Разработка методов получения целлюлозных волокнистых материалов с комбинированным биологическим действием тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МИНИСТЕРСТВО НШИ, ВЫСШЗЯ ШКОЛЫ К ТЕМгаХВСЯ

политики российской «еяерации

1ШЮВСШ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗВАЫЗКИ ГООУДЛКГГЕ-ЗШиЯ ТШШЬНЛЯ АКАДЕМИЯ ;>>1 А. Н. КОСЫГИНА

Га правах ругазнЗ'.оИ

. Л?

Л 1 \

V * -

у' ившзвд шрт вячес.шош

УДК ¡577.162.34.04"

РАЗРАБОТКА ШОДЭа ПО;1УЧШШ ЦЕШЮЗШХ в0л0ж2с.тык ШЕРШСВ О ШШИНИРОВШЬМ ЯЙОШГИЧ2СКШ ДЕЙЗТБШ

Специальность 02.00. 00 Хймия Б1йокомоде::улярных соединения

Автореферат диссертации иа еоисиачгэ г'-тпй степени кандидата химических наут:

Шсква - 1952

Работа выполнена fi Московской ордена Трудового Красного Окашии Государственной текстильной академии ш. A. R Косыгина

Научный руководитель: " доктор химических наук,

профессор

Вирник А. Д.

Официальные оппоненты: доктор хииичошш наук, профессор

кандидат химических наук, отарщиа научный-сотрудник

Шгилъшн 11 И. Латов а К.

Шдущзз предприятие: Санкт-Фтс-рбургский институт текстильной и легкой промышленности

Защита состоится Ш&'/Ы' г. в час. 1Ш йоседании споциаяиеированного совета К 053.26.05 в Шскоьской ордена Трудового Красного Знамени Государственной •рекс-тильной академии од A. IL Косыгина до адресу: 117018, Ыюква, U. Кадуизкая ул., д4-'

, С диссертацией мокно ознакомься в библиотеке акадеиии. Автореферат разослан "/У" .-¿¿¿l^ lQUii г.

Ученый секретаре специализированного совета кандидат технических наук

доцент * Балашова Т. Д.

- s -

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность îeiia S оОгей проблеме создания биологически агатных полимеров одним из интенсивно развиваюаихся направления является получение полимерных материалов, содержащих иию-бияивованныэ ферыэнгн. В последнее десятилетне показано ю-л'асообразность применения протеолитических ферментов для лечения гнойных и окоговнх ран. Ш.и.юбглиэация протеолитических фэркентов позволяет устранить присущие нативныи ферментом к<>~ достат!си ( пыструп рнактшзацзю в рале вследствие автоллгоа, антигенные свойства и вагпяшгое aasepreiwoo действие). Рначи-тайный ингерос представляет разработка методов получения цел-лшсеных юлошшотих материалов ( ПЕМ). додерладах иммобилизованные протеолптичесгоге ферменты, Которые предназначены для применения в качестве перевязочных средств. Характерной тенденцией современного этапа работ по Получению биологически актирных полимеров ыэдищшского назначения является создание материалов с комбинированным биологическим действием. 1Ълмюо вначенне имеет раэрабоиса методов получения волокнистых материалов, содержащих наряду с иммобилизованным протеолитическим ферментом биологически активное вещество другого типа Uomo полагать, что такие материалы будут более эйфею'ивны при лечении гнойных и оюговых ран, чем Уаторишщ, обладающие толы« протеолитической шсгявностью. Шэтоку ивучаиче вашюмерпостей н разработка методов получения ЦШ с кямоишгровгишым биологическим действием на основе доступных полимеров-носителей -привитых сополимеров целлюлозы и полиакриловой кислоты или ее соли (Ц-пр-ПЛК-И и Ц-пр-ПАК-Na) представляет значительный научный и практический интерес и является актуальной.

Закономерности нитерполимерных реакций (ИПР) между водорастворимыми полиэле ктролитаки в настоящее время исследованы очень подробно, 1ШР с участием нерастворим« полимеров, содержащих ионизующиеся группы, и белков изучены недостаточно, а ИПР ферментов и привить« сополимеров целлюловы практически не исследованы.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Постановлением ЦК КПСС и Совета Министров СССР от 02.09,1985, общесоюзной научно-технической программой 0.74.05 lia 1986-lSOOrr. (задание 05. H 4) и Государственной научно-технической программой "Новейшие методы биоинженерии" на 1990-1995гг.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы

йммег'вй разработка находив получения ЦВМ с комСкшгроваиаш си-эдогичэсккм дойстьвам и нвучениэ свойств исдушшых кзде риалов. Для дости.иния посталданной да аз иаобяодиш бшю: установись вакоиоизрности и разработать изход пшобилкзацци прогео-дитичеокого фортка трипсина (ТР) на Ц-пр-ШК-Н и Ц-нр-НАК-На. осу^зствляекиа по непрерывной тахшшгнческоа (¡Шаг, раграбогахь мотоды волучэнка ЦВМ. содержанет одновременно о ТР фаршкт л112оцни (Ш), обладающий бакгериолш;-чэской гиттностъ», шш низкоиодэкудяриав биодогичоски актиз-. нов весомо другого удаа (АУВ идя шчемму); установш» вако-исшриасти и разработать непрерывный штод прясоеддазнкя к Ц-пр-ШШ-Н(На) протерлитичасш: фэршитоз протеааы-0 СП?) и козлятина (НОЛ), обладавших доллагеиодаичесдай активностью; уа?шюйИ'?ь влияние штада и условий подачак«я, а тшта состава

3«рМйЩ'С0Дэр}ЩЩ ЦШ и ДШ о коибишфовйнньм 6}ш0гнчзск<ш д»йстэи на фиаика-химическиэ свойства ишобидавозаинш; фор-¡¡оцтов; научить аффекткзность пришнвшш получзнищ ДШ, обла-д!здн5с 1«зыбш1!р0вш!нш биологическим дэйстеяом.

ШОЙМ Ь'евняна. В диссертационной работе впэрвш установлено, что яри ю&юЗилшзадии на призшои соподншре цедама-вн и поашакридовоя кислоты (ПАК-Ю иди .ее натриевой сога (НАК-Ыа):

•• акстреыальная вааисимоеть ьишыства хишчзскн связанного Салка (КХОБ) при ишэОилнзщш ТР, КОЛ и ЯР от прододагсель-ности рошедш обусловлена перестройкой иолиэлектродктногг/ кошлакеа (НЭК) белок-привитой к дадлавоае подиашюн, ириаодя-йзй в вододвнк» части макромолекул балка;

- вавкмдая ог концаитраада степощ> ассоциации ыакроиояэкул ТР в растворе ока-.ьшаэт существенное влияние на фиакко-юм-ческиэ свойства иммобилизованного фзрыэнта, что свясаао с раз-

сз роашж,: обризувдшя ЮК;

- о увеяттш прододаятедькоэти реакции активность ишоби-/ишойаиного фермента йнижаатся, а стабильность возрастает вследствие перестройки ГОК и уведшлшя числа связей, образующие» ыеаду макромолекулами фершнта и полишром- носителем;

- различие в конформации привитых к цал-аозеде цепей ПАК-Н или ПАИ-На оказывает влияние на состав ХйК иратесди'гическиЯ фар-иэнт-прнзитой к ц-зйтдаозо полианион и кинэгяку его перестройки, а такш на свойства идообилиаованного форманта;

- образовать яоподнйтежмш ионных связей ь ГОК ТР-привитой к цалшееове полианион при обработка АМВ, содержаадми нссгллько

- б -

основных групп, приводит к увеличению стабильности иммобилизованного фермента;

- вследствие нивкой степени ассоциации макромолекул ЛКЗ в растворе перестройка ГОК ЛИЗ-привитой к целлюлозе полианиои по сопровождается выделением макромолекул белка и существенным спи-гэнивм бактернолитической ашшюсти( ОБА) иммобилизованного ¿КЗ;

Практическая значимость и Яроверта результатов работы.

Разработки метод,« получений ЦШ, содеркаших имшСивиэо-вашыЯ протеолитпчесгат фермент ТР и протеолитические ферменты, обладающие кодлагеполитической активностью, основанные на присоединении их иен'!ими связями к Ц-пр-ПАК-Н 5! Ц-пр-ПАК-На. Разработана непрерывная технологическая схема получения ДПМ, содержавдх ТР, ПР или ГОЛ. О использованием метода математического моделирования определены оптимальные параметры технологического режима иммобилизации ТР, ПР и КОЛ аа Ц-пр-ПАК-Н. Разработаны методы получения ЦВМ с комбинированным биологическим действием, основанные на введении в материалы, содержание иммобилизованные протеолитические ферменты (ТР, 13Р или 1ЮЛ),биологически актизного вещества другого типа (АМВ иди мочевины) или совместной иммобилизации двух ферментов с различным типом биологической активности (ТР и ЛИЗ). Установлено, что протеолитические свойства полученных ферментсодержащих материалов сохраняются при ^-стерилизации и последующем длительном хранении. Разработанные методы получения волокнистых материалов с комбинированным биологическим действием проверены при изготовлении укрупненных опытных образцов, испытанных в 1гм Московском медицинском институте и НИИ лазерной хирургии. Наказана целесообразность и эффективность применения ЦВМ с комбинированным биологическим действием для лечения экспериментальных гнойных и ожоговых ран.

Апробация работы и публикации. Основное содержание диссертационной работы докладывалось и обсуждалось на 8 .Всесоюзных научных симпозиумах и конференциях, научных конференциях профессорско-преподавательского состава, сотрудников и аспирантов МТИ,1988-1990 гг. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи, тезисы 8 докладов на 8 научных симпозиумах и конференциях, 3 статьи депонированы в ОНШТЭХИМ (г.Черкассы).

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, методической части, основных результатов и их обсуждения, выводов, библиографии и приложения. Диссертационная работа содержит 102 .страницы машинописного текста, 32

- б -

риоушса, 41 таблицу, библиографию на 102 наименований и 23 •pfpaüiíma приложения.

Б соответствии с теша диссертации в литературном обзоре Пррал&дщл'Фоаани работы, посвященные получению и иаучонию свойств 1ШМ, содердаших химически присоединенные протеодитн-цеокии ферменты, a такяе комплексов протеолитических фермантов ч неприродными полиэдектролоташ.

ОСдашИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ 050У1ЩЕШ Вдц получения ДШ, содеряаадх иммобилизованный ТР. ЛИЗ. 'совместно íp и ЛИВ, КОД или ПР, модифицированный ЦВУ, содержания киолотииа групп» (Ц-лр-ИАК~Н или Ц-пр-ПАК-Na). обрабатывали' растЕоррм ' íóptif-uya £ 0.05М фосфатной буфере (модуль ванны ti) ь течуниэ нескольких секунд, отжимали на лабораторной ¡глинке ."Бенц" (степень отжима 1СШ) и выдерживали во влажном аостсапии в течение различного врсмэци при £¡Qa0. Затем промы-равд йуфариьш раствором «о отсутствия белка в промывных водах И сушили при различной температуре.

■Для характеристики ЦВУ, содержащего иммобилизованные íep-Wiii'íu С ТР. ПР, КОЛ или ЛИЗ), определяли НЖ® (мг/г ЦВМ), степень п:шиного исполъаования белка - СПИБ (СШ{Б-СКХСБ/КЖБо] • 100Х, i'/ii ЮйЕо - количество белка, нанесенного на материал, мг/г Ж1Ш, казеинолитическуй активность ЩШ, содар>едаго иышйидл-BOBáHiiuíl ТР. ПР или КОЛ - КА (ТЕ/г ЦВЫ), относительную актив-'íioqn (ОА) иммобилизованного ТР.КОЛ ИДИ ПР (GA»[KA/(lOÜJB-KAo)j ' J,QOX, где Шш - 1сааеииоип'Ическак активность натшшаго ТР, КОЛ ■'илщЩ', Tfi/мг бедка), ОБА ЦВМ. содержащего иышЗшшовашши ,5lí{3 Ц). IíA и UAo определяли по отношении к высокомолекулярно-i; му субстрату кавеину в течение 10 мин при температуре 370 0 и ' выражали в единицах (ТЕ) - количестве ыкыоль тирозина, которое , выделяется при гидролизе кааеица % мг иативиого фермента или ir ДЩ. содержащим иммобилизованный формант. ОБА нативного или 1(Миобиллаованного ЛИЗ определяли по отношению к клеточному субстрату Mtcroooccus lysaclelotlcus. Коллагеюлитическую активность определяли десорбции ПР и КОЛ с МП ¡.о охноиз-¡ищо; \t израствори^ад1 кэддад-ену. Содержаний Солка в растворе ''Чрсдйлрн ызтодоы Л.щщ и !Л1^1гсрофо*хокетричс-оки npni.-boa им.

- гфттшт шшаш кшшйтщ: ттшт. ■ • ■ .;í '' ц§ш°аы я шшттт цшда

; . 'При й-зунении ишо^шюацин П' на Д-цр-ПАК-ШНа') било по -|;иаано, '.что макиишаьние Кй'Б.. СЯШ-И ВА формвотоод^рлаш^го ЦВМ.^ос-рираюгрн в «дуча'х нрвбдаиия процесса при рН 8.6. Уста-

иовлено (рис. 1), что вавксишсти КХСБ, СПИВ, КЛ трипсиксодер-тау>го ЦВМ и ОЛ иммобилизованного ТР от времени реакции имеют экстремальный характер.

В случае использования для получения • Ц-пр~ПЛ1\-Н(Нв)-ТР раствора ТР о ыеныкй концентрацией (0.25 мг/мл) характер вавгсимостей указонннх показателей процесса вышбшшзашш ТР на Ц-ир-ПАК-П(На) от времени не ивмепгется, однако. состав и свойства ферыэнтсодерйагеих ГШ при увеличения продолжительности реакции свыше оптимального значения изменяется в меньшей степени (при этом СПИВ болык», а ОЛ иммобилизованного ТР меньда, чем при использовании для иммобилизации раствора ТР о концентрацией ] мг/яя). Было установлено, что концентрация раствора ТР, попользованного для обработки Ц-пр-ПАК-НСНа}, оКаоьпваот суйвмвеииоэ влияние на фивико-химические свойства иммобилизованного фермента (таблица I).

2/отолом упругого светорассеяния било показано, чго для растворов ТР во времена наблюдается увеличение интенсивности светорассеяния, которое существенно оапиент от начальной кок-цэнтрации белка Шнримзр. если в нулевой момент времени моле-1?улярпая масса (Ш) ТР составляет 23.6 тыс., при выдерживании в течение 15 мин раствора ТР с концентрацией 0,25 и 1,0 иг/т М» составляла соответственно 28,6 тыс. ¡4 74,7 тыс.

Данные о зависимости степени ассоциации макромолекул ТР от концентрации раствора позволяет объяснить характерные особенности иммобилизации ТР на ТИф-ШШ-ЩНа). При использовании раствора ТР с концентрацией 1мг/мл на полимере-носителе первоначально иммобилизуются достаточно Крупные ассоциаты ТР, перестройка ГОК сопровождается части'шым или полным разрушением ассоциатов и выделением части макромолекул ТР при промывке, число связей между макромолекулами ТР и полимера-носителя возрастает. При низкой концентрации ТР в растворе степень ассоциации макромолекул белка небольшая, поэтов/ к полимеру-носителе первоначально присоединяются в основном небольшие но размерам ассоциаты или отдельные молекулы ТР, состав и строение ПЭК изменяется во времени значительно меньше. При снижении концентрации раствора ТР, использованного Для обработки Ц-пр-ПЛК-Н(На), меллу основными группами ТР и карбоксильными группами полимера-носителя возможно образование большего числа ионных связей, что приводит к уменьшению ОД И существенному повышению стабильности иммобилизованного ТР (Кэф. с)гарости инактивации снижается). При этом энергия активации (Еа) про-

мг/г 4

, О

а)

?, час 6)

чао

а)ККШ, иг/г ЦШ;

р»«,о. 1, Вдвдша продолжительности реакции на: (5) НА фершнтсодеркздзго ЦШ. ТЕ/г ЦВк Условия реакции,- концентрация бежа в растворе -шт/ил; ч ноиооОшнная емкость (НОЮ полимара-носитедя-и. 9шюль/г;

ЮШэ на Ц-пр-ПАК-Н и Ц-пр-ПДК-на соответственно 6,0 и • 6,9 мг/Г ЮЗД 1 - Ц-яр-ПАК-Й, 2 - Ц-пр-ПАК-Ца.

Таблица 1

Влияние условий получения Е-пр-ПАК-ЩНа)-ТР на фиаико-химнч&скне свойства иммобилизованного ТР.

I

, I Подимер-коаитель Концентрация раствора ТР, иг/ил Продолжительность реакции ишюби-ливации чао РН опт Тощ. •С £а гидролиза кавеи-на, кДк/ шдь Кэф скорости инактивации ТР. (згс.оЛы фосфатный Еа процесса инактивации к№ УОДЬ

к-н 1 ' {< . г 0,10 0 26 о, ее 0,80 1,00 1!оо 8.00 з!от 3,00 0.7Б 8,00 1*8 и 7,6 ББ 55 60 БО БО 16,4 22. В 34,2 32, 0 йа, 1 22,0 0,27 0,34 0,49 о.ез 0,70 0.6& об ,4 45,0 Б7,0

1,00 0,76 60 34, й 39,2 0,61 0,54 46, а 63,1

;,датрный, ТР - 7.6 60 за, о 0,46 £8.6

Условия реакция: ИОЕ додимера-цоситолл - 0,0 мшдь/г.

о - 8 -

даоса гидролиза казеина и анергия активации процесса инактивации ТР уменьшаются.

•■ ОСравовыше дополнительных ионных связей между ферментом и привитым к целлюлозе полианионом при увеличении продолжительности реакции таюоэ приводит к стабилизации конформации ышсромолекул белка и повышению стабильности иммобилизованного ТР. При использовании в качества исходного материала Ц-пр-П&К-Н КА ферыентсодершцего ЦВМ выше, а стабильность иммобилизованного ТР ниш, чем в случае присоединения ТР к Ц-пр-ПАК-11а, что момэт быть обусловлено образованием большего числа ионных связей между макромолекулам;! фермента и привитыми цепями Ц-пр-ПАК-На, имеюалы развернутуэ конформациа

" 0 целью выяснения суммарного влияния различных факторов на основные характеристики процесса получения трипсинсодераадаго ЦВМ использовали математический метод планирования эксперимента. В качестве варьируемых входных параметров были выбраны: концентрация белка, мг/мл (XI), продолжительность реакции, мин (Ж), ионообменная емкость полимера-носителя,ммоль/г (ХЗ). В качестве выходных характеристик - КХСБ.мг/гШ), СПИВД (У2), ЙА.ТЕ/г £ УЗ), ОАД (У4). В результате реализащш плана второго порядка для трех исследуемых фагаоров (униформрототабельного плана Бокса) и расчета на ЭВМ с учетом значимости коэффициентов были получены упрощенные уравнения регрессии:

3,33 + 0,52X3 + 1,25X1X2 - 0Д8Х1ХЗ - 3,76X2X3 У2» 83,90 + 3,69X1 - 3,35X2 - 12,12X3 - 10.13X3* УЗ- 7,02 - 0,59X1 - 1,85X2 - 0,69X3 - 1,24X1X2 + 0,49X113 У4- 22,БО - 4,39X1- 6,28X2- 6,42X3- 4,68ХШ*- 3,88;йХ^ З.бШ^ Слученные математические модели, адекв-.тко описывающие процесс на 52 уровне значимости, были использованы для поиска оптимальных условий проведения реакции получения Ц-пр-ПАК-й-ТР с заданной НА. Оптимизация ссуи^ствлядась по двум параметрам (СШ1Б и ОА).

2. Излучение материалов с комбишгеозаннь-м биологическим действие^ на основе трипошюодерздэго цоллюдозного волокнистого шмркада , •: '

Для определения оптимальных условий совместной ишобплиаа-шш ТР и ЛЛЗ на Ц-пр-ПАК-Н(Ма) предварительно были изучена' Ьг»г воясмераоог'и иммобилизации одного ЛШ на улвзаинш полимерах-носителях. Было установлено, что иммобилизацию да це-; лзсообразно проводить при рН-8,5. Показано, что кинетика Ш1 медну И-пр-ПАК-Н(На) и ЖЗ (рис.2) существенно отличается ог,

- 10 -

о

мг/г 10

0 6

4 6

10 12 14

'¿О 22 Ы

I , час

Рис. 2. Влияние продолжительности реакции на КХСВ.

Условия реакции: концентрация ЛИЗ в растворе: 1,2 - 0,3 мг/мл; 3,4 - 1,0 мг/мл; 6,6 - 2,0 мг/мл: 1исБо составла-ет; 1-2,0: £-2,8! 3-5,8; 4-2.5} Б-12,0; 6-12,8 мг/г ЦВМ; 1,3,5 - Ц-ир-ПАК-И; 2,4,0 - Ц-Нр-ПАК-Иа

кинетики ИПР между Ц-пр-ПАК-И(Ла) и ТР( зависимости КЖБ и СШШ от продолжительности реакции не являются экстремальными). При увеличении концентрации ЛИЗ с 0,3 до 2,0мг/мл максимальная СПИВ снижается со 100 до 80%, ОБА при этом возрастает с 62 до 72%. стабильность уменьшается. При увеличении продолжительности реакции ОБА иммобилизованного ЛЙЗ снижается незначительно, а стабильность несколы«? возрастает. Это показывает, что с увеличением времени реакции процесс перестройки НЭК с участием ЛИЗ все же происходит, но не сопровождается изменением состава и выделением части макромолекул ЛИЗ.

Методом упругого светорассеяния было показано, что наблюдаемое различие в ИПР с участием ТР И ЛИЗ обусловлено разной степенью ассоциации макромолекул ртих ферментов в растворе -для ЛИЗ она значительно ниже (например, если в Пулевой момэнт времени Мкс ЛИЗ составляет 14,3 тыс., то к 15 мин для раствора с концентрацией 1,1 мг/мл - 15,9тыс.). К привитым цепям ЦВМ присоединяются незначительные по размеру ассоциаты ИЛИ одиночные макромолекулы ЛИЗ, которые в процессе реакции могут перераспределяться на привитых цепях, образуя большее число ионных связей, в результате этого возрастает стабильность иммобилизованного ЛИЗ.

- п -

При совместной иммобилиаации ЛИЗ и ТР на' Ц-пр-1ШИ1 ва-ПН0И1!0С5.'И КХСВ, КА и ОБА от продолжительности реакции имеет е!ю?ре»,«шп>лый характер. Ыакстшьние КХСБ, КЛ и ОВД достигаются оа 46 шш, КА и ОБА при этом спишется сильнее, чей в случае иммобилизации на Ц-пр-ПАК-Н одного ТР или одного ЛЮ, что макет быть обусловлено образованием фермент-субстратного комплекса ТР-ЛКЗ, частичным гидролизом ЛИЗ и увеличением числа {ганишс связей ТР и ЛИЗ о полимерной матрицей.

Для придания трипсинсодериашэыу ЩШ антимикробных свойств ' попользовали АЫВ о широким спектром действия и нивкой токсичность»: здоргексидин Оигшжон&т (ХГБГ) и гентамицил сульфат. Установлены закономерности получения ЦВМ, содержащих одновре-гэнно ТР и ШВ, по двум способам путем последовательной обработки Ц-пр-ПАН-ЩНа) растворами ТР и АШ или растворами АШ и ТР. ''Снижение КА и увеличение стабильности иммобилизованного ТР после обработки АШ может быть обусловлено дополнительной фиксацией макромолекул белка за счет "мостиков-скрепок", которым! с дукат шлекулы А1£В, содержащие несколько основных групп.

Установлено, что иммобилизация на Ц-пр-ПАК-ЩМз) реш» повышает стабильность ТР к действию мочевины, обладавдзй керато-лзгтичесгагм действием. Для получения ДЕ11, содерлчщчго одновре-!йшю ТР и мочевину, Ц-пр-ПАК-Ш1а)-ТР обрабатывали БМ раствором иочовтш по непрерывной с хеш и сушили при Иг/о.

3, Присоодииокиа ц рриврому сополимеру й

полиакриловой кисдрты протеолтичЕских

ШШйШШШ^Л^МЙ ШШВШС'ЗШ!

Выли определены отииадьшю я ничьим рН да шдипшшяэшш ПР И КОЛ на Ц-пр-ПАК-ЩНа): 8,0 дт ПР я 8.8 ¿ля КОЛ. фкдаа-: ко, что прн иммобилизации ПР и КОЛ на Ц-пр-ШИКНа), как и: при иммобилизации ТР, вависимости КХОВ, СПИВ, КА и ОД ш-моби-лиаованшдс ферментов от продолжительной?!! реакции являются экстремальными. Это обусловлено изменением строения обргщувдэ-\ гося ГШ фврмент-прнвнтиэ цепи подианиока, соаровоаднадизд ■ выделением части макромолекул Форманта, при этом но,*.«1 воч-г растить числа иашш свпкий маму привитые «охчишюпси п тк-:;!' ротллкуюй 4арши*а Уоташзл&м, что кшыгика )!!№ и уч\:у\т П? и КОЛ ишь? рщ гара'лсерцих осойенаоетгй, строением фзрмша, канформаииой лриаотш и кони^^ридо-.' эй раствора Фермента При иммобилизации кол на *1 на«!.- Н • восительная холлагоиолитичеокая активность при «»<(••. щм додаотешадсти реакции с 0,6 до 2,0 час уионыт^:: с ' ш "Д0ч

гох (КХСБ уменьшалось от 1,0 до 1,3 мг/г ЦВМ). Относительная коллагенолитическая активность ПР при иммобилизации на Ц-пр-ПАК-Н при продолжительности реакции 30 шш (ЮСВ -О.бмг/г ЦВМ) составляла 12Х.

Установлено, что при увеличении продолжительности реакции стабильность иммобиливованной ПР И Еа процесса гидролиза казеина возрастают. При уменьшении :юнцептрацик растворов ПР и КОЛ стабильность иммобилизованных ферментов возрастает, а Еа гидролиза |{8зешш уменьшается, что связано с отличиями в строении образующихся ГОК ив-в в равной степени ассоциации макромолекул белка.

С использованием математического метода планирования эксперимента п расчета па ЭВЫ были получены математические модели процесса синтеза Ц-пр-ПЛК-Н-ПР к Ц-пр-ПАК-Н-КОЛ по непрерывной схеме (входные и выходные параметры такие же, как при иммобилизации 'ГР на Ц-пр-ПАЙ-Ю для ПР:

У1-0.40+0,054X1+0,041X2-0,019X3+0,038X1X2-0,021X1X3-0.039X2X3-2 2 -0,017X1 -0,052X2

У2-95,50+3,70X1+8,66X2+4,00X1X2+10,60X1X3-4,25X2X3-12,60X1 -

-10.30X^-7.13X3® й

УЗ-0,81 +0,22X1+0,10X3-0,10X1X2-0.08X1X3+0,13X2X3 +0,08X1

У4-29,06+4,90Х1+Б, 77X3-8.96X1X2-5,19X1X3+8.53X2X3+4,55X1+3,40X2

и для кой -

У1-0,903+0,030X1-0,084X2-0.060X3-0,105X1X2-0,108X1X3-0,107X1 -

-0,062Х2г+0,174ХЗ£ г

У2-56,18+6,15X1-5,25X2-10,50X1X2+4,37X1 +3,60X3 1(3-0,696-0,054X1+0,047X2-0,072X1X2-0,138X1X3-0,162X2X^0,085X2

+0,033X35 ' г

У4-23,66-5,39X1+3,87X2-1,47X3-2,46X1X3-5,46X2X3+3,83X1 -1,83X2 -2,05X33

На основе полученных математических моделей, адекватно описывающих процесс на 5% уровне значимости, были найдены оптимальные параметры получения Ц-пр-ПАК-Н-ПР и Ц-пр-ПАК-Н-КОЛ с заданной КА. Оптимизация осуществлялась по двум параметрам (СПИБ и ОА).

На основе материалов, содержащих иммобилизованные ПР и КОЛ. были получены ЦВМ, содержащие одновременно ХГЕГ или мочевину^-

Проведенные эксперименты показали, что Ц-пр-ПАК-ТР, Ц-пр-ПАК-ЛИЗ, Ц-пр-ПАК-ТР-ЛИЗ. Ц-пр-ПАК-ПР и Ц-пр-ПАК-КОЛ могут быть получены по одной обшей непрерывной технологической

схеме, иредуонатриваипей: кратковременную пропитку ЦБУ растьо-jxi'j фермента и отжим, ьыдеркку материала во влалмом состоянии в течение 0,25-3,0 час, промывку водой и сушку при 80°С. Для ярядаинл |$ерментсодериигаш материалам антимикробных или кера-толитичесКих свойств должна боть предусмотрена дополнительная обработка, включающая: кратковременную пропитку ЕШ раствором AUB или мочевины, отжим ц сушку при 00 С. в производственных условиях -это ноиет быть осуществлено на обычном оборудовании предприятий текстильной промышленности.

4. Исследование стерилизации получениях: биологически

активных волокнистых материалов Было установлено, что иммобилизации на Ц-пр-ПАК-И(Мл) резко повышает устойчивость к ¡f -облучение ТР.1ЮЛ и ПР. При доев 25 кГр иммобилизованные ферменты сохраняют 95-1СОХ ka в от-лнчиэ от катиЕких ферментов, КАо которых спишется на 20-30.?. Пзслв ¡f -стерилизации иммобилизованный ЛИЗ сохраняет 35Х ОБА, а иатнвныа ЛИЗ полиостьп кнактивируетса. Образование комплекса ТР-ЛИЭ приводит к значительной стабилизации иммобилизованного Л';з к стерилизации ¡¡"-облучением (сохраняется 30% ОБА). 85-1007, КА сохраняют после f-стерилизации ЦВМ, содержащие одновременно кзлюбилкзованный ТР и АШ, Изучение спектров ЭПР облученных ютквных и иммобилизованных ТР. КОЛ и ПР, a tmwb полтю-pos-Hoo5i?oí.eft показало, что для иммобилизованных протеодити-тоекшс ферментов наблхщается сигнал ЭПР только полимера-носителя. При одинаковой дозе облучения концентрация свободных радикалов а Фермеятсодертаде мотеркгиш иеньет, чем в подняв-рэх-носителях. Это позволяет сделать вывод, что увеличений стабильности ферментов к 5-обяучеяи» при иымобили&эцаи обусловлено эсгафэиюй передачей свободной валентности о макромолекул белка на полимер-носитель с поолодувдзй рекомбинацией м&чрорздикалов. Шсле двух лет хранения !»ри 4°О ¡1A подвергну-tero ¡-облучении Ц-пр-ПАК-Н(Ма)-ТР практически не ияизпилась, а после хранения при 20°С снижалась на б-lüx, натшшй ТР после гранения в указанных условиях сохранил соответственна 45 и 27% НА. При .крале н;ш облученного натязвога ТР н тэчзшм 1 года ко-.,'! личгстсо радикалов ешсэдгоя на SOX, i» паса* 24 шедав »psije-ивя ситная ЭПР т рогюгофуотсч, . пра . хр-шёвкм Ц-пр-ИАК-Н(Ма)-ТР в течение 12 кесяпзв сэ*ршмегвя 60-60%; •' ра-яккалэв. Рзглг-а'л в серости гибели радштлоз, иптдаюго цим.-.-' иобшзшоваякого "ТР объясняются тем, что из-за - отсутствии., кгроотранотвеннизс вйтрудяеаий щкрорадпкалы яатм?него • ТР едкомч-

бинируюг быстрее, чем макрораиикалы полимеров-носителей, при этом возникают дополнительные сотвкй Между макромолекулами иа-тивиого фермента или внутри Пик, которые оказывают влияние на остаточную активность фермента. В иммобилизованном ТР за счет миграции свободной валентности на полимер-йоситель дополнительные сшивки обраоовыйаться не могут (или образуйся в меньшей степени), вследствие чего ?НигоНиа активности трипсинсо-держаших материалов происходит медленнее (или совсем не наблюдается).

В. Исследование эффективности применения целлюлозных волокнистых Материалов с комбинированным биологическим действием йля лечения экспериментальных гнойных И одэговык рвя Медико-биологические исследования на швотных (крксай), проведенные совместно с. 1-м Московским медицинским иститутои И НИИ лазерной хирургии На моделях гнойной и ожоговых ран, пока-еали, что:

1) При использовании разработанных перевязочных материалов, содержащих иммобилизованные протеолитические ферменты, процесс очищения и еаживл&иия ран у крыс ускоряется в большей степени, чем при применении нативных ферментов.

2) При использовании иммобилизованных КОЛ Й ПР. обладающих наряду с казеинодитической и коллагенолитической активность»,

к достигается более высокий лечебный эффект, чем при применении материалов, содержащих иммобилизованный ТР или террилитии.

3) Введение в материалы, содержащие иммобилизованные ТР, КОЛ или ПР, дополнительно 17. ХГБГ или 30% мочевины существенно увеличивает эффективность их лечебного действия.

4) Материал, содержащий наряду с ТР бактериологический фэр-мент ЛИЗ, при лечении ожоговых ран является более эффективными, чем материал, содержащий только ТР. с

Таким образом, разработанные перевязочные материалы с комбинированным биологическим действием, получаемые по непрерывной технологической схеме, являются более эффективными, чем материалы, содержащие только протеолитические ферменты, и с успехом Могут быть использованы для лечения ран различной этиологии.

ВЫВОДЫ

1. С целью создания ЦВМ медицинского назначения установлены закономерности и разработаны методы получения материалов с комбинированным биологическим действием на основе Ц-пр-ПАК-Н и П-пр-ПАК-На.

Я. Установлено, что при осуществлении иммобилизации ТР. а такя» ШЛ и ЙР (протеаа, обладаквдщ коллагенолитической активностью) на Ц-пр-ПАН-Н(На) но непрерывной схеме экстремальная зависимость ЮЮБ от продолжительности реакции обусловлена перестройкой ПЭН белок-привитой к целлюлозе полианион, приводящей к выделению части макромолекул белка. Показано, что с увеличением продолиительности решении активность иммобилизованного фермента снижается, а стабильность воврастает, что могкт быть обусловлено, увеличением числа связей, образующихся между шфошлекулами белка и полимера-носителя. Установлено, что различие в конформациях привитых к целлюлозе цепей ПАК-Н и ПАК-На оказывает влияние на состав ПЗК протеолитический фер-изит-привитой к целлюлоае полишшон, кинетику перестройки ГОК й свойства иммобилизованного фермент

* 3. Показано, что зависящая от концентрации степень ассоциации макромолекул ТР в растворе оказывает существенное влияние на физико-химические свойства иммобилизованного фермента, что связано с различным строением образующихся ГОК.

4. Установлено, что в отличие от ТР макромолекулы бактери-олитического фермента ЖЗ мало ассоциированы в растворе, вследствие этого перестройка ГОК ЛИЗ-привитой к целлюлозе полианион ие сопровождается выделением макроыолмсул фермента. Шказано, что при совестной иммобилизации ТР и Л(13 вследствие образования комплекса ТР-ЛИЗ при увеличении продолжительности реакции происходит сниявние КЖБ и ОБА имшбкшювзшюго ЛИЗ.

5. Изучены ваканешрпоети получения материалов е коыбшш-ровшшым лечебным действием по методу, основанному на иммобн-яиаадш на полимере-носителе протеолитическогг фермента и шю~ гашлекулярного биологически активного вещества (АШЗ или мочевины). Установлено, что образование дополнительных ионных связей в ГОК ТР-привитой Л Цеддщозе полианион при обработке АМВ, содержащими несколько основных групп, приводит к увеличению стабильности иммобилизованного фермента.

6. Показано, что увеличение стабильности ТР, КОЛ и ИР к действии у-облучения при ишдобиишшщ обусловлено протеканием радиационно-юшчэских процессов о участием макромолекул 'ёаршнта и Пояолра-Еооителя, Усвьомвно» что при совместной втюбплизащт с ТР стабильность Ш к у -стерилизации резко возрастает, что обусловлено обрасованием комплекса ТР~ЛИЗ.'

7. Разработаны методы иммобилизации ТР, Шч и ШЛ на Я-пр-ПАК-П, которые шгут быть реализованы по непрерывной, техг-

нологической схеме на сущэствукэды оборудовании, о использоб&~ нием метода математического моделирования определены оптимальные параметра технологически режимов иммобилизации указанных ферментов.

G. Разработаны методы получения ЦВМ с комбинированным биологическим действием, основанные на введении а материал, содержащий иммобилизованные протеглитические ферменты, АШ? или мочевины, совместной иммобилизации TP и ЛИЗ.

9. Meдико-биологические испыгаши на лаборатории кивотных покапали целесообразность и эффективность применения разработанных ЦВМ с комбинированным биологическим действием лаг лечения экспериментальных гнойных и слоговых ран.

Основные подоязния диссертационной работы изложены ¡¿ следующих публикациях 1. Иванова it В., Скокова J1Q., Вирник А. Д. Излучение целлюлозного волокнистого материала медицинского назначения// Изв. ву-' eco: Технология текстильной промквленпости.-1989.-КЗ,-С. 69-71. £, Иванова 1,1 В., Лазарева ¡а К.. Скокова И. Ф., Вирник А. Д. Изучение закономерностей и оптимизация процесса присоединения трипсина к привитому сополимеру целлюлозы и полиакриловой i . кислоты // Иэв. вузов: Химия и химическая технология. - ШЮ. -к '' 10,- 0.84-86.

Иванова & В., • Вириик А. Д., Скокова И. Ф. Получение кодифицированного целлюлозного волокнистого материала, содержащего иммобилизованный трипсин. - Черкассы, 1088.- 10 е.- Деп. в ОНШ-

тэяим, w 691-хп-еэ.

4. Высоцкая Е. ÍL , Иванова М. В.,' Хомяков К. П., Вирник А. Д. Получение модифицированных целлюлозных волокнистых материалов, содержащих иммобилизованные ферменты. - Черкассы, 1989. - 15с. -ДОП. в ОШТЗХИМ, N 540-ХП-89.

Б. Иванова М. В., Скокова И. Ф., Довбий Е. Е , Вирник А. Д. Изучение свойств фермектсодерлащих целлюлозных материалов после стерилизации ^-облучением и длительного хранения.- Черкассы, 1991.- 15с.- Деп. в ОНИИТЭХИМ, N 183-ХП-91.

Подписано в печать Ü5.U5.92

Формат бумаги

Сдано в производство U5.Ü5.92 бумаги 60 х Ü4/I6 Бумага шок. Уол.поч.л. I,U ".л. 0,75

За кпз 33 U

Ротапринт МГТА, П741У, Москва, ул., Допекая., 26