Радиационно-инициируемая свободнорадикальная фрагментация глицеридов в водных растворах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТБЕШБШ УШШЕРСИШГ

РГ6 0*

На правах рукописи

ЕРКОВА ИРИНА ЛЕОНИДОВНА.

РЛД1ШДЮШЮ -ШАДЖРУВШ СЮВОДЮРАДЖМЬНАЯ ФРАГМЕНТАЦИЯ ШЦЕРВДОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ

02.00.03 - органическая химия 02.00.09 - радиационная хишя

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата хишческих наук

Минск - 1994

Работа выполнена на кафедре радиационной хииии и хиытехноло-гии химического факультета Белорусского государственного университета.

Научный руководитель: доктор химических наук

ШДЦЫРО о.и.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор ШАРПАТЫИ В.А.

доктор химических наук, профессор СТАБИПЕВСКШ Л.С.

Ведущая организация: Институт Биоорганической

химии АН РБ

Завита диссертации состоится " 1994 г в-^^ас

на заседании специализированного ученого Совета Д 056.03.04 при Белорусском государственном университете по адресу: 220080 г. Минск , проспект Ф.Скорины, 4. Главный корпус, ауд. 206.

С диссертацией изхно ознакомиться в библиотеке Белгосунивер-ситета.

Автореферат разослан 1994 г.

Учений секретарь специализированного Совета, доктор химических наук

Л.П.КРУЛЬ

Актуальность работы. Исключительно важная раль биомеыбран в процессах клеточного метаболизма сделала их предметом многочисленных исследования специалистами, работаюпими в различных областях естествознания. Это обстоятельство предопределило развитие работ, связанных с изучением влияния ионизируют« излучения на функции биологических мембран, а также с установлением закономерностей процессов, протекающих при облучении их компонентов. Особенно актуальным это направление становится в последнее время в связи с широким использованием ядерных технологий, применением радиоактивных изотопов, рентгеновского излучения и ускорителей в промышленности, медицине и сельском хозяйстве, что значительно расширило с£еру соприкосновения радиации с отлетал организма'«.

Основными компонентами клеточных мембран являются белки и полярные липиды. представленные, главным образом, глицерофосфоли-пидами. Ввиду того, что биологическая значимость белков в жизнедеятельности организмов была понята исторически ранее, чем других макромолекул, внимание радиационных химиков в большей степени было сосредоточено на изучении радиолиза водных растворов этих веществ и родственных им соединений, в то время, как изучению радиолиза липидов уделялось меньше внимания. И только после установления того факта, что неферментативное перекисное окисление личидов играет ватную роль при функционировании клетки в норме и патологии, интерес к ралиаяионно-хииичесюш превращениям липидов значительно возрос. Было установлено, что липиды, входящие в состав биомембран. во многом предопределяют высокую радиационную чувствительность последних, и это делает их нз менее важной радиобиологической мишенью, чем ДИК. Обнарузенные экспериментально изменения свойств биомембран при облучении связывали, главным образом, со способностью радиации инициировать перекисное окисление липидов (ЮЛ) . Поэтому более пристальное внимание при изучении радиолиза липидов и их моделей уделялось процессам, протекающим в их липофильной части, где и реализуется, радиацинно-индуцированные процессы окисления входящих в состав липидов остатков полиненасышенних карбсновых кислот. Как известно, липиды являются амфифильными веществами и содержат кроме гидрофобных И' гидрофильные части. К сожалению, в литературе имеются лишь единичные работы. позволяющие только качественно судить

о возможности протекания радиашнно-химических процессов, затрагивающих гидрофильную составляющую. Систематические исследования, направленные на установление взаимосвязи между структурой полярной части липидов и способностью их к различным трансформациям при облучении ранее не проводились. В то же время на примере радиологических превращений a-диолов, глицерина и их зфиров -соединений, содержащих фрагменты, которые входят в состав глице-рсфосфолипидов -было убедительно показано, что набор конечных продуктов радиолиза во многой определяется реакциями фрагментации, образующихся органических радикалов. Возможность реализации и роль такого типа реакций в радиационном повреждении липидов не установлена.

Целью настоящей работы было изучение закономерностей протекания радиационно-инициированной свобаднорадикальной фрагментации производных глицерина в водных растворах и установление возможности деструкции фосфолипидов за счет мономолекулярного распада радикалов, образующихся nisi взаимодействии продуктов радиолиза воды с их полярной составляющей. .

В соответствии с поставленной целью бьши проведены исследования радиолиза водньж систем как водорастворимых, так и амфи-фильных глицеркдров. Изучены закономерности образования конечных продуктов радиолиза указанных соединений, исследовано влияние на их выходы различных акцепторов активных продуктов радиолиза воды, оценено влияние рН исходных растворов на вероятность протекания радиолитических процессов. Изучено также влияние строения исходных глицеридов на вероятность протекания реакции ыономолеку-лярной фрагментации их первичных радикалов.

Научная новизна. Впервые в идентичных условиях проведен ра-диолиз различных глицеридов, что позволило провести сравнение величин рапиационно-химических выходов конечных продуктов радиолиза для всех исследованных соединений и выявить обшие закономерности их радиолитических превращений.

Показало, что при действии ионизирующего излучения на водорастворимые вещества CHg(0H)CH2(0H) CH(D , где X - ОН, 0НР03"\ С1, NHg, —C'C^Hg, -ОООС3Н7, основным процессом среди превращений органических радикалов, образующихся при радиолизе водных растворов исходных соединений, является мономолекулярная фрагментация.

Данные по влиянию рН среды на образование конечных.продуктов радиолиза, а также результаты по радиолизу ациклических и циклических производных глицерина позволили установить, что распад первичных радикалов протекает с одновременным разрывом двух виии-нальных по отношению к радикальному центру связей.

Установлена, что наличие гидрсксильной группы в молекулах глицерофосфолипидов при их радиолизз делает склонными образующиеся в полярной части первичные радикалы с неспаренной валентностью на «-С-атшэ по отношению к ОН-труппе к процессу мономолекулярного распада. Радиашонно-инишированная свободнорадикальная фрагментация глицерофосфолипидов приводит к расщеплению эфирных связей и, как следствие, к разрушению молекул липихов.

Показано, что сфингсмиелин, относящийся к фосолипидам, при облучении его водных дисперсия такге фрагментирует с разрывом 0-Н и С-И связей.

Практическая значимость, фактическая значимость настоящей работы определяется тем. что полученные экспериментальные результаты по радиационна-индуцированной свабаднарадикальной фрагментации липидов необходимы для понимания на молекулярном уровне механизмов радиационного повреждения различных биообъектов, а,, следовательно, и для нахождения эффективных способов управления их устойчивостью к воздействию как: ионизирующих излучений, так и других инициаторов свободнорадикальных реакций. Это, в свою очередь, определяет использование установленный закономерностей для создания новых радиопротекторов, лекарственных препаратов для лечения патологий, вызванных активацией в организме свободноредикальных реакций.

На защиту выносятся следующие основные полояени^;

1. Экспериментальные данные по закономерностям радиационно-иниоиированной сзободнорадикалькой фрагментации водорастворт&к глшеридоз.

2. «аспериментальные результаты, позволяшие предложить механизм шномолвкулярного распада первичных радикалов исследуемых .глицеридов.

''3. Результаты эксперимента, свидетельствущие о трансформации гидрофильной части липидов в результате свободнорадикальной фрагментации.

4. Совокупность данных, устанзвливаншх взаимосвязь между

3

строением полярных фрагментов различных глицеринов и склонностью их к деструкции при 7-облучэнии.

5. Экспериментальные результаты, свидетельствующие о свобод-норадикальной фрагментации сфингомиелина.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на Международной конференции "Наука и медицина -Чернобылю" (г. Минск, 1993), на Радиобиологическом съезде (г. Киев, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано шесть научных работ.

Обьем и структура диссеоташи: Работа изложена на 116 стр. машинописного текста, включая 20 рисунков, 8 таблиц и библиографию из 116 наименований. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы.

СОДЕЙШНЕ РЖ)ТЫ

Во введении показана актуальность изучения радиолиза водных дисперсий липидов и их моделируотих соединений, обоснована цель диссертационной работы, приведении основные положения, выдвигаемые на задату, а также научная новизна и практическая значимость полученных результатов..

В первой главе обобщены основные литературные данные по теме диссертации. Обзор литератур» состоит из двух разделов. Первый содержит литературные данные, посвященные свободнорадикальным превращениям полярных.липидов. Во втором рассмотрены закономерности протекания мономолекулярного распада первичных радикалов, образующихся при радиолиза водных растворов многоатомных спиртов и их производных.

Из приведенных в ' литературном обзоре данных следует, что среди возможных родаашонно-инишируемых реакций <$оо£олипидов наиболее детально изучен процесс перекисного окисления, проте-кахдай в гидрофобной части молекул липидов. Что те касается сво- ;> боднорадикальных превращений в полярной части, то сведения об этом практически отсутствуют.

Во второй главе (экспериментальная часть) изложены методики синтеза и очистки исходных соединений, способы приготовления, облучения и анализа образцов. Водные растворы глицеридов подвергали действию 7-излучения (137Сэ) на установке ЛМБ-7-1М с мощностью дозы 3.2 1018 зВ/-л с.

Анализ конечных продуктов проводили, преимупвственно используя методы газо-жидкосгной хроматографии, а также методы тонкослойной и жидкостной хроматографии. Отдельные продукты радиолиза определяли фотокшориметрически. Выходы конечных продуктов определяли на линейных участках кривых накопления продукта в зависимости от поглотанной дозы методом наименьших квадратов.

В третьей главе изложены полученные экспериментальные результаты и проведено их обсуждение. Глава состоит из двух частей: в первой (разд. 3.1) - изложены данные эксперимента, полученные при исследовании радиолиза водорастворимых глидаридов, во второй (разд. 3.2) - полученные результаты по радиализу аыфифильных гли-церидов.

3.1. Свободнораджальная Фрагментация водорастворимых глицеридов

Для определения возможности мономолекулярной фрагментации свободных радикалов, образующихся в гидрофильной части глицеро-фосфолипидов при радиолизе их водных дисперсий, необходимо было установить закономерности образования продуктов фрагментации модельных соединений при облучении их водных растворов. В качестве моделей были использованы водорастворимые глицериды с различными типами эфирной связи, а также некоторые юнозамешенные производные глицерина. Для установления возможного механизма протекания радиолитических процессов изучали влияние различных акцепторов свободнорадикальных интерыедиатов на образование конечных продуктов радиолиза.

При облучении водных растворов глицеро-1-фосфата, содержа-ивго связь С-О-Р, характерную для всех глииерофосфолипидов, было установлено, что основным продуктом радиолиза (си. таб. 1) водных растворов глицеро-1-фосфата является фосфат-анион, следовательно, разрыв фосфо-эфирной связи в глицеро-1-фосфэте при его облучении является доминирующим процессом. Причем увеличение радиашоннс-хинического выхода фосфат-аниона с 3,8 до 6,0 молекулЛОО зВ, в растворах, насиненных закисью азота, подтверждает важную роль окислительной компоненты радиолиза воды - ОН радикалов в его образовании .

Таблица 1

Значения выходов (6) продуктов радиолиза глицеро-1 -фосфата в водных аэрированных растворах и в присутствии закиси азота и ацетона <10"^ моль/л>

Продукты

фосфат-анион

оксиаштсн

формальдегид"

ацетальдегид

ацетон

б , молекулЛШ эВ

аэрированные

.растворы_

3,803), 20 0,13=0,01 0,07-43,01 0,07=0,01 0,10=0,01

закись _азота_

6,00=0,40 0,53=0.03

0,11=0,01

.ацетон

3,80=0,20 0,52=0,03

"формальдегид определялся в облученных деаэрированных 0,1 И водных растворах г лииаро-1-фосфата.

Элиминирование фосфат-аниона юкет происходить за счет превращений радикалов г лицеро-1 -фосфата с неспаренным электроном на (¡2 атома по следующей схеш:

ЗШ5Н ' ' НоСОН н^сон

I он -и I

НС0Н -мм - -СОН - С-0 ♦ &>¥04~ <15

I -«2° I | ^ 4

^соро2Н~ • • Р^СОРО31Г -Ь&г

Кроме того, на иошяена воз мощность расцепления фосфо-эфирной связи и за счет участия гидратированного электрона по реакции диссоциативного захвата

Н ¿ОН + е" - Н Ьэн - НР0?~ (2)

Г ач I 4

Н^СОРОзН" .¿{¡2

Для установления возможности реализации и оценки вклада последнего процесса в общую сумму образования фосфат-аниона нами изучалось влияние акцепторов акватирсванного электрона таких, как закись азота и ацетон, а также исследован радиолиз водных растворов З-хлор-1,2-пропандиола. Среди конечных прдуктов радиолиза данного соединения бьи идентифицирован пропандиол-1,2- с выходом 0,7=0,1, образование которого возможно в результате протекания реакции диссоциативного присоединения е" к молекуле исходного вещества:

С1^(С1)СН(0Н>СЕ2(0т ♦ - СН2СН(ОН)СН2СОН) 4- С1~

В то же время среди конечных продуктов радиолиза 0.1 М водного раствора г лицеро-1-фосфата намзл пропандиол-1,2 обнаружен не был. Кроме того, введение ацетона в облучаемый раствор глкцеро-1-фосфата (сы. табл.1) не привело к уменьшению выхода фосфат-аниона.

Приведенные факты позволяют исключить реакцию (2) как ответственную за расщепление фосфозфирной связи при радиолизе водных растворов |*лицеро~1-фосфата.

Процесс элиминирования фосфат-аниона в результате превращений образующихся из глицеро-1-фосфата радикалов с неспаренной валентностью в (З-лоложенни по отношению к фосфатной группеможет осуществляться как за счет разрыва двух (3-связей (реакция 1), так и в результате Р-расиепления согласно схеме:

1^С0Н ^СОН

•Ьон п .- !х>н - ¿-о СЗ)

I Ч - ОРОоКГ Г I

Н^С-О-Р-О ~ ^Ь НдС

Ьн

В случае реализации реакции (3) как основного процесса, приводящего к разрыву • фосфо-зфирной связи, выход оксиацетона был бы равен или превышал бы выход фосфат-аниона. Поскольку из экспериментальных данных следует, что (ХЬ^РСф больше оксиацетона) (сы. табл. 1), то реакцией (3) южно пренебречь.

Анализ литературных данных по ЭПР- исследованиям радиолиза глицерофосфатов также указывает на вазный вклад реакции типа (1) в наблюдаемые эффекты радиолиза. В то же время существует две точки зрения по поводу того, каким образом протекает распад радикалов с разрывом двух Р-связей.

Так, согласно представлениям о гетеролитической фрагментации реакция (1) протекает следующим образом:

^СОН £у30Н Ь^СОН ЕзСОН

' -ЬоН -^гг -¡»Н ™ «АоН --^г Ь-0 С-4)

^-О-РОдН" ~ 4 Другая точка зрения основывается на том, что такого типа реакции протекают согласованно через пятичленное переходное состояние с одновременным разрывом двух (3-связей

ЕоСОН

КэСОН

ч

С=0 * Н^

(Б)

Известно, что протеканию реакции по гетеролитическому механизму способствует наличие в системе ионов водорода. Гак, следовательно р кислых средах отщепление неорганического фосфата за счет гетерслитического распада радикалов г лицеро-1-фосфата будет протекать с большей вероятностью. Нами были проведены исследования по влиянию рК исходных расТЕороЕ глкцеро-1-фосфата на образование при их облучении неорганического фосфата. Полученные данные свидетельствуют о том, что при переходе от сильнокислых к сильноща-лочным средам выход фосфат-аниона практически не изменяется (см. рис. 1>.

Результаты радиационнэ-инищдарованного двзаминирования З-амино-1,2-пропандиола такке указываот на согласованный механизм распада радикалов гидроксиясайертадах производных глицерина. В результате 7-облучения 0,1 Ы водного раствора З-алико-! ,2-пропандиола было установлено, что одним из продуктов радиолиза является аммиак. По аналогии с 0-аниноспиртами можно предположить, «то аммиак образуется в результате мономолекулярной фрагментации исходного радикала с разрывом двух вицинальных по отношению'к радикальному центру связей. При исследовании влияния рН среды на радиационно-ккыический выход аммиака обнаружено, что величина последнего значительно изменяется при переходе от келоч-ных к кислым средам (см. рис.2).Выход КН^ при облучении кислых растворов СсН 2> составил 0,12^,01 молекул Л СЮ зВ. Облучение водных щелочных <рН 12) раствэров 3-аданс-1,2-пропандиола, когда рН больна рКд исходного соединения, привело к увеличению выхода аммиака до 2,7^0,2 молекулЛ00 зВ.

Согласно представлениям о гетеролитическоы механизме фрагментации радикалов в кислых средах с большей вероятностью должен реализовьзаться процесс:

В паточных растворах аминоспирты депротонированы и гетеролиз радикалов по вышеуказанной схеме представляется маловероятным. В то зз время могат осуществляться их распад по согласованному механизму поскольку возможно закрепление необходимого для фрагментации пятичлениого переходного состояния внутримолекулярной водородной связью:

-С-СЛ'оОН - НоС—С—ОЬОН - МНд

Большой выход аммиака в щелочной среде (2,7 молекулЛ00 эВ> говорит в пользу согласованного распада радикалов

исходного соединения.

В результате мономолекулярной фрагментации глицеро-1-фосфата по реакции (1) помимо фосфат-аниона образуется радикал оксиацето-на, который за счет отрыва атома водорода может давать оксиацв-тон. Действительно,'среда продуктов радиолиза глицеро-Цбосфата идентифицирован оксиацетон, однако величина его радиашонко-химического выхода (0,13 молекулЛОО эВ> существенно меньше выхода фосфат-аниона (3,8 молекулЛ СЮ зВ) (см. табл. 1.).

Полученные результаты по радиолизу глицерина показывает, что оксиацетон при облучении водных растворов глицерина образуется так-кз в небольших количествах (в »€,23^0,02 молекулЛОО зВ). Вместе с тем согласно литературным данным одним из основных процессов среди радиолитических превращений глицерина является мономолекулярная дегидратация радикалов СН^ ОН) СХ ОН) С'^С ОН) с. образованием радикала оксиалетона. Небольшие величины выходов оиси-ацетона южно объяснить тем, что радикал СНуОНХХОСН^ более склонен к бирадикальным реакциям, чем к реакция^ отрыва атома водорода.

Для установления закономерностей радиацданно-инициируемой фрагментации радикалов органических эфироз глицерина"нами^изучен радиолиз 0,1 М водных растворов 1-О-бутилглицерина Сглицерида: с простой эфирной связью) и 1-бутираилглицерина (глицерида со слокнозфирной связью) . ,

Таблица 2.

Данные по радиолизу ОД М водных растворов 1-0-бутилглицерина и

1 -бутироилглицерина

1 -О-бутилгладерин бутанол-1 1,73^0,09 2.7^0,1 1,?3±0,09 оксиацетон 0,СйЗЗ,01 0,24^0,02 0,13^0,006 1-Сутироилглкцерин масляная кислота 1,72*0,02

оксиацетон 0,12*0,01 0,14*0,01 0,03*0,005

Высокие величины радиационно-химических выходов бутанола-1 и масляной кислоты (см. таб. 2) позволяет утверждать, что расщепление эфирных связей при радиолизе исходных соединений является одним из основных процессов. Зависимость накопления бутанола-1 и масляной кислоты от поглощенной дозы имеет пропорциональный характер и это указывает на то, что данные вещества являются первичными продуктами радиолиза'. В обоих случаях среди конечных продуктов радиолиза идентифицирован оксиацетон. Выход бутанола-1 увеличивается при облучении растворов, насыщенных закисью азота, не изменяется при введении в систему добавок ацетона и превосходит выход оксиацетона (см. таб.2). Эти экспериментальные результаты позволяет утверждать по аналогии с г лицеро-1-фосфатом, что расщепление эфирных связей происходит, главным образом, по радикальному пути в результате процесса ыономолекулярний Фрагментации радикалов исходного соединения

где . К - -С4Нд, -С0СзН7 {^значительное различие в выхода* бутанола-1 и масляной кислоты (см. табл. 2) указывает на то, что тип эфирной связи суиественно не влияет на вероятность ее распада.

Как отмечалось вше, существуют две точки зрения на механизм мономолекулярного распада свободных радикалов. Сторонники гетеро-литического механизма полагает, что гетеролитическая фрагментация мжл иметь место для 1,2-бифункциональных соединений' с хорош уходяшей группой в ¡З-галохении (например, ацетатной) и при отсут-

С,' молекул Лии эВ

исходное вещество продукты аэрированные _*_растворы

ыго 10

Ю^М ацетон

ствии протай. у «-кислородного атома. Тогда, для полностью ацвли-рованнсго глицерина при его радиолизе должен протекать следуший процесс:

1КС-0Дс ИрС-ОЛс ЯоС-ОАс Н^С-ОАс

"I ОН г\ \ НЛ)

И С-0Ас -- -С-ОАс--.0-0Ас -- С-ОАс

I -11,0 I - АсО~ I ~ I

Н2С-0Ас ^ Н2С-0Ас - - СР^ . С1Ь

Н2С-ОЛс Н2С-0Ас &эр-0Лс -- ШО'-ОАс - ко * Н -

- АсОН I I

¿Из

При радиолизв 0,1 М водного раствора триацетата глицерина методом ИХ ацетоксиаштон среди конечных продуктов рапиолкза обнаружен не был. Этот факт находят объяснение с точки зрения согласованного распада радикалов. Отсутствие подвижных протонов в триацетате глицерина затрудняет образование переходного пятичлен-ного состояния и, следовательно, вероятность мономолекулярной фрагментации с разрывом двух связей не большая.

В то же время закрепление необходимого переходного цикла ко-еалэнтньми связями способствует Фрагментации. Это подтверждают полученные результаты по 1,2-ди-О-изопропилиденглицерину Сем. рис.3). Среди конечных продуктов радиолиза его 0,1 М водного раствора идентифицированы ацетон (в - 2,09^0,02 молекулЛОО зВ) и оксиацетон (С - 0,27^0,03), образующееся по реакции монемзлеку-лярного распада исходных радикалов 1,2-ди-О-изопрошлиденглиш-рина:

НрСОН НрСОН Н>С0Н Н>С0Н Ч ОН \ \ ♦ Н Ч н с-й т----- 6=0 — с-о

^¡>-0^X313 ~ НгЬ-^О^СЕд ~ снзсоспз .Ц (ж.

Таким образом, значительный вклад в сумму радиолитических превращений, протекающих при 7-облучении водных растворов соединений СН2(Ш)СН(ОН)СН2<Ю, где X - ОН, ОРОдй; ' С1, -0С4%, -ОООСдНу вносит процесс распада образующихся радикалов исходных веществ с неспаренным электроном у С? атома, который протекает с

разрывом двух вкцкнальных по отношению к: радикальному центру связей. В результате такого распада происходит элиминирование продукта НХ с образованием нового более устойчивого радикала CHgCCOCH^OH) аллильного типа, незначительная часть которых превращается в оксиацетон за счет отрьза атома водорода. Совокупность полученные нами и имешихся в литературе данных находят более удовлетворительное объяснение, если предположить, что фрагментация радикалов гидроксилсодерхаиих производных глицерина протекает по согласованному механизму.

*

3.2. Свободнооадикальная фрагментация липидоз Исследуя радиолиз различных водорастворимых глишридов, мы установили, что при наличии в составе их молекул ОК группы наиболее существенный вклад в раддалитические превращения вносят реакции радикалов с неспаренной валентностью на атош углерода глицеринового скелета. Ери изучении радиолиза глицерофосфолипндоз основное внимание бьшо уделено возможности реализации таких процессов для даннет соединений и установлению закономерностей их протекания.

Рассмотрим возкоаность осуществления данного процесса для аморального монозфира глицерина. Для этого был изучен радиолиз 1-О-гексадецилг лшерика. Среди конечных.продуктов радиолитичес-ких превращений, протекающих при облучении его еодных дисперсий, были идентифицированы гексадециловый спирт и оксиацетон (см. рис. 4).

Таблица 3.

Данные по радколизу водных дисперсий амфифильных глицеридов

G. «олекулЛШ зВ исходное вещество продукты аэрированные м п 1Тг57ТГ1ГГи - - ' •_растворы 2 1U м ацц' цн

1-0-гексадецил- гексадеииловый спирт 0,8=0,08 глицерин оксиацетон ,0,02=0,00?

ДПФГ фосфатидная кислота 0,7=0,0?

оксиацетон 0,05=0,09

ДМФГ ..оксиацетон 0,04=0,003 0,14=0.02 0,07=0,08

лизо-ФХ пальштоксиацетон 0,067=0,005

сФинготелин_стеароиламид_0.1=0.01 _

Наличие оксиацегона среди конечных продуктов (см. табл.З) ра-

12

диолиза в облученной системе позволяет предположить, что и. для исходных радикалоз аыфифильнсго глицерида, каким является 1-0-гексздецилглицзрин, характерна реакция монсгалекулярной фрагментация .

По аналогии с установленными закономерностями радиолиза водорастворимых глицеридов можно представить, что образование указанных продуктов происходит в результате распада радикалов исходного Еьшэства с разрывом двух вишшальных по отношению к радикальному центру связей:

Я^СОЦ Н-,С0Н БоСОН К-,С0Н

I С'1 \ Г I

II СОН . бон--6=0 С-0

I -11-,О I -С, Г I

Н2СЧ)-С16.Чзз ° %С-0-С,6Нзз 1Ь $¿0'

Разница в выводах продуктов фрагментация может быть объяснена, как я в случае радиолиза водорастворимых гидроксилсодерзадах производных глицерина, значительной устойчивостью предшественника оксиацетона - радикала СНрССОЗСЫ^ОН), что делает предпочтительным его расходование в бирадикальных процессах рекомбинации, а не а реакциях отрыва а.тсма водорода.

Следовательно, вели как и в случае с 1-бутилглицериком, расщепление зФиркой связи в гексадешлглкиврине происходит в результата мсномолекулярной фрагментации исходных радикалов, то и другие амфифильныа глицэриды, имеюсие в своем составе гидроксильную группу, будут склонны при облучении задних дисперсий претерпевать мономолекулярный распад с разрывом двух (¡-связей. Действительно, это подтверждают данные, полученные при радколизе водных М

дисперсий димиристоилфссфатихилглицэрина СДМГ) и дипальмитоил-фосфатидилглицерика С Щ1ФГ), имевсие следуктае структурные формулы:

СН^-СН—СН, ¿Н !)Н I—Ц^-СН,

где п - 13 для ДМФГ; п - х5 для ДПФГ 5

Срэди конечньа продуктов радиолиза ДПФГ были обнаружены Фос-' фатиднал кислота и оксиацстон с раяиаииокно-химкческими выходами, 0,7^0,07 и 0.05^0,009 молекулЛ00 зВ соответственно.

13

Образование указанных продуктов радиолиза ДШ>Г возможно в результате фрагментации радикалов, возникающих при отрыве атома водорода от глицеринового Фрагмента исходных молекул по схема

%ООН Е^СОИ ^ООН И^СОН

Н ¿ОН л —94,— -Ьон Л -- Ь-О Ь-0

I I у -В0ГО.Ф- I I

Н^С-О-Р-ОФ Ь^О-О-Р-ОФ 3 НдС

Введение в водную дисперсию ДМФГ акцепторов гидратированного электрона - ацетона и закиси азота, как и в случае глицеро-1-фосфата. привело к повышению выхода оксиацетона (см. рис.5). Эти экспериментальные результаты подтверждают радикальный путь его образования. Рассмотрим результаты, полученные при радиолизе 2.10"^ Ы водной дисперсии фосфатидилхолина (ФХ), имеющего следующее строение:

В^С—0—Р-О-ЧЛ^-С^—«С С%)

ФХ отличается от ДПФГ тем, что в гидрофильной части содержит остаток аминоспирта - холина, не имеющего гидроксильных групп. Анализ облученной дисперсии ФХ показал, что среди конечных продуктов радиолиза фосфатидная кислота, образование которой возможно бьшо бы в результате растепления фисфозфирпоя связи, отсутствует, в то время, как при радиолизе ДПФГ она идентифицирована с выходом 0,7 ыолекулЛОО эВ. Эти экспериментальные данные -служат доказательством склонности гидроксилсодеркадак глицеридов к реакции мо-ноиолекулярной фрагментации с разрывом двух р-связей, а также позволяет исключить иные пути образования фосфатидной кислоты при радиолизе ДПФГ.

ДПФГ, ДМФГ и ФХ является производными диацилглииеро-3-фос-фата (фосфатидной кислоты): 0

, _ 0 Н2с—0Р031Г

Фосфатидная кислота (ФЮ - аыфифильный глицерид, не содержащий в

глицериновом фрагменте свободных гидроксильных групп. Для водорастворимого триацетата глицерина экспериментально показано, что радикалы с неспареннсй валентностью на втором атоме углерода глицеринового скелета полностью этерифицированных глицеридов на склонны к реакциям мономолекулярная фрагментации с разрывам двух связей. Установлена такке, что реакция фрагментации с разркзо;.! одной связи на вносят существенного вклада з отщепление неорганического фосфата при радиолизв глццзро-1 -фосфата.

Для установления возможности расивплекия эфирной связи при радиолизе ФосФатидкой кислоты мы проводили облучение ее водной дисперсии с концентрацией 2.10"2 М. В результате анализа облученной дисперсии ФК среди конечных продуктов радиолиза шристиновая кислота не обнаружена, а концентрация образовавшегося при радиолизе ФК фосфат-аниона при дозе 9 кГр составила 1.10"^ шхь/л. В то время как для аналогичной концентрации глицеро-1-фосфата, неорганический фосфат при той ев дозе облучения накапливается в количестве 25,5.10"^ моль^л. Очевидно, что для диашлглицерол-З-фосфата не характерны процессы ыономолекуляркой Фрагментации, приводящие к разрыву эфирных связей. Следует полагать, что для производных фосфатидной кислоты будут сохраняться эти закономерности. Так, если бы при радиолизе фосфатидилхолина реализсвызалея процесс ыономолекуляркого распада радикалов с неспаренной валентностью на атома углерода глицеринового фрагмента, приводящий, к разрыву двух вицинальных по отношению к радикальному центру связей

НзАбСООСЙэ он ВДбОООСН, b^gOOOClfe %1С15™ 0 -и j' f^ f) ♦

ч- "0-^-01 - ^с^соон

0" . ' то среди конечных продуктов радиолиза í>I доляен быть пальмитокси-ацетон. При проведении анализа облученной водной суспензии ФХ пальмитоксиацетон.не идентифицирован. Следовательно, ФХ, как и ФК, не склонен к реакции шномолекулярного распада, хотя с точки зрения гетеролитической фрагментации, протекание рассмотренной реакции возможно и при отсутствии ОН группы з молекуле соедине-

1S . . "

ния. ГЬдтвервдением тому, что наличие свободной гидрок-сильной группы в исходных глицеридах определяет склонность радикалов, образующихся при облучении их водных систем к мономолекулярной Фрагментации, служат данные, полученные при' исследовании радиолиза. 2.10"^ М водной дисперсии лизофосфатидилхолина (лизо-ФЮ . Лизо-ФХ образуется в результате Ферментативного гидролиза слохнозфирной связи у второго атома углерода глицеринового скелета. Среди конечных продуктов радиолиза водной суспензии ли-зо-ФХ обнаружен пальмитоксиацетон . Значение его радиационно-кимического выхода составило 0,067*0,005 шлакулЛОО эВ. Пропорциональная зависимость накопления данного вешзства от поглощенной дозы подтверждает, что это первичный продукт радиолиза Сем. рис.6). Склонность исходных радикалов лизо-ФХ к юкомолекулярно-» иу распаду хорошо объясняется с позиции фрагментации по согласот ванному механизму. Наличие подвижного атома Н в молекула данного липида делает возможным гсятичленнэе переходное состояние, что способствует реализации следующего процесса

В31С15СООСБ> он %с1Бах№,

юан -- -с—а^ -¡т-

о 0— Оч) —---С-0

Отсутствие такового в молекуле ФХ затрудняет образование переходного состояния и, как следствие, препятствует мономолекулярной фрагментации исходных радикалов. Образование фссфатидной кислоты при радиолизе ДПФГ и отсутствие таковой при радиолизе ФХ такка объясняется и находится в соответствии с положениями о ыономолекулярной фрагментации по согласованному механизму.

Таким образом, для гидроксилсодержадах глицерофосфолипидоз при действии ионизирующего излучения на их водные дисперсии характерны процессы мономолекулярной Фрагментации с разрывом двух связей. В результате реализации данных процессов происходит рас-шеплеииее эфирных связей в молекуле липида и, как следствие, их деструкция.

Одними из важных составляющих биомембрану фосфолипидов являктся

16

сфингофосфолипиды. В обшзм видв наиболее распространенный сфингофос-

Фолипид - сфингомиелин - имеет строение Н

нх5-сн-си-сс^)12са3 к^-мАя

^-О-^-ОС^С^МС СНд)

где й - углеводородный остаток.

Сфингомиелин в составе молекулы имеет свободную гидроксиль-ную группу. Для водорастворимых и амфифильных зфиров глицерина мы установили, что при наличии ОН группы в своем составе соединения при облучении претерпевают деструкцию вследствие расщепления эфирных связей. Разрыв эфирных связей происходит в результате мономолекулярного распада радикалов исходных веществ с неспаренной валентностью в (3-шложенки по отнесению к эфирной группе. Наличие ОН группы в молекуле сфингомиелина позволяет предположить, что данное вещество при облучении также будет претерпевать свободно-радикальную фрагментацию. Однако в отличие от ранее рассмотренных глицерофосфолипидов, сфингомиелин содержит не слозснозфирную связь, а амидную. Для выяснения возможности гомолитического расщепления амидной связи мы изучали радиолиз 0,1 М водного раствора N -аиети лэтаноламина.

Согласно литературным данным по «.(З-аминоспиртаы, а также экспериментально полученных нами по З-амино-1,2-пропандиолу, установлено, что радикалы аминоспиртов, образующиеся при косвенном радиолизе водных растворов исходных соединений, неустойчивы и распадаются на молекулу аммиака и соответствующего дезоксикето-производного

он _ Ц

1^6—011 - 1^0 Ш-МУ^ - Л'Нд Ю-0 Ю-0

В результате данного процесса в исходных аминоспиртах происходит . одновременное расщепление С-Н и 0-Н связей. Бели N-aцeтилзтaнoлaшн фрагментирует при облучении по нижеприведенной реакции

нз^юоенз"^^с^ст -^-сйдсш

то в итоге должен образовываться ацеташд. Действительно, среди конечных продуктов радшлкза М-алетилзтаноламина идентифицирован ацетамид с радиационно-химическкм выходом 0,9 юлекулЛОО эВ и уксусный альдегид с выходом 0,1 мэлекулЛОО эВ. Аналогичные продукты образовывались и при фогосенскбилизированном разложении И-аштилэтанолаАШна. Расщепление ашдноЯ связи в N-ацетилзтаноламике происходит в результате хоноколекулярного распада ' ' радикалов, с неспареннсй валентностью в

Р-лолсхёнии к ашдной связи. Так как радиолитические превращения амфифильных глицеридоз протекают по сходным закономерностям с теш, какие установлены для водорастворимых глицеридсв, то по аналогии с водорастворимым Ы-ацетилзтанолашном сфингомиелин при облучений его водной дисперсии может претерпевать сзободноради-кальную фрагментацию с образованием стеароиламида

С целью проверки этого предположения нами был изучен радио-лиз водной дисперсии С)-эритрз-2;-Ь'~стеароилсфкнгазил-1-фосфохолина. Среди конечных продуктов радиолиза исследуемого соединения идентифицирован стеароиламид (см. рис.Ш, величина радиационно-химического выхода которого для дисперсии с концентрацией исходного веиества 6 М составила 0,1=0,01 молекулЛ00 зВ. Кроме того установлено, что стеароиламид образуется и при УФ-облучении образца в присутствии пероксида водорода. Эти данные служат доказательством свободгарадикального пути его образования. Следовательно, сфингоыиелин. как и другие гидроксилсодержаше фосфолипи-ды. претерпевает при облучении свободяорадикальную фрагментацию. В результате реализации указанного процесса в молекуле данного липида происходит расвдзпленеив C-N и 0-Н связей.

ОСНОВНЫЕ выводы

1., Исследовённы закономерности радиашонно-инициированной Фрагментации производных глицерина обшей формулы СЕ>( ОН) СН( OID CÜ~.C X) (где X » ÚH, ОНЮ3, Cl, NHg, -OC^Hj, -OCOCgH;,) "Показано, что при

L-0X —- R-

^-nho +

облучении водных 0,1 М растворов указанных веществ происходит распад образующихся из них радикалов с элиминированием молекулярного фрагмента ИХ.

2. Сопоставление дачных по образованию конечных продуктов ра-лиогиза водных растворов частично и полностью этерифицированных ■ производных глицерина указывает, что наличие свободных гидроксильных групп в исходных соединениях предопределяет способность образующихся из них радикалов Фрагментировать с разрывом двух Р-связей.

3. Полученные данные по влиянию рН на выходы продуктов фрагментации глииеро-1-фосфата, З-амино-1,2~пропандиола, установленные особенности Фрагментации радикалов ациклических и циклических зфиров глицерина позволили сделать вывод о том, что распад\ радикалов изученных соединений протекает по согласованному механизму с одновременным разрывом двух Р-связей. вииинальных по отношению к радикальному центру.

4. Впервые установлено, что гидроксилсодержаше глицерофосфо-липиды более склонны Фрагментировать при действии излучения на их водные дисперсии за счет распада радикалов с неспареннкы электроном на атоме углерода глицеринового скелета, чем их полностью этерифицировашые аналоги. ■ . , ч

5. Наличие среди конечных продуктов радиолиэа и сенсибилизированного фотолиза водных дисперсий сфингомиелина: --стеароиламида указывает на протекание фрагментации его радикалов, с .разрывом С~НЧ и 0-Н связей. - ^

Основное содержание диссертации изложено з слдяукают работах: 1. Кисель М. А., Еаимечева И. П., Медведев П. Д. ШадыроОЛ И., Юркова И.Л. Ингибирование «-токоферолом свободнорадикального распада сфингомиелииа, кардиолипина и фосфатидилинозита в модельных мембранах. - В сб. тезисов докладов IV конференции СШ\ "Биоантиоксидант"-М.:июнь. 1992.-Т.1.-стр. 74.

2. Юркова И. I., Медведев Н. Д. .Кисель М. А., Шадыро 0. И. ' Влияние биоантиоксидантов на свободнрорадикальную фрагментацию липидпв и их моделируодих соедитнений.- В сб. тезисов докладов IV конференции СНГ Биоантиоксидант-М.:икнь, 1992.-Т. 1.-стр, 21.

3. Кисель М. А., Шадыро 0. И., Юркова И Л.' Радиационна-индуцированныз реакции деструкции липидов и их влияние на функционирование клеточных мембран.-В сб. тезисов докладов Междуна-

19 '

родной конференции "Наука и медицина - Чернобылю" -Минск, 10-13 ноября 1993.-стр. 453—454.

4. Юркоаа И. 1., Кисель М. А., ¡¡¡адыро 0. И. Радиолиз водных растворов биологически активных моноглицеридов. -(Материалы Радиобиологического сьезда.-Киев.-сентябрь, 1993.-Т. 3.-стр. 1126.

5. Ахрем А. А., Кисель М. А., Шадыро 0. И., Кокова И. Я. Радиационно-инициированная свободнорацикальная фрагментация биологически активных глицеридов.-Доклады РАН-июнь. 1993.-Т. 4.стр. 716-718.

6. Срксва И. Л. .«.Кисель М. А. .Шадыро 0. И. Радиолиз биологически активных производных глицерина в растворе и составе липо-сом. -Материалы радиобиологического сьезда-Киев:сентяорь, 1993.Т. 3.-стр.1125.

Рис. 1. Зависимость накопления фосфат-аниона от поглощенной

дозы при радиолизе 0.1 М водного раствора глице-ро-1 -фосфата:

1 - рН 5,3 2'- рН 12,5 3 - рН 1,9.

Рис. 2. Зависимость накопления аммиака от поглотанной дозы при'" радиолизе 0,1 М водного раствора З-амино-1.2-пропандиола: 1 - рН 12 2 - рН 2.

С

С го .

рнс.:^ о ,--, /v 1

Рис. 3. Зависимость накопления ацетона (1) и оксиацетоиа (2) от поглрощенной дозы при радиолизе 0.1 М водного раствора 1,2-ди-О-изопрош.лиденглицерина. Рис. 4. Зависимость накопления гексадециливого спирта (1) и оксиацетона С 2) от поглосэнной дозы при радиолизе 5 10"2 и водной суспензии 1-0-гексадешлглицерина.

Рис.

Рис. 6.

10"^ М водной

Зависимость накопления оксиаштона' от поглоданной дозы при радиолизе 2 Ю-2 М водной суспензии ДОГ: 1 - без добавок. 2 - в присутствии Ю-2 М ацетона, 3 - в присутствии закиси азота. Зависимость накопления от поглощенной дозы

1 - пальмитоксиацетона при радиолизе 2 суспензии лизо-фосфатидилхолина,

2 - стеароилаыида при радиолизе 6 10 М водной суспензии 0-эритро-2-Н-стеароилсфингозил-1 -фссфохолина.