Рентгеноструктурное исследование триптофаназы из Proteus vulgaris при разрешении 2.1 a тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

ргег од

- 4 ДПР 1994

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ ИИ. А. В. ШУБНИКОВА

На правах рукописи

ИСУПОВ Михаил Николаевич

УДК 548. 737

•РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРИПТОФАНАЗЫ ИЗ Proteus vulgaris ПРИ РАЗРЕШЕНИИ 2. 1 Ä.

Специальность 01.04.18 - Кристаллография,

физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва, 1994г.

w

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. , ,

щ'Пиридоксаль 5-фосфат (ПЛФ) зависимые ферменты катализируют в основном .реакции, метаболизма', аминокислот (реакции трансамйнирования, декарбоксилирования, рацемизации, p-элиминирования. Р~ замещения и. т. д.). В настоящее время интенсивно изучаются механизмы действия этих ферментов и пространственные структуры некоторых, из них. Исследована пространственная: структура нескольких трансаминаз, триптофан сиетазьи диапкш1глицил дсжарбоксилазы и. тирозин фенол-лиазй.

Триптофаназа Один из наиболее исследованных; ПЛФ зависимых ферментов. Он обратимо катализирует реакцию гидролиза триптофана на индол, , пируват и аммиак в некоторых бактериях. ,

Цель работы состоит в установлении пространственной структуры триптофаназы методом рентгеноструктурного анализа. '

Научная новизна работы. Впервые определена пространственная структура триптофаназы - холофермента из бактерии Proteus vulgaris с разрешением 2.1 А, Показана Эффективность циклического усреднения электронно^ плотности для улучшения фаз. Проведен анализ Вторичной, третичной и четверичной структур молекулы триптофаназы и- сравнение с другими известными структурами ПЛФ-зависимых ферментов.

Пращиче.дкая ценность' работы заключается в том, что построенная модель фермента является основой, для изучения структур сто комплексов с-аналогами субстратов, иш^бирующими различные стадии реакции, а также комплексов ^ неактивных мутантов фермента с истинными субстратами для выяснения его механизма действия. - , 1 ;

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международной конференции "Современная энзимология; Проблемы и Направления" (Санкт-Петербург, .1992), представлены на 9-ом международном симпозиуме по витамин Вб и карбонильному катализу (Капри,1994).

: Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата. . '

, Объем работы. „ Дисс-сртапия состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Qua изложена на 106 страницах, содержит 30 рисунков и ,12 таблиц. ■ : (

'V'^j

1 белка 25 щУмл.в присугствии 0.25 ,мМ ЩТФ. Их максимальный разм<;р;достигал 0.40 х'0.30 х! 0.30 мм. Крис таллы тринтофапазы P. vulgaris были гюлучецыпри.рН . J А и концентрации белки 25 мг/мл в 25-28 г/< ПЭГс 4000 в 0.L M калий-фосфа^ном буфере в Присутствии 0.25 мМ :ПЛ% 0Л M KCl илй 0,1 M CsCI. Размер кристаллов достигал 0.6 х 0.4 х 0.4 мм. В таблице 1 приведены-кристалличеекис г}х>рмы трннтофаназы. - "

Таблица 1. Кристаллические формы триптофана»»!.

Бактерия, форма фермента, тип иона в растворе Пространственная группа Параметры элементарной ячейки, Предел дйффракции, Â

Exoli, холо Р43212 а=Ь= 113.8,. ¿=231,7 - 2.7 2 субъединицу в независимой части

P. vulgaris, холо, цезий, 'калий P2l2i2i as П 5.0; b=l 18.2, c= 15.1.7 1.7 ' 4 субьед. в н.ч

P. vulgaris, холо, калий P2i2)2i * a=l 13,6, b= И4.6. ci 151.4 - ' ■■ 2.1 4 суб1>ед. вл.ч

P. vulgaris, холо, калий, В2 ' ' a= 128.4, b= 118.3. c=146.4.y=l 19.5° .. 3.4 . 4 субъсд. в п.ч

• P.vulgaris,. ок^индолил-Ьталапин ■Р21212 a= 152,5, b=212.2. c=63.2 ■■ 2.8 4 субьед. в н.ч

P. vulgaris, цезий, оксиндолил-Ь-аланин Р21 a=133.0. H= 128.7,'. 0=112.2,7=114.4° , 1.9, ' ' ' 8 субьед. в пл.

Диффракционные данные для наганных Кристалллрв тринТофаназы E.coli с разрешением 15-3.4 Â были- собраны, методом вращения на image-plate Marreseàrch на пучке еинхротронного излучения накопителя DORIS и обработаны А.А.Антсоном ç использованием, программы MOSFLM [8]. Набор интегральных интенсивиоетей с разрешением 15-2.7 А был собран методом .вращения с более совершитых кристаллов этого фермента на image-plate Raxis на пучке еинхротронного излучения в ДарсбсрИ (Великобритания) и обработан с использованием программ^ MOSFLM. Нат^вцые диффракниоппыс. данные с разрешением 30-2.5 Â с орторомбическйх* кристаллов хо^отрйшофапазы

Ориентация и положение молекулы тирозин фенол-лиазы в ячейке .триптофаназы были найдены с помощьюпрограмм молекулярного замещения комплекса БЛАНК А.А. Вагана [9] и потверждены с использование^ комплекса программ Дж. Навазы АМоЛе [10.]. Для одной 'субъединицы решение задачи молекулярного замещения найдено не бьио. Оно было найдено для димера, который формирует активные центры в молекуле тирозин фенол-лиазы. Решение было найдено при работе в диапазоне разрешений 10-4 А с радиусом интегрирования 30 А. Правильным энантиоморфом является пространственная 1руппа Р4з2]2, а в независимой части элементарной ячейки находятся две субьединицы фермента. Модель была уточнена до Я-фактора 34%. После решения структуры триптофаназы Я.уи/^аш ее уточненная модель была использована для решения структуры триптофаназы Е.соИ, модель которой в настоящее время уточнена до И-фактора 25% при разрешений 10-2.7, А. Уточнение триптофаназы £ сой продолжается.. . - ~ " '

----> X ' ■•.'..'■.

< ; '" Scale » 1.0000mm/A Section 139

Рис. 1. Сечение карты значения функции трансляции.

"воды было добавлено" к модели при переходе на уточнение с более высоким, разрешением. На этом, этапе циклически >усреднялись синтезы электронной, плотности ПЪкрс. Крисгшшографический Я-фактОр модели, рассчитанный по 113455 рефлексам в диапазоне 8-2.1 А, которые<были использованы в уточнении, ' составляет 15.6%. 2% отражений не использовались в уточнении. По ним . рассчитывался свободный ¿-фактор, который, по мнению Брюнгера, [19], является критерием качества уточняемой, модепи.Свободиый Ё-фактор модели, расчитанный по 2315 рефлексам, составляет 22.6 Ус. Модель содержит аминокислотные остатки 2-466, т.е. все кроме одного К-конц^вого и одного С-концевого остатка. Модель включает 14712; атомов белка, 4 молекулы; пиридоКсаль 5'-фосфата, 4 иона калия и 1746 молекул воды. Средний температурный фактор атомов модели равен 27 А?. Статистические данные модели ' триптофаназы и весовая схема стереохимичсских ограничений ; на последнемэтапе уточнения представлены в таблице 3

. . ; • Таблица 3. ' , , '

Показатели уточнения модели холотриптофаназы из Р.уи1кат.

Характеристика Стандартное" отклонение с

Валентные связи, А . ' ; ' ', ■ • •

^Расстояния 1-2 0.016 0.020

Расстояния 1-3 • 0.034 0.030

Расстояния 1-4 0.049 - „ - 1 0.050

. Плоские группы, А . 0.015 .0.020

. Хиральнйе объемы, А^ : 0Д43 0.300

Невалентные контакты, А

Близкие 0.213 0.300

Дальние 0.255 0.300

Двугранные углы, град.

Пептидные 2.85 ' 5.00

Алифатические 16.89 2О.О0

Ароматические . 26.24 30.00

Тепловые факторы, А^ *

1-2 главной цепи'., 3.7- 4.0 ' /

1-3 главной цепи 5.1 • ;" • 6.0

1-2 боковой цепи 7.3 - ,''8.0

1-3 боковой цепи 9.9 10.0

\ .

Решение задачи молекулярного замещения для орторомбичеекой формы \ кристаллов комплекса триптофаназы Р. уи^а^ ■ с оксиндолил-Ь-аланином бьшо Чащ(ею) с Использованием дифракционных данных с разрешением 7 А собранных Ю.В. Некрасовым на диффрактометре "Зутех Р2.Г. Показано, что в независимой ' части элементарной ячейки находится тетрамер. Для моноклинных кристаллов комплекса триптофаназы с оксийдолил-Ь-аланином по. 2.7 А набору, собранному аГ. Аругюняном и И.С. Дементьевой на синхротроне в Гамбурге также найдено ' решение задачи,молекулярного замещения и показано что в. независимой части : находятся два тетрамера, связанных псевдотрансляцией 1/2 параметра ячейка ■ 180-

-180! , I--г——г—-г-

-180 -135 -90 -45 6 ф 45 Рис. 3. Карта Рамачандрана для модели „триптофаназы. Глициновые i / показаны треугольниками.

59. Фупкионально наиболее важная область контактов формируется субьединицами, связанными молекулярной осью q. Они-стабилизируют структуру активных центров фермента, в формировании .которых участвуют аминокислотные остатки большого и малого доменов одной субъединицы и большого домена субъединицы, связанной с первой осью я- Существенный вклад в стабилизацию димера вносят молекулы кофермента и моновалентные катионы, расположенные между субьединицами.: " Таким образом, каталитически активной субъединицей триптофаназы является , димер, формируемый субъединицами, связанными молекулярной осью, 4. ! ,. , .

Рис. 5. Ленточная модель одной субъединицы триптофаназы, Субъединица триптофаназы (Рис. 5) имеет двухдоме^шое строение. Большой домен является ПЛФ связывающим, Малый - каталитическим. Основой структуры большого домена является ß-лист, образованный из 7 ß-цепей. Он окружен с обеих сторон á-спйралями. Ядро малого домена состоит из 4-цепочечного ß-листа, прикрытого с внешней сторны а-спираЛями. Таким образом, структура доменов Может быть отнесена к Классу a/ß (Таблица 4).

На Рис. 6. дано стереоизображение активною центра фермента. Молекула кофермента образует основание Шиффа с Lys 266. Фосфатная ручка расположена у N-конца спирали а4 (100-118) и образует водородные связи с азотами основной цепи Gly 100 и Arg 101, боковыми группами остатков Gin 99,Arg 101, Ser 263. / Через молекулы воды водородные связи с фосфатом имеют Ser 52, Lys 265, из соседней субъединицы Туг' 72 и Туг 301. .Водород^ связь с азотом N1 пиридоксаля имеет Asp 223, а с ОЗ придажеаля Arg 226. В стабилизацию кольца ¡шридоксаля вносит вклад "slacking" взаимодействие с Ph¿ 132.

Рис.6. Место связывания кофактора ПЛП. Приведена разностная* "отН"-карта со

срезкой 5 ст.

На рис. 7., показано окружение одного из ионов калия в молекуле

триптофаназы. Он находится между субьединицами формирующими активный димер. Места связывания моновалентных катионов недавно бьши найдены в диалкилглицил декарбоксилазе [23] и тирозин. фенол-лиазе (А.А.Антсон; частное сообщение). - .

Глава 5. Сравнение Модели триптофаназы с пространственными структурами других ниридоксаль 5-фосфат зависимых ферментов.

Для модели триптофаназы бьш проведен поиск' структур с похожей организацией ^элементов вторичной структуры по банку трехмерных ..Структур,'- " доступных в настоящсе вреш. Близкие структурные мотивы бьйш найдены лишь , "у двух других ПЛФ ферментов - тирозин фенол-лйазы и аеиартат амш(о-; г трансфера!Ы.; Близкой структурой) обладает и дишжилглишш декарбоксилича, .... коордшфты которой в байке белковых структур отсугст^кяг. >

Наблюдаемые небольшие различия в строении активных центров этих ферменюв могут , быть обусловлены-различиями в строении субстратов - триптофана и тирозина, Не исключено, однако, что они вызваны тем, что сравниваются апо (тирозин фенол-лиаза) и ,холо (триптофаназа) ферменты. ;

Рис. 8. Сравнйгие активных центров триптофаназы и аспартат аминотрансферазы. . Триптофаназа выделена жирной линией. ч Наложение активных ..центров ииридоксалсвой формы мйтОхйщришшной (зормы аспартат амиНо трапсфсразы иЬ сердца кур'И тришофйиазь! приведет) па; 'ис.8. Аминокислотные последовательности этих ПЛФ. ферментов далеки ^а

■' '",

■■>.•: I 'е:

г

2. Dementieva, IS., Zakomirdina, L.K, Sinitzinä, N.I., Antson, A.A., Wilson, K S , Isupov, M.N.j Lebedev, A.A and Harutyunyan, E.H. (1994) Crystallization and preliminary X-ray investigation of holotryptopharises Дот -Escherichia coli and Proteus

~ vulgaris. J.Moi.Biol235,783-786, : , ■ Г - ^ . :,

3. L.N. Zakomirdina, I.S. Dementieva, M.N. Isupov, A.A. Antson and EH, •>. Harutyunyan. (1994) Crystalization of tryptophan indoje^lyase from Proteus vulgaris., Abstracts of the 9-th International Symposium on Vitamin B6 arid Carbonil Catalysis, .

v Kapri. -V ' ■ '■ _ ' ■ • ,'vl'.: ' 4

4. I.S. Dementieva, L.ii., Z^somirdiria; A.A. Antsort, G.G. Dodson; M.'fr.' Isupov and E.H. Harutyimyan. (1994) Tryptbphanase from Proteus vulgaris'- three- 1 . -dimensional structure of the active site. Abstracts Of- the 9-th International Symposium.

on Vitamin B6 and Carbonil Catalysis, Kapri. . ■

'5. M.N. Isupov, A.A. Antsbri, G,G. Dodson, I.S: Dementieva, L.NV _ r "Zakomirdina and Ё.Н. Harutyunyari. (1994) Crystal structure of t17ptophana.se from .'..'".'..,' Proteus vulgaris at 2.5 A retolution. Abstracts of the 9-ih International Symposiuni on Vitamin B6 and Carbonil Catalysis, Kapri. '

6. M. N. Isupov, A. A. Antson,4 E. J. Dodson, G. G! Dodson, G. N. Murshudov, I. S, Dementieva, L. N. Zakomirdina, K. S. Wilson, Z. Dauter and E; H. Harutyunyan. ' (1994) Crystal structure of tryptophanase. J.Mol.Biol (in press).

Цитированная литература; ' Л . , , '

1. Snell, E.E. (1975). Tryptophanase: structure, catalytic activities, and mechanism of aptioa Аф.Етуто1., 42,287-333. . ,

. 2. Deeley, M.C. & Yanofsky, C. (1981) Nucleotide sequence pf structural,gene for tryptophanase of Escherichia coli К-12. J.Bacterial. 147, 787-796.

3. Kamath, A.V. & Yanofsky, C. (1992). Characterization of the tiyptophanase " operon of Proteus vulgaris. Cloning, nucleotide sequence, aminoacid homology, and in Л ' vitro synthesis of the leader peptide arid regulatory analvsis. J.ß/o/.fAfw, 267, 1997819985. , ' .. ■

4. Hirahara Т., Suzuki S., Hoririouchi S. & Beppu T. (1992). Cloning, nucleotide sequences and overexpression in Esherichia coli of tandem copies of a tryptophanase gene , in an obligately symbiotic thermophile, Symbiobacteriiim thermophilum Appl Envir. Microbiol, 58,2633-2642. 1 ' . * ■ ,

5. Antson, AA;, Demidkina, T V,, Gollnicki P., Dauter, Z , Von Tersch, R.L., Long, I., Berezhnoy, S.N., Phillips,, R.S., Harutyunyan, E.H. & Wilson, K.S. (1993), Three-dimentional structure of tyrosine phenol-lyase. Biochemistry, 32, 4195-4206.

6. Kawata, Y., Tani, S„ Sato, M., Katsube, Y. & Tokushige, M. (1991). *' Preliminary! X-ray crystallographic analysis Of tryptophanase from Escherichia coli. . EKBS .

Letters, 284,270-272,- • ■ ; ,

7. Закомырдина, Л.Н., Сахарова. v И.С и Торчинский K£M. (1988) Иссдедованис взаимодействия триптофангпы с аналогами субстра1а: Мол. :. - ;.f"fi биология., 22,187-194.' — . • ■ - '""'V-:;