов) от образовавшихся в объеме водной фазы радикалов к молекулам липидной матрицы и включенного в липидный бислой акцептора (рис.5). В области массовой гибели ОН* радикалов (диапазон температур 90-110К) наблюдается очевидный подъем количества "лецитиновых" радикалов (максимум в области 105-115К). В свою очередь, массовая гибель "лецитиновых" радикалов (температурный диапазон 110-130К) приводит к заметному возрастанию концентрации феноксильных радикалов при тех же температурах. Таким образом, рисунок 5 демонстрирует взаимодействие ОН* радикалов, образовавшихся в водной фазе, с бислойной липидной матрицей с образованием лецитиновых радикалов, которые, в свою очередь, взаимодействуют в бислое с акцептором с эффективностью не менее 30%. Можно предположить, что аналогичные процессы эстафетного взаимодействия (ОН* "лецитиновые" радикалы

"акцепторные" радикалы) должны происходить и при жидкофазном радиолизе систем - лецитиновых дисперсий.

Кинетическая модель реакций в липидном бислое липосом (глава 4). Процесс разрушения акцептора, включенного в липидный бимолекулярный слой липосом, можно представить в виде схемы, в которой радиолитические частицы, взаимодействуя с поверхностью липидного бислоя липосом, генерируют в ходе химической реакции набор лецитиновых радикалов:

Lee—R*-> Lee* W*",-,,, (9)

где W¡n - скорость генерации образующихся i-x лецитиновых радикалов, моль/(лЛШ1ВДас). В том случае, если липидный бислой липосом содержит неселективный акцептор, хорошо растворимый в углеводородах и нерастворимый в воде, "гибель" Лецитиновых радикалов может осуществляться по следующей схеме:

Lee,' + Ас Ас' (10)

Lec¡* + Lee,* продукты к® (11)

Lec¡* + Ас* продукты A3W (12)

Для случая избирательной реакционной способности радиолитических частиц с молекулами лецитина (реакция НО*2/Огг радикалов с ненасыщенными двойными связями в неполярной зоне бислоя) возможна реакция:

НО'2/Or+Lec -»LecOO" W^T"' (13)

В присутствии кислорода

Lec¡* + 02 LecOO* к0 (14)

г LecOO* + Lee -> LecOOH + Lee* К (15)

2LecOO* -> молекулярные продукты (16)

- LecOO* + Lee* -> молекулярные продукты h (17)

LecOO* + Ас —) LecOOH + Ас* ^ính (18)

LecOO* + Ac* -» молекулярные продукты h (19)

Ас* + Ас* -» продукты к* (20)

Записав дифференциальные уравнения, описывающие расход акцептора и накопление радикалов в липидном бислое для случаев аэрированных и дезаэрированных систем, и решив их в приближении метода стационарных концентраций по радикалам, получим уравнение, описывающее расход

10-18 радикалов/г

300

350

Рис. 5. Кривые термической гибели радикалов (система: вода/лецитин/ионол); -•- общее количество радикалов; -□- ОН* радикалы;-А- феноксильные радикалы;-О- радикалы из лецитина.

Р, ММОЛыХЛдшшиС)

2

1,5 -I 1

0,5

0

-1--1-1 I I-т-1---—-1 Ш-Г-

2 3 4 5 6 7 С(лецитина), мг/мл

10

Рис, 6. Изменение величины параметра р (скорость инициирования радикалов в объеме липидного бислоя) от концентрации липосом в дисперсии. Параметр р определен из экспериментальных зависимостей по уравнению (21) (• - водная фаза дисперсии насыщена ИгО; □ - водная фаза дисперсии насыщена воздухом; водная фаза дисперсии содержит этанол и одновременно насыщена воздухом). Кривая рассчитала по диффузионно-

кинетической модели (— для систем насыщенных N20;___для кислородной системы с

этанолом).

акцептора при облучении дисперсии липосом:

, [Ас],-[Ас], Р

а[Ас]02+р

°Ф

а[Ас]2 + р ^ сф2

ар

1п

[Ас10(#+Уа[Ас]2+р)

(21)

где [Ас]о, [Ас] - начальная и текущая концентрация акцептора, ^Ш1 - время облучения дисперсии.

к

система параметры

водная фаза насыщена N20 (радикалы ОН* и Н*) а = — 2 к2 Р = ™го

водная фаза насыщена кислородом воздуха и содержит этанол (радикалы Н0*2/021) • к шь а =- 8 к, Р = Щп°ШС

водная фаза насыщена кислородом воздуха (радикалы ОН* и НО'г/Ог1) • к шь а =- 8*.

Обработка массива экспериментальных данных о расходе акцептора от поглощенной дозы методом наименьших квадратов для дезаэрированной системы (водная фаза содержит ИгО) показала, что основные значения параметра а (примерно 60 % рассчетных значений) находятся в интервале от 5*10'4 до 1.5*10"3 л/(моль.с) с максимумом при 1 • 10"3 л/(моль.с), а величина параметра |3 зависит от концентрации липосом в дисперсии и увеличивается с 1.7*10"4 до 1.85*10'3 моль/(ллипвда с) при уменьшении концентрации с 4.8 до 0.5 мг/мл (рис.6). В экспериментах с аэрированными системами, содержащими в водной фазе этанол, параметр а' ~1-И0 л/(моль с), а величина параметра р, так же как и для дезаэрированной системы, зависит от концентрации липосом в дисперсии и увеличивается с 0.4'Ю"4 до 1.9*10"4 моль/(л липида с) при уменьшении концентрации с 8.6 до 1.2 мг/мл. Из вычисленного параметра а'

к2 к2

возможно оценить величину (тг- = 4а , в результате получим 4-

2к, 2«,

40 л/(моль.с)). Для чисто аэрированных условий (в инициировании процессов в липидном бислое принимают участие ОН* и Н0*2/02! радикалы) параметр а' ~ 1-И0 л/(моль с), а величина параметра Р, так же как для дезаэрированной и аэрированной системы с этанолом, зависит от концентрации липосом в дисперсии и увеличивается с 0.7*10"4 до 4.9*10"4 моль/(лЛИпида с) при уменьшении концентрации с 9.6 до 0.6 мг/мл.

Выражение (21) является инвариантным по отношению к описанию систем как в аэрированных, так и в дезаэрированных условиях, поэтому, представив его следующим образом:

№

аг1

Р \ Р

с01 Р

+ 1-

аг1

+1

+ 1п

1 + .—+1

у

(22),

возможно оценить зависимости расхода акцептора (20 тл X - начальная и текущая концентрации акцептора в липидном бислое, мояь/ллипида) от

поглощенной дозы при разных значениях (этот параметр будет определять

Р

вид зависимости). Численное моделирование (варьирование параметрами а, ¡3 и

0&} 2

X) показало, что в случае, когда 10 , соотношение упрощается до вида 1 = 2(2°'г) (или 2 = 2й ---В), а при Щг- Ю"3 соотношение принимает вид

Р

2Р

Р

~Jo.pt з рУ?" 2

-¿ое ■ В промежуточном интервале 10' < -< 10 все три

Р

составляющие (линейная, корневая и логарифмическая) вносят ощутимый

вклад и не могут быть упрощены. Для случая, когда дисперсия липосом

насыщена И20 (а ~ 10~3 л/(моль с), р ~10"3 - 10"4 моль/(ллипвда с), [Ас] ~ 0.03 -

ей2 з

0.25 моль/ллшщда), параметр -^-принимает значения от 1 до 10", что

соответствует случаю, когда в расчетах невозможно пренебречь ни одной из составляющих. Для случая с аэрированной системой (а ~ 1-10 л/(моль с), р ~10"3 - 10"4 моль/(ллшшда с), [Ас] ~ 0.03 - 0.25 моль/ллипида) параметр

— принимает значения от 1 до 104, что дает возможность использовать

Р

соотношение:

0 2Р

(23)

для высоких концентраций акцептора ~ 0.25 моль/л1ИГШ;и и низких величин скоростей инициирования ~10"4 моль/(лЛШ1Ида с). В этом случае радиационно-химический расход акцептора в будет определяться соотношением р/2Р.

Из анализа кинетических схем как для аэрированных, так и дезаэрированных систем видно, что скорость инициирования радикалов в липидном бислое играет ключевую роль в радиационно-химических процессах. Снижение скорости инициирования приводит к увеличению разрушения акцептора в липидном бислое, что с точки зрения защиты самого липидного бислоя является благоприятным фактором, увеличивающим его агрегативную устойчивость. Введение в дисперсию водорастворимых акцепторов (например глюкозы, диметилсульфоксида и т.д.) приводит к конкуренции реакций радиолитических частиц, генерируемых в объеме водной фазы, с липосомами и растворимыми молекулами акцептора, что влияет в конечном итоге на скорость инициирования (уменьшение области сбора радикалов вокруг поверхности липосомы). Таким образом, подбирая тип водорастворимого акцептора и варьируя его концентрацию (с одновременным использованием акцептора в липидном бислое), возможно ингибировать процессы разрушения липидного бислоя и агрегации липосом, что приведет к повышению устойчивости дисперсии при облучении и возможности применения для дисперсий метода радиационной стерилизации.

Выводы

1. Установлено, что разрушение липидного бислоя и потеря агрегативной устойчивости дисперсии липосом определяется радиационно-химическими процессами, протекающими в водной фазе липосом (косвенное действие

t излучения). Глубина разрушения структуры липидного бислоя зависит от

качественного и количественного состава активных радиолитических частиц, генерируемых излучением в объеме водной фазы, который определяется условиями облучения (ОН* и Н* - водная фаза насыщена К20; НО*2/02! - водная фаза кислородом воздуха и содержит этанол; ОН" и Н0*2/024 - водная фаза насыщена кислородом воздуха; ОН*, Н" и е'ч • дезаэрированная система). Показано, что для систем с разным качественным и количественным составом радиолитических радикалов в зависимости от концентрации дисперсной фазы можно иметь различные соотношения скоростей протекания объемных и поверхностных химических реакций.

2. Определены зависимости образования продуктов деградации молекул фосфатидилхолина (ТБК-активных продуктов, продуктов, изменяющих рН

среды, диеновых коньюгатов), составляющих липидный бимолекулярный слой, в присутствии и отсутствии акцептора от поглощенной дисперсией дозы для систем с разным качественным и количественным составом активных частиц. Для аэрированных и дезаэрированных систем процессы накопления продуктов деградации молекул фосфатидилхолина существенно различаются. Включение в бислой акцептора в аэрированных и дезаэрированных систем дает разные продукты превращения, тормозя процесс деградации молекул фосфатидилхолина. Для аэрированных систем достигается снижение деградации молекул фосфатидилхолина в присутствии акцептора в 3-7 раз, при этом средний размер липосом в дисперсии при ее облучении дозами до 8-12 кГр остается неизменным. Введение в водную фазу дисперсии дополнительного акцептора значительно снижает разложение акцептора, локализованного в липидном бислое.

3. Установлено, что наиболее активные радикалы, инициирующие реакции внутри липидного бислоя (в неполярной углеводородной зоне), - НО*2/02! (для аэрированных систем), а в полярной зоне - ОН" (как для аэрированных, так и для дезаэрированных систем).

4. Построена математическая модель, описывающая распределение профиля концентраций радиолитических частиц по объему дисперсной фазы, липидного бислоя и внутривезикулярного ядра. Модель дает возможность рассчитать эффективные области сбора активных радиолитических частиц, образующихся в объеме водной фаз, для различных дисперсных систем. Результаты расчета удовлетворительно согласуются с экспериментальными результатами, полученными для системы, насыщенной закисью азота, и для аэрированных систем, для липосом с радиусом ~45-50 нм. В рамках модели объясняются полученные экспериментальные результаты.

5. Установлено в исследованиях по низкотемпературному радиолизу (77 К) лецитиновых дисперсий с включенным в липидный бислой липосом ионолом, что ионол эффективно акцептирует радикалы, дошедшие до поверхности липидного бислоя из объема водной фазы (подвижные при 77К атомы водорода играли важную роль в образовании феноксильных радикалов). При разогреве облученных образцов наблюдали процессы эстафетного взаимодействия ОН" радикалов с акцептором (ионолом) через промежуточную стадию образования "лецитиновых" радикалов.

6. Определено на основе кинетического анализа основной схемы радиолиза молекул липидного бислоя соотношение констант скоростей ингибирования к квадратичной гибели для аэрированной и дезаэрированной систем и кинетических параметров (скорости инициирования радикалов в липидном бислое). На основе экспериментальных данных и математического моделирования (модель является инвариантной и описывает поведение систем как в аэрированных, так и в дезаэрированных условиях) предложена схема защиты липосом в дисперсии от радиационного повреждения путем введения акцепторов в водную и липидную фазы.

Основной материал диссертации изложен в следующих работах:

1. Парамонов Д.В., Антонова Е.А., Бугаенко JI. Т., Трофимов В.И., Бяков В.М. Радиолиз 2,6-ди-трет-бутил-4-метил-фенола (ионола) в липидной мембране в присутствии кислорода. // Менделеевские сообщения, Mendeleev Communication. -1998. -№ 1 -С. 32-34.

2. Парамонов Д.В., Трофимов В.И., Антонова Е.А., Бугаенко Л.Т., Бяков В.М. Радиационное разрушение ионола в водной суспензии липосом в присутствии кислорода. // Химия высоких энергий. -1998. -Т. 32. -№ 4. -С. 255-259.

3. Антонова Е.А., Парамонов Д.В. Радиационно-химические превращения 2,6-ди-трет-бутил-4-метил-фенола в водных суспензиях липосом. // Вестник МГУ. -Сер. 2. (Химия). 1999. -Т.40. -№4. -С. 283-286.

4. Бяков В.М., Бугаенко Л.Т., Антонова Е.А., Парамонов Д.В., Трофимов В.И. Кинетика радиационно-химических реакций в неоднородной коллоидной частице. // Химия высоких энергий. -2000. -Т. 34. -№ 6. -С. 411-415.

5. Парамонов Д.В., Трофимов В.И. рН-зависимое радиационно-химическое разложение ионола, включенного в липидный бислой лецитиновых липосом. // Химия высоких энергии. -2003. -Т. 37. -№ 2. -С. 159-160.

6. Парамонов Д.В., Трофимов В.И. Радиационно-химическое окисление молекул липидного бислоя лецитиновых липосом радиолитическими продуктами, образующимися при радиолизе водной дисперсии. // Химия высоких энергии. -2003. -Т. 37. -№ 2. -С. 115-119.

7. Парамонов Д.В., Трофимов В.И., Князев А.А. Исследование радикальных процессов при низкотемпературном радиолизе дисперсий липосом. // Химия высоких энергий. -2004. -Т. 38. -№ 2. -С. 113-119.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17 01.2006 г Формат 60x90 1/16. Уел печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 025. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

»-5500

О

Введение.

• 1. Обзор литературы.

1.1. Физико-химические свойства молекулярных компонентов, составляющих липосомы.

1.2. Получение и свойства липосом, структура липидного бислоя.

1.3. Температура фазового перехода в липидном бислое.

1.4. Латеральная диффузия, трансбислойное движение и проницаемость липидного бислоя.

1.5. Радиолиз фосфолипидов.

1.5.1. Радиолиз фосфолипидов в отсутствии кислорода.

1.5.2. Действие ионизирующего излучения на липиды и моделирующие их системы в присутствии кислорода.

1.5.3. Радикалы, образующиеся при облучении фосфолипидов.

1.5.4. Ингибирование процессов с участием радикалов в бимолекулярном слое фосфолипидов.

1.6. Выводы обзора и постановка задачи исследования.

2. Материалы и методы проведения исследований.

2.1. Материалы.

2.2. Приготовление образцов.

2.3. Обработка водно-лецитиновой гетерогенной системы ультразвуком ("озвучивание").

2.4. Центрифугирование.

2.5. Определение среднего размера частиц в дисперсии.

2.5.1. Спектры мутности.

2.5.2. Математическое описание спектров мутности.

2.5.3. Адекватность математического алгоритма расчета среднего размера частиц дисперсии липосом и экспериментальных данных.

2.6. Условия у-облучения образцов.

2.7. Методы анализа продуктов деградации лецитина в дисперсии липосом.

2.8. Жидкостная хроматография.

2.9. Радиоспектроскопические измерения.

3. Радиационно-химические исследования.

3.1. Радиационно-химические процессы, протекающие в дисперсии пустых липосом, и агрегативная устойчивость липосом при облучении.

3.2. Влияние концентрации липосом в дисперсии на радиационно-химические превращения в бислое.

3.3. Расчет профиля концентраций радиолитических частиц в приближении однорадикальной модели.

3.4. Радиационно-химические процессы, протекающие в липидном бислое липосом с включенным в него акцептором.

3.4.1. Превращения включенного в липидный бислой акцептора при облучении дисперсии, насыщенной закисью азота.

3.4.2. Превращения включенного в липидный бислой липосом акцептора при облучении дисперсии, содержащей этанол и насыщенной кислородом воздуха.

3.4.3. Превращение включенного в липидный бислой липосом акцептора при облучении дисперсии, насыщенной кислородом воздуха.

3.5. Радиационно-химические процессы, протекающие при низкотемпературном радиолизе дисперсий липосом.

4. Моделирование радиационно-химических процессов превращения молекул лецитина и акцептора в липидном бислое липосом.

Выводы.

Фосфолипиды (производные высших жирных кислот, относящиеся по классификации к сложным липидам) - природные органические соединения, нерастворимые в воде, но растворимые в жирорастворителях (этиловом и метиловом спиртах, бензоле, петролейном и серном эфирах, бензине, ацетоне, хлороформе, сероуглероде [1]) и обладающие амфифильными свойствами - образуют в воде и в водном растворе после гидратации гетерогенные бислойные водно-липидные системы с развитой границей раздела фаз липид-вода. Физическая или физико-химическая обработка (механическое встряхивание; воздействие ультразвуком; экструзия при повышенном давлении через узкое отверстие; инжекция в водную среду раствора фосфолипида в легколетучем растворителе; циклическое "замораживание-оттаивание" и др.) такой системы приводит к образованию замкнутых бислойных концентрических структур, имеющих форму, близкую к сферической. Такие структуры называются липосомами или фосфолипидными везикулами. Бимолекулярный слой липидов, составляющих оболочку липосом, - это структурообразующий элемент любой клетки, лежащий в основе всех биологических мембран (цитоплазматическая и ядерная мембраны; внутренние структуры: эндоплазматическая сеть, рибосомы, лизосомы, митохондрии, пластинчатый комплекс Гольджы, клеточный центр, микротрубочки, пластиды и т.д.) и выполняющий две основные функции: несущей матрицы для других компонентов биомембраны и разделительной границы для ионов и молекул.

В настоящее время в литературе, посвященной исследованию наносистем (липосомы, наночастицы, нанокапсулы), накоплен большой экспериментальный и теоретический материал по изучению свойств как самих липидных мембран, так и липосом (осмотической активности, проницаемости для органических и неорганических веществ через мембрану, структуры липосом и липидного бислоя, агрегативной устойчивости и т.д.), их поведению в организме, способам получения и методам включения различных веществ (органических, неорганических, биоорганических) и вирусов [2-9]. Липосомы могут различаться по химическому составу липидного бислоя (фосфолипиды разной природы или их смеси с добавлением других молекул), количеству бислоев в одной липосоме, физическим свойствам липидного матрикса (бислоя), размерам (от нескольких десятков до нескольких тысяч нанометров), дисперсному распределению, способам получения и другим характеристикам. В связи с этим интерес к липосомам многогранен. В частности, липосомы, имеющие высокую биосовместимость, являются одной из перспективных форм направленной доставки лекарственных препаратов в органы-мишени [2]. Известно большое количество фармакологически активных веществ, включаемых как в сам липидный бислой липосом, так и во внутривезикулярный объем [3,7,9]. В обзорной статье [10] обсуждаются вопросы получения, стерилизации и хранения липосомальных лекарственных форм. Активно развивается направление, связанное с использованием липосом в косметической индустрии. За последние десять лет только в России запатентовано более 180 изобретений по получению (способы получения липосомальных дисперсий цитостатиков, иммуномодуляторов [11, 12]) и использованию липосомальных форм в медицине (создание высокодозированных аэрозольных липосомальных композиций, содержащих противовоспалительные, противогрибковые, противовирусные и противораковые соединения [13, 14]) и ветеринарии (антибактериальное средство на основе эмульсии липосом с включенным антибиотиком для парентерального и перорального введения при лечении сельскохозяйственных животных и птиц [15]; создание вакцины против инфекционных заболеваний [16]), в научных исследованиях и косметологии (использование акцепторов радикалов, инкапсулированных в липосомы, для обработки кожи с целью защиты от света и для предотвращения старения и образования угрей [17]; предотвращение повреждений внутриклеточной ДНК живых клеток кожи [18]; косметическое средство для регенерации увядающей кожи [19]). Разработаны методы получения суспензий апирогенных, атоксичных липосом, содержащих лецитин и отрицательно заряженный компонент (смесь кислых фосфатидов, выделяемых из соевых бобов), которые стабильны при длительном хранении (сохранность размера и структуры в течение года) [20], или композиции содержащие фосфолипиды, целевые добавки и короткоцепные (длина цепи 5-8 углеродных атомов) жирные кислоты [21]. На сегодняшний день существуют как общие способы получения липосом с повышенной инкапсулирующей способностью [22], в которые можно включать даже микроорганизмы, клетки растений и животных, нерастворимые в воде структуры с биохимической и иммунологической активностью, катализаторы и плохо растворимые в воде лекарства [23], так и частные методы приготовления отдельных фармацевтических и косметических композиций на основе липосом [24-26]. Предлагаются способы уменьшения гемодинамических эффектов парентерально вводимого липосомального препарата [27], получения фармацевтических композиций с антиревматической активностью (на основе кетопорфена [28]), с биологически активными веществами (содержащие гидроксилированый пролин и/или лизин [29]), антибиотиками [30, 31], противолейкозными лекарственными препаратами (действующее начало цитарабин [32]), анальгетиками [33], антиоксидантами (а-токоферол [34]), белковыми препаратами (гемолитический фактор [35], эритропоэтин [36], противовирусное лекарственное средство для перорального введения на основе интерферона и витамина С [37]), препаратами содержащими фрагменты нуклеиновых кислот [38] и генные конструкции, кодирующие факторы роста [39]. Получены специфические средства доставки лекарственных препаратов против СПИДа и карцином на основе синтетических мембранных везикул, на поверхности которых находятся функционально активные к клеткам белки [40].

С другой стороны, дисперсии липосом интересны с точки зрения исследования протекания конкурирующих химических процессов под действием различных физических факторов и химических агентов (радиационно-химических, химических и биохимических) как внутри липидного бислоя, так и в объеме всей дисперсной системы. Исследованию радиационных процессов в системах, моделирующих клеточные мембраны, уделено, по нашему мнению, значительно меньше внимания. В литературе по радиационной химии липидов в основном обсуждается вопрос о их радиационном окислении [41-46]. В связи с этим представляет интерес изучение липидных липосом с точки зрения радиационной химии коллоидных систем (изучение влияния потоков активных частиц, образующихся при радиолизе воды, на липосомы; глубины проникновения активных частиц в липидную мембрану липосом; определение размера области вокруг липосомы, из которого она собирает активные частицы и т.д.).

Исследование радиационно-химических процессов в дисперсиях липосом важно для решения нескольких задач. Одна из таких задач - обеспечение надежной стерильности лекарственных форм и снижение микробной обсемененности косметических изделий, изготовленных на основе липосомальных носителей. Поскольку на сегодняшний день не существует ни одного универсального способа достижения стерильности для всего спектра лекарственных препаратов и материалов, вопросы разработки и оптимизации процесса стерилизации для отдельного лекарства или группы лекарств очень актуальны. Обеспечение стерильности липосомальных лекарственных препаратов возможно, в принципе, тремя методами: стерильной фильтрацией через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм [10]; тепловой стерилизацией с применением стабилизаторов, препятствующих разрушению липосом при обработке [47-49], или криорадиационным способом [50]. У каждого из этих способов существует ряд достоинств и недостатков. Стерильная фильтрация не требует протектора для защиты липосом, но ограничена невозможностью стерилизовать крупные липосомы с диаметром больше диаметра пор фильтра и сложностью реализации процесса по обеспечению высоконадежной стерильности в промышленных условиях. При реализации метода тепловой стерилизации требуется решить проблему, связанную с окислением липидов липосом при длительном нагревании до температуры 121 °С. Так, при нагревании дисперсии малых однобислойных липосом, полученных из лецитина соевых бобов, выше 40°С окисление происходит без индукционного периода и проходит как аутоокислительный процесс [51]. Одним из перспективных методов стерилизации и деконтаминации (частичного снижения микробного загрязнения) термолабильных препаратов являются радиационная обработка и комбинация радиационной обработки с другими видами физических воздействий (замораживание, ультразвук, нагрев, лазерная обработка, обработка высоким давлением и т. Д. [52]).

В настоящее время опубликовано большое количество статей и монографий по радиационной обработке соединений лекарственного (и иного) назначения. Основной задачей при такой обработке является обеспечение надежной стерильности, с одной стороны, и максимальной сохранности свойств препарата - с другой, то есть поиск оптимальных условий воздействия на сложные по химическому составу и фазовой структуте системы. Таким образом, исследование радиационно-химических процессов, происходящих при воздействии ионизирующих излучений на многокомпонентные системы, является достаточно сложной проблемой, решение которой дает возможность судить о практической применимости данного вида обработки и искать пути оптимизации процесса.

Другой не менее важной, интересной и малоизученной задачей является исследование кинетики гомо-гетерогенных реакций, протекающих в дисперсиях липосом. Возможность варьирования в достаточно широком диапазоне различных параметров, характеризующих состояние дисперсии липосом (температурный интервал; рН; ионная сила; размер липосом; химический состав как самого липидного бислоя, так и внутривезикулярного объема), без потери способности фосфолипидов образовывать замкнутые бислойные везикулы дает ценнейший инструмент для исследования процессов кинетики в гетерогенных системах. Результаты исследований в этой области могут быть полезны и для понимания процессов, протекающих в живых объектах при любом воздействии, приводящем к появлению активных промежуточных продуктов. Радиобиологические эффекты, приводящие к гибели живых организмов, связаны с воздействием ионизирующего излучения (прямое и косвенное действие) на критические мишени клеток [53, 42]. Вклад косвенного действия излучения при радиационном поражении за счет генерации высокоактивных продуктов радиолиза водной среды внутри клетки составляет, по разным оценкам, от 25 до 80-90% при содержание воды в клетках и тканях живых организмов примерно 70-80 % от общей массы. Существует основанная на экспериментальном материале точка зрения, что наряду с ДНК мембраны клеток также являются критическими мишенями действия излучения [53,54]. Радиационноиндуцированные изменения в клеточных мембранах вызывают серьезные изменения многих жизненно важных процессов, что приводит в конечном итоге к гибели клетки при дозах, превышающих определенный предел. Конкретная же роль тех или иных химически активных продуктов радиолиза воды (ионов, возбужденных молекул, активных радикалов) в механизме разрушения клеточных мембран остается неясной. Поскольку структура, химический состав, толщина, проницаемость клеточных мембран для клеток разной природы и дифференцировки различны, для изучения реальных клеточных систем необходимо предварительно провести исследования на моделирующих их объектах.

На основе анализа экспериментального и теоретического материала по исследованию наносистем для решения перечисленных вопросов была выбрана модельная система на основе лецитиновых липосом контролируемого среднего размера с включенным акцептором. На выбор данной модели оказало влияние то, что, во-первых, в процессе приготовления дисперсии лецитиновых липосом возможно варьирование их размеров путем изменения времени "озвучивания"; во-вторых, возможно включение молекул различной природы (селективные и неселективные акцепторы радикалов, антиоксиданты, белковые молекулы, витамины и т. д.) как в везикулярный объем, так и в стенку липосомы и использование одновременно нескольких акцепторов радикалов; в-третьих, липидные липосомы являются принятыми моделями биологических систем, поэтому полученные результаты по изучению радиационных процессов можно использовать в дальнейшем в радиобиологии.

Настоящая работа состоит из четырех глав. Первая глава посвящена описанию имеющихся в литературе данных о физико-химических свойствах природных и синтетических лецитинов, их способности образовывать липидные бислойные структуры, о свойствах самих бислоев и о радиационно-химических процессах в лецитинах. Во второй главе описаны методы проведения экспериментов. В третьей главе представлены результаты собственных исследований радиационно-химических процессов в дисперсиях липосом. Четвертая глава посвящена теоретическому моделированию процессов в липидном бислое и способам повышения устойчивости дисперсии липосом при облучении.

1. Обзор литературы.

На химические процессы, протекающие в липидном бислое, будет оказывать влияние физико-химическое состояние самого липидного бислоя, зависящее от многих параметров. Так, к примеру, толщина липидного бислоя будет определяться длиной углеводородных цепей лецитиновых молекул, степенью гидратации, средой, в которой находится липидный бислой. Подвижность молекул, входящих в сам липидный бислой, также является многопараметрической функцией, зависящей и от степени ненасыщенности углеводородных цепей самих молекул лецитина, и от присутствия молекул включения (например - холестерин) и т.д. Поэтому прежде, чем рассматривать химические процессы в бимолекулярном слое, охарактеризуем сам бимолекулярный слой.

Выводы

1. Установлено, что разрушение липидного бислоя и потеря агрегативной устойчивости дисперсии липосом определяется радиационно-химическими процессами, протекающими в водной фазе липосом (косвенное действие излучения). Глубина разрушения структуры липидного бислоя зависит от качественного и количественного состава активных радиолитических частиц, генерируемых излучением в объеме водной фазы, который определяется условиями облучения (ОН* и Н* - водная фаза насыщена N20; НО^/Ог* водная фаза насыщена кислородом воздуха и содержит этанол; ОН* и НО*2/02! водная фаза насыщена кислородом воздуха; ОН*, Н* и e"aq - дезаэрированная система). Показано, что для систем с разным качественным и количественным составом радиолитических радикалов в зависимости от концентрации дисперсной фазы можно иметь различные соотношения скоростей протекания объемных и поверхностных химических реакций.

2. Определены зависимости образования продуктов деградации молекул фосфатидилхолина (ТБК-активных продуктов, продуктов, изменяющих рН среды, диеновых коньюгатов), составляющих липидный бимолекулярный слой, в присутствии и отсутствии акцептора от поглощенной дисперсией дозы для систем с разным качественным и количественным составом активных частиц. Для аэрированных и дезаэрированных систем процессы накопления продуктов деградации молекул фосфатидилхолина существенно различаются. Включение в бислой акцептора в аэрированных и дезаэрированных систем дает разные продукты превращения, тормозя процесс деградации молекул фосфатидилхолина. Для аэрированных систем достигается снижение деградации молекул фосфатидилхолина в присутствии акцептора в 3-7 раз, при этом средний размер липосом в дисперсии при ее облучении дозами до 8-12 кГр остается неизменным. Введение в водную фазу дисперсии дополнительного акцептора значительно снижает разложение акцептора, локализованного в липидном бислое.

3. Установлено, что наиболее активные радикалы, инициирующие реакции внутри липидного бислоя (в неполярной углеводородной зоне), - НО*2/Огг (для аэрированных систем), а в полярной зоне - ОН* (как для аэрированных, так и для дезаэрированных систем).

4. Построена математическая модель, описывающая распределение профиля концентраций радиолитических частиц по объему дисперсной фазы, липидного бислоя и внутривезикулярного ядра. Модель дает возможность рассчитать эффективные области сбора активных радиолитических частиц, образующихся в объеме водной фаз, для различных дисперсных систем. Результаты расчета удовлетворительно согласуются с экспериментальными результатами, полученными для системы, насыщенной закисью азота, и для аэрированных систем, для липосом с радиусом ~45-50 нм. В рамках модели объясняются полученные экспериментальные результаты.

5. Установлено в исследованиях по низкотемпературному радиолизу (77 К) лецитиновых дисперсий с включенным в липидный бислой липосом ионолом, что ионол эффективно акцептирует радикалы, дошедшие до поверхности липидного бислоя из объема водной фазы (подвижные при 77К атомы водорода играли важную роль в образовании феноксильных радикалов). При разогреве облученных образцов наблюдали процессы эстафетного взаимодействия ОН* радикалов с акцептором (ионолом) через промежуточную стадию образования "лецитиновых" радикалов.

6. Определено на основе кинетического анализа основной схемы радиолиза молекул липидного бислоя соотношение констант скоростей ингибирования к квадратичной гибели для аэрированной и дезаэрированной систем и кинетических параметров (скорости инициирования радикалов в липидном бислое). На основе экспериментальных данных и математического моделирования (модель является инвариантной и описывает поведение систем как в аэрированных, так и в дезаэрированных условиях) предложена схема защиты липосом в дисперсии от радиационного повреждения путем введения акцепторов в водную и липидную фазы.

В заключении автор выражает глубокую благодарность: научному руководителю диссертационной работы доктору химических наук, профессору

Бугаенко Ленару Тимофеевичу! за руководство диссертационной работой и непосредственное участие в обсуждении полученных результатов; доктору химических наук, профессору Трофимову Владиславу Ивановичу за предложенное направление исследований, обеспечение экспериментального проведения работы и непосредственное участие в обсуждении полученных результатов; кандидату химических наук Антоновой Елене Александровне - за поддержку в работе, многочисленные полезные советы и самое непосредственное участие в обсуждении результатов; кандидату физико-математических наук Михалеву Олегу Ивановичу и аспиранту Князеву А.А. - за содействие и методическую помощь в проведении экспериментов при низких температурах; автор искренне признателен сотрудникам лаборатории физических методов обработки биопрепаратов НТЦ "Лекбиотех" и лаборатории радиационной химии химического факультета МГУ - за чуткое отношение, внимание и помощь в работе.

1. Леиииджер А. Л. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки. Пер. с англ. М.: Мир. 1974. 957 стр.

2. Liposomes in biological systems //Ed. by G. Gregoriadis, A. C. Allison. Wiley, 1980. -P. 422.

3. Liposomes // Ed. by Marc J. Ostro. Ney York and Basel. 1983. - P. 397.

4. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. Серия Биологические и технические мембраны. М.: Наука. 1986. -240 с.

5. Геннис Р.Б. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Пер. с англ. М.: Мир. 1997. 622 стр.

6. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. М.: Наука. 1981. С. 293.

7. Liposome Technology. Ed. Gregoriadis G. Preparation of Liposomes. Florida: CRC Press, Inc. Boca Raton, 1989. V.l. P.268.1.corporation of Drugs, Proteins, and Genetic Material. Florida: CRC Press, Inc. Boca Raton, 1989. V.2.P.231.

8. Targeted Drug Delivery and Biological Interaction. Boston: CRC Press Boca Raton Ann Arbor, 1990. V.3. P.292.

9. Бадер X. и др. Полимерные липосомы. //Успехи химии. 1987. Т.56. Вып. 12. стр. 2028.

10. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ.// Вопросы медицинской химии. 1999. Том 45. Вып.45. стр.145

11. Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Швец В.И. Некоторые аспекты технологии получения липосомальных форм лекарственных препаратов.// Методы синтеза и технологии производства лекарственных средств. 1999. Стр.20-23.

12. И. Шанская А.И., Иванова Р.П., Булушева Е.В., Яковлева Т.Е., Милицина Т.В. Способ получения лиофилизированных липосом. Патент РФ № 02144352 от 2000.01.20.

13. Шанская А.И., Булушева Е.В., Яковлева Т.Е., Недачина Н.А. Способ получения липосом. Патент РФ № 2071765 от 20.01.1997.

14. Волдреп Дж. К., Найт В., Блэк М.Б. Высокодозированные липосомальные аэрозольные фармацевтические композиции. Патент РФ № 99101940 от 27.11.2000.

15. Найт Дж.В., Гильберт Б., Волдреп Дж.К., Кошкина Н., Веллен К.В., Джованелла Б.

16. Липосомальные аэрозоли с малым размером частиц для доставки противораковых лекарственных препаратов. Патент РФ № 02223749 от 20.02.2004.

17. Сухинин А.А., Кобатов А.И., Автушенко С.С., Виноходов В.О., Антонов С.Ф., Морозова Ю.А. Вакцина против "Синдрома снижения яйценоскости-76" и способ вакцинации. Патент РФ. № 02155030 от 10.12.2000.

18. Рибье А., Нгийан-Канг Л., Симонне Ж-Т, Буссуира Б. Использование акцептора спинов в косметической или дерматологической композиции и косметическая или дерматологическая композиция на ее основе. Патент РФ № 2139038 от 10.10.1999.

19. Генкин Д.Д., Тец В.В. Способ профилактики и коррекции изменений кожи. Патент РФ № 02258530 от 20.08.2005.

20. Кобринский Г.Д., Александрова И.В. Косметическое средство для регенерации увядающей кожи. Патент РФ № 2045261 от 10.10.1995.

21. Шанская А.И., Яковлева Т.Е., Булушева Е.В., Недачина Н.А., Пучкова С.М. Липосомальная везикула стабильная при хранении. Патент РФ № 93029233 от 20.11.1995.

22. Хаманн Х-Ю., Зерно П., Хербот М., Курка П. Липосомальная фармацевтическая композиция для внутривенного введения. Патент РФ № 02160099 от 10.12.2000.

23. Хироси Кикути, Кийото Яти. Липосомы с повышенной инкапсулирующей способностью. Патент РФ № 96119991 от 27.12.1998.

24. Грегориадис Г., Антимисиарис С.Д., Гурсел И. Липосомы, содержащие материалы, состоящие из частиц. Патент РФ № 2145212 от 10.02.2000.

25. Курунов Ю.Н., Курунова Н.Н., Шаталова Н.Д. Способ фаготерапии туберуклеза. Патент РФ № 02214829 от 27.10.2003.

26. Амарджит С., Раджеш Д. Целевые везикулярные конструкции для защиты клетки и для лечения инфекций Н. Pylori. Патент РФ № 02207113 от 27.06.2003.

27. Ким Синил, Губер Андрас, Ким Таехи. Способ эпидурального введения терапевтических соединений с поддерживаемой скоростью высвобождения, способ27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37.38,39,40.уменьшения угнетения дыхания. Патент РФ № 02215522 от 10.11.2003

28. Краузе В., Заксе А., Салливан М. Препарат на основе заряженных липосом. Патент

29. РФ № 96110889 от 27.12.1998.

30. Мотавкина Н.С., Каленик Т.К., михайленко Т.А., Бронников Ю.Н. Способ получения липосом, содержащих антибиотики. Патент РФ № 2099087 от 20.12.1997.

31. Капцов B.B., Симонов A.H., Баранов Ю.Н., Скрыпин В.И., Кукушкин Н.И., Авакян Э.А. Способ получения липосомальной формы альфа-токоферола и гомогенизирующий клапан для его осуществления. Патент РФ № 2085192 от 27.07.1997.

32. Коллинз Дэвид, Ча Юнсик. Фосфолипидная композиция и способы ее приготовления. Патент РФ № 2119791 от 10.10.1998.

33. Нэфф Р., Делменико С., Веттер А., Флетер Фр-У. Эритропоэтиновая липосомальная дисперсия. Патент РФ № 02218914 от 20.12.2003.

34. Золин В.В., Колокольцов А.А., Баранов Ю.Н., Длин В.В., Маркарян А.С. Противовирусное лекарственное средство для перорального введения. Патент РФ №96108008 от 10.07.1998.

35. Хирабаяси К, Секи Д. Лекарственные средства против гепатита. Патент РФ № 02226102 от 27.03.2004.

36. Stark G. The effect of ionizing radiation on lipid membranes// Biochem. Biophes. Acta. 1991. V.1071. n.l. P. 103-122.

37. Коломийцева И.К. Радиационная биохимия мембранных липидов. Сер. Теоретическая и прикладная биофизика. М.: Наука. 1989. С.181.

38. Мочалина А.С., Климова Т.П. Радиационно-химические изменения фосфатидилхолина.// Радиобиология. 1977. Т.17. Вып. 5. С. 711.

39. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука. 1972. Стр.249.

40. Sprinz Н., Brede О. Lipid oxidation in bilayer liposomes induced by radicales from the surrounding water phase. //Radiat. Phys. Chem. 1996. V.47. n.3. pp.511-513.

41. Kikuchi H., Carlsson A., Yachi K., Hirota S. Possibility of heat sterilization of liposomes. // Chem. Pharm. Bull. 1991. V. 39. N.4. pp.1018-1022.

42. Zuidam N.J., Lee Stephen S.L., Crommelin Daan J.A. Sterilization of liposomes by heat treatment.// Pharmaceutical research. 1993. V.10. n.l 1. pp. 1591.

43. Choquet C.G., Patel G.B., Sprott G.D. Heat sterilization of archaeal liposomes.// Can. J. Microbiol. 1996. V.42. n.2. pp. 183-186.

44. Капании П.В. Влияние низкотемпературных и радиационных воздействий на свойства дисперсий фосфолипидов. Дисс. канд. физ.-мат. наук. Москва. Московский физико-технический институт. 1989.

45. Wu G. S., Stein R.A., Mead J.F. Autoxidation of phosphatidylcholine liposomes.// Lipids. 1982. V.17. pp.403-413.

46. Трофимов В. И. //Достижения в области стерилизации фармацевтических препаратов (обзор). Химико-фармацевтический журнал. 1988. № 9. Стр. 1111-1121.

47. Окада Ш. Радиационная биохимия клетки. Пер. с англ. М.: Мир. 1974. Стр. 407.

48. Эйдус JT.X. Мембранный механизм биологического действия малых доз. Новый взгляд на проблему. Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН. М. 2001.82 с.

49. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. 1990. Т1-Т.6.56. SIGMA. 2004-2005.-Р.2950

50. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов. Серия Биологические и технические мембраны. М.: Наука. 1981.-259 с.

51. Panasenko О.М., Arnhold J., Schiller J., Arnold K., Sergienko V.I. Peroxidation of egg yolk phosphatidylcholine liposomes by hypochlorous acid.// Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1215. n.3. pp.259-266.

52. Landi L., Fiorentini D., Stefanelli C., Pasquali P., Pedulli G.F. Inhibition of autoxidation of egg yolk phosphatidylcholine in gomogeneous solution and in liposomes by oxidized ubiquinone. //Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1028. Pp. 223-228.

53. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Пер. с англ. М., Мир 1991.543.

54. Sakurai I., Iwavanagi S., Sakurai Т., Seto Т. X-ray study of egg-yolk lecithin: Unit cell datd and electron density profile.- J. Mol. Biol., 1977, V. 117, p. 258-291.

55. Tardieu A., Luzzati V., Reman F. C. Structure and polymorphism of the hydrocarbon chains of lipids: A study of lecithin-water phases.- J. Mol. Biol., 1973, V.75, p.711-734.

56. Perkins W.R., Minchey S.R., Ostro M.J., Taraschi T.F., Janoff A.S. The captured volume of multilayer vesicles // Biochim. Biophys. Acta. -1988. -V.162, -n.l. -p. 103-107.

57. Olson F., Hunt C.A., Szoka F.C. et al. Preparation of liposome of defined size distribution by extrusions through polycarbonate membranes. // Biochim. et biophys. Acta, 1979. V.557. P. 9-23.

58. Mayer L.D., Hope M.J., Cullis P.R., Janoff A.S. Solute distributions and trapping efficiences observed in freeze-thawed multilamellar vesicles. // Biochim. et biophys. Acta, 1985. V.817 (M 130). N.l. P. 193-196.

59. Hauser H.O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. //Biochim. and Biophys. Res. Communs, 1971. V.45. P.1049-1055.

60. Левчук IO. H., Воловик З.Н. Размеры лецитиновых липосом, образующиеся при воздействии ультразвука. //Биофизика. 1983. Т.28. вып. 2. С. 266-269.

61. Finer E.G., Flook A.G., Hauser H. Mechanizm of sonication of aqueous egg yolk lecithin dispersions and nature of the resultant particles. // Biochim. et biophys. Acta, 1972. V.260. P. 49-54.

62. Johnson S.M. The effect of charge and cholesterol on the size and thickness of sonicatedphospholipid vesicles. // Biochim. et biophys. Acta, 1973. V.307. n. 1. P. 27-41.

63. Hamilton R.L., Goerke J., jun., Guo L.S.S. et al. Unilamellar liposomes made with the french pressure cell: A simple preparative and semiquantitative technique. // J. Lipid. Res. 1980. V.21.P. 981-992.

64. Batzri S., Korn E. Single bilayer liposomes prepared without sonication. // Biochim. et biophys. Acta, 1973. V.298. n. 4. P. 1015-1018.

65. Kremer J. M. H., Esker M.W.J., Pathmamanoharan C., Wiersema P.H. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method. // Biochemistry. 1977. V.16. P.3933-3935.

66. Zumbuel 0., Weder H.G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. // Biochim. et biophys. Acta, 1981. V.640. n. 1. P. 252-262.

67. Brunner J., Skraval P., Hauser H. Single bilayer vesicles prepared without sonification. Physico-chemical properties. // Biochim. et biophys. Acta, 1976. V.455. n. 2. P. 322-331.

68. Enoch H.G., Strittmatter P. Formation and properties of 100-A-diameter, single bilayer phospholipid vesicles. // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1979. V.76. P.145-149.

69. Szoka F., jun., Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1978. V.75. P.4194-4198.

70. Mueller P., Chien T.F., Rudy B. Formation and Properties of Cell-Size Lipid Bilayer Vesicles.//Biophys. J. 1983. V.44. P.375-381.

71. Murphy T.J., Shamoo A.E. Reconstitution of Ca2+ -Mg2+ -ATPase in giant vesicles. //Biophys. J. 1978. V.21. P.27a.

72. Hub H.H., Zimmermann U., Pingsdorf H. Preparation of large unilamellar vesicles. //FEBS Letter. 1982. V. 140. P. 254-256.

73. Barton P.G., Gunstone F.D. Hydrocarbon chain packing and molecular motion in phospholipid bilayers formed from unsaturated lecithins. // J. Biol. Chem. 1975. V.250. n. 12. P. 4470-4476.

74. Devaux P., McConnell H.M. Lateral diffusion in spin labeled phosphatidylcholine multilayer. //J. Amer. Chem. Soc. 1972. V. 94. n. 13. P. 4475-4481.

75. Cullis P.R. Lateral diffusion rates of phosphatidylcholine in vesicle membranes: Effects of cholesterol and hydrocarbon phase transitions. //FEBS Lett. 1976. V. 70. N. 1. P. 223228.

76. Wu E.C., Jacobson К., Papahadjopoulos D. Lateral diffusion in phosphatidyl multilayers measured by fluorescence recovery after photo bleaching. // Biochemistry. 1977. V. 16. n. 17. P. 3936-3941.

77. Добрецов Г.Д., Борщевская T.A., Петров B.A. Сопоставление скоростей латеральной диффузии пирена в различных биологических и модельных мембранах.// Биофизика. 1980. Т.25. вып. 5. Стр 960.

78. Kornberg R.D., McConnell Н.М. Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes.//Biochemistry. 1971. V. 10. N.7. pp. 1111-1120.

79. Walter A., Gutknecht J. Permeability of small nonelectrolytes througt lipidbilayer membranes.//J. Membrane. Biol. 1986. V.90. pp. 207-217.

80. Romano-Fontes L.G., Curi R., Peres C.M., Nishigama-Naruke A., Brunaldi K., Abdulkader F., Procopio J. Fatty acid transport across lipid bilayer planar membranes.// Lipids. 2000. Vol. 35. N.l. pp.31-34.

81. Andrasko J., Forsen S. NMR study of rapid water diffusion across lipid bilayers in dipalmitoyl lecithin vesicles.// Biochim. Biophys. Research Commun. 1974. V.60. N.2. pp.813-819.

82. Deamer D.W., Bramhall J. Permeability of lipid bilayers to water and ionic solutes.// Chem. Phys. Lipids. 1986. V.40. pp.167-188.

83. Физические величины. Справочник, под ред. Григорьева И.С., Мейлихова Е.З. М.: Энергоатомиздат. 1991. Стр.380.

84. Deamer D.W. Proton permeation of lipid bilayer.// J. Bioenerg. And Biomemb. 1987. V.19. pp.457-479.

85. Inglefield P.T., Lindblom K.A., Gottlib A.M. Water binding and mobility in the phosphatidylcholine-cholesterol-water lamellar phase.//BBA. 1976. V.419. pp.196-205.

86. Бугаенко JI.T., Кузьмин М.Г., Полак JT.C. Химия высоких энергий. М.: Химия. 1988. Стр.244.

87. Сараева В.В. Радиолиз углеводородов в жидкой фазе. М.: Изд-во Моск. ун-та. 1986.256 с.

88. Своллоу А.Дж. Радиационная химия органических соединений. Пер с англ. подред. B.J1. Карпова. М.: Изд-во иностр. лит., 1963. 408 с.

89. Barber D.J.W., Thomas J.K. Reactions of radicals with lecithin bilayers.// Radiat. Res. 1978. Vol.74. Pp.51-65.

90. Первичные радиобиологические процессы. Под ред. Тимофеева-Ресовского Н.В. Глава II (Мочалина А.С.) Действие излучения на высшие жирные кислоты и фосфолипиды. М.: Атомиздат. 1973. Стр 52-96.

91. Сараева В.В. Окисление органических соединений под действием ионизирующих излучений. М.: Из-во МГУ. 1991. 264 стр.

92. Элиас П.С., Кохен А. Дж. Радиационная химия основных компонентов пищевых продуктов. Пер с англ. Евтеевой Ф.Н. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1983. 224 стр.

93. Dubravcic М., Nawar W.W. Radiolysis of lipids: Mode of cleavage in simple tryglicerides. // J. Am. Oil. Chem. Soc. 1968. Vol. 45. P.656.

94. Радиолиз углеводородов. Под ред. Топчиева А.В., Полака Л.С., М.: Изд. АН СССР, 1962. 208 стр.

95. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. Радиолиз газов и жидкостей. М.: Наука. 1986. 440 стр.

96. Coleby. R. Chemical changes produced in lipids by irradiation. //Int. J. Appl. Radiat. Isotopes. 1959. Vol. 6. P.71.

97. Эмануэль H.M., Денисов E.T., Майзус З.К. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе. М.: Наука. 1965. 270 с.

98. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. Сборник научных статей. М.: Наука. 1992.110 стр.

99. Пулатова М.К., Рихирева Г.Т., Куроптева З.В. Электронный парамагнитный резонанс в молекулярной радиобиологии. М.: Энергоатомиздат. 1989.232 стр.

100. Суслова Т.Б. Хемилюминисцентное исследование перекисного оксиления липидов в митахондриальных мембранах и растворах олеиновой кислоты. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. М.: 1971.150 стр.

101. Мажуль В.М., Щербин Д.Г. Фосфоресцентный анализ продуктов перекисного окисления липидов в составе липосом.// Биофизика. 1999. Том 44. Вып. 4. Стр. 676681.

102. Stratton S.P., Liebler D.C. Determination of singlet oxygen-specific versus radical-mediated lipid peroxidation in photosensitized oxidation of lipid bilayers: effect of p-carotene and a-tokopherol.// Biochemistry. 1997, vol. 36, pp.12911-12920.

103. Misik V., Gergel' D., Alov P, Ondrias K. An unusual temperature dependence of malondialdehyde formation in Fe2+/H2C>2-initiated lipid peroxodation of phosphatidylcholine liposomes.//Physiol. Res., 1994, vol. 43, pp.163-167.

104. Erriu G., Ladu M., Meleddu G. Modifications induced in phosphatidylcholine multilayers by Co60 y-rays. // Biophys. J. 1981. Vol. 35. № 3. Pp. 799-802

105. Юркевич И.Л. Радиационно-индуцируемая свободнорадикальная фрагментация глицеридов в водных растворах. Автореф. дисс. . канд. хим. наук. Минск. БГУ. 1994.

106. Иванов И.И. Эстафетная модель перекисного окисления липидов биологических мембран. // Молекулярная биология. 1984. Т. 18. вып.2. стр. 512-524.

107. Панасенко О.М., Арнхольд Ю., Сергиенко В.И. Влияние рН на перекисное окисление фосфолипидных липосом, индуцированное гипохлоритом. // Биофизика. 1998. Том 43. Вып.З. стр.463-469.

108. Биофизика мембран. Материалы конференции 21-23 сентября 1973г. Паланга. Каунас. 1973.

109. Nakazawa Т., Nagatsuka S. Radiation-induced lipid peroxidation and membranepermeability in liposomes. //Int. J. Radiat. Biol. 1980. Vol.38. № 5. Pp. 537-544.

110. Дранов A.JL, Дудниченко A.C., Мезин И.А., Мензелеев Р.Ф., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Эффективность липосомальных форм цитостатиков.//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Онкология. 1996. Т. 121. №1. Стр 85-88.

111. Akama К., Awai К., Tokuyama S., Satoh Т., Hosoi F., Omichi H. Development of artificial red cells (ARC) produced by y-ray induced polymerization of liposomes. // Radiat. Phys. Chem. 1995. Vol. 46. № 2. Pp.257-262.

112. Feix J. В., Kalyanaraman B. Spin trapping of lipid-derived radicals in liposomes.// Biochimica et Biophysica Acta. 1989. V.992. № 2. Pp. 230-235.

113. Yamauchi R., Yagi Y., Kato K. Oxidation of a-tokopherol during the peroxidation of dilinoleoylphosphatidylcholine in liposomes.// Biosci. Biotech. Biochem. 1996, vol.60, №4, pp. 616-620.

114. Stratton S.P., Liebler D.C. Determination of singlet oxygen-specific versus radical-mediated lipid peroxidation in photosensitized oxidation of lipid bilayers: effect of carotene and a-tokopherol.// Biochemistry. 1997. Vol. 36. Pp. 12911-12920.

115. Kale R.K., Sitasawad S.L. Non-linear pattern of radiation induced lipid peroxidation is not affected by vitamin E, Fe2+ ions and molecular oxygen.// Indian J. Experimental Biology. 1991. Vol. 29. № 8. Pp. 778-781.

116. Wiseman H. Vitamin D is a membrane antioxidant. Ability to inhibit iron-dependent lipid peroxidation in liposomes compared to cholesterol, ergosterol and tamoxifen and relevance to anticancer action.//FEBS. 1993. Vol. 326. №1-3. Pp. 285-288.

117. Кадочникова Г.Д. Кинетика окисления жирнокислотных компонентов липидов в присутствии ингибиторов. Автореф. дисс. канд. хим. наук. Томск. 1992. 140 стр.

118. Ким Ю.А., Фоменко Б.С., Акоев И.Г. Влияние электромагнитных излученийрадиочастотного диапазона (340 и 800 МГц) на липосомы из димиристоиллецитина.// Биофизика. 1988. Т. 33. Вып. 1. Стр 97-100.

119. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты. Реакционная способность и эффективность. М.: Наука. 1988. 248 стр.

120. Raleigh J.A., Kremers W. DMSO dose not protect against hydroxyl radical induced peroxidation in model membranes. // Int. J. Radiat. Biol. 1981. Vol. 39. №4. Pp. 441-444.

121. Yoshida Т., Otake H., Aramaki Y., Нага Т., Tsuchiya S., Hamada A., Utsumi H. Free radicals from l-palmitoyl-2-arachidonoylphosphatidylcholine liposomes in Fe2+/ascorbic acid solution.// Biol. Pharm. Bull. 1996. Vol. 19. №6. Pp. 779-782.

122. Надточенко B.A., Рубцов И.В., Кинетика рекомбинации радикалов феофетина а и аскорбата в суспензии липосом.// Журнал физической химии. 1991. Том.65. №4. С. 1057-1063.

123. Gratzel М., Henglein A., Janata Е. Mechanism of electron transfer from e'aq to acceptors in micelles. // Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1975. Vol. 79. № 5. Pp.475-480

124. Proske Th., Fischer Ch.-H., Gratzel M., Henglein A. The reactivity of pyrene derivatives in neutral micelles towards hydrated electrons. // Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1977. Vol. 81. №9. Pp.816-820.

125. Schnecke W., Gratzel M., Henglein A. Reactions of the hydrated electron with pyrene in lipid bilayer vesicles. // Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1977. Vol. 81. № 9. Pp.821-826.

126. Patterson L.K., Hasegawa K. Pulse radiolysis studies in model lipid systems. The influence of aggregation on kinetic behavior of OH induced radicals in aqueous sodium linoleate. // Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 1978. Vol. 82. № 9. Pp.951-956.

127. Henglein A., Proske Th., Schnecke W. Kinetics of the reactions of the hydrated electron with pyrene solubilized in large cationic aggregates. // Ber. Bunsenges. Phys. Chem.1978. Vol. 82. № 9. Pp.956-962.

128. Thomas J.K. Radiation-induced reactions in organized assemblies.// Chem. Reviews. 1980. Vol. 80. № 4. Pp.283-299.

129. L-альфа-лецитин из яичного желтка, раствор марки "ч". ТУ 6-09-10-289-90. 11.06.1990.

130. Государственная фармакопея СССР, 11 издание, вып. 1. М.: Медицина. 1987. С. 180.

131. Генкин М.В., Уланов Б.П., Доценко О.Е., Давыдов P.M. Особенности спектров мутности липосом. Одновременное определение размеров и концентраций.// Журнал физической химии. 1987. Т.61. №1. Стр. 220-224.

132. Ван де Хюлст Г. Рассеяние света малыми частицами. М.: ИЛ. 1961. 536 стр.

133. Шифрин К.С. Рассеяние света в мутной среде. М.-Л.: Гостехтеориздат. 1951. 288 стр.

134. Борн М., Вольф Э. Основы оптики. Пер. с англ. М.: Наука. 1970. 856 стр.

135. Пришивалко А.П., Бабенко В.А., Кузьмин В.Н. Рассеяние и поглощение света неоднородными и анизотропными сферическими частицами. Минск. Наука и техника. 1984.263 стр.

136. Иванов А.П., Лойко В.А., Дик В.П. Распространение света в плотноупакованных дисперсных средах. Минск. Наука и техника. 1988. 191 стр.

137. Кленин В.И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. Саратов. Из-во Саратовского университета. 1977. 175 стр.

138. Mie G. Beitrage zur optic triiben medien sparell kolloidaler metaliosungen. // Annalen der Phys. 1908. Vol.25. №3. S.377-442.

139. Безрукова А.Г., Розенберг О.А. Определение параметров липосом методом спктра мутности. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицыны. 1981. Т.91. №4. Стр.506-508.

140. Левчук Ю.Н., Воловик З.Н. Размеры лецитиновых липосом, образующихся при воздействии ультразвука.// Биофизика. 1983. Т.28. Вып.2. стр. 266-269.

141. Левчук Ю.Н., Воловик З.Н., Щербацкая Н.В. Оценка размеров бислойных липосом по оптической плотности и показателю преломления. // Украинский биохомический журнал. 1983. Т.55. №2. Стр. 191-193.

142. Шифрин К.С. Рассеяние света на двуслойных частицах. // Изв. АН СССР. Сер. Геофизическая. 1952. №2. Стр. 15-21.

143. Зельманович И.Л., Шифрин К.С. Таблицы по светорассеянию. Коэффициенты ослабления, рассеяния и лучевого давления. Л.: Гидрометеориздат. 1968. Т.З. стр.150.

144. Байбулатов Ф.Х., Ивания С.П., Пасько Л.Н. К расчетам светорассеяния на сферических частицах. // Изв. Сибирского отделения АН СССР. Серия технических наук. 1971. №3. Вып 1. Стр.3 8-44.

145. Buxton G.V., Greenstock C.L., Helman W.P., Ross A.B. Critical review of rate constants for reaction of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxyl radicals in aqueous solution //J. Phy. Che. Ref. Data. 1988. V.17. N2. Pp.513-886.

146. А.И. Горбанева. М.: Изд-во иностр. Литературы. 1958. 341 стр.

147. Камке Э. Справочник по обыкновенным дифференциальным уравнениям. М.: Наука. 1976. 483 с.

148. Жоров Ю.М. Справочник. Кинетика промышленных органических реакций. М.: Химия. 1989. Стр. 62.

149. Антонова Е.А. Механизм химической защиты углеводородов от ионизирующих излучений алкилированными фенолами. //Химия высоких энергий. 1996. Т.ЗО. №1. Стр.58-64.

150. Ершов В.В., Володькин А.А., Богданов Г.Н. Фенол-диеновая перегруппировка в реакциях фенолов. //Успехи химии. 1963. Т.32. вып. 2. Стр. 154-185.

151. Ветчинкин В.Н., Обухов Л.К. Метод количественного определения 2,6дитретбутил-4-метилфенола (ионола).// Журнал аналитической химии 1965. Т.20. Вып.8. стр. 860-863.

152. Пунтежис С.А. Низкотемпературный радиолиз кристаллического льда и некоторых кристаллогидратов. Дисс. канд. хим. наук. М. 1972.

153. Походенко В.Д. Феноксильные радикалы. Киев.: Наукова думка 1969. С.195.

154. Минхаджидинова Д.Р., Шарпатый В.А. Реакции атомов Н с 4-окси-3.5-ди-/и/?е/я-бутил-а-метилбензиламином. // Химия высоких энергий. 1996. Т.30. № 5. С.352-355.

155. Atkins P.W., Symons M.C.R. Oxides and oxy-ions of the non-metal. Part IV. Nitrogen derivatives. //J. Chem. Soc. 1962. Pp.4794-4797.

156. Livingston R., Zeldes H. Paramagnetic resonance study of NO3 in irradiated KNO3. //J. Chem. Phys. 1964. V. 41. P. 4011.

157. Эткинс П., Саймоне M. Спектры ЭПР и строение неорганических радикалов М.: Мир. 1970.310 с.

158. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. Твердое тело и полимеры. Прикладные аспекты. М.: 1987. Т. 3.448 с.