Разработка и развитие методов диффузионной флуоресцентной томографии биологических тканей с плоскопараллельной геометрией сканирования тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.03 ВАК РФ

На правах рукописи

Клешнин Михаил Сергеевич

РАЗРАБОТКА И РАЗВИТИЕ МЕТОДОВ ДИФФУЗИОННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ С ПЛОСКОПАРАЛЛЕЛЬНОЙ ГЕОМЕТРИЕЙ СКАНИРОВАНИЯ

01.04.03 - радиофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

31 ИЮЛ 2014

Нижний Новгород - 2014

005550927

Работа выполнена в ФГБУН Институт прикладной физики Российской академии наук (ИПФ РАН г. Нижний Новгород)

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Турчин Илья Викторович, зав. отд. ФГБУН ИПФ РАН.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук

Агафонов Михаил Игоревич,

с.н.с. ФГБНУ НИРФИ (г. Н. Новгород);

доктор физико-математических наук

Аветисян Юрий Арташесович,

в.н.с. ФГБУН ИПТМУ РАН (г. Саратов).

Ведущая организация:

ФГБУН Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН (ИПЛИТ РАН, г. Троицк).

Защита состоится «_6_» октябпя 2014 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.069.02 при ФГБУН Институт прикладной физики РАН по адресу: 603950, г. Нижний Новгород, ул. Ульянова, д. 46.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН ЙПФ РАН.

Автореферат разослан « 23 » июля 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук, профессор

Ю. В. Чугунов

Актуальность работы

На сегодняшний день известно большое количество методов измерений, достаточно полно и достоверно описывающих исследуемые объекты и процессы, однако задача томографии для визуализации внутренней структуры, скрытой от внешнего наблюдателя, остается одной из основных в различных областях науки. Особое место томографические исследования занимают в современной биомедицине, где они стали незаменимым инструментом для фундаментальных исследований процессов канцерогенеза в живых системах, ранней диагностики онкологических заболеваний и разработки терапевтических методов лечения. В биологии и медицине применяются различные типы томографов (компьютерные, магнитно-резонансные, ультразвуковые и др.), каждый из которых занимает свою нишу в исследованиях. В последнее десятилетие появились мощные и компактные источники света, а также высокочувствительные охлаждаемые фотоприемники, поэтому создание новых флуоресцентных маркеров, которые могут быть встроены в раковые клетки или доставлены к опухоли, привело к развитию флуоресцентного имиджинга и появлению диффузионной флуоресцентной томографии (ДФТ).

Диффузионная флуоресцентная томография является практически идеальным методом для исследования процессов канцерогенеза в организме лабораторных животных. Например, раковые клетки можно трансфициро-вать флуоресцентным белком и привить животному, после чего появляется возможность наблюдать развитие опухоли, процессы метастазирования и результаты лечения. При этом данный метод обладает рядом преимуществ перед традиционной томографией: полная неинвазивность воздействия зондирующего излучения на биоткани, чувствительность к молекулярным событиям для функциональной диагностики, высокая контрастность и хорошее пространственное разрешение изображений, а также относительно низкая стоимость оборудования и компактная конструкция томографа.

Развитием методов ДФТ занимается большое число научных групп по всему миру. Однако вопрос оптимальной реализации ДФТ - систем остается открытым. Наибольший интерес представляют томографы с плоскопараллельной геометрией измерений благодаря максимальной компактности и широкой вариативности конструкции. Однако, вне зависимости от конфигурации ДФТ - системы, существующие методы требуют увеличения точности восстановления пространственного распределения флуорофора в теле животных, поскольку сильное рассеяние света приводит к плохой обусловленности обратной задачи томографии. Другой актуальной проблемой диффузионной флуоресцентной томографии является собственная флуоресценция биотканей, которая существенно снижает точность восстановления послойных флуоресцентных изображений животного и ограничивает максимальную чувствительность данного метода.

Цель работы

Целью диссертационной работы является развитие диффузионной флуоресцентной томографии лабораторных животных и разработка методов томографических измерений с гаюскопараллельной геометрией измерений.

Для достижения поставленной цели были разработаны: метод томографических измерений на основе проекционной флуоресцентной визуализации, и метод симметрично-направленных спектроскопических измерений, который основан на спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии с экспериментальной оценкой оптических свойств объекта. Для технической реализации предложенных методов была разработана и создана экспериментальная установка для флуоресцентного ими-джинга мелких лабораторных животных с плоскопараллельной геометрией измерений. В целях апробации разработанных методов была проведена серия экспериментальных исследований модельных объектов и животных.

Научная новизна

1. Впервые разработан и реализован метод томографических измерений на основе проекционной флуоресцентной визуализации, который позволяет сократить общее число экспериментальных измерений по сравнению с традиционной диффузионной флуоресцентной томографией и оптимизировать процесс сканирования объекта в плоскопараллельной геометрии с использованием направленного источника света и точечного приемника флуоресценции.

2. Впервые разработан и реализован метод симметрично-направленных спектроскопических измерений на основе спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии с плоскопараллельной геометрией измерений, который позволяет выделять собственную флуоресценцию освещенной поверхности биоткани при отсутствии данных о спектрах поглощения и эмиссии источников автофлуоресценции.

3. Впервые показано, что оценка спектра показателя поглощения света в биоткани по измеренному спектру ослабления света при прохождении через объект в области флуоресценции обеспечивает устойчивость решения задачи спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии относительно погрешности аппроксимации спектра транспортного показателя рассеяния по литературным данным.

4. Впервые разработана и создана установка для имиджинга лабораторных животных, которая позволяет получать флуоресцентные изображения с использованием отражательной и проекционной конфигурации источника и приемника света, а также реализует в себе методы стандартной и спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии для восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера.

5. Впервые проведен мониторинг накопления и выведения фотосенсибилизатора в органах мышей с использованием проекционного флуоресцентного имиджинга.

Практическая значимость работы

Результаты представленной диссертационной работы имеют как научное, так и практическое значение. Разработанный метод томографических измерений на основе проекционного флуоресцентного имиджинга позволяет определять положение и размеры маркированной опухоли в организме мелких лабораторных животных с использованием простой конструкции томографа, которая отличается сравнительно низкой стоимостью оборудования. Предложенный метод симметрично-направленных спектроскопических измерений и применение оценки оптических свойств исследуемого объекта по измеренному спектру показателя ослабления света в области флуоресценции повышают обусловленность обратной задачи спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии и точность восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в присутствии выраженной автофлуоресценции биотканей. Созданная установка для флуоресцентного имиджинга реализует разработанные методы измерений и позволяет проводить современные биомедицинские исследования, которые имеют отдельное научное и практическое значение.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод томографических измерений на основе проекционной визуализации позволяет определять положение и размеры маркированной опухоли в теле мелких животных по набору проекций, полученных в ходе многократного синхронного сканирования объекта в плоскопараллельной геометрии при различных смещениях источника света относительно оси точечного приемника флуоресценции.

2. Использование синхронного сканирования направленным источником света и точечным приемником флуоресценции позволяет оптимизировать томографические измерения в плоскопараллельной геометрии и значительно сократить количество неинформативных измерений по сравнению со стандартной диффузионной флуоресцентной томографией, в которой применяется CCD камера.

3. Использование симметрично-направленных спектроскопических измерений позволяет решить задачу спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии в присутствии автофлуоресценции среды с неизвестным спектром эмиссии, даже когда ее уровень сравним с уровнем флуоресценции маркера.

4. Оценка оптических свойств биоткани по измеренному спектру ослабления света в исследуемом объекте обеспечивает устойчивость решения

5

задачи спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии относительно ошибок аппроксимации спектра транспортного показателя рассеяния по литературным данным при отсутствии априорной информации о спектре поглощения света. 5. Экспериментальная установка для флуоресцентного имиджинга позволяет проводить мониторинг эволюции маркированных областей в теле лабораторных животных с использованием отражательной и проекционной конфигурации источника и приемника света, а также определять положение и размеры маркированных областей на основе разработанных методов томографических измерений.

Публикации и апробация результатов

По результатам, вошедшим в диссертационную работу, опубликовано 42 работы: 1 глава в книге, 9 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, 16 статей в сборниках трудов конференций, 12 тезисов докладов и 4 патента на изобретения. Результаты представленной диссертации обсуждались на семинарах Института прикладной физики РАН и докладывались на российских и международных конференциях:

XIII научная школа «Нелинейные волны», Н. Новгород, Россия, 2006

• XII нижегородская сессия молодых ученых, Н. Новгород, Россия, 2007. International symposium «Topical problems of biophotonics», H. Новгород

- Москва - Н. Новгород, Россия, 2007.

• XI International school for junior scientists and students on optics, laser physics and biophysics «Saratov Fall Meeting», Саратов, Россия, 2007.

XIII нижегородская сессия молодых ученых, Н. Новгород, Россия, 2008.

XIV нижегородская сессия молодых ученых, Н. Новгород, Россия, 2009. IV International graduate summer school «Biophotonics», Швеция, 2009.

• International symposium «Topical problems of biophotonics», H. Новгород

- Самара - H. Новгород, Россия, 2009.

SPIE Photonics west, Сан-Франциско, США, 2010.

• European conference on biomedical optics, Мюнхен, Германия, 2011. International symposium «Topical problems of biophotonics», С.-Петербург

- H. Новгород, Россия, 2011.

• V троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине», Троицк, Россия, 2012.

• International symposium «Topical problems of biophotonics», H. Новгород

- Ярославль - Казань - Н. Новгород, Россия, 2013. SPIE Photonics west, Сан-Франциско, США, 2014.

Личный вклад автора

Все научные и практические результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены либо лично автором, либо при его непо-

средственном участии. Он активно участвовал в теоретической разработке, технической реализации и экспериментальной апробации опубликованных методов. Автору лично принадлежат идеи и реализации метода симметрично-направленных спектроскопических измерений для выделения автофлуоресценции биотканей и метода оценки оптических свойств биоткани по спектру показателя ослабления света в области флуоресценции. Он является полноправным соавтором метода томографических измерений с применением направленного источника и точечного приемника света, а также конструкции экспериментальной установки для флуоресцентного ими-джинга. Автор принимал непосредственное участие в экспериментальных исследованиях на животных, а большинство модельных экспериментов были поставлены и проведены им лично.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа включает в себя введение, четыре главы, заключение и список использованной литературы. Полный объем работы составляет 111 страниц, включая 32 рисунка, 1 таблицу и 107 наименований цитируемой литературы, в том числе 17 авторских работ.

Краткое содержание диссертации

Во ВВЕДЕНИИ обоснована актуальность темы диссертационной работы, определена цель работы, ее практическая значимость и научная новизна, а также сформулированы положения, выносимые на защиту, приведена структура диссертационной работы и ее краткое содержание.

ПЕРВАЯ ГЛАВА диссертации посвящена физическим принципам визуализации внутренней структуры биологических объектов.

В разделе 1.1 сформулирована задача томографии биотканей и ее место в современной биомедицине. Здесь описана идея вычислительной томографии, которая основана на предположении, что внутренняя структура исследуемого объекта может быть охарактеризована некоторой функцией пространственных координат f(x,y). Соответственно, задачей томографии является восстановление данной функции по набору ее проекций FR(p, ф):

В настоящее время традиционные методы томографии (компьютерная, ультразвуковая, магнитно-резонансная и позитронно-эмиссионная) стали незаменимым инструментом для своевременной диагностики наиболее опасных заболеваний и наблюдения эффективности лечения пациента. Актуальным направлением развития биомедицинской томографии является разработка оптических методов визуализации внутренней структуры биотканей, которые отличаются сравнительно низкой стоимость оборудования и полной

безвредностью зондирующего излучения. Современные методы оптической диффузионной томографии позволяют исследовать биоткани на глубинах 10 - 100 мм с пространственным разрешением 0.5 - 10 мм. При этом контрастность оптических изображений может быть существенно улучшена при использовании флуоресцентной маркировки интересующих структур исследуемого объекта.

Раздел 1.2 посвящен флуоресцентной визуализации биотканей, которая основана на регистрации возбужденной флуоресценции при сканировании исследуемого объекта зондирующим излучением. Большинство биотканей флуоресцируют под действием света ввиду присутствия в них естественных флуорофоров, однако наиболее широкое распространение получили методы визуализации экзогенных флуорофоров (красители, флуоресцентные белки, квантовые точки и др.), которые позволяют проводить селективную маркировку структур. Для отображения флуоресценции на поверхности биотканей применяются системы с отражательной конфигурацией источника и приемника света, а для визуализации глубинной флуоресценции используется проекционная геометрия, однако полную информацию о распределении флуоресцентного маркера позволяет получить только диффузионная флуоресцентная томография. ДФТ является двухэтапным методом: сначала исследуемый объект просвечивается зондирующим излучением для возбуждения флуоресценции, которая регистрируется при различных положениях источника и приемника света, а далее решается обратная задача. При этом для проведения измерений применяются две геометрии сканирования: круговая и гаюскопараллельная. В настоящей диссертационной работе рассматривается плоскопараллельная конфигурация ДФТ системы, поскольку она отличается низкой стоимостью оборудования, а также компактностью и широкой вариативностью конструкции. Основными научными проблемами ДФТ являются плохая обусловленность обратной задачи томографии вследствие сильного рассеяния света биотканями и автофлуоресценция исследуемого объекта, которая снижает точность восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера.

В разделе 1.3 сформулированы основные выводы по первой главе диссертационной работы, которые показали, что основные научные проблемы ДФТ не решены до конца для широкого использования томографов практической биомедициной, поэтому разработка и развитие методов ДФТ является перспективным направлением научных исследований.

ВТОРАЯ ГЛАВА диссертационной работы посвящена диффузионной флуоресцентной томографии биологических объектов с плоскопараллельной геометрией сканирования.

В разделе 2.1 представлена математическая формулировка задачи восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в мутной среде, которая выражается в виде интегрального уравнения Фред-гольма первого рода относительно неизвестной концентрации флуорофора:

P(.rSlrD) = ^ f y(As)C(r)E(r - rs,Ás)E(rD - r,AF) d3r,

v

где C(r) - распределение флуоресцентного маркера по объему объекта V, P(?S'?d) ~ мощность зарегистрированной флуоресценции для заданного положения источника света rs и приемника rD, E(fD — f, Я) - пространственная облученность точечного источника с единичной мощностью излучения Р\, y(As) - произведение квантового выхода флуорофора и его сечения поглощения на длине волны зондирующего излучения As, Ps - мощность зондирующего излучения, Г - апертура приемника света. Для решения данного уравнения исследуемый объект разбивается на воксели, в пределах которых все величины считаются постоянными, что позволяет свести интегральное

уравнение к системе линейных алгебраических уравнений (СЛАУ):

м

m^FuCj, Cj > о, 1=1

где Pi - вектор томографических измерений, N - число измерений, М - количество вокселей, c¡ - вектор количества флуорофора, FÉJ- - функция размытия точки, определяющая вклад j-й компоненты в i-e измерение. При этом точность восстановления пространственного распределения флуорофора, в первую очередь, зависит от точности расчета светового поля, которое определяет значения элементов весовой матрицы СЛАУ задачи ДФТ.

Источник излучения

Приемник излучений

Мутная среда

ДФТ с плоскопараллельной геометрией измерений

Распределение " флуорофора

х.

Рис. 1. Схема метода

Раздел 2.2 посвящен методам расчета светового поля в мутной среде на основе уравнения переноса излучения (УПИ) [Исгшару А., 1981]: (\д \

Ь д1+ п7)/(г'п'я) + + п, С, Я) =

аЛХ) С

= I /(г, п', Ь, Х)р(п', п, X) АПп, + (}(г, п, С).

4п

Здесь /(г,п,£,Я) - лучевая интенсивность излучения, р(п',п,А) - индикатриса рассеяния, которая описывает плотность вероятности рассеяния фотона го направления п' в направление п, ^а(Я) и ¡13 (Я) - показатели

поглощения и рассеяния света в среде, Q(r,n, t) - плотность мощности источников излучения, V - скорость света в мутной среде. В общем случае данное уравнение не имеет аналитического решения, поэтому для расчета светового поля в биоткани используются приближенные решения УПИ. Вблизи границ биоткани пространственную облученность можно описать в рамках малоуглового приближения УПИ [Кляцкин В.И., 1980], поскольку большинство тканей отличаются сильной анизотропией рассеяния. Однако по мере распространения света в биоткани многократное рассеяние приводит к размытию коллимированного пучка и, начиная с расстояния, превышающего транспортную длину (расстояние, на котором фотон «забывает» о первоначальном направлении: 1-2 мм), угловая диаграмма рассеянного излучения становится близкой к изотропной. В этих условиях световое поле может быть описано в рамках диффузионного приближения УПИ [Вгеттег #., 1964]. Для корректного учета перехода малоуглового рассеяния в диффузное световое поле можно использовать гибридную модель переноса излучения, в которой выражение для облученности содержит направленную и диффузную компоненты {Долин Л.С., 2001]. Таким образом, гибридная модель повышает точность расчета светового поля в биоткани, что позволяет снизить погрешность вычисления весовой матрицы задачи ДФТ.

В разделе 2.3 описаны методы решения систем линейных уравнений, которые применяются для восстановления пространственного распределения флуорофора в мутной среде. Здесь показано, что характерной особенностью задачи ДФТ является очень большой размер (количество элементов более 106) и плохая обусловленность (число обусловленности превышает 1017) весовой матрицы СЛАУ. Кроме того данная система уравнений, как правило, переопределена или недоопределена. Таким образом, для решения задачи ДФТ применяются итерационные алгоритмы:

¿(fc+D = w^wy

где - сжимающий оператор. Наиболее широкое распространение

получили алгоритмы алгебраической реконструкции (ART - algebraic reconstruction technique) [Терещенко С. A., 2004] и метод сопряженных градиентов (CGT - conjugate gradients technique) [Бахвалов Н.С., 1973]. Достоинством алгоритма CGT является быстрая сходимость к устойчивому решению. При этом полученное решение будет совпадать с точным решением СЛАУ после выполнения конечного числа итераций. Однако для применения метода CGT необходима процедура симметризации СЛАУ, которая ухудшает обусловленность задачи. Таким образом, если СЛАУ «зашумлена» или размер матрицы имеет порядок 107 и более, целесообразно использовать метод ART и его модификации, которые не требуют симметризации СЛАУ. Кроме того ART позволяет решать недоопределенные системы уравнений.

В разделе 2.4 представлен разработанный метод томографических измерений на основе проекционной флуоресцентной визуализации. Основная

идея данного метода заключается в многократном синхронном сканировании области флуоресценции направленным источником света и точечным приемником. При этом для поиска области детального исследования проводится предварительное сканирование исследуемого объекта при соосном положении источника и приемника, а для получения каждой новой проекции, источник света необходимо смещать относительно оси приемника. Полученный набор смещенных проекций можно использовать для решения задачи ДФТ, если отношение уровня сигнала к дисперсии шума будет достаточно высоким, и в случае, когда дисперсия шума не превосходит характерного изменения зарегистрированной интенсивности флуоресценции для соседних вокселей дискретизации объекта, точность восстановления пространственного распределения флуорофора будет определяться размером вокселя. Таким образом, предложенный метод позволяет создать томограф, который обеспечивает оптимальную информативность измерений, а также отличается простой конструкцией и низкой стоимостью комплектующих. При этом проведенный анализ функции размытия точки в биотканях показал, что оптимальный размер вокселя дискретизации при исследовании мелких лабораторных животных находится в пределах 0.5 - 1 мм.

х [мм] х [мм] z [мм]

Рис. 2. Результаты восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в мутной среде по набору смещенных проекций флуоресцирующей области. Пунктирной линией обозначены исходные границы распределения флуоресцентного маркера в исследуемом объекте

В разделе 2.5 приведены результаты апробации разработанного метода томографических измерений на основе проекционного имиджинга в численном эксперименте по многократному сканированию биологического фантома с ограниченной областью флуоресценции. Полученные результаты продемонстрировали возможность восстановления пространственного распределения флуорофора в мутной среде толщиной 10 - 14 мм с точностью до 0.5 мм для маркированной области размером от 2 мм в случае, когда уровень автофлуоресценции среды много меньше интенсивности флуоресценции маркера, а дисперсия шума не превосходит 10% от уровня сигнала.

В разделе 2.6 сформулированы основные выводы по второй главе диссертации, которые показали, что качество восстановления пространствен-

ного распределения флуорофора определяется точностью расчета светового поля внутри исследуемого объекта и характеристиками алгоритма решения обратной задачи томографии. При этом наиболее простая конструкция томографа, которая обеспечивает оптимальную информативность измерений, может быть реализована на основе проекционного имиджинга.

ТРЕТЬЯ ГЛАВА диссертационной работы посвящена спектрально-раз-решенной диффузионной флуоресцентной томографии биотканей.

В разделе 3.1 показано, что при распространении света в биоткани, его спектр будет искажаться, поскольку оптические свойства тканей зависят от длины волны, и чем больше расстояние от источника света до приемника, тем сильнее будет выражено искажение. Таким образом, по спектру флуоресценции можно определить пространственное распределение флуорофора \Axelsson 1, 2007]. Эта идея лежит в основе спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии, в которой регистрируется спектральная мощность флуоресценции при различных положениях источника и приемника. Соответственно, задача СДФТ сводится к СЛАУ для спектроскопических измерений, при этом методы расчета светового поля в среде и алгоритмы решения СЛАУ успешно переносятся из ДФТ с учетом зависимости оптических свойств объекта от длины волны. Главным преимуществом СДФТ перед ДФТ является улучшение обусловленности обратной задачи томографии и возможность селекции флуорофоров по спектру эмиссии. Основная научная проблема СДФТ связана с собственной флуоресценцией биотканей, которая приводит к дополнительным искажениям спектра регистрируемого света и существенной погрешности при восстановлении пространственного распределения флуорофора. Стандартный метод СДФТ позволяет выделить автофлуоресценцию среды, только когда известны ее спектры поглощения и эмиссии. В диссертационной работе предложен оригинальный метод симметрично-направленных спектроскопических измерений, который позволяет выделить автофлуоресценцию с неопределенными характеристиками. Идея разработанного метода основана на предположении, что собственная флуоресценция среды вносит одинаковое искажение А1 в спектры излучения р?^0 и (симметрично-направленные измерения), измеренные до и после взаимной перестановки источника и приемника света, поэтому задачу СДФТ можно разделить на две СЛАУ:

м

7=1 м

¡=1

А1 > 0, с, > О,

для восстановления трехмерного изображения распределения флуоресцентного маркера и двумерной проекции источников автофлуоресценции. Данный метод предназначен для исследования различных биологических объектов с замкнутой поверхностью (животные, органы и др.), поскольку наибольшее искажение в спектр зарегистрированного света вносит автофлуоресценция освещенной поверхности, которая слабо варьируется при перестановке источника и приемника света. При этом для увеличения точности решения задачи СДФТ в разработанном методе используются экспериментальные измерения показателя ослабления белого света в области флуоресценции, которые позволяют восстановить спектр поглощения света для аппроксимированного спектра транспортного показателя рассеяния. Предложенный способ оценки оптических свойств среды позволяет определить спектры поглощения и рассеяния света в исследуемом объекте таким образом, чтобы они обеспечивали реальную зависимость показателя ослабления оптического излучения от длины волны.

Рис. 3. Схема симметрично-направленных измерений

Раздел 3.2 посвящен апробации разработанного метода симметрично-направленных спектроскопических измерений на результатах численного эксперимента, в котором моделировалось синхронное сканирование биоткани лазером и спектрометром. Исследуемый объект представлял собой слой мутной среды, внутри которой находился флуоресцирующий шар, а на границах были распределены источники автофлуоресценции. Результаты решения обратной задачи томографии по смоделированным измерениям показали, что автофлуоресценция объекта приводит к существенному размытию восстановленного распределения флуоресцентного маркера при использовании стандартной ДФТ. Однако метод симметрично-направленных измерений продемонстрировал возможность локализации маркированной области размером от 2 мм с точностью до 0.5 мм в мутной среде толщиной 10 — 14 мм, когда уровень собственной флуоресценции среды сравним с интенсивностью флуоресценции маркера, а дисперсия шума не превосходит

10% от уровня флуоресцентного сигнала. При этом оценка оптических свойств объекта по спектру ослабления света в области флуоресценции обеспечила устойчивость решения задачи СДФТ относительно погрешности аппроксимации показателя рассеяния света по литературным данным.

X [мм] г [мм]

х [мм] г [мм]

Рис. 4. Результаты восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в плоском слое автофлуоресцирующей среды с использованием традиционной ДФТ (вверху) и метода симметрично-направленных спектроскопических измерений {внизу). Пунктирными линиями обозначены исходные границы распределения флуоресцентного маркера и источников собственной флуоресценции среды

В разделе 3.3 сформулированы основные выводы по третьей главе диссертационной работы, которые показали, что использование симметрично-направленных спектроскопических измерений и экспериментальной оценки оптических свойств исследуемого объекта позволяет существенно повысить точность восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в автофлуоресцирующей мутной среде с неизвестными оптическими свойствами.

ЧЕТВЕРТАЯ ГЛАВА диссертационной работы посвящена экспериментальным исследованиям модельных сред и биологических объектов с использованием разработанных методов для флуоресцентного имиджинга.

В разделе 4.1 представлена разработанная экспериментальная установка для исследования мелких лабораторных животных, которая позволяет получать флуоресцентные изображения с использованием отражательной и

проекционной конфигурации источника и приемника света, а также реализует в себе методы стандартной и спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии. Для возбуждения флуоресценции исследуемого объекта в экспериментальной установке используются светодиоды и источники лазерного излучения с волоконным выходом, при этом для регистрации флуоресценции применяются охлаждаемые высокочувствительные приемники: ФЭУ и спектрометр с волоконными входами, а также CCD камера с объективом. Для отделения флуоресценции от зондирующего излучения, на объектив CCD камеры и волоконный вход ФЭУ установлены полосовые интерференционные фильтры, а аппаратная часть томографа помещена в «черную камеру» для исключения влияния сторонних источников света. При этом для проведения томографических измерений в экспериментальной установке применяются две двухкоординатные подвижки, одна из которых определяет положение волоконного выхода лазера, а другая позволяет перемещать волоконные входы спектрометра и ФЭУ. Управление томографом осуществляется на компьютере через АЦП-ЦАП.

Раздел 4.2 посвящен апробации проекционной флуоресцентной визуализации на модельных объектах и лабораторных животных. Для реализации данного метода в разработанной установке используется синхронное сканирование объекта источником лазерного излучения и ФЭУ. В целях апробации проекционного имиджинга в задаче мониторинга биологических процессов, совместно с ННГУ им. Лобачевского и НижГМА Минздрава России была проведена серия экспериментальных исследований по наблюдению накопления и выведения фотосенсибилизатора в органах и тканях мышей линии СВА, которым были перевиты раковые опухоли РШМ-5. Результаты исследований позволили оценить динамику накопления препарата в раковой опухоли и здоровых тканях животного, а также проследить про-

цесс выведения фотосенсибилизатора из организма, что продемонстрировало эффективность экспериментальной установки для мониторинга процесса

О 15 30 0

х [мм]

Рис. 6. Мониторинг накопления фотосенса в опухоли РШМ-5 (рак шейки матки) слева направо: до введения препарата, через 2 ч, через 48 ч и через 96 ч

доставки флуоресцентного маркера к опухоли. Для реализации томографических измерений на основе проекционного имиджинга в разработанной установке используется многократное синхронное сканирование флуоресцирующей области при различных смещениях лазера относительно оси ФЭУ. В целях апробации данного метода в задаче восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера использовался биологический фантом, выполненный в виде кюветы с водным раствором интралипида и туши, внутри которой находился стеклянный шарик с ФБ Вз11ес12. Результаты решения обратной задачи ДФТ по смещенным проекциям фантома показали высокую точность реконструкции, что подтвердило результаты численного эксперимента по апробации разработанного метода

0 3 6 9 12 х [мм] X [ММ] 7 [мм]

Рис. 7. Результаты восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера в биологическом фантоме с использованием метода ДФТ на основе проекционного флуоресцентного имиджинга. Пунктирной линией обозначены границы исходного распределения флуорофора внутри исследуемого объекта

х = 6 мм

томографических измерений. Для апробации реализованного метода ДФТ в биомедицинских исследованиях, совместно с ИНБИ им. Баха РАН была проведена серия экспериментов по локализации инъекции флуоресцентного белка DsRed2, в тело мыши линии NUDE in vivo. Результаты исследований на лабораторных животных показали удовлетворительную точность вос-

становления пространственного распределения флуоресцентного маркера и продемонстрировали эффективность метода томографических измерений на основе проекционного имиджинга для определения положения и размеров маркированной опухоли в теле животного, когда интенсивность флуоресценции многократно превосходит уровень собственной флуоресценции органов и тканей исследуемого животного.

Z = 1 мм

30|

-g-25 JL

^20

15 —i—I

2 [ММ]

Рис. 8. Результаты восстановления размеров и положения инъекции флуоресцентного белка DsRed2, в теле мыши NUDE in vivo

В разделе 4.3 представлены результаты исследования модельных и биологических объектов с использованием симметрично-направленных измерений и оценки оптических свойств мутной среды по спектру ослабления света в области флуоресценции. Для реализации разработанного метода в экспериментальной установке применяется синхронное сканирование объекта лазером и спектрометром, а симметрично-направленные измерения выполняются с помощью поворота объекта на 180° вокруг вертикальной оси с сохранением области сканирования. Для оценки оптических свойств объекта к установке подключается ксеноновая лампа, и проводятся измерения спектра ослабленного белого света при соосном положении лампы и спектрометра. Для апробации данных методов в задаче восстановления пространственного распределения флуоресцентного маркера использовалась модель биоткани, выполненная из нескольких слоев силикона, между которыми был помещен стеклянный шарик с раствором красителя Оксазин-17. Автофлуоресценция исследуемого объекта моделировалась слоями бумаги на его границах, а параметры распространения света в фантоме были определены с помощью предложенного метода оценки оптических свойств мутной среды. Как и ожидалось, результаты восстановления пространственного распределения флуорофора с применением стандартной СДФТ показали высокую погрешность локализации, вследствие сильной собственной флуоресценции фантома. В то время как разработанный метод симметрично-направленных измерений продемонстрировал высокую точность определения положения и размеров флуоресцирующей области, а ошибка реконструкции не превысила линейный размер вокселя дискретизации объекта. В целях апробации метода симметрично-направленных спек-

25 х [мм]

троскопических измерений в биомедицинских исследованиях, совместно с ННГУ им. Лобачевского были проведены эксперименты по локализации

12.5 мм

16

s 1 8 х

4 О

16 _12

8

^

4

Mil;

г г

lili i i < ■ ■ i

О 4

8

х [мм]

х = 8.5 мм

О

12 16 I

z = 4.5 мм

Л. 8 4 О

--J-£-,-

;; О .. .1. .J

—; Т«

0 4 £ 12

z [мм]

О 4 8 12 16

16

12

£ Л, 8 щр.....:

4

0.

z [мм]

X [мм]

Рис. 9. Результаты восстановления пространственного распределения флуорофора с использованием стандартной СДФТ (вверху) и разработанного метода симметрично-направленных измерений (внизу). Пунктирной линией обозначены исходные границы области флуоресценции

опухоли, маркированной ФБ Katuska, в теле лабораторных животных (мыши NUDE). Результаты исследований на животных с применением методов СДФТ подтвердили результаты экспериментов на модельных объектах и продемонстрировали существенное увеличение точности восстановления пространственного распределения флуорофора при использовании симметричных проекций, которые позволяют выделять автофлуоресценцию.

z = 3.5 мм

ю 20 ÓÜ 0 4 8 12

* М z [мм]

Рис. 10. Результаты восстановления размеров и положения раковой опухоли, маркированной флуоресцентным белком Katushka, в теле мыши NUDE in vivo

В разделе 4.4 сформулированы выводы по четвертой главе диссертации, которые показали, что разработанная установка для флуоресцентного ими-джинга позволяет проводить современные биомедицинские исследования in vivo. При этом методы флуоресцентной визуализации и томографии, реализованные в экспериментальной установке, позволяют получать двумерные и трехмерные изображения распределения флуорофора с хорошим пространственным разрешением и высокой точностью восстановления.

В ЗАКЛЮЧЕНИИ представлены основные результаты, полученные в ходе выполнения настоящей диссертационной работы:

1. Разработан метод томографических измерений на основе проекционной флуоресцентной визуализации для восстановления пространственного распределения флуорофора в биотканях по набору двумерных проекций, полученных в ходе многократного синхронного сканирования области флуоресценции в плоскопараллельной геометрии при различных смещениях направленного источника света относительно оси точечного приемника флуоресценции. Результаты апробации разработанного метода показали возможность определения положения и размеров 2-4 мм флуоресцирующей области с точностью 0.5 - 1 мм в мутной среде толщиной 10-14 мм, если дисперсия шума не превосходит 10% от уровня сигнала на каждой проекции. Использование данного метода для исследования лабораторных животных позволяет оптимизировать томографические измерения и сократить количество неинформативных данных по сравнению со стандартной диффузионной флуоресцентной томографией.

2. Разработан метод симметрично-направленных спектроскопических измерений на основе спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии с плоскопараллельной геометрией сканирования, который улучшает обусловленность обратной задачи и позволяет восстановить распределение флуоресцентного маркера в присутствии автофлуоресценции исследуемого объекта с неопределенным спектром эмиссии. Результаты апробации разработанного метода в численном эксперименте продемонстрировали возможность локализации маркированной области размером от 2 мм с точностью до 0.5 мм в мутной среде толщиной 10-14 мм, когда уровень собственной флуоресценции среды сравним с интенсивностью флуоресценции маркера, а дисперсия шума не превосходит 10% от уровня флуоресцентного сигнала.

3. Предложен метод оценки оптических характеристик мутной среды по измеренному спектру ослабления света в области флуоресценции, который основан на восстановлении спектра поглощения для аппроксимированной зависимости транспортного показателя рассеяния света от длины волны. Результаты апробации предложенного метода в численном эксперименте продемонстрировали устойчивость решения обратной задачи спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной

томографии относительно ошибок аппроксимации транспортного показателя рассеяния света по литературным данным, при этом для точной аппроксимации спектра рассеяния погрешность восстановления спектра показателя поглощения определятся ошибками расчета светового поля в среде.

4. Разработана экспериментальная установка для исследования мелких лабораторных животных, которая позволяет получать двумерные флуоресцентные изображения с использованием отражательной и проекционной конфигурации источника и приемника света, а также реализует в себе методы стандартной и спектрально-разрешенной диффузионной флуоресцентной томографии для восстановления пространственного распределения флуорофора. Результаты апробации разработанной установки на биологических фантомах и лабораторных животных продемонстрировали эффективность конструкции томографа для локализации маркированных опухолей в организме лабораторного животного и проведения мониторинга эволюции флуоресцирующих областей в реальном времени.

Список публикаций по теме диссертационной работы

1. Savitsky А.Р., Meerovich I.G., Zherdeva V.V., Arslanbaeva L.R., Burova O.S., Sokolova D.V., Treshchalina E.M., Baiyshnikov A.Yu., Fiks I.I., Orlova A.G., Kleshnin M.S., Turchin I.V., Sergeev A.M. Three-dimensional in vivo imaging of tumors expressing red fluorescent proteins / in book «In vivo cellular imaging using fluorescent proteins: Methods and protocols» / Edited by Hoffman R.M. - NJ. Humana Press, 2012 - P. 97-114.

2. Turchin I.V., Plehanov V.I., Orlova A.G., Kamensky V.A., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V., Shakhova N.M., Balalaeva I.V., Savitsky A.P. Fluorescence diffuse tomography of small animals with DsRed2 fluorescent protein // Las. Phys. - 2006. - Vol. 16(5). - P. 741-746.

3. Turchin I.V., Balalaeva I.V., Vasil'ev R.B., Zlomanov V.P., Plehanov V.I., Orlova A.G., Zagaynova E.V., Kamensky V.A., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V., Dorofeev S.G., Dirin D.N. Imaging of QDs-labeled tumors in small animals by fluorescence diffuse tomography II Las. Phys. Let. - 2006. - Vol 3(4).-P. 208-211.

4. Turchin I.V., Kamensky V.A., Plehanov V.I., Orlova A.G., Kleshnin M.S., Fiks I.I., Shirmanova M.V., Meerovich I.G., Arslanbaeva L.R., Jerdeva V.V., Savitsky A.P. Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals // J. Biomed. Opt. - 2008. -Vol. 13(4).-P. 041310/1-10.

5. Загайнова E.B., Ширманова M.B., Сироткина M.A., Балалаева И.В., Клешнин М.С., Турчин И.В., Седакова JI.A., Романенко В.И., Трещалина Е.М. Мониторинг накопления фотосенсибилизаторов в опу-

холи методом диффузионной флуоресцентной томографии // Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - Т. 7(4). - С. 30-35.

6. Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Сироткина М.А., Клешнин М.С., Орлова А.Г., Балалаева И.В. Визуализация экспериментальных опухолей на установке для диффузионной флуоресцентной томографии // Альманах клинической медицины. - 2008. - Т. 17(1). - С. 128-131.

7. Ширманова М.В., Сироткина М.А., Клешнин М.С., Турчин И.В., Снопова Л.Б., Орлова А.Г., Балалаева И.В., Загайнова Е.В., Трещалина Е.М. Визуализация экспериментальных опухолей с использованием фотосенса на флуоресцентном диффузионном томографе // Нижегородский медицинский журнал. - 2008. - Т. 4. - С. 7-12.

8. Kleshnin M.S., Turchin I.V. Spectrally resolved fluorescence diffuse tomography of biological tissues // Quantum Electron. - 2010. - Vol. 40(6). - P. 531-537.

9. Shirmanova M.V., Zagaynova E.V., Sirotkina M.A., Snopova L.B., Balalaeva I.V., Krutova I.V., Lekanova N.Yu., Turchin I.V., Orlova A.G., Kleshnin M.S. In vivo study of photosensitizers pharmacokinetics by fluorescence transillumination imaging // J. Biomed. Opt. - 2010. - Vol. 15(4) -P. 048004/1-8.

10. Kleshnin M.S., Turchin I.V. Fluorescence diffuse tomography technique with autofluorescence removal based on dispersion of biotissue optical properties // Las. Phys. Lett. - 2013. - Vol. 10(7). - P. 0756011-0756016.

11. Turchin I.V., Savitsky A.P., Kamensky V.A., Plehanov V.l., Orlova A.G., Sergeeva E.A., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V. Frequency domain fluorescent diffuse tomography of small animals with DsRed2-expressed tumors // SPIE Proc. - 2006. - Vol. 6098. - P. 60980C/1-8.

12. Orlova A.G., Turchin I.V., Kamensky V.A., Plehanov V.l., Balalaeva I.V., Sergeeva E.A., Shirmanova M.V., Kleshnin M.S. Frequency domain fluorescence diffuse tomography of small animals // SPIE Proc. - 2007. - Vol. 6534.-P. 65343G/1-8.

13. Turchin I.V., Savitsky A.P., Kamensky V.A., Plehanov V.l., Meerovich I.G., Arslanbaeva L.R., Jerdeva V.V., Orlova A.G., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V., Fiks I.I. Fluorescence diffuse tomography for detection of RFP-expressed tumors in small animals // SPIE Proc. - 2007. - Vol. 6449. - P. 644915-644922.

14. Turchin I.V., Savitsky A.P., Kamensky V.A., Plehanov V.l., Orlova A.G., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V., Fiks I.I., Popov V.O. Fluorescence diffuse tomography for detection of RFP-expressed tumors in small animals // SPIE Proc. - 2007. - Vol. 6626. - P. 66260R/1-8.

15. Balalaeva I.V., Turchin I.V., Orlova A.G., Plekhanov V.l., Shirmanova M.V., Kleshnin M.S., Fiks I.I., Zagainova E.V., Kamensky V.A. Diffuse fluorescence tomography of exo- and endogenously labeled tumors // SPIE Proc. - 2007. - Vol. 6734. - P. 67340K/1-8.

16. Kleshnin M.S., Kamensky V.A., Orlova A.G., Plehanov V.I., Turchin I.V. Development of experimental setup for diffuse fluorescent tomography // Proc. of International Symposium «Topical problems of biophotonics». -2007.-P. 113-114.

17. Turchin I.V., Savitskiy A.P., Kamenskiy V.A., Plehanov V.I., Orlova A.G., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V., Fiks I.I. Diffuse fluorescence tomography for detection of RFP-expressed tumors in small animals // Proc. of International Symposium «Topical problems of biophotonics». - 2007. - P. 79-80.

18. Fiks I.I., Kirillin M.Yu., Sergeeva E.A., Kleshnin M.S., Turchin I.V. Reconstruction of fluorophore distribution for fluorescence diffuse tomography based on hybrid model // SPIE Proc. - 2009. - Vol. 7369. - P. 73690B/1-7.

19. Kleshnin M.S., Turchin I.V., Fiks I.I., Kamensky V.A. Fluorescence diffuse tomography for monitoring tumor growth in small animals // Proc. of 4th International Graduate summer school «Biophotonics». - 2009. - published online: http://www.biop.dk/biophotonics09/poster/kleshnin_summary.pdf.

20. Kleshnin M.S., Kamensky V.A., Turchin I.V. Fluorescence tomography for small animal imaging with RFP-expressing tumors based on dispersion of biotissue absorption // Proc. of International Symposium «Topical problems of biophotonics». -2009. - P. 105-106.

21. Turchin I.V., Kleshnin M.S., Orlova A.G., Fiks I.I., Meerovich I.G., Savitsky A.P. Fluorescence imaging for detection of RFP-expressed tumors in small animals // Proc. of International Symposium «Topical problems of biophotonics». - 2009. - P. 80-81.

22. Kleshnin M.S., Fiks I.I., Turchin I.V., Balalaeva I.V., Savitsky A.P. Small animal fluorescence imaging with lifetime and spectral resolution for detection of RFP-expressed tumors // Proc. of International Symposium «Topical problems of biophotonics». - 2011. - P. 65-66.

23. Клешнин M.C., Турчин И.В. Использование дисперсии оптических параметров биотканей для постановки и решения обратной задачи диффузионной флуоресцентной томографии // Материалы V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине». - 2012. -Т. 1.-С. 32-34.

24. Fiks I.I., Kleshnin M.S., Turchin I.V. Reconstruction in fluorescence diffuse tomography based on non-negativity condition // SPIE Proc. - 2013. - Vol. 8799.-P. 87990V/1-7.

25. Kleshnin M.S., Fiks I.I., Orlova A.G., Balalaeva I.V., Shirmanova M.V., Turchin I.V. Versatile system for small animal fluorescence imaging // Proc. of International Symposium «Topical problems of biophotonics». - 2013. -P. 73-74.

26. Fiks I.I., Kleshnin M.S., Turchin I.V. Reconstruction in fluorescence diffuse tomography based on non-negativity condition // Proc. of International Symposium «Topical problems of biophotonics». - 2013. - P. 52-53.

27. 1Ш 2368306 С2. А61В5/05. Устройство получения флуоресцентных томографических изображений. / Турчин И.В., Каменский В.А., Плеханов В.И., Орлова А.Г., Клешнин М.С. - Заявка 2007144338/14. - Дата подачи: 03.12.2007. - Дата публикации: 27.09.2009.

28. ЬШ 2373973 С1. А6Ш5/00. Способ прижизненного исследования фотосенсибилизаторов. / Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Балалаева И.В., Сироткина М.А., Турчин И.В., Клешнин М.С. - Заявка 2008132353/14 -Дата подачи: 07.08.2008. - Дата публикации: 27.11.2009.

29. 1Ш 2441582 С2. А61В5/05. Устройство диффузионной флуоресцентной томографии / Каменский В.А., Турчин И.В., Клешнин М.С., Фикс И.И. - Заявка 2010117525/14. - Дата подачи: 30.04.2010. - Дата публикации: 10.02.2012.

30. ГШ 2515203 С2. 00Ш21/64 Устройство получения томографических флуоресцентных изображений / Клешнин М.С., Турчин И.В., Фикс И.И., Кириллин М.Ю. - Заявка 2012143507/28. - Дата подачи: 12.10.2012. - Дата публикации: 20.04.2014.

Клешнин Михаил Сергеевич

РАЗРАБОТКА И РАЗВИТИЕ МЕТОДОВ ДИФФУЗИОННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ С ПЛОСКОПАРАЛЛЕЛЬНОЙ ГЕОМЕТРИЕЙ СКАНИРОВАНИЯ

Автореферат

Подписано к печати 07.07.2014 г. Формат 60 х 90 'Лб. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 48 (2014).

Отпечатано в типографии Института прикладной физики РАН, 603950 Нижний Новгород, ул. Ульянова, 46