Разработка методических подходов для элементного анализа тканей сердца и сосудов человека методом рентгено-флуоресцентного анализа с использованием синхротронного излучения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

ио34634Э

ЗВЕРЕВА Валентина Викторовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ЭЛЕМЕНТНОГО АНАЛИЗА ТКАНЕЙ СЕРДЦА И СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ РЕНТГЕНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНХРОТРОННОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 ПАР

Новосибирск - 2009

003463491

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте неорганической химии им. A.B. Николаева Сибирского отделения РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук Валентина Александровна Трунова Учреждение Российской Академии Наук Институт неорганической химии им. А.В.Николаева Сибирского отделения РАН

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Дмитрий Иванович Кочубей Учреждение Российской Академии Наук Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

доктор геолого-минерапогических наук Геннадий Никитич Аношин Учреждение Российской Академии Наук Объединенный институт геологии, геофизики и минералогии им. A.A. Трофимука СО РАН

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт геохимии им. А.П. Виноградова СО РАН (г. Иркутск)

Защита диссертации состоится « марта 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.051.01 в Учреждении Российской Академии Наук Институте неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, просп. акад. Лаврентьева, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Институте неорганической химии Сибирского отделения РАН им. A.B. Николаева.

Автореферат разослан « 'й » февраля 2009

г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук

т^ВЛПЙдолинный

ОСНОВНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для определения дефицита или избытка химических элементов в организме человека широко используется информация об уровнях их содержания в сыворотке и плазме крови. Однако, о распределении химических элементов между плазмой крови и органами, являющимися очагами патологических процессов известно очень мало. В работе сердца именно миокард (сердечная мышца) несет основную функциональную нагрузку. Микроэлементы играют ключевую роль в метаболизме миокарда, аккумулирование определенных микроэлементов или их дефицит может привести к развитию сердечно-сосудистых заболеваний. Установление локальных концентраций химических элементов в пораженных и здоровых тканях миокарда и сосудов имеет важное значение для изучения механизмов патологических процессов и является актуальной задачей. Литературные данные о содержании микроэлементов в миокарде и стенках аорты немногочисленны и противоречивы. Наиболее полную информацию о содержании макро- и микроэлементов можно получить на материале аутопсии, однако, наиболее актуальным представляется прямой анализ биопсийного материала (масса образцов < 1 мг, сухой вес) для получения прижизненной информации об элементном составе тканей. Разнообразие типов биотканей, видов патологий, функций отделов сердца диктует необходимость разработки методик анализа для каждого исследуемого объекта (типа ткани). Вышеперечисленные факторы приводят к тому, что содержание одних и тех же элементов в различных исследуемых образцах варьирует зачастую на несколько порядков величины. Метод рентгено-флуоресцентного анализа (РФА) с использованием син-хротронного излучения (СИ) позволяет проводить прямой неразрушаю-щий многоэлементный анализ образцов биотканей. Особенности СИ открывают следующие возможности для РФА: анализ образцов малого объёма и малой массы; снижение пределов обнаружения; проведение анализа с вариацией энергии возбуждающих квантов; большой запас интенсивности при использовании СИ позволяет резко уменьшить толщину образца.

При использовании методов внутреннего и внешнего стандарта для определения концентраций химических элементов в биотканях в основном используются методы мокрого или сухого озоления. Применяются синтетические стандартные образцы, полуэмпирические математические модели - ввиду отсутствия подходящих стандартных образцов. Основным требованием при использовании внешнего стандарта является близость химического состава матриц исследуемого и стандартного образца, а также уровней содержания элементов в них. Однако, в случае, когда содержание одних и тех же элементов в исследуемых образцах варьирует значительно, возникает вопрос о выборе подходящего биологического стандартного образца. Таким образом, оценка возможности применения

стандартных образцов с различной биологической матрицей (не идентичной матрице исследуемого образца) для определения широкого диапазона концентраций химических элементов при анализе биотканей является актуальной задачей.

Цель работы заключалась в разработке методических подходов для РФА-СИ анализа образцов миокарда и стенок сосудов у здоровых людей и пациентов с различными сердечно-сосудистыми патологиями, основываясь на применении способа внешнего стандарта для определения концентраций химических элементов в образцах.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

■ обосновать правомерность использования различных биологических стандартных образцов (матрица которых не идентична биологической матрице исследуемых тканей) для определения широкого диапазона концентраций химических элементов в различных типах мышечных тканей;

■ оценить рассеивающие характеристики матриц образцов и стандартов для обоснования использования стандартных образцов с разной биологической матрицей при определении концентраций химических элементов в разных типах мышечных тканей;

■ определить содержание химических элементов, концентрации которых не аттестованы в используемых стандартных образцах;

■ исследовать эффективность способа учета неидентичности геометрии образцов и стандартов при помощи нормирования площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния, что является необходимым этапом при анализе образцов биопсии;

■ оценить влияние неоднородности распределения химических элементов в используемых стандартных образцах на правильность определения концентраций химических элементов при анализе образцов малой массы (биопсия).

■ разработать методику недеструктивного РФА-СИ определения Б, С1, К, Са, V, Сг, Мп, Ре, N1, Си, Аб, Бе, Вг, Шэ и Бг в применении к образцам стенок сосудов и миокарда человека методом РФА-СИ;

■ апробировать аналитические данные (полученные при разработке методических подходов) при решении задач, поставленных Новосибирским научно-исследовательским институтом патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина для изучения механизмов развития сердечно-сосудистых патологий, выявления возможных предикторов заболеваний для их более эффективной кардиохирургической коррекции.

Научная новизна работы:

• для выбора внешнего стандарта при анализе образцов мышечных тканей методом РФА-СИ были впервые определены коэффициенты относительной спектрометрической чувствительности (по отношению к пику некогерентного рассеяния) для каждого химического элемента в международных биологических стандартных образцах;

• определено количественное содержание химических элементов (V, Мп, Вг, ЯЬ, Бг), концентрации которых не были аттестованы в используемых для РФА-СИ анализа биотканей международных биологических стандартных образцах на основе рассчитанных кривых относительной спектрометрической чувствительности;

• впервые были оценены рассеивающие характеристики матриц образцов мышечных тканей (скелетные мышцы, миокард, сосуды) и различных биологических стандартов для обоснования правомерности использования разных стандартных образцов при РФА-СИ анализе тканей миокарда и сосудов;

• для исследования уникальных образцов, полученных при биопсии (толщина которых варьирует) определена область значений поверхностной плотности, для которой нормирование площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния является эффективным способом учета неидентичности геометрии образцов и стандартов в случае излучателя «промежуточной» толщины.

Практическая значимость работы состоит в разработке методических подходов для определения Б, С1, К, Са, V, Сг, Мп, Ре, N1, Си, Ъп, Лб, Бе, Вг, ЯЬ и Бг в образцах миокарда и стенок сосудов методом внешнего стандарта. Разработанные подходы применены для определения концентраций химических элементов в образцах, полученных при аутопсии и биопсии для: 1) установления физиологической нормы содержания элементов у здоровых людей, 2) определения степени отклонения концентраций элементов у больных при ишемической болезни сердца, пороках сердца и аневризме аорты от их «нормального» физиологического уровня содержания, 3) установления распределения химических элементов по отделам сердца у пациентов при ишемической болезни сердца и у детей с врожденным пороком сердца, а также по зонам миокарда (интактный миокард; зона инфаркта, рубца, периферии инфаркта). Полученные данные могут помочь в изучении механизмов возникновения и развития вышеперечисленных сердечнососудистых патологий, установить возможные элементы-маркеры развития заболеваний, а также позволяют наметить более эффективные способы коррекции заболеваний сердечно-сосудистой системы.

На защиту выносятся:

• методика выбора внешнего стандарта для определения широкого диапазона концентрации химических элементов (от S до Sr) при анализе разных типов мышечных тканей методом РФА-СИ, используя международные биологические стандартные образцы;

• результаты определения концентраций химических элементов, содержание которых не аттестовано в используемых биологических международных стандартных образцах;

• методические подходы к анализу биопсийного материала малой массы методом РФА-СИ.

Личный вклад автора. Автором была проведена экспериментальная работа; произведены расчеты, необходимые для оценки рассеивающих свойств матрицы, коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности и соответствующих кривых, пределов обнаружения, концентраций химических элементов; проведена оценка метрологических характеристик. Автор принимал активное участие в апробации разработанных методик на биообъектах, наряду с научным руководителем и соавторами участвовал в написании всех имеющихся публикаций, обсуждении результатов и выводов.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на следующих Международных и Всероссийских конференциях: VI Всероссийской конференции по рентгеноспектральному анализу, Краснодар, 2008г.; XVII Международной конференции по использованию синхро-тронного излучения, Новосибирск, 2008г.; Европейской конференции по рентгеновской спектрометрии «EXRS 2008», Кавтат, 2008г.; X Аналитическом российско-германско-украинском симпозиуме ARGUS «Нано-анапитика», Саратов, 2007г.; Европейской конференции по рентгеновской спектрометрии «EXRS 2006», Париж, 2006г.; XVI Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2006г.; Международной конференции «Аналитическая химия и химический анализ», Киев, 2005г.; IX Аналитическом россиско-германско-украинском симпозиуме «ARGUS», Киев, 2005г.; XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2004г.; VII Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего востока», Новосибирск, 2004г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 статей и 12 тезисов докладов на международных и российских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), экспериментальной части (глава 2), обсуждения результатов (глава 3 и 4), выводов и списка цитируемой литерату-

ры (212 наименований). Диссертация изложена на 129 страницах, содержит 42 иллюстрации и 16 таблиц.

Благодарности. Автор выражает благодарность свому научному руководителю Труновой В.А., а также всем соавторам, в сотрудничестве с которыми были проведены исследования, за всестороннюю помощь и поддержу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение содержит обоснование актуальности темы исследования и выбора объектов исследования; заключает в себе постановку цели работы, а также положения, выносимые на защиту.

Первая глава (литературный обзор) содержит обзор литературы, в котором приведены данные о роли химических элементов в деятельности сердечно-сосудистой системы; представлен анализ литературных данных о том, какого рода информация о содержании и распределении макро-и микроэлементов в тканях миокарда и сосудов человека имеется на момент написания диссертации; представлен обзор методов анализа биообъектов (мышечных тканей), способов их пробоподготовки, рентгеновских методов анализа биотканей и биологических жидкостей; описаны основные аналитические трудности (и подходы) при анализе биообъектов рентгеновскими методами анализа: влияние матрицы, неоднородность стандартных образцов (при анализе образцов малой массы). Приведены также способы использования методов внутреннего и внешнего стандарта для определения концентраций химических элементов в биологических образцах, а также использования синтетических стандартов (для имитации органической матрицы) и полуэмпирических математических моделей. Рассмотрены особенности рентгено-флуоресцентных методов анализа биообъектов в тонком, промежуточном и насыщенном слоях. Исходя из имеющихся литературных данных, были определены основные задачи и направление исследования.

Вторая глава (экспериментальная часть) содержит данные о характеристиках накопительного кольца ВЭПП-ЗМ (ИЯФ СО РАН), станции элементного рентгено-флуоресцентного анализа. В ней описана геометрия и процедура измерений, процедура пробоподготовки исследуемых и стандартных образцов, приведена информация по пределам обнаружения для РФА-СИ анализа исследуемых образцов, а также данные по использованным материалам (инструментам, хим. реактивам, пленкам).

Третья глава (обсуждение результатов) содержит данные, полученные в ходе разработки методических подходов для прямого недеструктивного определения содержания химических элементов в образцах мышечных тканей методом РФА-СИ. В ней также представлен анализ всех данных, полученных при разработке методики выбора внешнего стандарта для исследуемых объектов, в том числе и для образцов малой

массы (до 1 мг, сухой вес), приведены данные проверки правильности определения концентраций химических элементов в исследуемых образцах методом РФА-СИ, а также данные воспроизводимости анализа.

Четвертая глава содержит результаты определения содержания химических элементов в образцах миокарда и сосудов человека методом РФА-СИ, полученные в ходе исследования распределения микроэлементов в разных участках миокарда у здоровых людей и при ишемической болезни сердца, у плодов и детей при врожденном пороке сердца, а также при изучении роли химических элементов в формировании и развитии аневризмы аорты.

Разработка методических подходов для РФА-СИ анализа мышечных тканей

Для определения количественного содержания S, Cl, К, Ca, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Br, Rb, Sr в образцах мышечных тканей методом РФА-СИ использовался метод внешнего стандарта. В качестве последнего использовались международные стандартные образцы: Mussel NIES №6 (мышцы моллюска), Bovine liver NIST 1577 (печень быка), Beef liver NCS ZC 85005 (печень быка), Oyster tissue NIST 1566 (мягкие ткани устрицы), Human hair NIES №5 (волосы человека), Animal blood IAEA A-13 (цельная кровь животных), Freeze-dried human serum NIES №2 (сыворотка крови человека). Образцы исследуемых тканей миокарда и сосудов были предоставлены Научно-исследовательским институтом патологии кровообращения им. акад. E.H. Мешалкина (г. Новосбирск). Все измерения проводились на экспериментальной станции элементного рентгено-флуоресцентного анализа (Центр СИ) на базе Института ядерной физики Сибирского отделения РАН (ВЭПП-ЗМ). Монохроматизиро-ванный при помощи монокристалла Si (111) пучок СИ попадает на образец под углом 45 к его поверхности, отбор флуоресцентного излучения осуществляется под тем же углом. Характеристическое рентгеновское излучение регистрируется полупроводниковым Si(Li) детектором (OXFORF 7367, Oxford Instruments Inc., USA), с разрешением на линии 5,7 кэВ - 133 эВ, который расположен под углом 90° по направлению к падающему первичному излучению. Измерения проводились при энергии первичного возбуждения Еех = 12+23 кэВ. Обработка полученных спектров осуществляется при помощи программы AXIL для флуоресцентных спектров (Canberra Packard, Benelux). Форма линии в ней описывается кривой Гаусса, расчет спектров осуществляется в диалоговом режиме при помощи нелинейного метода наименьших квадратов. В 2006 году была проведена аттестация методики выполнения измерений на станции элементного анализа (свидетельство № 253.11.09.343/2006 выдано Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии).

Характеризация рассеивающих свойств матриц образцов и стандартов

Для оценки данной характеристики была определена величина отношения площади пика когерентного рассеяния к площади пика некогерентного рассеяния (Coh/Incoh) в полученных спектрах образцов и стандартов. Известно, что величина данного отношения характеризует величину среднего атомного номера исследуемой матрицы. Величина Coh/Incoh была определена для всех используемых стандартных образцов, а также для широкого спектра исследуемых образцов (миокард разных отделов сердца, грудные мышцы; стенки аорты, артерий, вен) при энергии возбуждения 19 кэВ. Полученные данные представлены на рис. 1. Было выявлено, что величина данного отношения для исследуемых образцов (мышечные ткани) незначимо отличается от значения, полученного для стандартных образцов ткани печени и цельной крови животных, несмотря на различие их биологических матриц. Это подтверждает правомерность использования данных стандартных образцов для анализа исследуемых биотканей. Кроме того, различия незначимы для таких стандартов, как мышечная ткань моллюска и сыворотка крови человека, а также между стандартами волос человека и мягкими тканями устрицы.

исследуемы* образцы Beef 85005 (ткань печени) BL 1677 (ткань печени) IAEA А-1 (цельная кровь) Musse! #6 (мышечная ткань) HS U2 NIES (сыворотка крови) НН #6 NIES (волосы человека) ОТ 1666 (мягкие ткани устрицы) 0.

Рис /. Характеристика рассеивающих свойств матриц образцов и стандартов по данным величины отношения площадей пиков когерентного и некогерентного рассеяния. Е« = ] 9 кэВ

Определение коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности

Коэффициенты спектрометрической чувствительности (Я,5) по отношению к комптоновскому пику для каждого элемента в каждом из стан-

образцы (п>20) стандарты |п*5)

0.19 0.20 Coh / lncoh

дартных образцов были рассчитаны по следующей формуле: п = N ,, 1 (1)

К * ~ N „(. С„

где Nis - интегральная площадь пика Калинин элемента i в стандартном образце, Njnc - площадь пика некогерентно рассеянного излучения (ком-птоновское рассеяние), C¡s - концентрация элемента i в стандарте (аттестованное значение). Все кривые относительной спектрометрической чувствительности были аппроксимированы полиномиальными функциями второго и третьего порядка. Расчет коэффициентов и построение подобного рода кривых ранее был осуществлен в работах E.D. Greaves et al., L.M. Marco et al., а также L. M. Marcó P. et al. для анализа биологических жидкостей. На рис. 2 приведены кривые относительной спектрометрической чувствительности для двух стандартных образцов: Beef liver NCS ZC 85005 (печень быка, Китай) и Bovine liver NIST 1577 (печень быка, США) с одинаковой биологической матрицей, однако содержание химических элементов в них различно. Полученные кривые практически совпадают. Значимых отличий в величинах Ris не обнаруживается (в терминах величин стандартных отклонений). На рис. 3 представлены кривые относительной спектрометрической чувствительности для стандартных образцов с разной биологической матрицей: Mussel NIES №6 (мышцы моллюска) и Freeze-dried Human Serum NIES №2 1566 (сыворотка крови человека). Данные стандарты незначимо отличаются по рассеивающим характеристикам их матриц, несмотря на их биологическое различие. Значимые отличия в коэффициентах относительной спектрометрической чувствительности не наблюдаются, несмотря на то, что концентрации некоторых элементов различаются на порядок величины (Mn, Fe, Zn и Sr).

Рис.2. Кривые относительной чувствительности для стандартных образцов: Bovine liver NIST 1577 и Beef liver NCS 85005. E„ = 18 кэВ (и = 5)

Z, атомный номер элемента

Рис. 3. Кривые относительной чувствительности для стандартных образцов: Mussel NIES № 6 (мышцы моллюска) и Freeze-dried Human Serum NIES №2 (сыворотка крови человека). Ееч = 20 кэВ (л = 5)

Проведя сравнительный анализ всех кривых относительной спектрометрической чувствительности для выбранных стандартных образцов, было выявлено, что значимые отличия в величинах Ris наблюдаются в каждом случае для определенных элементов (для К, Са; в ряде случаев -для Fe, Zn и Cu), что может быть выявлено экспериментально. Однако, внешний стандарт должен быть подобран в каждом конкретном случае на основании характеристик рассеивающих свойств матриц образца и стандарта, а также на основании данных о коэффициентах относительной спектрометрической чувствительности для используемых стандартных образцов (критерием выбора того или иного стандарта является также близость величины отношения площади пика определяемого элемента к площади пика некогеренгного рассеяния в образе и стандарте).

Таким образом, определение содержания элементов в образцах биотканей возможно при использовании разных стандартных образцов, с разной биологической матрицей (неидентичной матрице исследуемого образца).

Определение концентраций химических элементов, содержание которых не аттестовано в стандартных образцах

После серии измерений и расчетов, на основании кривых относительной чувствительности, построенных по данным для аттестованных химических элементов в стандартных образцах, было определено содержание следующих химических элементов, концентрации которых не аттестованы в стандартном образце NIES №6 Mussel: V - 0,52 ±0,11 мкг/г, Br - 98 ± 5 мкг/г , Rb - 2,70 ± 0,44 мкг/г; в стандарте NIST 1566 Oyster

tissue: Br - 64 ± 6 мкг/г; в стандартном образце Animal blood IAEA A-13: Mn - 3,7 ± 0,4 и Sr - 0,20 ± 0,02 мкг/г. Содержание Br и Rb, оцененное для стандартного образца мышечной ткани моллюска (Mussel NIES №6) близко к уровням содержания этих элементов в исследуемых образцах ткани миокарда человека. Концентрации всех химических элементов были рассчитаны по формуле 1.

РФА-СИ анализ образцов биотканей «промежуточной» толщины.

Влияние поверхностной плотности

После проведения пробоподготовки, вследствие различия масс образцов ткани (доступной при биопсии), наблюдаются вариации толщины анализируемых образцов (поверхностная плотность порядка 15-40 мг/см2). При расчете концентраций методом внешнего стандарта в РФА-СИ площади пиков определяемых элементов нормируют на площадь пика некогерентного рассеяния для учета неидентичности геометрии образца и стандарта.

Для ответа на вопрос о том, для какой области значений поверхностной плотности (ps) данный способ является эффективным, было исследовано влияние изменения ps таблетки стандартного образца Bovine liver NIST 1577 (печень быка) в области значений 14,9-45,8 мг/см2, что соответствует «промежуточному» слою для РФА-СИ анализа. На рис. 4 приведены кривые относительной спектрометрической чувствительности для всех значений ps таблеток стандартного образца. Область наименьшего расхождения кривых (и их пересечения) лежит в пределах значения Z = 25-30 (от Мп до Zn). Эта область указывает, для каких элементов

2.0Е-03 1.8Е-03 1.6Е-03 1.4Е-03 1.2Е-03 1.0Е-03

!

I.0E-04 «0Е-04 4.0Е-04 2.0Е-04 О.ОЕЮО -2.0Е-04

• l)ps = 14,9 мг/см2

■ 2) ps = 18,3 A

» 3) ps = 23,7 R! » 0.9984 /: ■

= 4) ps = 26,7 ............t'y.......

♦ 5) ps = 37,4 tv

« 6) ps = 45,8 ж

- ¡¡y R1-0.9978

Z, атомный номер элемента

Рис. 4. Кривые относительной спектрометрической чувствительности для стандартного образца Bovine liver NIST 1577. Е„ = 17 кэВ (л = 3)

влияние поверхностной плотности таблетки стандарта наименьшее (Еех = 17 кэВ). Для легких элементов (вплоть до Мп) лимитирующим фактором является толщина таблетки, тогда как расхождение кривых в области более тяжелых элементов (до Rb) объясняется увеличением количества квантов флуоресцентного излучения с увеличением массы таблетки стандарта. Данные приведены только для аттестованных значений концентраций химических элементов в стандарте.

При сравнении коэффициентов относительной чувствительности для минимального (14,9 мг/см2) и максимального значений ps (45,8 мг/см2), обнаруживается, что для К, Са и Fe наблюдаются значимые отличия в величинах R,s, тогда как для Мп значимых отличий не наблюдается (что связано с различием ошибок, которые приведены для концентраций различных элементов в стандарте (аттестованное значение)).

Оценка влияния неоднородности распределения химических элементов в стандартных образцах при анализе образцов малой массы

Масса образцов биопсии после пробоподготовки может достигать 1 мг (на сухой вес). Для РФА-СИ анализа таких проб пучок монохроматического первичного возбуждающего излучения должен быть коллимирован в соответствии с размером образца, как и для используемого внешнего стандарта. Была проведена оценка однородности распределения химических элементов в стандартном образце, исследовано влияние уменьшения размера коллимированного пучка первичного возбуждающего излучения на величину коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности для каждого определяемого элемента (и, соответственно на определение концентраций химических элементов в образцах и стандартах). На основе экспериментальных данных были рассчитаны коэффициенты относительной спектрометрической чувствительности для двух биологических стандартов: ткани печени быка (NCS ZC 85005 Beef liver) и мышечной ткани моллюска (NIES №6 Mussel). Обнаружено, что К, Мп, Fe, Си, Zn, Se, Br, Rb в стандартном образце Beef liver NCS ZC 85005 и К, Мп, Са, Fe, Си, Zn, As, Se, Br - в стандартном образце Mussel NIES №6 распределены однородно и могут быть определены с необходимыми метрологическими характеристиками при уменьшении размера коллиматора до 2 мм в диаметре. Такие элементы, как Rb и Sr в стандартном образце Mussel NIES №6 распределены неоднородно, а также как и Sr - в стандарте Beef liver NCS ZC 85005, и не могут быть достоверно определены при минимальном диаметре коллиматора.

Проверка правильности результатов РФА-СИ анализа образцов миокарда и сосудов человека

С целью проверки правильности был проведен одновременный анализ двух стандартных образцов. Полученные значения концентраций элементов для Mussel NIES №6, определенные при помощи Oyster tissue NIST 1566 (внешний стандарт), попадают в доверительный интервал их паспортных значений. Также, был проведен анализ двух образцов миокарда методом РФА-СИ (и = 6) и методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (АЭС-ИСП) в ОИГГМ СО РАН; и = 3. Результаты представлены в табл. 1.

Результаты определения Na, Mg, Si и Р методом ИСП-АЭС не приведены, так как данные элементы не определялись методом РФА-СИ. Данные о содержании Mn, Fe и Си хорошо согласуются между собой. Для других элементов: К, Са, Zn, Sr данные по одному образцу хорошо согласуются, тогда как в случае другого образца наблюдаются некоторые расхождения в результатах анализов. Нужно отметить, что масса образцов являлась критической для ИСП-АЭС анализа (8-9 мг).

Т абл и ца 1

Сравнение результатов анализа образцов миокарда методами РФА-

СИ и ИСП-МС

образец 1 образец 2

миокард левого желудочка сердца (ишемия)

элемент С, мкг/г (сухой вес)

РФА-СИ ИСП-АЭС РФА-СИ ИСП-АЭС

доверит, интервал (Я = 0,95)

S 2800 - 5100 1400-2400

CI 780-1200 350-550

к 1000- 1600 800-920 550-850 660-820

Са 620-980 1100- 1300 390-610 1100- 1300

Сг 0.3-0.5 0,1-0,3

Мп 1,1-1,8 1.4-1,6 1,4-2,2 1,5-1,7

Fe 120-160 140-200 170-230 220-280

Ni 0,8-1,2 1,1-1,9

Си 6,9-9,1 8,0-10 6,0-8,0 9,0-11

Zn 1200- 1400 1600- 1800 1900-2200 2000-2200

Se 0,33-0,49 0,55-0,85

Br 7,9-10 9,6- 12

Rb 1,4-1,7 1,4-1,8

Sr 1,3-2,1 2,5-3,5 1,6-2,5 1,5-2,5

Воспроизводимость результатов анализа в методе РФА-СИ может варьировать в зависимости от выбранного режима энергии возбуждения флуоресценции, для определяемых элементов эта величина также различна. Значение воспроизводимости определялось в стационарном режиме при неизменном положении образца (или стандарта) и составляло 5-33 % для энергии возбуждения 17-23 кэВ; естественная неоднородность распределения химических элементов в образцах и стандартах учитывалась путем усреднения данных, полученных при измерении образца при его последовательных поворотах (п = 8 * 20). При этом, полученные данные характеризуют как воспроизводимость, так и неоднородность распределения элемента (суммарный фактор): от 6 до 78 % для разных определяемых элементов и типов исследуемых тканей.

Результаты определения содержания химических элементов в образцах миокарда и сосудов человека методом РФА-СИ

Разработанные методические подходы были применены для определения содержания макро- и микроэлементов (от S до Sr) в миокарде различных отделов сердца, а также в зонах инфаркта, рубца и зоне на периферии инфаркта у здоровых людей и при ишемической болезни сердца (аутопсия); проведен сравнительный анализ уровней содержания химических элементов в миокарде левого и правого желудочков, левого и правого предсердий у плодов (22-28 недель внутриутробного развития), здоровых детей и детей с тяжелой формой врожденного порока сердца (материал аутопсии). Было проведено исследование по изучению роли химических элементов в формировании и развитии аневризмы аорты на образцах стенки восходящей части дуги аорты (материал биопсии) у пациентов с различной степенью тяжести заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы для определения S, Cl, К, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, As, Se, Br, Rb, Sr методом РФА-СИ в применении к образцам стенок сосудов и миокарда человека, позволившие использовать международные стандартные образцы с разной биологической матрицей (отличной от матрицы образца) в качестве внешнего стандарта при анализе разных типов мышечных тканей.

2. Для выбора внешнего стандарта при расчете широкого диапазона концентраций химических элементов в образцах мышечных тканей рассчитаны коэффициенты относительной спектрометрической чувствительности (по отношению к пику некогерентного рассеяния) для каждого химического элемента в международных стандартных образцах: Mussel NIES №6 (мышцы моллюска), Bovine liver NIST 1577 (пе-

чень быка), Beef liver NCS ZC 85005 (печень быка), Oyster tissue NIST 1566 (мягкие ткани устрицы), Human hair NIES №5 (волосы человека), Animal blood IAEA A-13 (цельная кровь животных), Freeze-dried human serum NIES №2 (сыворотка крови человека). На основании полученных данных построены кривые относительной спектрометрической чувствительности для каждого стандарта при энергии возбуждения 13,18 и 20 кэВ.

3. Определено количественное содержание химических элементов, концентрации которых не были аттестованы в стандартных образцах мышечной ткани моллюска (NIES №6 Mussel), мягких тканей устрицы (N1ST 1566 Oyster Tissue) и цельной крови животных (IAEA А-13 Animal blood), используемых в качестве внешнего стандарта при РФА-СИ анализе образцов биотканей. Концентрации элементов в стандартном образце Mussel NIES №6 составляют: V - 0,52 ± 0,11, Br - 98 ± 5 и Rb - 2,70 ± 0,44 мкг/г; в стандартном образце Oyster tissue NIST 1566: Br - 64 ± 6 мкг/г, в стандарте Animal blood IAEA А-13 : Mn - 3,7 ± 0,4, Sr - 0,20 ± 0,02 мкг/г.

4. Для исследуемых тканей и международных стандартных образцов были оценены рассеивающие характеристики их матриц на основании данных о величине отношения площадей пиков когерентного и некогерентного рассеяния. Среднее значение величины данного отношения для широкого спектра исследуемых образцов (миокард, стенки артерий и вен, скелетные мышцы) незначимо отличается от аналогичной величины для стандартных образцов ткани печени (Bovine liver NIST 1577, Beef liver NCS ZC 85005) и цельной крови животных (Animal blood IAEA A-13), несмотря на различие их биологических матриц, что является подтверждением правомерности их использования в качестве внешнего стандарта при анализе мышечных тканей методом РФА-СИ.

5. Для исследования методом РФА-СИ уникального биопсийного материала (толщина образцов варьирует) определена область значений поверхностной плотности, для которой нормирование площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния является эффективным способом учета неидентичности геометрии образцов и стандартов для случая излучателя «промежуточной» толщины. На примере стандартного образца ткани печени было показано, что данный способ может быть эффективным в области значений поверхностной плотности 15-45 мг/см2. Значимые отличия в коэффициентах относительной чувствительности наблюдаются для К и Ca (энергия возбуждения 17 кэВ).

6. Оценено влияние неоднородности распределения химических элементов в следующих стандартных образцах при уменьшении размера коллиматора (для анализа образцов малой массы): ткани печени (Beef

liver NCS ZC 85005) и мышц моллюска (Mussel NIES №6). К, Mn, Fe, Cu, Zn, Se, Br, Rb в стандартном образце Beef liver NCS ZC 85005 и К, Mn, Ca, Fe, Cu, Zn, As, Se, Br - в стандартном образце Mussel NIES №6 распределены однородно и могут быть определены с необходимой точностью и воспроизводимостью при минимальном размере коллиматора (d = 2 мм).

7. Полученные с помощью разработанных подходов результаты РФА-СИ анализа образцов миокарда и сосудов апробированы при исследовании механизмов патогенеза различных сердечно-сосудистых заболеваний для изучения возможностей их более эффективной кардио-хирургической коррекции.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Зверева В.В., Трунова В.А. Влияние поверхностной плотности биостандартов при анализе биотканей методом РФА-СИ // Химия в интересах устойчивого развития. - 2008. - Т. 16, №5. - С. 593-599.

2. Трунова В.А, Зверева В.В. Исследование методом РФА-СИ распределения макро- и микроэлементов в тканях миокарда и сосудов человека // Журнал структурной химии. Приложение. - 2008. - Т. 49. -С. 211-216.

3. Trunova V. A., Brenner N.V., Zvereva V.V. Investigation of the Content and of the Distribution of Chemical Elements in Human Nails by SRXRF // Toxicology Mechanisms and Methods. - 2009. - Vol. 19, №1. - P. 1-18.

4. Trunova V.A., Zvereva V.V., Okuneva G.N., Levicheva E.N. The alteration of interelemental ratios in myocardium under the congenital heart disease (SRXRF) // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A. - 2007. - Vol. 575. - P. 202-205.

5. Zvereva V.V., Trunova V.A. Elaboration of methodical approach to the elemental analysis of myocardium by SRXRF // X Analytical Russian-German-Ukrainian Symposium ARGUS'2007-Nano-analytics: Book of Proceedings. - Saratov, 2007. - P. 53.

6. Trunova V.A., Zvereva V.V. Investigation of insoluble endogenous fractions of gastrointestinal tract by SRXRF // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A. - 2005. - Vol. 543, №1. - P. 266-270.

7. Trunova V.A., Zvereva V.V., Okuneva G.N., Levicheva E.N., Loginova I. Yu. The role of chemical elements in the formation of aneurism of aorta (SRXRF) // European Conference on X-ray Spectrometry: Abstract. -Cavtat, Croatia, 2008. - P. 92.

8. Зверева B.B., Трунова В.А. Разработка методических подходов для анализа мышечных тканей методом рентгено-флуоресцентного анализа с использованием синхротронного излучения // Материалы VI Все-

российской конференции по рентгеноспектральному анализу. - Краснодар, 2008.-С. 51.

9. Трунова В.А., Зверева В.В.. Исследование распределения макро-и микроэлементов в образцах миокарда и сосудов у кардиохирургиче-ских больных, метод РФА-СИ // Материалы VI Всероссийской конференции по рентгеноспектральному анализу. - Краснодар, 2008. - С. 120.

10. Zvereva V.V., Trunova V.A. The elaboration of the methodical approaches to the elemental analysis of the muscular tissue by SRXRF // XVII International Synchrotron Radiation Conference: Abstract. - Novosibirsk, 2008. - P. 6-22.

11. Trunova V., Okuneva G., Zvereva V., Chernyavskii A. Research of trace element content in human myocardium by SRXRF // European Conference on X-ray Spectrometry: Abstract. - Paris, France, 2006. - P. 54.

12. Трунова B.A., Зверева B.B., Окунева Г.Н., Чернявский A.M. Отклонение межэлементных отношений в миокарде при врожденных пороках сердца (РФА-СИ) // Материалы XVI Российской конференции по использованию синхротронного излучения. - Новосибирск, 2006. - С. 109.

13. Trunova V.A., Zvereva V.V. The Life-Time Analysis of Elemental Composition of Human Liver Punctures (SRXRF) // International conference Analytical Chemistry and Chemical Analysis: Abstract. - Kyiv, Ukraine, 2005.-P.387.

14. Trunova V.A., Brenner N.V., Zvereva V.V. Examination of the Chemical Elements Ratios in Human Nails (SRXRF) // IX Analytical Russian-German-Ukrainian Symposium: Abstract. - Kyiv, Ukraine, 2005. -P.430.

15. Trunova V.A., Zvereva V.V. The Investigation of Elemental Distribution in Different Parts of Myocardium in Humans with IHD (SRXRF) // International conference Analytical Chemistry and Chemical Analysis: Abstract. - Kyiv, Ukraine, 2005. - P. 353.

16. Трунова B.A., Вазина A.A., Федоров В.И., Симонова Н.Б., Бреннер, Н.В. Зверева В.В.Определение микроэлементов в биотканях методом РФА-СИ // VII Конференция «Аналитика Сибири и Дальнего востока»: Тез. докл. - Новосибирск, 2004. - С.78.

17. Кливер Е.Э., Окунева Г.Н., Левичева Е.Н., Непомнящих Л.М., Логинова И.Ю., Волков A.M., Лушникова Е.Л., Трунова В.А., Зверева В.В. Анатомические варианты транспозиции магистральных сосудов и их связь с содержанием химических элементов в желудочках сердца // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. -Т. 145,№5.-С. 578-581.

18. Окунева Г.Н., Левичева Е.Н., Логинова И.Ю., Волков A.M., Чернявский A.M., Альсов С.А., Трунова В.А., Зверева В.В. Роль химических элементов в формировании аневризмы аорты // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2008,- Т. 14, №4. - С. 21-26.

19.0кунева Г.Н., Левичева E.H., Логинова И.Ю., Кливер Е.Э., Горбатых Ю.Н., Трунова В.А., Зверева В.В. Распределение химических элементов по разным отделам сердца у детей в норме и при транспозиции магистральных сосудов // Педиатрия. Журнал им. Г.Н.Сперанского. -2008.-Т. 87,№2.-С. 10-15.

20. Окунева Г.Н., Чернявский А.М., Левичева E.H., Логинова И.Ю., Волков

A.М., Кливер Е.Э., Трунова В. А., Зверева В.В. /Распределение химических элементов в разных отделах сердца больных ИБС с острой сердечной недостаточностью // Кардиология - 2008. - Т. 48, №2. - С. 41 -46.

21. Окунева Г.Н., Чернявский A.M., Левичева E.H., Логинова И.Ю., Волков A.M., Трунова В.А., Зверева В.В. Содержание микроэлементов в миокарде левого желудочка больных ИБС по данным рентгено-флуоресцентного анализа с использованием синхротронного излучения //Кардиология.-2006.-№10.-С. 13-17.

22. Окунева Г.Н., Логинова И.Ю., Чернявский A.M., Левичева E.H., Кливер Е.Э., Горбатых Ю.Н., Трунова В.А., Зверева В.В. Микроэлементный состав сердца детей раннего возраста в норме и при транспозиции магистральных сосудов // Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2006. - №4 - С. 9-14.

23. Симонова Н.Б., Вазина A.A., Трунова В.А., Полякова Е.П., Зверева

B.В. Абсорбция микроэлементов гликопротеинами слизей ЖКТ // Материалы XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения. - Новосибирск, 2004. - С. 132.

24. Трунова В.А., Зверева В.В., Симонова Н.Б., Вазина A.A. Методические подходы для определения содержания элементов в секретах эпителиальных тканей желудочно-кишечного тракта методом РФА-СИ // Материалы XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения. - Новосибирск, 2004. - С. 133.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001 Подписано к печати и в свет 3.02.2009 Формат 60x84/16. Бумага № I. Гарнитура "Times New Roman". Печать оперативная. Печ. л. 1,2. Уч.-изд. л. 1,1. Тираж 120. Заказ Ks 20 Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. A.B. Николаева Сибирского отделения РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Роль химических элементов в деятельности сердечно-сосудистой системы. Биологическая роль микроэлементов, входящих в состав ферментов.

1.2. Количественные методы определения элементного состава биологических объектов: тканей сердца и сосудов.

1.3. Способы пробоподготовки биологических материалов.

1.4. Основные аналитические трудности (и подходы) при исследовании биообъектов рентгеновскими методами анализа.

1.4.1. Влияние матргщы.

1.4.2. Неоднородность стандартных образцов и масса используемого материала.

1.5. Биологические образцы. Методы рентгено-флуорссцентного анализа в тонком, промежуточном и насыщенном слоях.

1.6. Задачи и направления исследований.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Аппаратура.

2.2. Пробоподготовка стандартных образцов для РФА-СИ анализа.

2.3. Пробоподготовка образцов биотканей.

2.4. Измерение образцов биотканей.

2.5. Пределы обнаружения.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ РФА-СИ АНАЛИЗА МЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ.

3.1. Характеризация рассеивающих свойств матриц образцов и стандартов.

3.2. Определение коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности химических элементов для международных биологических стандартных образцов в РФА-СИ анализе.

3.3. Определение концентраций химических элементов, содержание которых не аттестовано в международных стандартных образцах.

3.4. РФЛ-СИ анализ образцов биотканей в слое «промежуточной» толщины. Поверхностная плотность излучателя.

3.5. Оценка влияния неоднородности распределения химических элементов в стандартных образцах при анализе образцов малой массы.

3.6. Оценка однородности распределения химических элементов в образцах ткани миокарда и сосудов человека. Воспроизводимость РФА-СИ анализа.

3.7. Проверка правильности результатов РФА-СИ анализа образцов миокарда и сосудов человека.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ХИМИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ В ОБРАЗЦАХ МИОКАРДА И СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ РФА-СИ.

4.1. Исследование распределения микроэлементов в разных участках миокарда у здоровых людей и при ишемической болезни сердца.

4.2. Исследование элементного состава миокарда различных отделов сердца плодов и детей в норме и при врожденных пороках сердца.

4.3. Изучение роли химических элементов в формировании и развитии аневризмы аорты.

Актуальность темы. Для определения дефицита или избытка химических элементов в организме человека широко используется информация об уровнях их содержания в сыворотке и плазме крови. Однако, о распределении химических элементов между плазмой крови и органами, являющимися очагами патологических процессов известно очень мало. В работе сердца именно миокард (сердечная мышца) песет основную функциональную нагрузку. Микроэлементы играют ключевую роль в метаболизме миокарда, аккумулирование определенных микроэлементов или их дефицит может привести к развитию сердечнососудистых заболеваний. Установление локальных концентраций химических элементов в пораженных и здоровых тканях миокарда и сосудов имеет важное значение для изучения механизмов патологических процессов и является актуальной задачей. Литературные данные о содержании микроэлементов в миокарде и стенках аорты немногочисленны и противоречивы. Наиболее полную информацию о содержании макро- и микроэлементов можно получить на материале ауюпсии, однако, наиболее актуальным представляется прямой анализ биопсийного материала (масса образцов < 1 мг, сухой вес) для получения прижизненной информации об элементном составе тканей. Разнообразие типов биотканей, видов патологий, функций отделов сердца диктует необходимость разработки методик анализа для каждого исследуемого объекта (типа ткани). Вышеперечисленные факторы приводят к тому, что содержание одних и тех же элементов в различных исследуемых образцах варьирует зачастую на несколько порядков величины. Метод рентгено-флуоресцептного анализа (РФА) с использованием синхротронного излучения (СИ) позволяет проводить прямой неразрушающий мпогоэлементный анализ образцов биотканей. Особенности СИ открывают следующие возможности для РФА: анализ образцов малого объема и малой массы; снижение пределов обнаружения; проведение анализа с вариацией энергии возбуждающих квашов; большой запас интенсивности при использовании СИ позволяет резко уменьшить толщину образца.

При использовании методов внутреннего и внешнего стандарта для определения концентраций химических элементов в биотканях в основном используются методы мокрого или сухого озоления. Применяются синтетические стандартные образцы, полуэмпирические математические модели — ввиду отсутствия подходящих стандартных образцов. Основным требованием при использовании внешнего стандарта является близость химического состава матриц исследуемого и стандартного образца, а также уровней содержания элементов в них. Однако, в случае, когда содержание одних и тех же элементов в исследуемых образцах варьирует значительно, возникает вопрос о выборе подходящего биологического стандартного образца. Таким образом, оценка возможности применения стандартных образцов с различной биологической матрицей (не идентичной матрице исследуемого образца) для определения широкого диапазона концентрации химических элементов при анализе биотканей является актуальной задачей.

Цель работы заключалась в разработке методических подходов для РФА-СИ анализа образцов миокарда и стенок сосудов у здоровых людей и пациентов с различными сердечнососудистыми патологиями, основываясь на применении способа внешнего стандарта для определения концентраций химических элементов в образцах.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: обосновать правомерность использования различных биологических стандартных образцов (матрица которых не идентична биологической матрице исследуемых тканей) для определения широкого диапазона концентраций химических элементов в различных типах мышечных тканей; оценить рассеивающие характеристики матриц образцов и стандартов для обоснования использования стандартных образцов с разной биологической матрицей при определении концентраций химических элементов в разных типах мышечных тканей; определить содержание химических элементов, концентрации которых не аттестованы в используемых стандартных образцах; исследовать эффективность способа учега неидентичности геометрии образцов и стандартов при помощи нормирования площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния, что является необходимым этапом при анализе образцов биопсии; оценить влияние неоднородности распределения химических элементов в используемых стандартных образцах на правильность определения концентраций химических элементов при анализе образцов малой массы (биопсия). разработать методику педеструктивного РФА-СИ определения S, С1, К, Са, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Си, Zn, As, Se, Br, Rb и Sr в применении к образцам стенок сосудов и миокарда человека методом РФА-СИ; апробировать аналитические данные (полученные при разработке методических подходов) при решении задач, поставленных Новосибирским паучно-исслсдовагельским институтом патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина для изучения механизмов развития сердечнососудистых патологий, выявления возможных предикторов заболеваний для их более эффективной кардиохирургической коррекции.

Научная новнзна работы:

• для выбора внешнего стандарта при анализе образцов мышечных тканей методом РФА-СИ были впервые определены коэффициенты относительной спектрометрической чувствительности (по отношению к пику некогерептпого рассеяния) для каждого химического элемента в международных биологических стандартных образцах;

• определено количественное содержание химических элементов (V. Mn, Br, Rb, Sr), концентрации которых не были аттестованы в используемых для РФА-СИ анализа биотканей международных биологических стандартных образцах па основе рассчитанных кривых относительной спектрометрической чувствительности;

• впервые были оценены рассеивающие характеристики матриц образцов мышечных тканей (скелетные мышцы, миокард, сосуды) и различных биологических стандартов для обоснования правомерности использования разных стандартных образцов при РФА-СИ анализе тканей миокарда и сосудов;

• для исследования уникальных образцов, полученных при биопсии (толщина которых варьирует) определена область значений поверхностной плотности, для которой нормирование площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния является эффективным способом учета иеидентичности геометрии образцов и стандартов в случае излучателя «промежуточной» толщины.

Практическая значимость работы состоит в разработке методических подходов для определения S, С1, К, Са, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Си, Zn, As, Se, Br, Rb и Sr в образцах миокарда и стенок сосудов методом внешнего стандарта. Разработанные подходы применены для определения концентраций химических элементов в образцах, полученных при аутопсии и биопсии для: 1) установления физиологической нормы содержания элементов у здоровых людей, 2) определения степени отклонения концентраций элементов у больных при ишемической болезни сердца, пороках сердца и аневризме аорты от их «нормального» физиологического уровня содержания, 3) установления распределения химических элементов по отделам сердца у пациентов при ишемической болезни сердца и у детей с врожденным пороком сердца, а также по зонам миокарда (интактный миокард; зона инфаркта, рубца, периферии инфаркта). Полученные данные могут помочь в изучении механизмов возникновения и развития вышеперечисленных сердечнососудистых патологий, установить возможные элементы-маркеры развития заболеваний, а также позволяют наметить более эффективные способы коррекции заболеваний сердечно-сосудистой системы.

На защиту выносятся:

• методика выбора внешнего стандарта для определения широкого диапазона концентрации химических элементов (от S до Sr) при анализе разных типов мышечных тканей методом РФЛ-СИ, используя международные биологические стандартные образцы;

• результаты определения концентраций химических элементов, содержание которых не аттестовано в используемых биологических международных стандартных образцах;

• методические подходы к анализу биопсийпого материала малой массы методом РФА-СИ.

Личный вклад автора. Автором была проведена экспериментальная работа; произведены расчеты, необходимые для оценки рассеивающих свойств матрицы, коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности и соо тветствующих кривых, пределов обнаружения, концентраций химических элементов; проведена оценка метрологических характеристик. Автор принимал активное участие в апробации разработанных методик на биообъектах, наряду с научным руководителем и соавторами участвовал в написании всех имеющихся публикаций, обсуждении результаюв и выводов.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на следующих Международных и Всероссийских конференциях: VI Всероссийской конференции по рентгеноспектральному анализу, Краснодар, 2008г.; XVII Международной конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2008г.; Европейской конференции по рентгеновской спектрометрии «EXRS 2008», Кавтат, 2008г.; X Аналитическом российско-германско-украинском симпозиуме ARGUS «Нано-аналитика», Саратов, 2007г.; Европейской конференции по рентгеновской спектрометрии «EXRS 2006», Париж, 2006г.; XVI Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2006г.; Международной конференции «Аналитическая химия и химический анализ», Киев, 2005г.; IX Аналитическом россиско-германско-украинском симпозиуме «ARGUS», Киев, 2005г.; XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2004г.; VII Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего востока», Новосибирск, 2004г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 статей и 12 тезисов докладов на международных и российских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), экспериментальной части (глава 2), обсуждения результатов (глава 3 и 4), выводов и списка цитируемой литературы (211 наименований). Диссертация изложена на 131 странице, содержит 42 иллюстрации и 16 таблиц.

выводы

1. Разработаны методические подходы для определения S, С1, К, Са, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Си, Zn, As, Se, Br, Rb, Sr методом РФА-СИ в применении к образцам стенок сосудов и миокарда человека, позволившие использовать международные стандартные образцы с разной биологической матрицей (отличной от матрицы образца) в качестве внешнего стандарта при анализе разных типов мышечных тканей.

2. Для выбора внешнего стандарта при расчете широкого диапазона концентраций химических элементов в образцах мышечных тканей рассчитаны коэффициенты относительной спектрометрической чувствительности (по отношению к лику некогерентного рассеяния) для каждого химического элемента в международных стандартных образцах: Mussel NIES №6 (мышцы моллюска), Bovine liver NIST 1577 (печень быка), Beef liver NCS ZC 85005 (печень быка), Oyster tissue NIST 1566 (мягкие ткани устрицы), Human hair NIES №5 (волосы человека), Animal blood IAEA A-13 (цельная кровь животных), Freeze-dried human serum NIES №2 (сыворотка крови человека). На основании полученных данных построены кривые относительной спектрометрической чувствительности для каждого стандарта при энергии возбуждения 13, 18 и 20 кэВ.

3. Определено количественное содержание химических элементов, концентрации которых не были аттестованы в стандартных образцах мышечной ткани моллюска (NIES №6 Mussel), мягких тканей устрицы (NIST 1566 Oyster-Tissue) и цельной крови животных (IAEA А-13 Animal blood), используемых в качестве внешнего стандарта при РФА-СИ анализе образцов биотканей. Концентрации элементов в стандартном образце Mussel NIES №6 составляют: V — 0,52 ± 0,11, Br - 98 ± 5 и Rb - 2,70 ± 0,44 мкг/г; в стандартном образце Oyster tissue NIST 1566: Br- 64 ± 6 мкг/г; в стандарте Animal blood IAEA A-13: Mn - 3,7 ± 0,4, Sr - 0,20 ± 0,02 мкг/г.

4. Для исследуемых тканей и международных стандартных образцов были оценены рассеивающие характеристики их матриц на основании данных о величине отношения площадей пиков когерентного и некогерентного рассеяния. Среднее значение величины данного отношения для широкого спектра исследуемых образцов (миокард, стенки артерий и вен, скелетные мышцы) незначимо отличается от аналогичной величины для стандартных образцов ткани печени (Bovine liver NIST 1577, Beef liver NCS ZC 85005) и цельной крови животных (Animal blood IAEA A-13), несмотря на различие их биологических матриц, что является подтверждением правомерности их использования в качестве внешнего стандарта при анализе мышечных тканей методом РФА-СИ.

5. Для исследования методом РФА-СИ уникального биопсийного материала (толщина образцов варьирует) определена область значений поверхностной плотности, для которой нормирование площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния является эффективным способом учета неидентичности геометрии образцов и стандартов для случая излучателя «промежуточной» толщины. На примере стандартного образца ткани печени было показано, что данный способ может быть эффективным в области значений поверхностной плотности 15-45 мг/см". Значимые отличия в коэффициентах относительной чувствительности наблюдаются для К и Са (энергия возбуждения 17 кэВ).

6. Оценено влияние неоднородности распределения химических элементов в следующих стандартных образцах при уменьшении размера коллиматора (для анализа образцов малой массы): ткани печени (Beef liver NCS ZC 85005) и мышц моллюска (Mussel NIES №6). К, Mn, Fe, Cu, Zn, Se, Br, Rb в стандартном образце Beef liver NCS ZC 85005 и К, Mn, Са, Fe, Cu, Zn, As, Se, Br - в стандартном образце Mussel NIES №6 распределены однородно и могут быть определены с необходимой точностью и воспроизводимостью при минимальном размере коллиматора (d = 2 мм).

7. Полученные с помощью разработанных подходов результаты РФА-СИ анализа образцов миокарда и сосудов апробированы при исследовании механизмов патогенеза различных сердечнососудистых заболеваний для изучения возможностей их более эффективной кардиохирургической коррекции.

1. Klaus К.A., Clark A.L., Cleland J.G.F. Chronic Heart Failure and Micronutrients // Journal of the American College of Cardiology. 2001. - Vol.37, № 7. - P. 1765-1774.

2. Navarro-Alarcon M., Lopez-Martnez M.C. Essentiality of selenium in the human body: relationship with different diseases // The Science of the Total Environment. 2000. - Vol. 249, № 1-3.-P. 347-371.

3. Nath R. Copper Deficiency and Heart Disease: Molecular Basis. Recent Advances and Current Concepts // Reviews Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. - Vol. 29, № 11. - P. 12451254.

4. Decrease of cytochrome с oxidase protein in heart mitochondriaof copper-deficient rats / L. Rossi, G. Lippe, E. Marchese et al. // Biometals.-1998.-Vol.l l.-No. 3.-P. 207-212.

5. Vijaya J., Subramanyam G., Paramma D. Effect of zinc supplementation on serum lipids of ischemic heart disease patients. // Atherosclerosis. 1995. - Vol. 115. - P. 581.

6. Lai Chih-Chia. Expression of antioxidant enzymes in copper-deficient rat brain, heart, and liver // Dissertation Abstracts International. 1996. - Vol. 56, № 08. - P. 4249.

7. Bailey Beth A. Calcium homeostasis in normal and hypertrophied/failing feline ventricular myocytes // Dissertation Abstracts International. 1993. - Vol. 53, № 05. - P. 2193.

8. Войнар А.И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека. -М.: Высшая школа, 1960. 544 с.

9. Cytosolic calcium accumulation and antioxidant enzyme activity in the mature and aged heart / N.C. Fladlow, J.D. McCully, T. Tsukube et al. // The Annals of Thoracic Surgery. 1995. -Vol. 60, №3,-P. 870.

10. Велданова M.B. Эндемический зоб как микроэлементоз // Медицинский научный и учебно-методический журнал. 2001. - № 6. - С. 150-173.

11. Moens L. Applications of mass-spectrometry in the trace element analysis of biological materials // Fresenius Journal of Analytical chemistry. 1997. - Vol. 359, № 4-5. - P. 309-316.

12. Ермолаев Ю.А. Возрастная физиология. M.: Высшая школа, 1985 г. - 384 с.

13. Schwinger R.H.G. Calcium and the failing heart // EDITORIAL: Basic Research in Cardiology. 2002. - Vol. 97, suppl. 1. - P. 1/1 - 1/3.

14. Regulation of Ion Channels in Myocardial Cells and Protection of Ischemic Myocardium / N. Sperelakis, M. Sunagawa, H. Yokoshiki et al. // Heart Failure Reviews. 2000,-Vol. 5, №2. P. 139-166.

15. Beyersmann D., Haase H. Functions of zinc in signaling, proliferation and differentiation of mammalian cells//BioMctals. -2001. -Vol. 14,- P. 331-441.

16. Bertrand M., Weber G., Schoefs B. Metal determination and quantification in biological material using particle-induced X-ray emission // Trends in Analytical Chemistry. — 2003. -Vol. 22, № 4. P. 254 - 262 .

17. Chipperfield В., Chipperfield J.R. Relation of myocardial metal concentrations to water hardness and death-rates from ischaemic heart disease // Lancet.- 1979. Vol. 2. № 6. - P. 709-712.

18. Chipperfield В., Chipperfield J.R. Differences in metal content of the heart muscle in death from ischemic heart disease // Am Fleart J. 1978. - Vol. 95, №6. - P. 732-737.

19. Berliner K. The effect of calcium on the heart // American Heart Journal. 1933. - Vol. 8, № 4. - P. 548-562.

20. Seely Stephen. Ischemic heat failure: a new explanation of its cause and preventability // Internationa Journal of Cardiology. 2002. - Vol. 86., No. 2-3. - P. 259-263.

21. Effect of gallium on in vitro aortic valve cusp mineralization EDXRF studies / A. Wrobel, G. Goncerz, J. Kunz et al. // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. - 2004. - Vol. 213. - P. 556-559.

22. MacPherson A., Basco J. Relationship of hair calcium concentration to incidence of coronary heart desease // The Science of the Total Environment. 2000. - Vol. 255. - P. 11-19.

23. Analysis of Calcium, Zinc, Magnesium, Iron and Copper Content in Myocardium and Stenotic Mitral Valves / I. Durak, A. Sahin, Z. Yurtarslani, A. Sonel. // The American Journal of Cardiology. 1989. - Vol. 64. - P. 1392-1394.

24. Accumulation of elements in the arteries and cardiac valves of Thai with aging / Y. Ohnishi. S. Tohno, P. Mahakkanukrauh et al. // Biol Trace Elem Res. 2003. - Vol. 96, № 13.-P. 71-92.

25. Iseri L.T., Freed J., Bums A.R. Magnesium deficiency and cardiac disorders // Am J Med — 1975.-Vol. 58.-P. 837-846.

26. Zinc, copper and magnesium and risks for all-cause cancer, and cardiovascular mortality / N. Leone, D. Courbon, P. Ducimetiere, M. Zureik. // Epidemiology. 2006. - Vol. 17. - P. 308-314.

27. Association between body iron stores and the risk of acute myocardial infarction in men / T.P. Tuomainen, K. Punnonen, K. Nyyssonen, J.T. Salonen. // Circulation. 1998. - Vol. 97. -P.1461-1466.

28. Heterozygosity for a hereditary hemochromatosis gene is associated with cardiovascular death in women / M. Roest, Y.T. van der Schouw, B. de Valk et al. // Circulation. 1999. -Vol. 100, № 12. - P. 1268 - 1273.

29. Iron-deficient diet reduces atherosclerotic lesions in apoE-deficient mice / T.S. Lee, M.S. Shiao, C.C. Pan, etal. // Circulation. 1999. - Vol. 99. - P. 1222-1229.

30. P. Ponka, C. Beaumont, D.R. Richardson. Function and regulation of transferrin and ferritin // Semin Hematol. 1998. - Vol. 35, № 1. - P. 35 - 54.

31. Lowering of body iron stores by blood letting and oxidation resistance of scrum lipoproteins: a randomized cross-over trial in male smokers / J.T. Salonen, H. Korpela, K. Nyyssonen, et al. // J Intern Med. 1995. - Vol. 237, № 2. - P. 161-168.

32. Trace elemental distributions in induced atherosclcrotie lesions using nuclear microscopy / R. Minqin, F. Watt, B. Tan Kwong Huat, B. Halliwell. // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2003. - Vol. 210. - P. 336-342.

33. Correlation of Iron and Zinc levels with lesion depth in newly formed atherosclerotic lesions / R. Minqin, F. Watt, В. T. Kwong Huat, B. Halliwell. // Free Radical Biology & Medicine 2003. - Vol. 34, №. 6. - P. 746-752.

34. Relationship between trace elements and atherosclerosis / Z.W. Zhang, S. Shimbo, N. Ochi, M. Watanabe. // Sci Total Environ 1995. - Vol. 205, № 2-3. - P. 179-187.

35. Zhou Y., Jiang Y., Kang Y.J. Copper inhibition of hydrogen peroxide-induced hypertrophy in embryonic rat cardiac II9c2 cells // Exp Biol Med. 2007. - Vol 232. № 3. - P. 385-389.

36. Bray T, Bcttger W. The physiological role of zinc as an antioxidant // Free Radic Biol Med. 1990.-Vol. 8.-P. 281-291.

37. Antioxidant-like properties of zinc in activated endothelial cells / B. Hennig, P. Meerarani, M. Toborek, C. Mc-Clain. // J Am Coll Nutr. 1999. - Vol. 18. - P. 152-158.

38. DiSilvestro R.A, Jones A.A. High ceruloplasmin concentrations in ratswithout high lipoprotein oxidation rates // Biochim Biophys Acta. 1996. - Vol. 1317. - P. 81-83.

39. Antioxidant effect of zinc in humans / A.S. Prasad, B. Bao, F.W. Beck et al. // Free Radic Biol Med. 2004. - Vol. 37. - P. 1182-1190.

40. O'Dell B.L. Biochemistry of copper // Med Clin North Am. 1976. - Vol. 60. - P. 687703.

41. Prasad A.S. Trace elements: biochemical and clinical effects of zinc and copper // Am J Hematol. 1979. - Vol. 6. - P. 77-87.

42. Clayton B.E. Clinical chemistry of trace elements // Adv Clin Chem. 1980. - Vol. 21. P. 147-176.

43. Trace element status (Se, Zn, Cu) in heart failure / F. Ko§ar, I. $ahin, Ta§kapan et al. // Anadolu Kardiyol Derg. 2006. - Vol. 6. - P. 216-220.

44. Scrum selenium, glutathione peroxidase activity and high-density lipoprotein cholesterol-effect of selenium supplementation / P. V. Luoma, E.A. Sotaniemi, H. Korpela, J. Kumpulainen. // Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 1984. - Vol. 46. - P. 469 - 472.

45. Selenium and coronary heart disease: a meta-analysis / G. Flores-Mateo, A. Navas-Acien. R. Pastor-Barriuso, E. Guallar. // The American Journal of Clinical Nutrition. — 2006. Vol. 84.-P. 762-773.

46. Ilback N.G., Fohlman J., Friman G. A common viral infection can change nickel target organ distribution // Toxicol Appl Pharmacol. 1992. - Vol. 114. - P. 166-170.

47. New aspects of murine Coxsackie B3 myocarditis focus on heavy metals / N.G. Ilback, U. Lindh, J. Fohlman, G. Friman. // Eur Heart J. - 1995. - Vol. 16. - P. 20-24.

48. Trace element changes in sclerotic heart valves from patients are expressed in their blood / C. Nystrom-Rosander, U. Lindh, G. Friman et. al. // BioMetals. 2004. - Vol. 17. - P. 121-128.

49. Halliwell B. Oxidative stress, nutrition and health. Experimental strategies for optimization of nutritional antioxidant intake in humans // Free Radic Res. 1996. - Vol. 25. - P. 57-74.

50. Harris ED. Copper // Handbook of nutritionally essential minerals. editors: O'Dell B.L., Sunder R.A. -NewYork, 1997. - P. 231-273.

51. Oster O., Prellwitz W. Selenium and cardiovascular disease // Biol. Trace Elem. Res. -1990. Vol. 24, №2. - P. 91 - 103.

52. Studies on the relations of selenium and Keshan Disease X. Chen, G. Yang, J. Chen et al. // Biol Trace Element Res. 1980. - Vol. 2. - P. 91-107.

53. The relationship between selenium and coronary disease / O. Oster, W. Prellwitz, C. Luley et al. // Analytical Chemistry in Medicine and Biology. Berlin-New York, 1987. - P. 579-87.

54. Oster O., Prellwitz W. Selenium and cardiovascular disease // Biol Tace Element Res. -1990.-Vol. 24.-P. 91-103.

55. Ostcr О. Trace element concentrations (Cu, Zn, Fe) in sera from patients with dilated cardiomyopathy // Clinica Chimica Acta. 1993. - Vol. 214. - P. 209-218.

56. Topographic and quantitative microanalysis of human central nervous system tissue using synchrotron radiation / M. Szczerbowska-Boruchowska, M. Lankosz, J. Ostachowicz et al. // X-ray spectrometry. 2004. - Vol. 33. - P. 3-11.

57. Iron and other elements (Cu, Zn, Ca) contents in retina of rats during development and hereditary retinal degeneration / C. Sergeant. Y. Llabador, G. Deves et al. // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2001. - Vol. 181. - P. 533-538.

58. Trace element load in cancer and normal lung tissue / A. Kubala-Kukus, J. Bra/iewicz, D. Banas et al. // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research В. 1999. - Vol. 150. - P. 193-199.

59. Peyrovan H., Amirabadi A. Heterogeneity measurement of trace elements distribution in sheep liver using the PIXE method // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 1996. - Vol. 109-110. - P. 309-311.

60. Determination of antimony in urine, blood and serum and liver and lung tissues of infants by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry / H. T. Delves, С. E. Sieniawska, G.S. Fell et al. //Analyst. 1997. - Vol. 122, № 011. - P. 1323-1329.

61. Direct total-reflection X-ray fluorescence trace element analysis of organic matrix materials with a semiempirical standard / E.D. Greaves, G. Bernasconi, P. Wobrauschek, C. Streli. // Spectrochimica Acta Part B. 1997. - Vol. 52. - P. 923-933.

62. Digestion of biological materials using the microwave-assisted sample combustion technique / M.F. Mesko, D.P. De Moraes, J.S. Barin et al. // Microchem J. 2006. - Vol. 82. -P. 183-188.

63. Speich M., Bousquet В., Nicolas G. Concentrations of magnesium, calcium, potassium, and sodium in human heart muscle after acute myocardial infarction // Clin Chem. 1980. -Vol. 26, № 12. P. 1662-1665.

64. Essential trace and toxic element distribution in the scalp hair of Pakistani myocardial infarction patients and controls / H.I. Afridi, T.G. Kazi, G.H. Kazi et al. // Biol Trace Elem Res. 2006. - Vol. 113,№ l.-P. 19-34.

65. Shiraishi K., Tanaka G. I., Kawamura II. Simultaneous multielement analysis of various human tissues by inductively-coupled plasma atomic-emission spectrometry // Talanta. 1986. -Vol. 33. № 11.-P. 861-865.

66. Calcium content of peripheral and central mitochondria in the guinea pig myocardium: electron probe analysis / R. Ho, D. Fan, A. V. Somlyo, A. P. Somlyo. // Cell Calcium. 2003. -Vol. 33.-P. 247-256.

67. Measurement of subcellular Ca2+ redistribution in cardiac muscle in situ: time resolved rapid freezing and electron probe microanalysis / M. Bond, M.D. Schluchter, E. Keller. C.S. Moravec. // Scanning Microsc. Suppl. 1994. - Suppl. 8. - P. 1-11.

68. Mercury and trace element distribution in organic tissues and regional brain of fetal rat after in utero and weaning exposure to low dose of inorganic mercury / W. Feng, M. Wang, B. Li et al. // Toxicol. Lett. 2004. - Vol. 152. - P. 223-234.

69. Intrasarcomere Ca2+. gradients in ventricular myocytes revealed by high speed digital imaging microscopy / G. Isenberg, E.F. Etter, M.F. Wendt-Gallitelli et al. // Proc. National Academy of Science (USA) 1996. - № 93. - P. 5413-5418.

70. Keller E., Moravec C.S., Bond M. Altered subcellular Ca2+ regulation in papillary muscles from cardiomyopathic hamster hearts // Am. J. Physiol. 1995. - Vol. 268. - P. HI875— H1883.

71. Correlation between 25 element contents in mane hair in riding horses and atrioventricular block / K. Asano, K. Suzuki, M. Chiba et al. // Biol Trace Elem Res. 2005. - Vol. 108, № 1-3.-P. 127-136.

72. Subramanian K. S. Determination о metals in biofluids and tissues: sample preparation methods for atomic spectroscopic techniques. Review. // Spectrochimica Acta Part B. 1996. -Vol. 51.-P. 291 -319.

73. Парфенов Ю.Д. Человек: мсдико-биологические данные. М.: Медицина, 1977. -282-332 с.

74. Скальный А.В. Микроэлементозы человека (диагноешка и лечение). М.: КМК, 2001.-96 с.

75. Marguf Е., Hidalgo М., Queralt I. Multielemental fast analysis of vegetation samples by wavelength dispersive X-ray fluorescence spectrometry: Possibilities and drawbacks // Spectrochimica Acta Part B. 2005. - Vol. 60. - P. 1363 - 1372. '

76. Stephens W.E., Calder A. Analysis of non-organic elements in plant foliage using polarised X-ray fluorescence spectrometry // Analytica Chimica Acta. 2004. - Vol. 527. - P. 89-96.

77. Wagner A., Boman J. Biomonitoring of trace elements in muscle and liver tissue of freshwater fish // Spectrochimica Acta Part B. 2003. - Vol. 58. - P. 2215-2226.

78. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry for Direct Multi-element Analysis of Diluted Human Blood and Serum / E. Barany, I. A. Bergdahl, A. Schutz et al. // Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 1997. - Vol. 12, № 9. - P. 1005-1009.

79. Statistical evaluation of ecosystem properties influencing the uptake of As, Cd, Co, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb and Zn in seaweed (Fucus vesiculosus) and common mussel (Mytilus edulis) /

80. B. D. Struck, R. Pelzer, P. Ostapzuk et al. // The Science of the Total Environment. 1997. -Vol. 207. - P. 29-42.

81. Metal Levels in Fish from the Savannah River: Potential Hazards to Fish and Other Receptors / J. Burger, K. F. Gaines, C. Sh. Boring et al. // Environmental Research Section A. -2002. Vol. 89. - P. 85-97.

82. Critical discussion on the need for an efficient mineralization procedure for the analysis of plant material by atomic spectrometric methods / M. Hoenig, H. Baeten, S. Vanhentenrijk et al. // Analyt. Chim. Acta. 1998. - Vol. 358. - P. 85-94.

83. Satake K., Vehiro T. Carbonization Technique for Pre-treatment of Biological materials in X-ray Fluorescence spectrometry // Analyst. 1985. - Vol. 110. - P. 1165-1169.

84. Ревенко А.Г. Применение рентгеноспектрального флуоресцентного метода для анализа растительных материалов и угля // Аналитика и контроль. 2000. - № 4. - С. 316328.

85. Quantitative determination of metals in radish using x-ray fluorescence spectrometry / M.J. Anjos, R.T. Lopes, E.F. Jesus et al. // X-ray Spectrometry. 2002. - Vol. 31, № 2. - P. 120-123.

86. Determination of potassium and calcium in vegetables by x-ray fluorescence spectrometry / R. Mittal, K.L. Allawadhi, B.S. Sood et al. // X-ray spectrometry 1993. Vol. 22, № 6. - P. 413-417.

87. Смагунова A.H., Коржова E.H., Беликова T.M. Элементный рентгеноспектральный анализ органических материалов // Журнал аналитической химии. 1998. - Т. 53, №7.1. C. 678-690.

88. Рентгенофлуоресцентный анализ в экологии / А.Н. Смагунова, С.В. Тарасенко, Е.Н. Базыкина, О.М. Карпукова // Журнал аналитической химии. 1979. - Т. 34, № 2. - С. 388397.

89. Карпукова О.М., Шматова J1.H., Илларионова Е.Н. Рентгенофлуоресцентное определение макрокомпонентов в растительных материалах // Журнал аналитической химии. 1982. - Т. 37, № 11.- С. 1938-1943.

90. Norrish К., Hutton J.T. Plant analysis by X-ray Spectrometry. I: low atomic number elements, sodium to calcium // X-ray spectrometry. 1977. - Vol. 6. - P. 6-11.

91. Hutton J. Т., Norrish К. Plant analysis by X-ray spectrometry. II: elements of atomic number greater than 20 // X-ray spectrometry. 1977. - Vol. 6, № 1. - P. 12-17.

92. Ревенко А.Г. Подготовка проб природных материалов для рентгенофлуоресцентного анализа с дисперсией по энергии (обзор) // Зав. лаб. 1994. - Т. 60, № 11. - С. 16-29.

93. Mercury Determination in Environmental Samples Using EDXRF and CV-AAS / Т.Н. Nguyen, J. Boman, M. Leermakers, W. Baeyens. // X-ray Spectrometry. 1998. - V. 27, №4. -P. 277-282.

94. Nguyen Т.Н., Boman J., Leermakers M. EDXRF and ICP-MS Analysis of Environmental Samples // X-ray spectrometry. 1998. - Vol. 27, № 4. - P. 265-276.

95. Stikans M., Boman J., Lindgren E.S. Improved Techique for Quantitative EDXRF Analysis of Powdered Plant Samples // X-ray Spectrometry. 1998. - Vol. 27, № 6. - P. 367-372.

96. Смирнова И. С., Таланова В.Н., Дубинин В.Т. Рентгеноспектральный метод определения К и Са в растениях // Аппаратура и методы рентгеновского анализа. 1975. - Л.: Машиностроение. - В. 16. - С. 111-115.

97. Cesareo R., Castellano A., Cuevas А. М. Energy Dispersive X-ray Fluorescence Analysis of Thin and Intermediate Environmental Samples // X-ray spectrometry. — 1998. Vol. 27, № 4. - P. 257-264.

98. Synchrotron radiation X-ray fluoresce analysis of trace elements in Nerium olender for pollution monitoring / E.F.O. De Jesus, S.M. Simabuco, M.J. dos Anjos, R.T. Lopes. // Speclrochim. Acta Part B. 2000. - Vol. 55. - P. 1181-1187.

99. Trace element analysis by means of synchrotron radiation, XRF, and PIXE: selection of sample preparation procedure / W.M. Kwiatek, B. Kubica, C. Paluszkiewicz, M. GalQka. // Journal of Alloys and Compounds. 2001. - Vol. 328. - P. 283-288.

100. Grazing-emission X-ray fluorescence spectrometry; principles and applications / P. K. de Bokx, Chr. Kok, A. Bailleul et al. // Spectrochimica Acta B. 1997. - Vol. 52, №7 - P. 829840.

101. Optimized sample preparation procedures for the analysis of solid materials by total-reflection XRF / K. Dargie, A. Markowicz, A. Tajani, V. Valkovic. // Fresenius' J. Anal. Chem. 1997.-Vol. 357, №6-P. 589-593.

102. Ayala R.E., Alvarez E.M., Wobrauschek P. Direct determination of lead in whole human blood by total reflection X-ray fluorescence spectrometry // Spectrochimica Acta B. 1991. -Vol. 46, №10 - P. 1429-1432.

103. Yap C.T. X-ray Total Reflection Fluorescence Analysis of Iron, Copper, Zinc, and Bromine in Human Serum // Applied. Spectroscopy 1988. - Vol. 42, №4 - P. 1250-1253.

104. Spolnik Z.M., Claes M., Van Grieken R. Determination of trace elements in organic matrices by grazing-emission X-ray fluorescence spectrometry // Analytica Chimica Acta. -1999. Vol. 401. - P. 293-298.

105. Optimized sample preparation procedure for the analysis of solid materials by total-reflection XRP / M. Dargie, A. Markowicz, A. Tajani, V. Valkovic. // Fresenius Journal of analytical Chemistry. 1997. - Vol. 357. - P. 589-593.

106. Thompson M., Ellison S.L.R. A review of interference effects and their correction in chemical analysis with special reference to uncertainty // Accred Qual Assur. 2005. - Vol. 10. - P. 82-97.

107. Barwick V.J, Ellison S.L.R. Measurement uncertainty: Approaches to the evaluation of uncertainties associated with recovery // Analyst 1999. - Vol. 124. - P. 981 - 990.

108. Вольдсет P. Прикладная спектрометрия рентгеновского излучения. Пер. с англ. канд.тех.наук В.П. Варварицы и канд. тех.наук К.И. Щекинаю М.: Атомиздат, 1977. -С. 113 - 146.

109. Standard deviations of the error effects in preparing pellet samples for WDXRF spectroscopy / F. Demir, G. Budak, E. Bayda?, Y. $ahin. // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. 2006. - Vol. 243. - P. 423-428.

110. Wtjgrzynek D., Holynska B. Fundamental quantification procedure for total reflection X-ray fluorescence spectra analysis and elements determination // Spectrochimica Acta Part B. -1997.-Vol. 52.-P. 915-921.

111. Quantitative analysis of metals in soil using X-ray fluorescence / M.J. dos Anjos, R.T. Lopes, E.F.O. de Jesus et al. // Spectrochimica Acta Part B. 2000. - Vol. 55. - P. 1189 -1194.

112. Application of the fundamental parameter method to the in vivo x-ray fluorescence analysis of Pt / I. Szaloki, D. G. Lewis, C.A. Bennett, A. Kilic. // Phys. Med. Biol. 1999. - Vol. 44. -P.1245-1255.

113. Kanngieper B. Quantification procedures in micro X-ray fluorescence analysis // Spectrochimica Acta Part B. 2003. - Vol. 58. - P. 609-614.

114. A general Monte Carlo simulation of ED-XRF spectrometers. II: Polarized monochromatic radiation, homogeneous samples / L. Vincze, K. Janssens, F. Adams et al. // Spectrochimica Acta Part В. 1995.-Vol. 50, №2.-P. 127-147.

115. Trace Element Distribution in Rat Brain followinf Lead and Lithium Supplementation A Study Using an EDXRF spectrometer / B. Singh, D. Dhawan, B. Chand et al. // Applied Radiation and Isotopes. - 1995. - Vol. 46. № 1. - P. 59-64.

116. Marco L.M., Greaves E.D., Alvarado J. Analysis of human blood serum and human brain samples by total reflection X-ray fluorescence spectrometry applying Compton peak standardization // Spectrochimica Acta Part B. 1999. - Vol. 54. - P. 1469-1480.

117. Al-Merey R., Karajou J., Issa H. X-ray fluorescence analysis of geological samples: exploring the effect of sample thickness on the accuracy of results // Applied Radiation and Isotopes. 2005. - Vol. 62. - P. 501-508.

118. Poletti M.E., Gongalves O.D., Mazzaro I. Measurements of X-ray scatter signatures for some tissue-equivalent materials // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B. -2004. Vol. 213. - P. 595-598.

119. M.J. Berger, J.I-I. Hubbel, S.M. Seltzer et al. 1989/1998. XCOM: photon cross sections database // NIST Standard Reference Database 8 (XGAM). National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD 20899, USA (1999).

120. Measurement of photon mass-energy absorption coefficients of paraffin wax and gypsum at 62 keV / B.Z. Shakhreet, C.S. Chong, T. Bandyopadhyay et al. // Radiat. Phys. Chem. -2003. Vol. 68. - P. 757-764.

121. Ekinci N., Astam N. Measurement of mass attenuation coefficients of biological materials by energy dispersive X-ray fluorescence spectrometry // Radiation Measurements. — 2007. — Vol. 42.-P. 428-430.

122. Kaijou J. Matrix effect on the detection limit and accuracy in total reflection X-ray fluorescence analysis of trace elements in environmental and biological samples // Spectrochimica Acta Part B. 2007. - Vol. 62. - P. 177-181.

123. Li G., Fan S. Direct determination of 25 elements in dry powdered plant materials by X-ray fluorescence spectrometry // Journal of Geochemical Exploration. 1995. — Vol. 55. — P. 7580.

124. Yap C.T., Ayala R.E., Wobrauschek P. Quantitative trace element determination in thin samples by total reflection X-ray fluorescence using the scattered radiation method // X-Ray Spectromet.- 1988.-Vol. 17.-P. 171.

125. Kyotani Т., Iwatsuki M. Multi-element analysis of environmental samples by X-ray fluorescence spectrometry using a simple thin-layer sample preparation technique // Analyst. -1998.-Vol. 123.-P. 1813-1816.

126. Renan M.J., Albrecht C.F., Jones D.T.L. Multi-elemental x-ray analysis of normal and malignant mammalian tissue by proton excitation of thick samples in air // Nuclear Instruments and Methods. 1981. - Vol. 181. Issue 1-3. - P. 297-300.

127. Trace elemental characterization of some food crustacean tissue samples by EDXRF technique / A. Mohapatra, T.R. Rautray, V. Vijayan et al. // Aquaculture. 2007. - Vol. 270, № 1-4.-P. 552-558.

128. Analysis of low Z elements in various environmental samples with total reflection X-ray fluorescence (TXRF) spectrometry / H. Hoefler, C. Streli, P. Wobrauschek et al. // Spectrochimica Acta Part B. 2006. - Vol. 61. - P. 1135-1140.

129. Preparation of tissue samples for X-ray fluorescence microscopy / J. Chwiej, M. Szczerbowska-Boruchowska, M. Lankosz et al. // Spectrochimica Acta Part B. 2005. - Vol. 60.-P. 1531 - 1537.

130. Трунова В.А. Рентгено-флуореецентный анализ с использованием синхротронного излучения: Автореф. диссертации канд. хим. наук: 02.00.02 / РАН. Сиб. отд-ние. ин-т неорганической химии. Новосибирск, 1997. — 37 с.

131. Analytical possibilities of SRXRF station at VEPP-3 SR source / V.A.Trounova, K.V.Zolotarev, V.B.Baryshev, M.A.Phedorin // Nuclear Instruments and Methods 1998 - V. A405.-P. 532-536.

132. Analytical possibilities of SRXRF station at VEPP-3 SR source / V.A.Trounova, K.V.Zolotarev, V.B.Baryshev, M.A.Phedorin // Nuclear Instruments and Methods 1997 - V. A392.-P. 281-286.

133. Analysis of grain and grain products by the SRXFA technique. V.P. Khvostova, V.P. Malina, V.A. Trunova et al. //Nuclear Instruments and Methods 1989 - Vol. A282 - P. 516518.

134. Trunova V. A., Brenner N. V., Zvereva V. V. Investigation of the Content and of the Distribution of Chemical Elements in Human Nails by SRXRF // Toxicology Mechanisms and Methods.-2009.-Vol. 19, №1.- P. 1-18.

135. Абсорбция микроэлементов гликопротеинами слизей ЖКТ / Н.Б. Симонова, А.А. Вазина, В.А. Трунова, Е.П. Полякова, В.В. Зверева // Материалы XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения. Новосибирск, 2004. -С.132.

136. Trunova V.A., Zvereva V.V. Investigation of insoluble endogenous fractions of gastrointestinal tract by SRXRF // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research. -2005. Vol. A543, №1. - P. 266-270.

137. Some methodical peculiarities of analysis of small-mass samples by SRXFA / A.F.Kudryashova, L.S.Tarasov, A.A.Ulyanov, V.B.Baryshev // Nuclear Instruments and Methods A. 1989. - Vol. 282. - P. 673-676.

138. Migration of chemical elements in food chains and ontogeny phases of meadom moth in the remote migration of butterflies / I.B. Knorr, E.N. Naumova, V.A. Trounova K.V. Zolotarev // Nuclear Instruments and Methods. 1997- Vol. A392. - P. 274-275.

139. Migration of chemical elements in food chains and ontogeny phases of meadow moth in the remote migration of butterflies / I.B. Knorr, E.N. Naumova, V.A. Trounova K.V. Zolotarev // Nuclear Instruments and Methods. 1998. - V. A405. - P. 550-552.

140. Зверева. B.B., Трунова В.А. Влияние поверхностной плотности биостандартов при анализе биотканей методом РФА-СИ // Химия в интересах устойчивого развития. 2008 г.-Т. 16, №5.-С. 593-599.

141. Effects of formalin-preservation on element concentration in animal tissues / I. Sato, K. Sera, T. Suzuki et al. // The Journal of Toxicological Sciences. — 2006. — Vol. 31, №3. P. 191-195.

142. Исследование микроэлементного состава миокарда человека методом РФА-СИ / В.А. Трунова, В. В. Зверева, Г. Н. Окунева, А. М. Чернявский // Материалы XVI Российской конференции по использованию синхротронного излучения. Новосибирск, 2006. - С. 108.

143. Мазалов. JI.H. Рентгеновские спектры. СО РАН: Институт неорганической химии им. А.В. Николаева,.2003 г. - 212 с.

144. Лосев Н.Ф. Количественный рентгеноспектральный флуоресцентный анализ. М.: Наука, 1969.-251 с.

145. Analytical possibilities of SRXRF station at VEPP-3 SR source / V.A. Trunova, K. Z. Zolotarev, V.B. Baryshev, M.A. Phedorin // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A. 1998. - Vol.405. - P. 532-536.

146. Ziebold. Т.О. Precision and Sensitivity in Electron Microprobe Analysis // Analytical Chemistry. 1967.-Vol. 39, №8.-P. 858-861.

147. Барышев В.Б., Кулипанов Г.Н., Скринский А.Н. Рентгенофлуоресценгный элементный анализ на пучках синхротронного излучения // Синхротронное излучение в геохимии: Сб.науч.тр. Новосибирск, 1989. — С. 46.

148. Зверева В.В., Трунова В.А., Окунева Г.Н. Разработка методических подходов к анализу элементного состава фрагментов ткани миокарда методом РФА-СИ // V Всероссийская конференция по рентгеноспектральному анализу: Тез. докл. Иркутск, 2006. - С. 54.

149. Zvereva V.V., Trunova V.A. Elaboration of methodical approach to the elemental analysis of myocardium by SRXRF // X Analytical Russian-German-Ukrainian Symposium ARGUS'2007-Nano-analytics: Book of Proceedings. Saratov, 2007. - P. 53 - 55.

150. V. V. Zvereva, V.A. Trunova. Те elaboration of the methodical approaches to the elemental analysis of the muscular tissue by SRXRF // XVII International Synchrotron Radiation Conference. Novosibirsk, 2008. - P. 6-22.

151. Трунова В.А, Зверева В. В. Исследование методом РФА-СИ распределения макро-и микроэлементов в тканях миокарда и сосудов человека // Журнал структурной химии. Приложение. 2008. - Т. 49. - С. 211-216.

152. Trunova V.A., Zvereva V.V. The Investigation of Elemental Distribution in Different Parts of Myocardium in Humans with IHD (SRXRF) // International conference Analytical Chemistry and Chemical Analysis: Abstract. Kyiv, Ukraine, 2005. - P. 353.

153. Research of trace element content in human myocardium by SRXRF / V. Trunova, G. Okuneva, V. Zvereva, A. Chernyavskii // European Conference on X-ray Spectrometry: Abstract. Paris, France, 2006. - P. 54.

154. Беленков Ю.Н., Агеев Ф.Т., Мареев В.Ю. Парадокс сердечной недостаточности: взгляд на проблему на рубеже века // Сердечная недостаточность. 2000. - Т.1, №1. - С. 1-7.

155. Incidence and etiology of heart failure. A population-based study / M.R. Cowie, D.A. Wood, A.J. Coats et al. // Eur. Heart J. 1999. - №20. - P. 421-428.

156. Peridopril for eldery people with chronic heart failure / J.Y.F. Cleland, M. Tendera, J. Adamus et ai.//Eur. J. Heart Failure. 1999.- №1.- P. 211-218.

157. Kannel W. В., Belanger A.J. Epidemiology of heart failure // Am. Heart J. 1991. -№121.-P. 951-957.

158. Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. Изменения содержания природных антиоксидантов и активности антиоксидантных ферментов при введении цинка // Вестник PYflFI, Серия Медицина. 2000. - №2. - С.75-79.

159. Панченко Л.Ф., Маев И.В., Гуревич К.Г. Клиническая биохимия микроэлементов. -2004. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ - 368 с.

160. The alteration of interelemental ratios in myocardium under the congenital heart disease (SRXRF) / V.A. Trunova, V.V. Zvereva, G.N. Okuneva, E.N. Levicheva // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research A. 2007. - Vol. 575. - P. 202-205.

161. Отклонение межэлемептных отношений в миокарде при врожденных пороках сердца (РФА-СИ) / В.А. Трунова, В.В. Зверева, Г.Н. Окунева, A.M. Чернявский И

162. Материалы XVI Российской конференции по использованию синхротронного излучения. — Новосибирск, 2006. — С. 109.

163. Анатомические варианты транспозиции магистральных сосудов и их связь с содержанием химических элементов в желудочках сердца / Е. Э. Кливер, Г. Н. Окунева, Е. Н. Левичева, Л. М. Непомнящих, И. Ю. Логинова, А. М. Волков, Е. Л. Лушникова, В.

164. A. Трунова, В. В. Зверева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008.-Т. 145, №5.-С. 578-581.

165. Elemental composition, morphology and mechanical properties of calcified deposits obtained from abdominal aortic aneurysms / S.P. Marra, C.P. Daghlian, M.F. Fillinger, F. Kennedy // Acta biomaterialia.- 2006. Vol.2, №5. - P. 515-520.

166. Comparative investigation of some mineral elements in the aortic wall and calcium concentration in hair / J. Bacsso, Y. Lusztig, A. Pal, J. Uzonyi // Exp. Pathol. 1986. - Vol. 29,№2.-P. 119-125.

167. Elemental analysis of soft plaque and calcified plaque deposits from human coronary arteries and aorta/ J.I. Murungi, S. Thiam, R.E. Tracy et al. // J. of Environmental Science and Health. 2004. - Vol. 39, № 6. - P. 1487-1496.

168. Iskra M., Patelski J., Majewski W. Relationship of calcium, magnesium, zinc and copper concentrations in the arterial wall and serum in atherosclerosis obliterans and aneurysm // J. Trace Elem. Med. Biol. 1997. - Vol. 11, №4. - P. 248-252.

169. Caseanu K.M., Petresu U.Y. Concentration of copper, zinc, chromium, iron and nickel in the abdominal aorta of patients deceased with coronary heart disease // J. Trace Elem. Electrolytes Health. 1994. - Vol. 8, № 2. - P. 111-114.

170. Роль химических элементов в формировании аневризмы аорты / Г.Н. Окунева, Е.Н. Левичева,И.Ю. Логинова, А.М.Волков, A.M. Чернявский, С.А. Альсов, В.А. Трунова,

171. B.В. Зверева // Ангиология и сосудистая хирургия. 2008.- Т. 14, №4. - С. 21-26.