Рентгеноструктурное исследование эндонуклеазы из Serratia marcescens при разрешении 1.1 А тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

На правах рукописи УДК 548.73

<" Г о он

ЛУНИН н

5 п 1"' •! " Т"! 1 Владимир Владимирович ь :

РЕНТГЕНТОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ИЗ Serratia marcescens ПРИ РАЗРЕШЕНИИ 1.1 А.

01.04.18 - кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2000 г.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии км. А.В.Шубншсова РАН

Научные руков одители: кандидат физико-математических наук

К.М.Поляков

доцент, кандидат физико-математических, наук, А М Михайлов

Prof., Dr Ch. Betzel

Официальные оппонента:

Профессор, доктор химических наук, Б.В.Мчедтишвили (Институт кристаллографии РАН)

Кандидат физико-математических наук С.В.Никонов (Институт белка РАН)

Ведущая организация.

Инстит>т Молекулярной Биологии РАН

Защита диссертации состоится "«?/ " июня 2000 г. в "//I -" на заседании Диссертационного совета Д002.58.01 в Институте кристаллографии им. А.В.Шубншсова РАН по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии РАН.

Автореферат разослан "/? " мая 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат физико-математических наук В М.Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Эндонуклеаза Serratia marcescens, Sm (КФ 3.1 4.9) принадлежит к классу нуклеодеполимераз - ферментов, осуществляющих разложение нуклеиновых кислот. Данный фермент катализирует расщепление З'О-Р связей в одно- и двуцепочечных дезоксирибонуклеиновых кислотах (ДНК), рибонуклеиновых кислотах (РНК), гибридных ДНК-РНК молекулах, не проявляя при этом видимого предпочтения ни к химической природе углеводного компонента субстрата ни к типу нуклеинового основания.

В настоящее время относительно хорошо изучены ферменты, избирательно расщепляющие ДНК (ДНКазы) и РНК (РНКазы) по конкретным нуклеотидным последовательностям. Но до сих пор единственным представителем семейства гомологичных неспецифичных нуклеаз, для которого известна пространственная структура, является нужлеаза Sm

Пространственная структура нуклеазы Sm была решена методом полиизоморфного замещения в 1994 г и уточнена до разрешения 2.1 А [1]. При этом в модели отсутствовала часть аминокислотных остатков, модель не содержала никаких дополнительных ионов и молекул и не позволяла установить механизм действия фермента. Поэтому актуальной задачей было уточнение структуры нуклеазы Sm при атомном разрешении в присутствии металл кофактора.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в расшифровке, определении и уточнении вторичной и третичной структуры нативного фермента при разрешении 1.7 А, утешении пространственной структуры нуклеазы Sm, содержащей ион магния, при атомном разрешении 1.1 А и определении механизма ферментативной активности нуклеазы Sm на основе структурных данных высокого разрешения.

НАУЧНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые с атомным разрешением определена пространственная структура неспецифичной эндонуклеазы из Serratia marcescens и ее активного центра, содержащего ион металла кофактора. Точные структурные сведения о расположении

аминокислотных остатков в активном центре, полученные в данной работе, представляют надежную структурную базу для построения стереохимического механизма реакции расщепления фосфодиэфирной связи в нуклеиновых кислотах данным ферментом. Полученные данные существенно расширяют и уточняют существующие представления о механизме ферментативной активности фермента, основанные на исследованиях биохимическими методами

В настоящее время известны более 3000 белковых структур, и только 40 из них определены с атомным разрешением.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ Полученные в данной работе результаты представляют собой детальную структурную информацию дня понимания механизма активности фермента и проведения белково-инженерных работ с целью дальнейшего изучения этого фермента, обладающего противоопухолевыми и противовирусными свойствами.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано б работ. Список публикаций приведен в конце автореферата

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Работа состоит из введения, пята глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Она изложена на 109 страницах, содержит 42 рисунка и 12 таблиц.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучения, нейтронов и' электронов (Дубна, май 1997), Европейском Кристаллографическом конгрессе (Прага, Чехия, август 1998), Молодежном конкурсе научных работ в ИКР АН (декабрь 1998) (призовое место).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ Расшифровка, уточнение и интерпретация моделей фермента, их анализ и построение механизма функционирования фермента проведены лично автором.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи и сформулирована цель работы

Глава I. Литературный обзор.

Глава содержит обзор литературных данных о классификации нуклеодеполимераз, биохимических свойствах нуклеазы &л, семействе неспецифичных нуклеаз, гомологичных нуклеазе изучении роли различных аминокислотных остатков нуклеазы на основании данных по кинетике реакций на мутангаых формах нуклеазы также рассмотрены литературные данные о свойствах ионов магния как металл кофактора. Кроме того, литературный обзор содержит данные о работах по исследованию пространственной структуры нуклеазы Бт и высокоспецифичной нуклеазы \-Ppol из РИузапт ро1усер1па1ит Также глава I содержит раздел о методах уточнения атомных структур, в котором большая часть посвящена новому направлению -уточнению атомных структур путем максимизации статистического правдоподобия.

Эндонуклеаза принадлежит к семейству гомологичных

неспецифичных нуклеаз, выделенных из самых различных организмов - от цианобактерий до человека Этот фермент расщепляет внутренние З'О-Р связи в одно- и двуцепочечных ДНК, РНК и гибридных молекулах без видимого предпочтения к химической природе углеводного компонента субстрата и к нуклеотидной последовательности Нуклеаза 5т является магний-зависимым ферментом и проявляет максимальную активности в присутствии 5-10 мМ ионов магния

Нуклеаза Зт является гомодимером, состоящим из двух идентичных субъединиц по 245 аминокислотных остактов весом 26700 Да каждая

В исследованиях по влиянию точечных замен аминокислотных остатков на активность фермента были выявлены наиболее важные для катализа остатки' А^-57, Ш!-89, Аяа-119, 01и-127 [2].

Пространственная структура нуклеазы Sm бьша решена методом полиизоморфных замещений на разрешении 2 1 А [1]. При этом в модели отсутствовал ряд аминокислотных остатков и не содержалось никаких ионов или молекул, кроме атомов белка и связанной воды. Данная модель бьша непригодна для анализа и описания механизма действия фермента

Глава IL Кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное исследование эндонуклеазы Sm.

Работы по очистке и кристаллизации эндонуклеазы Sm проводились в Институте кристаллографии РАН сотрудником лаборатории структуры биокристаллов Е.В.Благовой. Бьша разработана многостадийная методика очистки и были найдены оптимальные условия кристаллизации нуклеазы Sm.

Наибольшие по размеру и лучшие по качеству кристаллы получались при использовании метода висячей капли при 4°С. Кристаллизационный раствор содержал 10 мг/мл белка, 0.6 М сульфата аммония в 10 мМ TRIS-HC1 буфере с pH 8.3 в присутствии 5 мМ MgS04 Противораствор содержал 1.2 М сульфат аммония в том же буфере

В дальнейшей работе использовали кристаллы в виде прямоугольных призм размером 0.7x0.3x0 2 мм, которые принадлежали к пространственной группе P2i2i2 и имели параметры элементарной ячейки 106.7x74.5x69.0 А.

Глава Ш. Уточнение структуры нуклеазы Sm.

Уточнение структуры нуклеазы на разрешении 1.7 Ä. Набор интенсивностей рентгеновских отражений от кристаллов белка в нативном состоянии до разрешения 1.7 А собран на синхротронном излучении (длина волны 0.98 А) станции XI1 на накопительном кольце DORIS (EMBL, с/о DESY, Гамбург, Германия) с использованием детектора "Imaging Plate", разработанного Д. Хендриксом и А. Лентфером. Интегрирование было проведено программой DENZO

Рентгенографические характеристики кристаллов нуклеазы Sm и набора экспериментальных дифракционных данных приведены в табл. 1.

В качестве стартовой модели для уточнения бьша взята депонированная в Protein Data Bank модель молекулы, уточненная ранее [1] при разрешении 2.1 А

до R-фактора 16.8%. Поскольку молекулы воды, как правило, являются менее надежно определяемой частью структуры, и параметры элементарных ячеек использовавшихся нами (см. табл. 1) и группой Краузе (106.7 х 74.5 х 68.9 А) кристаллов несколько отличались, что отчасти смогло свидетельствовать и о наличии разшшы в структуре водного окружения молекул, то все молекулы воды были исключены из стартовой модели и реконструированы на более поздних стадиях исследования независимо. Начальный кристаллографический R-фактор, рассчитанный по имеющимся экспериментальным данным (55952 отражений с F/a > 2 в зоне от 6 до 1.7 А) для стартовой модели составил 36.0%.

В ходе уточнения для обеспечения более надежного контроля из экспериментальных данных в самом начале работы были отобраны случайным образом 10% отражений, которые образовали контрольный набор, использующийся далее для расчета свободного R-фактора. Следует подчеркнуть, что далее на всем протяжении работы этот набор не изменялся. Экспериментальные значения модулей структурных факторов из этого набора не использовали ни для уточнения атомной модели, ни для построения синтезов Фурье, по которым далее производилась ручная правка модели либо добавление молекул воды. С целью понижения уровня шума на синтезах Фурье, вызванного исключением из расчета синтеза отражений контрольного набора, для таких отражений в расчете синтезов использовали рассчитанные по модели модули структурных факторов. Снижение уровня шума, вызванного ошибкам! в используемых фазах структурных факторов, достигали введением в расчет синтезов весовых множителей, определенных на базе максимизации маргинальной функции правдоподобия, вычисляемой по контрольному набор)' отражений [3].

На первом этапе уточнение проводили на IBM PC 486 с помощью программы FROG, позволяющей легко осуществлять произвольную разбивку модели на блоки, рассматриваемые как жесткие тела. Уточнение проводили с постепенным расширением набора используемых отражений и постепенным увеличением числа степеней свободы модели.

Таблица 1

Параметры кристаллов эндонуклеазы Ли и статистические характеристики набора дифракционных данных, полученных с использованием синхротронного излучения до разрешения 1. 7 А

Пространственная груша Р2,212

Параметры элементарной ячейки, А

а 106.7

Ъ 74.8

с 69.0

Число молекул в независимой части ячейки 2

Разрешение, А 30.3-1.71

Число независимых рефлексов (1>а) 57095

Полнота, % 94.6

Таблица 2

Статистические параметры уточненной на 1.7 А структуры нукпеазы Бт

Разрешение, А 6.0-1.7

Число рабочих рефлексов (использованных при уточнении) 50268

Число контрольных рефлексов 5679

Число остатков в модели - 2x239

Число неводородных атомов в модели 3678

Число молекул воды, включенных в модель 443

Число сульфат-ионов 2

Стандартный Я-фактор 17.3

Яйсе-ф актор 22.2

Среднеквадратичные/максимальные отклонения от стандартных

значений для:

длин связей, А 0.011/0.069

Ьалентных углов, ° 1.8/10.9

планарных групп от плоскости, А 0.017/0 078

хиральных объемов, А3 0.087/0.327

Средние/максимальные значения В-факторов (остатки 7-243):

атомы основной цепи, А2 12.9/31.4

атомы боковых групп, А2 16.0/50.5

молекулы воды, А2 35.1/62.9

сульфат-ионы, А2 42.7/45.8

Среднее значение В-факгора для остатков 5-6 и 244-245:

атоьш основной цепи, А2 39.1

атомы боковых групп, А2 43.8

Статистика распределения углов ф и у на карте Рамачандрана, %

в разрешенных областях 91.2

в дополнительных областях 7.8

Точность определения атомных коордшат (по Лузатш) 0.157

Дальнейшее уточнение модели проводили с помощью программного комплекса X-PLOR. При этом этапы автоматического уточнения чередовали с анализом и интерактивной правкой модели на графических станциях при помощи программ FRODO и О. На последних этапах уточнения в модель были включены по описанной выше методике дополнительные молекулы воды так, что их общее число составило 439, при этом индивидуальные значения их уточненных В-факгоров не превышали 63 А2. Также в области остатка Arg-57 в каждой субъединице был определен сульфат-ион (заселенность 0.5). Результирующие значения факторов достоверности по зоне разрешения 6.0-1.7 А составили: R=17.3% и R_i.t(,=22.2%. Средние величины отклонений длин связей и валентных углов в уточненной модели от стандартных значений составили 0.011 А и 1.8°, и максимальные не превышали 0.07 Л и 110 соответственно.

Проверка качества модели при помощи программы PROCHECK показала, что по всем контролируемым параметрам модель находится либо внутри интервала обычно встречающихся значений для структур при таком разрешении, либо превосходит их по качеству. Характеристики уточненной структуры отражены в табл. 2.

Уточнение структуры нуклеазы на разрешении 1.1 А. Для уточнения на разрешении 1.1 А использовались те же кристаллы, что и для проведенного ранее уточнения на разрешении 1.7 А. Набор интенсивностей рентгеновских отражений был собран с использованием MAR-image plate детектора на пучке BW7B синхротрона DORIS/DES Y в Гамбурге (длина волны 0.847 А). Кристаллы были заморожены в токе азота, температура 100 К. Криопротектор готовился из кристаллизационного противораствора с добавлением глицерина и сульфата магния. Криопротектор содержал глицерин (25% об.), 1.2 мМ сульфат аммония и 20 мМ MgS04 в 10 мМ TRIS-HC1 буфере с pH 8.3. Набор был обработан программой DENZO.

Рентгенографические характеристики кристаллов нуклеазы Sm и набора экспериментальных дифракционных данных приведены в табл. 3.

Уточнение структуры проводилось с использованием всех данных в зоне разрешения 19.92 - 1.1 А. 5% рефлексов были отобраны в контрольный набор.

Параметры элементарной ячейки претерпели некоторые изменеши вследствие использования ¡шзкотемпературной съемки (106.39x73.69x68.12 А против 106.7x74.8x69.0 А при кшшютной теьтературе), что не помешало использовать модель 1.7 А в качестве стартовой при уточнении на 1.1 А. Все молекулы воды были удалены и введены вручную заново в ходе уточнения. Для уточнения была использована программа ЯЕРМАС 4.0.2, позволяющая работать в анизотропном приближешш и использующая уточнение из принципа максимального правдоподобия. Этапы уточнения чередовались с визуальным анализом

(а)

/

м§

(б)

Рис. 1. Группа пиков электронной плотности на 21^-1^ синтезе Фурье (уровень 2а) в районе боковой цепи остатка Азп-119 (а), идентифицированная как магний-еодныи кластер (б).

Таблица 3

Параметры кристаллов эндонуклеазы Sm и статистические характеристики набора дифракционных данных, полученных с использованием синхротронного излучения до разрешения 1.1А_

Пространственная группа Р2,2,2

Параметры элементарной ячейки, А

а 106.39

Ъ 73.69

с 68.12

Число молекул в независимой части ячейки 2

Разрешение, А 19.92 - 1-.1

Число независимых рефлексов 198103

Полнота, % 91.5

Таблица 4

Статистические параметры уточненной па 1.1 А структуры нуклеазы Sm

Разрешение, А 19.92-1.1

Число рабочих рефлексов (использованных при уточнении) 188128

Число контрольных рефлексов 9975

Число остатков в модели 2x241

Число неводородных атомов в модели 3924

Число остатков с двойными положениями боковых групп 51

Число молекул воды, включенных в модель 715

Число молекул воды с двойными положениями 131

Число ионов /сульфат-ионов /молекул глицерина 2/4/4

Стандартный Я-фактор 12.9

Р&=е-фактор 15.6

Среднеквадратичные/максимальные отклонения от стандартных

значений для:

длин связей, А 0.013/0.05

валентных углов, ° 1.4/8.9

планарных групп от плоскости. А 0.010/0.027

хирачьных объемов, А3 0.113/0.285

Средние/максимальные значения В-факторов

атомы белка (ост. 7-243), А2 10.69/31.84

молекулы воды, А' 19.46/53.77

сульфат-ионы, А2 17.7/24 15

молекулы глицерина, А2 21.1/25.6

Значения В-факторов для ионов М§2" в молекуле А (В), А2 7.11 (4.64)

Среднее значение В-фактора для остатков 4-5 и 244-245: 28.14

Статистика распределения \глов и на карте Рамачандрана, %

в разрешенных областях 91.2

в дополнительных областях 7.8

Точность определения атомных координат (по Л\'затти) 0.081

синтезов Фурье и ручной правкой модели с использованием программы FRODO. На первых же этапах уточнения при анализе распределения электронной плотности в области активного центра была выявлена группа пиков, обладающая октаэдрической симметрией, с расстошшями до центрального пика порядка 2 А (рис. 1). Центральный пик был идентифицирован как атом магния, коордтшрующий боковую цепь остатка Asn-119 и пять молекул воды.

Структура была уточнена до R-фактора 12.9% (R/,ft=15.6%). Стереохимические параметры модели приведены в табл. 4. Для 51 аминокислотного остатка (25 в субъединице А и 26 в субъединице В) были определены вторые положения боковых цепей. В том числе, две конформации боковой цепи имеет каталитически важный остаток активного цешра Arg-57. Конечная модель содержит 715 молекул воды (131 с двойными положениями), для всех молекул воды температурный фактор не больше 54 А2. Модель содержит 2 иона магния с полной заселенностью (по 1 в активном центре каждой субьедишщы).

Также модель содержит 4 сульфат-иона (заселенность 0.6, 0.6, 0.3, 0.3), два из которых находятся в активных центрах субъединиц А и В, и 4 молекулы глицерина (заселенность 1, 0.7, 0.7 и 0.5), который был использован в качестве криопротектора.

Глава IV. Анализ структуры нуклеазы Sin.

Сравнение моделей, уточненных на разрешении 1.7 А и 1.1 А показало среднеквадратичное отклонение (R.M.S.) коордштат атомов основной цепи 0.213 А (рис. 2).

Согласно карте Рамачандрана, рассчитанной для финальной модели нуклеазы Sm (1.1 А) по программе PROCHECK, значения торсионных \тлов ф и у для аминокислотных остатков основной цепи белка попадают в область разрешенных значений и все неглициновые остатки, за исключешем Ala-10 и Asn-117, находятся в наиболее выгодных либо допустимых конформациях. Остатки А1а-10 и Asn-117 находятся при этом в конформации у-поворота, которые в последнее время также рассматривается как допустимая

1,2 -I 1 -

< 0,8 -

"S 0,G -£

l: 0,4 -

A В

0,2

0 -6

111111111111111 м 111111111111111 м м м 111111111

56

106

156

206

номера остатков

Рис. 2. R.M.S. отклонения положений Са атомов структур, уточненных нй 1.7 Ли 1.1 А для А (черным) и В (серым) субъединиц.

конформация [4]. При этом следует отметить, что остаток А1а-10 находится в короткой петле Cys-9-Ala-10-Val-l 1-Gly-12-Cys-13, стабилизированной S-S мостиком между остатками дастеина и водородными связям! Cys-9 О - Val-11 N, Val-11 О - Gly-221 N и Gly-12 О - Ala-220 N, а остатки аспарагина, согласно статистическое анализу [5], проявляют тенденцию более часто попадать в правую часть карты Рамачандрана, нежели другие типы аминокислотных остатков. Карта Рамачандрана для структуры,, уточненной на 1.7 А аналогична рассмотренной.

На рис. За представлена схема вторичной структуры исходной модели нуклеазы Sm. Проведенный нами анализ показал, что фермент обладает более богатой вторичной структурой, (рис. 36). Основанием для выделения элементов вторичной структуры послужили помимо визуального изучения хода полипептидной цепи анализ значений дв>транных утлов <р и у и подробное .рассмотрение системы возможных водородгых связей в выделяемых нами элементах вторичной структуры.

На рис. 4 приведено сравнение структур активных центров моделей нуклеазы Smy уточненных при 1.7 и 1.1 А. Как видно, наличие магний-водного кластера в структуре 1.1 А вызывает некоторые отличия от структуры 1.7 А, а

О п 140 V)

.N2 .43 84 ¡>5

3.1 150 ш

N.112 \

^42)7 / /

БГ 1 Г

1 с. //1)1

(а)

142 ЛЛ

82 БС 57

и 16У

(б)

Рис. 3. Схема расположения элементов вторичной структуры в стартовой (а) и уточненной (б) моделях. Показаны спиральные и [¡-складчатые участки.

Ый-127

Рис. 4. Сравнение активных 11ентров моделей, уточненных на 1.7 А (черный) и 1.1 А (серый).

именно: сульфат-ион смещен на 2.11 А в сторону растворителя, наблюдается изменение в положениях боковых цепей остатков А5П-119 (разница в положениях

СЖ атомов 0.61 А) и 01и-127 (разница в положениях СБ атомов 0.54 А). В структуре 1.1 А остаток А^-57 имеет две информации боковой цепи. Однако, из 8 молекул воды, находящейся вблизи магний-водного кластера в структуре 1.1 А,

Глава 5. Механизм действия нуклеазы Sm. Для описания механизма каталитического действия фермента мы использовали модель структуры нуклеазы Sm, уточненную на 1.1 А и содержащую магннй-водный кластер в активном центре, который образован остатками Arg-57, His-89, Asn-119 и Glu-127. Как уже было отмечено, в исследованиях структуры нуклеазы Sm мы имели дело с ферментом без субстрата и, следовательно, были ограничены отсутствием прямых данных о фермент-субстратном взаимодействии.

Однако недавно была решена кристаллографическая структура интрон-кодируемой специфичной эндонуклеазы \-Ppol из Physanm polycephalum в комплексе с ДНК (без иона магния) и с продуктом расщепления (в присутствии иона магния) [6] и было показано, что нуклеазы \-Ppol и Sm имеют сходную геометрию каталитической части активного центра [6]. Это позволяет предположить, что ДНК вблизи расщепляемой связи может быть связана нуклеазой Sm сходным образом с нуклеазой \-Рро\. В пользу этого предположения говорит также то, что при наложении структур двух нуклеаз (рис. 6) боковая группа остатка Arg-57 нуклеазы Sm (в одной из конофрмаций) оказывается на оптимальном расстоянии для связывания расщепляемой фосфатной группы, а боковые группы остатков Arg-131 и Arg-S7 - для связывания соседних с расщепляемой фосфатных групп субстрата.

Н,о 5 присутствуют и в структуре 1.7 А,

- ,с iGIu-127

-о-^о что подтверждает правильность их

в активном ijентре нуклеазы Sm.

/, в 11

Рис. 6. Моделирование связывания фрагмента ДНК нуклеазой Sm на основании схожего строения каталитической части активного центра нуклеаз Sm (серый) и I-Ppol (чернош).

При моделировании связывания фрагмента ДНК нуклеазой Sm сначала было осуществлено совмещение структур нуклеаз Sm и \-Рро\ по остаткам 89 (98 для I-РроТ), 119 (для обеих нуклеаз) и магний-водному кластеру. Затем от структуры нуклеазы \-Рро\ был оставлен только фрагмент ДНК (рис. 6).

В комплексе \-Рро\ с ДНК 3 '-О атом координирован ионом магния. При моделировании связывания ДНК нуклеазой Sm, З'-О атом связанной ДНК занимает положение воды (с) в координационном кластере магния Прямое взаимодействие З'-ОН группы субстрата с ионом магния предполагает нетривиальный для нуклеаз внутрисферный механизм активации магнием [7]. Asp-86, GIn-114 и Gln-127 нуклеазы Sm являются непрямыми участниками этого процесса, их роль, возможно ограничена правильным позиционированием магний-водног.- кластера.

На основании наших данных His-89 нейтрален в кристаллографической структуре нуклеазы Sm, только NE2 атом имидазола гистидина протонирован (рис. 7). His-89 связан водородной, связью с Asn-106 и молекулами воды (а) и (е) (рис. 5). В структуре I-Ppol и в модельном комплексе Sm с фрагментом ДНК остаток гистидина расположен оптимально для позиционирования молекулы воды (а) для in-line атаки фосфодиэфирной связи, которая будет расщепляться.

• / #

' ' £ ■

А'£2

, ■ /

Рис. 7. Фрагмент 27Г°-.РС синтеза Фурье (уровень 2а) для остатка Н'б-Н9.

Следовательно, наиболее реалистичен механизм реакции, включающий активацию молекулы воды (а) остатком Н1б-89 (рис. 8). При этом остаток Н1б-89 выполняет роль общего основания, депротонируя атакующую молекулу воды. Расщепление фосфодиэфирной связи нуклеазой Бт протекает через нуклеофильное замещение у атома фосфора, как реакция присоединения-отщепления молекулы воды с образованием пентакоординированного переходного состояния с геометрией тригональной бипирамиды с атомом

фосфора в центре, атакующей и

Аг§-57

н,ы' "ЧМН-о

(X я,

01и-127

уходящей группами в вершинах, и тремя атомами кислорода в плоскости основания (рис. 8). Реакция сопровождается

инверсией конфигурации атома фосфора.

<— Рис. 8. Схематическое

изображение активного центра

их, I д 11 о нуклеазы Бт и механизма ' абп-пу '

141 н расщепления фосфодиэфирнои

О

01п-114—« э^-Авр-вб о О

связи.

а

Ь

Рис. 9. Моделирование связывания субстрата (а) и продукта расщепления фосфодиэфирной связи (Ь) в активном центре нуклеазы Бт. При связывании субстрата А1^-57 координирует фосфатную группу ДНК (она выделена окружностью). Изменение положения остатка Arg-57 в ходе реакции освобождает место и позволяет фосфатной группе удалиться от расщепленной связи.

Наличие двух конформаций боковой цепи Аг£-57 позволяет предположить 2 состояния активного центра - до и после расщепления фосфодиэфирной связи. В первом случае, Ат%-51 контактирует с 5'-фосфатной группой расщепляемой связи, во втором случае измененное положение боковой цепи Аг§-57 позволяет

связи, во втором случае измененное положение боковой цепи Аг£-57 позволяет фосфатной группе удалиться от З'-О атома после расщепления ДНК (рис. 42). Это может рассматриваться как подтверждение того, что А^-57 вовлечен в позиционирование и поляризацию фосфата и также может быть вовлечён в стабилизацию переходного состояния в процессе расщепления фосфодщфирной связи.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Проведено утотгнение атомной структуры нуклеазы 8т на основе набора дифракционных данных, полученного с использованием синхротронного излучения при комнатной температуре до разрешения 1.7 А. Получена модель со значениями Я-фактора 17 3% и 11б„ 22.2%. 2 Проведено уточнение атомной структуры нуклеазы 8т на основе набора дифракционных данных , полученных с использованием синхротронного излучения и низкотемпературной съемки до разрешения 1.1 А. Получена модель со значениями 11-фактора 12.9% и К&се 15.6%. В структуре идентифицирован магний-водный кластер в области активного центра, определены альтернативные положения для пятидесяти одного остатка димера Установлены лиганды, входящие во внутреннюю и внешнюю координационные сферы иона магния.

3. На основе анализа системы водородных связей в полученных моделях дано описание вторичной структуры нуклеазы 5т.

4. Проведено детальное сравнение структур активных центров апофермента и фермента в комплексе с ионом магния. Обнаружены конформационные изменения, вызванные связыванием металла кофактора в активном центре

5. На основании сравнения структуры комплекса нуклеазы 5т с ионом магния со структурой высокоспецифичной нуклеазы 1-Рро1 предложен механизм каталитического действия нуклеазы 8т с описанием роли конкретных аминокислотных остатков.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В_СЛЕДУЮЩИХ

РАБОТАХ

1 V.Yu.Lunin, V.M.Levdikov, S.V.Shlyapnikov, E.V.Blagova, V.V.Lunm, K.S.Wilson, A.MMikhailov Three-dimensional structure of Serratia marcescesns nuclease at 1.7A resolution and mechanism of its action // FEBS Letters 412 (1997) 217-222

2 V.V.Lunm, V.YuLunm, EV.Blagova, V.M.Levdikov, S.V Shlyapmkov, A.M Mikhailov Atomic structure of 5m 1 endonuclease molecule at 1.7A resolution // All-Russian Conference on application of X-ray and synchrotron radiation, neutron and electron diffraction for investigation of materials 25-29 may 1997 p.221

3 VV.Lunm, V.Yu.Lunin, E.VBlagova, S.V.Shlyapmkov, V M.Levdikov, A M Mikhailov Serratia marcescesns enodnuclease. Refined structure of enzyme at 1.7A resolution and mechanism of its action // Eighteen European Crystallographic Meeting, Praha, Czech Republic, August 15-20, 1998, p 472

4 V.Yu.Lunin, EV.Blagova, V.M.Levdikov, VV.Lunm, S V. Shlyapmkov, A.M.Mikhailov Extracellular Serratia marcescens endonuclease. Three-dimensional structure of enzyme m crystal state at 1.7A resolution // Molecular Biology (rus), 33, 2 (1999), p 214-222

5 S.V Shlyapmkov, EV.Blagova, V M.Levdikov, V.Yu.Lunin, V V Lunm, A M Mikhailov Extracellular Serratia marcescens endonuclease Structure of active site and catalytic mechanism of enzyme action // Molecular Biology (rus), 33, 3 (1999). p. 456-461

6 S.V. Shlyapnikov, V.V. Lunm, M. Peibandt, KM. Polyakov, Ch Betzel, V M Levdikov and A.M. Mikhailov Atomic Strucrure of the Serratia marcescens Endonuclease At 1.1 Angstroms Resolution And the Enzyme Reaction Mechanism // Acta Cryst, D56 (5), 567-572

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Miller M.D.; 'Tanner J., Alpaugh M., Benedik J., Krause K.L. 2.1 A structure of Serratia marcescens endonuclease suggest a mechanism for binding to double-stranded DNA, Struc. Biol., 1994, 1, 461-468.

2 Fnedhoff, P., IColmes, В., Gimadutdinow, О , Wende, W., Krause, К. and Pingoud, A. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-diiected mutagenesis, Nuclei с Acid Research, 1996, 24 (14), 2632-2639.

3. Urzhumtsev A.G., Skovoroda T P., Lunin V.Yu. A procedure compatible with X-PLOR for the calculation of electron-density maps weighted using an R-free-likelihood-based approach ,JAppl.Cryst., 1996, 29, 741-744.

4. Hutchinson E G., Thornton J M. PROMOTTF - a program to identify and analyze stryctural motifs in proteins, Protein Science, 1996, 5, 212-220.

5. Бошаров, M.A. Биофизика, 1997, 42, 753-764.

6. Flick, K.E., Jurica, MS , Monnat, J.R., and Stoddard, В L. DNA binding and cleavage by the nuclear intron-encoded homing endonuclease l-Ppol, Nature, 1998,394, 96-101.

7. Cowan J.A. Metal Activation of Enzymes in Nucleic Acid Biochemistry, Chem Rev., 1998, 98, 1067-1087.