Разработка методов иммобилизации и детекции фрагментов ДНК на микрочипах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Химический факультет

На правах рукописи

004600799

Шляпников Юрий Михайлович

Разработка методов иммобилизации и детекции фрагментов ДНК на микрочипах

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

,1 5 АПР 2010

Москва-2010

004600799

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук Белецкий Игорь Петрович

доктор физико-математических наук Морозов Виктор Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Савицкий Александр Павлович

кандидат химических наук Зубин Евгений Михайлович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К.Скрябина РАН

Защита состоится 27 апреля 2010 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ Автореферат разослан 26 марта 2010 года.

Учёный секретарь совета кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многие современные биохимические, генетические, фармацевтические и клинические анализы, анализы загрязнений окружающей среды и пищевых продуктов требуют проведения сотен и даже тысяч однотипных манипуляций. Вполне очевидными представляются тенденция к их автоматизации, а также стремление проводить такие манипуляции параллельно, сводя к минимуму затраты времени и расход реагентов. Среди ряда успешных решений этой задачи особо выделяется внедрение в практику биологических микрочипов - аналитических устройств, позволяющих одновременно выявлять множество специфических межмолекулярных взаимодействий с использованием минимальных количеств анализируемого материала. В настоящее время наибольшее распространение получили ДНК-микрочипы, предназначенные для обнаружения в образце заданных последовательностей ДНК. Принцип их работы заключается в следующем. На поверхности чипа в определенных зонах фиксируются молекулы зондов, представляющие собой олигонуклеотиды или ПЦР-фрагменты, комплементарные анализируемым последовательностям ДНК-мишеней. Количество таких активных зон на микрочипе, в зависимости от его назначения, может составлять от нескольких десятков до сотен тысяч. В ходе анализа, называемого гибридизационным, несущие какую-либо метку фрагменты ДНК-мишеней образуют с молекулами зонда ДНК-дуплексы, которые идентифицируются с помощью специальных детекторов.

ДНК-микрочипы могут быть использованы при определении патогенных микроорганизмов и вирусов, выявлении наследственных заболеваний, для обнаружения генно-модифицированных организмов (ГМО) в продуктах питания и т.д. С конца 80-х годов прошлого столетия многие научные коллективы занимаются проблематикой, связанной с производством ДНК-микрочипов, однако, только небольшая часть этих работ получила практическое воплощение в виде коммерческих продуктов. В нашей стране пионерами в этой области являются сотрудники ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН, разработавшие под руководством акад. А.Д.Мирзабекова гелевые биочипы, применяемые в настоящее время, в основном, в медицинской диагностике. Работы по созданию новых типов ДНК-микрочипов ведутся также в ИХБФМ СО РАН в лаборатории проф. В.Ф.Зарытовой. Тем не менее, объемы реального применения ДНК-микрочипов остаются небольшими и явно не соответствуют потенциальным возможностям этого аналитического инструмента. Основными причинами, препятствующими их широкому распространению, являются недостаточная воспроизводимость отдельных стадий производства микрочипов и длительность анализа (несколько часов). Кроме того, традиционные методы детекции сигнала в гибридизационном

анализе, основанные на использовании флуоресцентных, ферментных и других меток, имеют ряд существенных недостатков. Флуоресцентные метки могут подвергаться фотохимическому и окислительному разрушению, а также мешать протеканию отдельных этапов анализа, например, полимеразной цепной реакции. Применение ферментных меток значительно усложняет анализ за счет дополнительной стадии - катализируемой ферментом реакции образования окрашенного нерастворимого продукта. Кроме того, адсорбция этого продукта на поверхности микрочипа трудно контролируема, что может приводить к низкой воспроизводимости анализов.

Таким образом, поиск новых и совершенствование существующих подходов, направленных на решение отмеченных проблем, остается весьма актуальной задачей.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлась разработка методов получения ДНК-микрочипов, обладающих высокой воспроизводимостью, а также быстрого и чувствительного метода детекции сигнала.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать стабильность получаемых в различных условиях аминированных стеклянных подложек и ДНК-микрочипов на их основе.

2. Разработать способы модификации поверхности полимеров для получения ДНК-микрочипов, обладающие высокой воспроизводимостью.

3. Разработать метод детекции сигнала в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах с использованием суперпарамагнитных частиц и оценить его чувствительность.

4. Исследовать процесс гибридизации фрагментов ДНК на микрочипах в условиях ускоренного массопереноса аналита к поверхности под действием магнитного поля.

5. Получить подложки и ДНК-микрочипы на их основе, обладающие минимальной адгезией магнитных частиц.

Научная новизна. Установлено, что ДНК-микрочипы на основе стеклянных подложек, модифицированных 3-аминопропилтриэтоксисиланом в полярном растворителе в присутствии воды, обеспечивают высокую воспроизводимость анализа в течение не менее полутора лет. Разработан высокочувствительный способ определения поверхностной плотности аминогрупп, заключающийся в их реакции с диметокситритилхлоридом с последующим высвобождением и спектрофотометрической детекцией диметокситритильного катиона. Показана возможность изготовления ДНК-микрочипов на подложках из полиметилметакрилата, модифицированных путем аминолиза поверхностных

2

сложноэфирных групп: (i) гексаметилендиамином в газовой фазе; (ii) олигомерами 3-аминопропилтризтоксисилана в растворе.

Разработан метод детекции сигнала в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах с использованием суперпарамагнитных частиц. Показано, что применение суперпарамагнитных частиц позволяет сократить время проведения гибридизационного анализа с нескольких часов до нескольких секунд за счет ускорения массопереноса под действием магнитного поля. С помощью предложенного метода детекции зарегистрированы единичные межмолекулярные взаимодействия. Получены подложки с ковалентно удерживаемым декстрановым покрытием и ДНК-микрочипы на их основе, обладающие минимальной адгезией магнитных частиц, для проведения сверхчувствительного гибридизационного анализа.

Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют очевидное практическое значение. Разработанный в настоящей работе новый метод детекции сигнала позволяет многократно повысить чувствительность гибридизационного анализа, сократить время его проведения, а также снизить его себестоимость. Эти преимущества открывают новые возможности для широкомасштабного применения тест-систем на основе ДНК-микрочипов в медицинской диагностике, анализе продуктов питания и других областях.

Изготовленные по предложенной технологии ДНК-микрочипы внедрены в производство, выпускаются компанией ММТех и используются в нескольких лабораториях Москвы и Московской области для выявления генно-модифицированных организмов в продуктах питания. В настоящее время ведутся испытания ДНК-микрочипов для диагностики ряда инфекционных заболеваний, а также некоторых наследственных заболеваний, вызванных мутациями в определенных генах.

Апробация диссертации. Основные результаты и положения диссертации докладывались и обсуждались на 5 научных конференциях: XI Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", 2007; Российско-корейском семинаре, посвященном современной науке и высоким технологиям (Russia-Korea Seminar on Modern Science and High Technology), Пущино, 2008; V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова, Москва, 2008; 2м Корейско-российском объединенном симпозиуме по бионаукам и биотехнологиям (the 2nd Korea-Russia Joint Symposium in Bioscience and Biotechnology), Москва - Пущино -Санкт-Петербург, 2009; Юбилейной конференции Молодых ученых ИТЭБ РАН, посвященной 90-летию Института, Пущино, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи и 4 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах с использованием 33 рисунков, 9 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, полученные результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 180 ссылок.

Список сокращений.

АПТЭС - 3-аминопропилтриэтоксисилан;

ГМДА - гексаметилендиамин;

ГМО - генно-модифицированные организмы;

EDC - гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида;

NMI- 1-метилимидазол;

TsCl - п-толуолсульфохлорид;

МЧ - магнитные частицы;

ПММА - полиметилакрилат;

СКО - среднеквадратичное отклонение.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Изготовление ДНК-микро чипов на стеклянных подложках.

На первом этапе работы в качестве материала подложек для изготовления ДНК-микрочипов было выбрано стекло, поскольку методы химической модификации поверхности стекла различными функциональными группами хорошо разработаны. Однако до сих пор существенной проблемой при производстве ДНК-микрочипов остаётся низкая воспроизводимость отдельных его стадий (Halliwell et al., Anal. Chem., 2001, 73 , 2476). Кроме того, считается, что срок хранения чипов с иммобилизованными на стеклянной поверхности молекулами зонда не превышает двух месяцев, в противоположность гелевым биочипам, для которых этот срок составляет около одного года (Чечеткин и др., Российские нанотехнологии, 2006, 1, 2). В связи с этим была поставлена задача исследовать стабильность получаемых в различных условиях стеклянных подложек и ДНК-микрочипов на их основе.

Химическая модификация стеклянных подложек включает две стадии: очистку поверхности стекла и формирование органосилоксанового слоя путем обработки поверхности алкилтриалкоксисиланами, несущими различные реакционноспособные группы. В настоящей работе были использованы стандартные предметные стекла из листового стекла ("Menzel", Германия). В качестве модифицирующего агента был выбран 3-аминопропилтриэтоксисилан (АПТЭС). Получающаяся аминированная поверхность сравнительно инертна, что необходимо для длительного хранения подложек и готовых микрочипов; кроме того, она гидрофобна, что позволяет наносить при иммобилизации капли раствора олигонуклеотида с высокой плотностью. Органосилоксановый слой формировали: i) в разных растворителях с различным содержанием воды с последующим прокаливанием подложек; ii) без растворителя в газовой фазе.

Одной из характеристик полученных подложек является поверхностная плотность аминогрупп. Для её определения был разработан простой метод, отличающийся от существующих высокой чувствительностью. Аминогруппы алкилировали диметокситритилхлоридом в присутствии основания и нуклеофильного катализатора, после чего окрашенный диметокситритильный катион отщепляли действием хлорной кислоты и количественно детектировали спектрофотометрически (см. рис. 1). Результаты определения плотности аминогрупп на поверхности подложек, изготовленных в различных условиях, представлены в табл. 1.

Рис. 1. Схема метода определения плотности аминогрупп на поверхности стеклянных подложек.

Табл. 1. Поверхностная плотность аминогрупп и интенсивность сигнала в гибридизационном анализе на стеклянных подложках, модифицированных АПТЭС в различных условиях. Приведены средние значения ± 2 среднеквадратичных отклонения (СКО).

Метод модификации Число Интенсивность Фон3

подложки аминогрупп/нм2 сигналаа

АПТЭС в газовой фазе 0,5 ±0,1 42 ±13 30 ±4

Сухой толуол 0,4 ±0,1 38 ±16 28 ±4

Ацетон (0,2% воды) 1,1 ±0,1 64 ±21 36 ±5

Этанол (4% воды) 1,2 ±0,1 94 ±40 35 ± 5

Этанол (15% воды) 1,3 ±0,1 118 ±43 33 ±4

"Приведены усредненные значения из 10-50 экспериментов.

В отсутствие в реакционной среде воды на стекле формируется мономолекулярный слой АПТЭС, удерживаемый на поверхности силоксановыми связями. В присутствии воды на поверхности адсорбируются олигомеры АПТЭС, образующиеся в результате частичного гидролиза и последующей поликонденсации, что объясняет большую поверхностную плотность аминогрупп по сравнению с получаемой в безводных условиях. Схема формирования органосилоксанового слоя на поверхности стекла в водно-органической среде представлена на рис. 2.

ДНК - микрочипы получали иммобилизацией на такой поверхности 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов в присутствии водорастворимого гидрохлорида 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида (EDC) и нуклеофильного катализатора 1-метилимидазола (NMI) (см. рис. 2). Свежеприготовленный раствор с концентрацией олигонуклеотида 2 мкМ наносили на поверхность подложки кластерами, состоящими из 4 или 9 капель объемом ~30 нл, с помощью робота ХАСТ II Compact Microarrayer (Lab.NEXT Inc., США).

Н,М —«и «I

оно онононо

ОН" -)0Н АРТЕ5

, I I Т Т I т, I стекло |

Рис. 2. Схема формирования органосилоксанового слоя на поверхности стеклянной подложки и ковалентной иммобилизации олигонуклеотидов.

Для проверки работы ДНК-микрочипов проводили гибридизацию зондов на поверхности микрочипа с комплементарными олигонуклеотидами, несущими на 5'-конце флуоресцентную метку - цианиновый краситель Су5, в концентрации 5 нМ. Флуоресценцию регистрировали с помощью детектора ВАФ-1 (ММТех, Россия). Метод изготовления подложек считался воспроизводимым, если сигнал был всегда различим с вероятностью 0,98, то есть если выполнялось неравенство: (средний сигнал - 2 СКО сигнала) > (средний фон + 2 СКО фона).

Аминированные подложки, изготовленные в безводных условиях (в сухом толуоле или в газовой фазе), изначально показывали низкие и нестабильные значения сигнала в гибридизационном анализе, не соответствующие сформулированному выше критерию воспроизводимости (см. табл. 1). В связи с этим такие подложки в дальнейшем не исследовались. Переход к полярному растворителю и увеличение содержания воды в нем приводил к повышению интенсивности сигнала и выполнению условия воспроизводимости. Было изучено влияние срока хранения таких подложек, а также ДНК-микрочипов на их основе на интенсивность сигнала в гибридизационном анализе (см. табл. 2). Было показано, что реакционная способность аминированных подложек со временем снижается, однако скорость инактивации невелика: средняя интенсивность сигнала уменьшается в 1,5-2 раза за 1,5 года. Также была исследована зависимость плотности аминогрупп на поверхности подложек от срока их хранения (см. рис. 3). Наблюдалось снижение поверхностной плотности аминогрупп во времени, происходящее со скоростью, примерно соответствующей скорости инактивации, наблюдаемой по уменьшению сигнала в гибридизационном анализе. Считается, что основной причиной инактивации подложек является разрушение

органосилоксанового слоя в результате автокаталитического гидролиза силоксановых связей (Smith et al., Langmuir, 2008, 24, 12405), однако указываемая в литературе скорость разрушения на несколько порядков выше наблюдаемой в настоящей работе. В противоположность подложкам, готовые ДНК-микрочипы полностью сохраняют свою работоспособность в течение, по крайней мере, полутора лет вне зависимости от таких условий хранения как температура (в диапазоне 5-20°С) и влажность воздуха.

Табл. 2. Зависимость интенсивности сигнала в гибридизационном анализе от времени хранения стеклянных подложек, модифицированных в различных условиях, и ДНК-микрочипов на их основе. Приведены средние значения ± 2 СКО.

Время, Этанол (4% воды) Этанол (15% воды) Ацетон (0,2% воды) Фон

месяцы Подложки Чипы Подложки Чипы Подложки Чипы

0 94 ± 40а 127 ±46 64 ±21 35 ±5

3 69 ±21 105 ± 41 83 ±28 132 ±35 61 ±29 76 ±30 41 ±4

6 68 ±24 77 ±28 97 ±31 92 ±27 85 ±54 74 ±26 38 ±5

9 54 ±27 73 ±22 84 ±28 113 ±28 44 ± 15 81 ± 18 27 ±2

12 53 ±32 102 ±53 85 ±31 142 ±49 41 ±19 78 ±36 25 ±2

15 52 ±28 82 ±25 55 ±29 122 ±31 28 ± 11 75 ±34 23 ±3

18 59 ±24 78 ±30 59 ± 17 104 ±37 37± 18 77 ±41 25 ±2

'Приведены усредненные значения интенсивности сигнала из 10-50 экспериментов.

Рис. 3. Зависимость поверхностной плотности аминогрупп от времени хранения стеклянных подложек, модифицированных в различных условиях. Значения получены методом, проиллюстрированным на рис. 1. Приведены кривые экспоненциальной регрессии

экспериментальных данных.

Время, месяцы

Показано, что получаемые ДНК-микрочипы могут являться основой для высокоселективных тест-систем. На рис. 4 приведена иллюстрация работы ДНК-микрочипов для анализа ГМО по 7 маркерным последовательностям. Наблюдаются положительные сигналы только от присутствующих в образце последовательностей.

Рис. 4. Результат гибридизационного анализа образца трансгенной сои с содержанием ГМО 0,02%, полученный в тест-лаборатории по определению ГМО (ИТЭБ РАН). Флуоресцентная детекция красителя Су5 с помощью прибора ВАФ-1. Цифрами обозначены сигналы: 1 - положительный контроль, 2 -отрицательный контроль, 3 - трансгенный маркер 35S, 4 - трансгенный маркер NOS, 5 -маркер видовой специфичности лектин.

Изготовление ДНК-микро чипов на полимерных подложках.

Полимеры в качестве материала для изготовления подложек обладают рядом преимуществ перед стеклом. Основное преимущество заключается в легкости формования, что существенно для придания микрочипу требуемой формы, например, формы гибридизационной камеры. В настоящей работе были использованы полимеры, содержащие реакционноспособные группы и поддающиеся химической модификации: полиметилметакрилат (ПММА), поликарбонат и поливинилхлорид. На первом этапе проводили щелочной гидролиз поверхностных сложноэфирных групп ПММА до карбоксильных, способных взаимодействовать в присутствии подходящего конденсирующего агента с олигонуклеотидами, содержащими аминогруппу (рис. 5 (1)). Степень протекания реакции контролировали, измеряя краевой угол смачивания поверхности подложки водой (рис. 6). Показано, что водно-спиртовые растворы щелочи быстрее, чем водные, гидролизуют ПММА вследствие лучшего смачивания изначально гидрофобной поверхности полимера. Показано также, что гидролиз при нагревании происходит за 10-15 мин против нескольких часов при комнатной температуре.

Иммобилизацию олигонуклеотидов, содержащих аминогруппу на 5'-конце, проводили по стандартной методике в присутствии конденсирующего агента ЕЭС и нуклеофильного катализатора ЫМ1. Для проверки работы полученных таким образом ДНК-микрочипов проводили гибридизацию зондов на поверхности микрочипа с комплементарными олигонуклеотидами, несущими на 5'-конце биотиновую метку.

сн, сн,

°у° °у I ПММА

.Г

ОИдоМ ОПдоМ

I ПММА ~1 мм? I ПММА ~1

у'УУ ел;

I ПММА I ' .Т _.Л.. I .

мн, ин,

I I 0

<С.НЛ СН (СНА О-Р-О-ОНдоЫ

1,1 он

ПММА I

о рв

О'5'—----—

но-й|. г1-он ЕЮ Г

<рГ)доМ

0

0=1^-0"

1

мн (СН2).

(рндон

0

1

ин

I

(«У,

^нн

ПММА

о-ов

ЕЭС Г1М1

■ ПММА

+ ЦМ

сн, сн,

ОуО Оу^ Оу

I ПММА

НО-51._51-ОН ЕЮ

о^-о-опдом <?»аом 1 о

"ОЕ« 0=^-0"

СН, ) сн,

I ПММА I

оЧ>-0-011доМ _он_

ЕйС N№1

о-г-о-ош

о

НО-г! 51-0Н ЕЮ 0

I ПММА |

Рис. 5. Стратегии получения ДНК-микрочипов на подложках из полиметилметакрилата.

время, часы

Рис. 6. Зависимость угла смачивания от времени для разных способов щелочного гидролиза поверхности ПММА: (1) 1М ЫаОН в воде при 20°С, (2) 1М ЫаОН в воде при 110°С, (3) 1М ЫаОН в 50% этаноле при 20°С. Время указано в логарифмической шкале.

Детекцию биотиновой метки осуществляли путем ее связывания с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза с последующей реакцией окисления субстрата (диаминобензидина), приводящей к образованию нерастворимого продукта, интенсивность окраски которого измерялась после сканирования слайда на планшетном сканере. Результаты гибридизационного анализа представлены на рис. 7 (1). Данные по количественному анализу интенсивности сигнала приведены в табл. 3. Несмотря на удовлетворительную интенсивность сигнала, практическое

применение такого метода ограничено избыточной смачиваемостью карбоксилированной поверхности ПММА, что приводит к растеканию капель раствора олигонуклеотида в ходе иммобилизации. По этой причине была предпринята попытка получения более гидрофобных полимерных подложек.

Рис. 7. Результаты гибридизационного анализа на ДНК-микрочипах,

изготовленных согласно схемам 1-3 (рис. 4). Концентрация иммобилизуемого зонда -2 мкМ, объем наносимых капель - -30 нл, концентрация гибридизуемого олигонуклеотида - 50 нМ. Детекция с помощью пероксидазной цветной реакции.

Табл. 3. Интенсивность сигнала и фона в гибридизационном анализе с использованием подложек из ПММА. Детекция с помощью пероксидазной цветной реакции. Приведены средние значения ± 2 СКО.

Метод модификации Интенсивность сигнала2 Фон3

Щелочной гидролиз 61 ± 18 18 ± 2

Аминолиз ГМДА 42 ± 13 15 ± 2

Аминолиз олигомерами АПТЭС 85 ± 14 16 ± 2

а Приведены усредненные значения из 10-20 экспериментов.

В литературе описана модификация поверхности ПММА путем аминолиза поверхностных сложноэфирных групп гексаметилендиамином (ГМДА) в водном щелочном растворе (Fixe et al., Nucleic Acids Res., 2004, 32, 9). Очевидным недостатком такого подхода является конкурирующая реакция щелочного гидролиза сложноэфирных групп, в результате чего получаемые подложки обладают высокой смачиваемостью водой (данные не приведены). Для предотвращения протекания побочной реакции нами был разработан метод газофазного аминолиза поверхностных сложноэфирных групп ПММА действием паров ГМДА (см. рис. 5(2)) при атмосферном давлении и температуре, предельно близкой к температуре размягчения ПММА (80-90°С). Ковалентную иммобилизацию 5'-фосфорилированных олигонуклеотидных зондов на полученной таким образом подложке и детекцию гибридизованного биотинилированного олигонуклеотида проводили, как описано ранее. Измерение угла смачивания водой поверхности аминированного ПММА даёт значение 120-130°, что свидетельствует о её гидрофобности, вполне достаточной для нанесения капель растворов зондов с высокой плотностью. Однако, как видно из приведенных в табл. 3 данных, в гибридизационном анализе ДНК-микрочипы на рассматриваемых подложках показывают сравнительно низкую интенсивность сигнала вследствие, вероятно,

1 2 3

®

« & с * ♦ * «

• « « « * *

малой плотности аминогрупп, что, в свою очередь, может быть объяснено невысокой степенью протекания аминолиза.

Для получения подложек, сочетающих высокую поверхностную плотность функциональных групп с низкой смачиваемостью в воде, был разработан метод аминолиза поверхностных сложноэфирных групп ПММА действием продуктов поликонденсации АПТЭС в водном растворе. Хемосорбция олигомеров АПТЭС на поверхности ПММА, протекающая за счет образования амидных связей, приводит к формированию на поверхности кластеров аминогрупп (см. рис. 5(3)). Иммобилизацию олигонуклеотидов и проверку работоспособности полученных ДНК-микрочипов осуществляли так же, как описано выше для подложек, модифицированных ГМДА. Гибридизационный анализ выявил сравнительно высокую интенсивность сигнала (см. рис. 7(3) и табл. 3), а краевой угол смачивания такой подложки водой составил 85-95°. Это значение совпадает с углом смачивания аминированных стеклянных подложек, что подтверждает сходство строения органосилоксанового слоя на стеклянной и полимерной поверхностях.

Способ изготовления ДНК-микрочипов на полимерных подложках, иллюстрируемый схемой на рис. 5(3), был также опробован для других полимеров, содержащих электрофильные группировки: поливинилхлорида и поликарбоната. В этих случаях олигомеры АПТЭС удерживаются на поверхности подложки вследствие образования в результате реакций нуклеофильного замещения, соответственно, вторичных аминов и уретанов. На подложках из таких полимеров были изготовлены ДНК-микрочипы, показывающие удовлетворительные результаты (данные не приведены). Тем не менее, наиболее перспективным материалом для массового производства микрочипов является ПММА, сочетающий доступность с высокой прозрачностью и низкой автофлуоресценцией. На его основе по схеме 5(3) было изготовлено и испытано в гибридизационнм анализе около ста ДНК-микрочипов. Эти испытания показали высокую воспроизводимость предложенной методики.

Детекция с помощью магнитных частиц в гибридизационном анализе.

Эффективность аналитических методов, основанных на применении микрочипов, критически зависит от способа детекции сигнала. Недавно в качестве метки при анализе межбелковых взаимодействий на микрочипах были предложены суперпарамагнитные частицы, состоящие из наночастиц оксида железа, встроенных в полимерную матрицу (Morozova et al., Anal. Biochem., 2008, 374, 263). Задача настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить применимость аналогичных подходов для детекции гибридизации на ДНК-микрочипах. В работе были использованы покрытые стрептавидином магнитные частицы диаметром 1 мкм (Dynal MyOne, Invitrogen, США), способные прочно связываться с биотиновой

12

меткой. Было предложено два способа проведения гибридизационного анализа с применением магнитных частиц. В первом способе, называемом «классическим», магнитные частицы обнаруживают меченные биотином фрагменты ДНК, гибридизованные с олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа. Во втором, «активном» способе, биотинилированные фрагменты анализируемой ДНК сначала связываются с покрытыми стрептавидином магнитными частицами, которые затем вступают в контакт с поверхностью микрочипа и удерживаются на ней за счет образования ДНК-дуплексов с зондами в области контакта. Схема методов представлена на рис. 8.

С - стрептавидин ш - биотиновая метка

.шя -олигонуклеотидныи зонд «да - анализируемая ДНК

Б % ■ ф

2Л|1Иагн итнаяу частица

Подложка

Магнитные частицы

Магнитный концентратор

V—1

Магнит)

Удерживаемые частицы

Рис. 8. Принцип двух методов детекции сигнала с помощью суперпарамагнитных частиц в гибридизационном анализе. (А) - «Классический» метод. (Б) - «Активный» метод (пояснения в тексте). (В) Схема эксперимента.

В обоих методах использование магнитного поля позволяет быстро оперировать с магнитными частицами. Процедура анализа заключается в их притягивании к поверхности микрочипа действием расположенного под ним магнита; несвязавшиеся частицы затем удаляются при помощи магнита с коническим концентратором (рис. 8 (В)). Визуализация магнитных микрочастиц легко осуществляется простой оптической системой, которая регистрирует рассеиваемый микрочастицами свет при темнопольном освещении (см. рис. 9).

А К

Рис. 9. Визуализация суперпарамагнитных частиц на поверхности микрочипа в оптическом микроскопе при темнопольном освещении. Кластер из четырех активных зон ДНК-микрочипа до (А) и после (Б) удаления несвязавшихся магнитных частиц.

Чтобы оценить эффективность предложенных способов детекции, было проведено сравнение описанного выше «классического» способа детекции с традиционными, использующими флуоресцентные и ферментные метки, в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах, изготовленных на стеклянных аминированных подложках. С этой целью олигонуклеотиды, меченные биотином или Су5, взятые в различных концентрациях, гибридизовали с комплементарными олигонуклеотидными зондами на поверхности микрочипа и детектировали соответствующим методом (рис. 10, табл. 4).

Рис. 10. Сравнение чувствительности трех способов детекции. (А) - Детекция с помощью магнитных частиц

«классическим» методом (см. рис. 7А). Изображения получены в оптическом микроскопе с темнопольным осветителем. Концентрация гибридизуемого

биотинилированного олигонуклеотида: 1 -1000 пМ, 2 - 100 пМ, 3 - 10 пМ, 4 - 1 пМ. (Б) - Детекция с использованием пероксидазной цветной реакции. Изображения получены с помощью планшетного сканера. Концентрация гибридизуемого олигонуклеотида: 1-10 нМ, 2 - 1 нМ, 3 - 0,5 нМ. (В) - Детекция флуоресцентного красителя Су5 (детектор ВАФ-1). Концентрация гибридизуемого олигонуклеотида: 1-10 нМ, 2 - 1 нМ, 3 -0,1 нМ, 4-10 пМ.

Предел обнаружения определяли как концентрацию или количество аналита, при которых соотношение сигнал/шум составляло не менее 2,5, что соответствует доверительной вероятности 0,99. Из табл. 4 следует, что «классический» метод детекции с использованием магнитных частиц на 1 -2 порядка более чувствителен по сравнению с традиционными способами. В этом случае сигнал остается различимым при концентрации гибридизуемого олигонуклеотида до 1 пМ, в то время как сигнал при детекции флуоресцентной и ферментной меток исчезает при концентрации аналита 10 и 500 пМ, соответственно. Следует отметить, что предел обнаружения флуоресцентного метода был определен для конкретного детектора, разработанного компанией ММТех и предназначенного для проведения массовых анализов.

Табл. 4. Соотношение сигнал/шум в зависимости от концентрации и количества гибридизуемого олигонуклеотида для различных методов детекции. Представленные на рис. 10 и 11 изображения оцифровывались, среднее и СКО сигнала и фона рассчитывались по светимости соответствующих областей на изображениях.

Метод детекции Концентрация, пМ Кол-во, фмоль Сигнал Фон Сигнал/ шум1

Среднее СКО Среднее СКО

«Классическая» детекция магнитными частицами (МЧ) 1000 3 192,0 26,5 83,5 6,2 17,5

100 0,3 207,1 24,4 86,1 13,8 8,8

10 0,03 176,0 22,9 100,3 11,7 6,5

1 0,003 143,0 25,2 89,8 9,4 5,7

0,1 0,0003 89,2 23,5 81,1 10,3 0,8

Пероксидазная цветная реакция 10000 30 30,0 7,0 2,7 3,1 8,8

1000 3 22,8 5,6 8,1 4,5 3,3

500 1,5 8,6 4,6 3,0 3,9 1,4

Флуоресцентная детекция 10000 30 247,0 14,7 34,2 2,4 88,7

1000 3 139,5 20,1 32,4 2,3 46,6

100 0,3 41,9 5,9 33,9 2,3 3,5

10 0,03 35,5 3,3 31,6 2,2 1,8

«Активная» детекция МЧ 3000 10 112,1 18,7 69,1 8,0 5,4

300 1 103,9 19,4 80,2 9,7 2,5

150 0,5 88,0 15,2 72,2 9,9 1,6

Соотношение сигнал/шум рассчитывалось как (средний сигнал - средний фон) /(СКО фона)

Для иллюстрации работы оценки чувствительности «активного» метода детекции с использованием магнитных микрочастиц различные количества биотинилированного олигонуклеотида смешивали с суспензией покрытых стрептавидином магнитных частиц. В отличие от традиционных методов гибридизационного анализа, в которых связывание аналита на поверхности микрочипа из-за ограниченной скорости массопереноса протекает за часы, в предложенном «активном» методе связывание биотинилированной ДНК магнитными частицами протекает в суспензии за несколько секунд. Собранный таким образом на магнитных частицах анапит затем быстро доставляется к поверхности микрочипа действием магнитного поля. В области контакта двух

поверхностей образуются ДНК-дуплексы с комплементарными зондами, магнитные частицы фиксируются в соответствующих зонах, после чего несвязавшиеся частицы удаляются. В результате, все стадии анализа занимают не более минуты, что значительно быстрее других способов проведения гибридизационного анализа.

Чувствительность «активного» метода была определена в единицах количества вещества, а не концентрации, так как вследствие чрезвычайно прочного связывания биотина стрептавидином на поверхности магнитных частиц можно собрать меченые фрагменты ДНК из сколь угодно большого объема. Полученные результаты представлены на рис. 11. Как следует из табл. 4, предел обнаружения «активного» метода составил 1 фмоль.

Рис. 11. Иллюстрация «активного» метода детекции с помощью магнитных частиц. Изображения получены в оптическом микроскопе с темнопольным осветителем. Количество олигонуклотида, взятого для реакции с 2х10б магнитных частиц в объеме 3 мкл: 1-10 фмоль, 2- 1 фмоль.

Данные, приведенные в табл. 4, показывают, что «активный» способ на 3 порядка менее чувствительный, чем «классический». Это объясняется тем, что в «активном» методе только около 1% поверхности магнитной частицы контактирует с микрочипом, и молекулы аналита, находящиеся на остальной части поверхности, оказываются потерянными для анализа. Кроме того, совокупная площадь поверхности микрочастиц, взятых для анализа (~6 мм2), примерно на порядок больше суммарной площади кластера из четырех активных зон на ДНК-микрочипе (~0,8 мм2). При использовании в анализе микрочипов с меньшими по размеру активными зонами и, соответственно, меньшего количества магнитных частиц чувствительность «активного» метода может быть существенно повышена.

Используя значения предела детектирования, можно оценить минимальное число ДНК-дуплексов, способное удержать магнитную частицу на поверхности микрочипа. Для «классического» метода, предполагая, что все 1,8х106 молекул олигонуклеотида из 3 мкл 1 пМ раствора гибридизованы и равномерно распределены по поверхности 4 активных зон площадью 0,8 мм2, минимальная поверхностная плотность олигонуклеотидов, детектируемая с помощью магнитных частиц, составляет 2 молекулы/мкм2. Поскольку площадь контакта магнитной частицы с микрочипом составляет -0,03 мкм2, можно заключить, что единичные ДНК-дуплексы способны удерживать магнитные микрочастицы на поверхности микрочипа. В «активном» методе минимальное детектируемое количество олигонуклеотида составило 1 фмоль (табл. 4) при использовании 2х106 магнитных

частиц, что соответствует 300 молекулам на одну частицу, из которых только -1% может взаимодействовать с поверхностью микрочипа. Таким образом, в условиях предела детектирования «активного» метода каждая магнитная частица удерживается на микрочипе в среднем тремя ДНК-дуплексами, что по порядку величины совпадает с оценкой, сделанной для «классического» метода.

Применение предложенного метода детекции с помощью магнитных частиц проиллюстрировано в гибридизационном анализе образца сои на содержание ГМО (рис. 12).

Рис. 12. Пример применения магнитных частиц в анализе ГМО. Представлен результат гибридизационного анализа образца трансгенной сои с содержанием ГМО 0,1%. Детекция с помощью суперпарамагнитных частиц осуществлялась «классическим» методом. Изображение получено в оптическом микроскопе с темнопольным осветителем. Показан сигнал трансгенного маркера NOS.

Важной проблемой, возникающей при использовании предложенных способов детекции с применением магнитных частиц, является их неспецифическая адгезия на поверхности микрочипа. Для решения этой проблемы в описанных выше экспериментах использовалось блокирование поверхности микрочипов бычьим сывороточным альбумином. Однако и в этих условиях неспецифическая адгезия магнитных частиц оставалась высокой (данные не приведены). Кроме того, при таком блокировании поверхности слой адсорбированного белка может препятствовать взаимодействию части олигонуклеотидных зондов с молекулами аналита, что снижает чувствительность анализа.

В серии предварительных экспериментов была изучена адгезия покрытых стрептавидином магнитных частиц на поверхностях различной природы. Показано, что наименьшей адгезией к магнитным частицам обладает гидрофильная поверхность декстрана. В результате проведенных исследований был разработан метод изготовления стеклянных подложек, покрытых ковалентно удерживаемым слоем декстрана, а также способ иммобилизации олигонуклеотидных зондов на такой подложке. Для этого декстран (250 кДа) активировали в безводной среде действием п-толуолсульфохлорида (TsCl) в присутствии пиридина и наносили на поверхность аминированной подложки. Полученное покрытие вновь активировали TsCl и иммобилизовали модифицированный аминогруппой олигонуклеотид. Непрореагировавший эфир п-толуолсульфокислоты гидролизовали в щелочной среде. Схема описанных реакций приведена на рис. 13.

Преимущество предложенного метода состоит в том, что активированная поверхность декстрана достаточно гидрофобна (краевой угол смачивания водой составил 65°). Это обстоятельство, как уже отмечалось ранее, существенно для

17

нанесения иммобилизуемых зондов с высокой плотностью расположения капель. В то же время, после гидролиза тозилатных групп декстрановое покрытие вновь приобретает гидрофильные свойства, обеспечивающие низкий уровень неспецифической адгезии магнитных частиц (рис. 14).

Рис. 13. Схема получения ДНК-микрочипа на стеклянной подложке с декстрановым покрытием.

ДШ

ёШЙШШИ

ЙМЯР1

Рис. 14. Детекция сигнала в гибридизационном анализе с использованием магнитных частиц на поверхности микрочипа, изготовленного согласно схеме, представленной на рис. 13. Изображение получено в оптическом микроскопе с темнопольным осветителем. Концентрация гибридизуемого биотинилированного

олигонуклеотида - 50 нМ. Яркая область в верхней части изображения - активная зона ДНК-микрочипа с удерживаемыми на ней магнитными частицами.

выводы

1. Установлено, что ДНК-микрочипы на основе стеклянных подложек, модифицированных 3-аминопропилтриэтоксисиланом в полярном растворителе в присутствии воды, обеспечивают высокую воспроизводимость анализа в течение не менее полутора лет.

2. Показана возможность изготовления ДНК-микрочипов на подложках из полиметилметакрилата, модифицированных путем аминолиза поверхностных сложноэфирных групп олигомерами 3-аминопропилтриэтоксисилана.

3. Разработаны методы детекции сигнала в гибридизационном анализе на ДНК-микрочипах с использованием суперпарамагнитных частиц. Чувствительность этих методов позволяет регистрировать единичные ДНК-дуплексы на поверхности микрочипа.

4. Применение суперпарамагнитных частиц позволяет сократить время проведения гибридизационного анализа с нескольких часов до нескольких секунд за счет ускорения массопереноса под действием магнитного поля.

5. Получены подложки с декстрановым покрытием для сверхчувствительного гибридизационного анализа с использованием ДНК-микрочипов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Yu.M.Shlyapnikov, E.A.Shlyapnikova, T.Ya.Morozova, I.P.Beletsky, V.N.Morozov. The detection of the microarray-hybridized oligonucleotides with magnetic beads. Analytical Biochemistry (2010), 399(1), 125-131.

2. Е.А.Шляпникова, Ю.М.Шляпников. В.Н.Афанасьев, Г.В.Афанасьева, А.В.Гаврюшкин, И.П.Белецкий. Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа. Биоорганическая химия (2007), 33(2), 261-268.

3. Е.А.Шляпникова, Ю.М.Шляпников, И.Э.Грановский, Г.В.Афанасьева, И.П.Белецкий. Биологические микрочипы в медицине. Вестник НИИ молекулярной медицины (2007), 7, 42-50.

4. Шляпников Ю.М.. Шляпникова Е.А., Бирюков С.В. Способ получения ДНК-чипов (варианты). Патент №2315114 (2008).

5. Шляпников Ю.М., Шляпникова Е.А., Белецкий И.П. Способ получения ДНК-чипов. Патент №2321574 (2008).

6. Грановский И.Э., Белецкий И.П., Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Гаврюшкин А.В., Бирюков С.В. Биочип. Патент на полезную модель №69866 (2008).

7. Гаврюшкин А.В., Шляпников Ю.М., Бирюков С.В., Шляпникова Е.А., Белецкий И.П., Грановский И.Э. Способ изготовления многофункционального мультичипа, мультичип для последовательного или параллельного скрининга биополимеров, способ анализа биополимеров и набор для осуществления способа. Патент №2321638(2008).

8. Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Грановский Н.Э., Афанасьева Г.В., Гаврюшкин А.В., Белецкий И.П. Перспективы использования биологических микрочипов в диагностике. XI Всероссийский форум с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге". Санкт-Петербург, 28-31 мая 2007.

9. Granovsky I.E., Philippova V.V., Shlyapnikova E.A., Afanasyeva G.V., Shlvapnikov Yu.M., Afanasyev V.N., Gavryushkin A.V., Beletsky LP. "Microarray-based medical diagnostics". Russia-Korea Seminar on Modern Science and High Technology. Pushchino,

2008, p. 13.

10. Грановский И.Э., Филиппова В.В., Шляпникова Е.А., Афанасьева Г.В., Шляпников Ю.М.. Гаврюшкин А.В., Белецкий И.П. "Биологические микрочипы для медицинской диагностики".V съезд общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова. Москва, 2-4.12.2008, стр. 218.

11. Shlvapnikov Yu.M., Granovsky I.E., Shlyapnikova E.A., Afanasyeva G.V., Afanasyev V.N., Beletsky I.P. Test-systems development for the foodstuff analysis and medical diagnostics. The 2nd Korea-Russia Joint Symposium in Bioscience and Biotechnology. Moscow-Pushchino-S-Petersburg, June 15-18, 2009, p.16.

12. Шляпников Ю.М. Использование суперпарамагнитных частиц в гибридизационном анализе. Конференция Молодых Ученых ИТЭБ РАН. Пущино,

2009, стр. 52-53.

Подписано в печать: 18.03.2010

Заказ № 3413 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ni

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Технологии изготовления ДНК-микрочипов.

1.1. Синтез олигонуклеотидов in situ.

1.2. Постсинтетическая иммобилизация олигонуклеотидов.

1.2.1. Методы модификации стеклянных подлооюек.

1.2.2. Методы ттобипизации па полимерных подложках.

1.2.3. Методы штобилизагцш на полисахаридах.

1.2.4. Методы определения поверхностной тотности аминогрупп.

2. Детекция сигнала в гибридизационном анализе.

2.1. Прямые методы.

2.2. Детекция радиоактивных меток.

2.3. Детекция ферментных меток.

2.4. Флуоресцентная детекция.

3. Активные методы проведения гибридизационного анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе результаты позволяют снять многие вопросы теоретического и практического характера, связанные с технологиями изготовления ДНК-микрочипов - одного из новых аналитических инструментов в современной биохимической диагностике. Разработанный метод детекции в гибридизационном анализе с помощью суперпарамагнитных частиц дает возможность многократно повысить чувствительность анализа и сократить время его проведения. Эти преимущества открывают дополнительные перспективы для широкомасштабного применения тест-систем на основе ДНК-микрочипов в некоторых научных исследованиях, медицинской диагностике, анализе продуктов питания и др.

Изготовленные по одной из предложенных технологий ДНК-микрочипы внедрены в производство, выпускаются компанией ММТех и используются в нескольких лабораториях Москвы и Московской области для выявления генно-модифицированных организмов в продуктах питания. В настоящее время ведутся испытания аналогичных ДНК-микрочипов для диагностики ряда инфекционных и онкологических заболеваний, а также некоторых наследственных заболеваний, вызванных мутациями в определенных генах.