Ферменты рестрикции-модификации нового типа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На прадах рукописи

МАНЯЛЕНЕ ЗИТА, ПРАНО

УДК 047.863.3

ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ НОВОГО ТИПА

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -1092

Работа выполнена в Институте биотехнологии "Fermentas

Научные руководители: член-корр. А.Н. Литвы

"профзссЪр Янулайтис А-.А.

. t доктор химических наук

Буткус В.В.

Официальные оппоненты: доктор'биологических наук

Дегтярев С.Х.

доктор химических наук Громова Е.С.

Ведущая организация: Институт Биохимии Литвы

Защита состоится г^/"" ее/^?/?^. 1992 года в^Очесов на заседании Специализированного совета Д 053.05.4? по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "V" года.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат химических наук И.Г.Смирнова

■ ";:iü

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Современные исследования в молекулярной генетике и генной инкенерии трудно представить без широкого применения рестрик-ционных эдцонуклеаз различной специфичности. Несмотря на уже имеющийся большой набор ферментов рестрикции, пбйсй новых hó теряет актуальности. Менее исследованными являются комплементарные ферменты бактериальной системы рестрикции-модификации (RM) - модифицирующие ДНК метилазы. В последнее время эти ферменты стали привлекать все большее внимание исследователей. Отчасти это связано с необходимостью более полной характеристики рестрик-циошшх эндонуклеаз в отношении их чувствительности к метилированным субстратам. С другой стороны, метилазы являются привлекательными как новые объекты для изучения взаимодействия белков и нуклеиновых кислот. Очень интересными являются ферменты с "необычными" специфичностями. Исследование таких ферментов' открывает новые возможности не только для экспериментальной молекулярной генетики и генной инженерии, но и способствует более глубокому пониманию феномена рестрикции-модификации в частности и эволюционных аспектов развития микроорганизмов в целом.

Цель работы. Настоящая работа посвящена исследованию новых ферментов рестрикции-модификации, обнаруйеных и выделенных в Институте биотехнологии "Fermentas". В задачу работы входило разработка удобного метода определения специфичности метилаз при помощи синтетических субстратов, включающего определение природы модифицируемого основания и локализацию его в узнаваемом участке.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе определена специфичность 4-ех новых рестриктаз, которые стали кожерчеекили препаратами "Fermentas" и 5-ти новых бактериальных ДНК-метилаз.

В системе RM 11-го типа впервые обнаружена и охарактеризована рестрикцконная эндонуклеаза Есо57 I, обладающая бифункциональными свойствам, т.е. способная расщеплять и модифицировать ДНК.

Впервые обнаружены и исследованы ДНК-метилазы Alw26 I, Есо31 I, ЕзрЗ I, способные модифицировать два различных основания (А и С) в комплементарных последовательностях узнаваемого участка.

В работе предложены удобные методы определения продуктов биометилирования, включающие природу модифицируемого основания и локализацию его в узнаваемом участке, при помощи синтетических олигонуклеотидных дуплексов.

Результаты настоящей работы способствовали расширению ассортимента ферментов для работы с ДНК. Охарактеризованные рестрикционные эндонуклеазы в настоящее время являются коммерческими препаратами "Fermentas".

Апробация работы. Результаты работы докладывались в' международных конференциях: Second New England Blolabs workshop on biological DNA modification, Berlin, 1990; Seventh International oymposlum on raethabolism and enzymology or nucleic acids including gene and protein engineering, Bratislava, 1990; в Всесоюзном симпозиуме "Ферменты рестрикции-модификации ДНК: от генов до белков Вильнюс, 1989.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и обьем работы. Диссертация изложена на 130 страница машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатав, экспериментальной части, выводов, списка литературы, содеркит 18 рисунков и 15 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и сетоды.

Все ДНК-метилазы, рестрикционные эндонуклеазы и препараты ДНК выделены и предоставлены сотрудниками Института биотехнологии "Fermentas". стандарты минорных нуклеозидов т5С и т4С синтезированы в лаборатории нуклеиновых кислот, т6А - фирмы Pharmacia. Радиоактивные соединения: Б-ад9Нозил-1г-метилСэН]-метионин (15 Cl/ммол) Amersham, 7згАТР (70 мБк/ммол) - фирмы Изотоп. Все необходимые в настоящей работе олигодезоксирибонуклеотиды синтезированы лично автором на ДНК-синтезаторе Blosearch с использованием ß-цианоэтилфосфорамидитного метода. Гидролиз до нуклеозидов нативной ДНК и синтетических %-метилированных субстратов проводили при помощи нуклеазы Р1 и щелочной фосфатазы. Природу модифицируемого основания исследуемыми метилазами осуществляли методом ВЭдХ на хроматографе Gllson. Локализацию модифицированного основания определяли методом нуклеотидных карт.

Реакции метилирования проводили в реакционной смеси следующего состава: 25мМ Трис-HCl, 20мМ NaGl, 1мМ DÎT, 0,1мг/мл BSA (рН 7,5). Реакции расщепления рестриктазами проводили в стандартных буферах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Применение рестрикционных эндонуклеаз как аналитических реагентов в области молекулярной генетики и генной инженерии в основном и стимулирует поиск и исследование новых ферментов рестрикции-модификации. Для практических целей исследование рестриктаз ограничивается определением узнаваемой последовательности и места расщепления фосфодиэфирной связи. Исследование сопутствующих им ферментов ДНК-нетилаз отчасти связано с необходимостью более полной характеристики эндонуклеаз в отношении их • чувствительности к метилированным субстратам, с другой стороны, это открывает новые возможности в области исследования белково-нуклеинового взаимодействия и других как теоретических, так и прикладных вопросов молекулярной биологии.

1.Исследование новых фериентов рестртодга-цодкфикацни

АШ6 I, ЕС031 I Н ЕзрЗ I

1.1. Исследование субстратной специфичности новых рестриктаз

Alw26 I, Есо31 I и ЕзрЗ I

В ходе выполнения работ, связанных с поиском и изучением новых Ферментов рестрикции-модификации, в штаммах Aclnetobacter Uoofft RFI26, Escherichia colt RFL31 и Ervlnla species RFL3 были обнаружены и выделены соответствующие рестрикционные эндонуклеазы Alw26 I, Ее031 I и ЕзрЗ Г. Методом картирования и визуального сравнения, по величине образовавшихся фрагментов ДНК-субстрата известной'структуры, были определены приблизительные координаты узнаваемых участков исследуемых эндонуклеаз. Дальнейший анализ узнаваемых последовательностей, проведенный на компьютере с использованием пакета программ, позволяющих вести поиск гомологичных последовательностей в различных молекулах ДНК, позволил определить сайти, узнаваемые исследуемыми рестриктазами.

Оказалось, что все три исследуемые эндонуклеазы рестрикции узнают похожие нуклеотидные последовательности: А1ю 26 I -5'-СГСТС; ЕсоЗ? I - б'-ССТСТС и ЕзрЗ I - б'-ССТСТС. Место расщепления суострата, а одновременно и подтвервдение узнаваемого сайт£ было определено следующим образом: фингерпринтированием пяти индивидуальных рестрикционных фрагментов.ДНК X и рВИ322 было определено, что И.ЕсоЗ? I расщепляет субстрат за пределами узнаваемого сайта на расстоянии 1.и 5 нуклеотидов. Так как узнаваемый сайт В..А1т2б I (СТСТС) составляет часть сайта Н.ЕзрЗ I, (ССТСТС), месте расщепления субстрата этими рестриктазами было определено с использованием 5'-32Р-меченого синтетического олигонуклеотидного дуплекса, имеющего участок узнавания обеих рестриктаз:

Анализ 5*-меченых продуктов рестрикционного и З'-экзонуклеазного гидролиза синтетического олигонуклеотидного дуплекса в тонком слое БЕАЕ-целлзолозы позволило установить, что В..А1&26 I и ЕзрЗ I расщеп- ляет ДНК за пределами узнаваемого сайта на расстоянии 1 и 5 нуклеотидов. Таким образом было показанно, что все три рестрик-ционные эндонуклеазы узнают похохие нуклеотидные последовательности и расщепляют ДНК одинаково следующим образом:

3' -ССАСАСЛШЮГ З'-ССАСАСШШГ З'-САСАСШШГ

1.2. Определение специфичности иотапаз А\ю26 I, Есо31 I, ЕзрЗ 1.2.1. Определение последовательностей, узнаваемых ыетилазаыи

Одновременно с эндонукпеазами,рестрикции были выделены и сопуствущие им сайт-специфические модифицирующие метилазы. Главшши характеристиками специфичности ДНК-метилаз являются узнаваемая последовательность нуклеотидов, природа модифицируемого основания и локализация его в узнаваемом участке. Первым этапом

б'ЧХ; С СТСТС вССАТАСС З'-СС й САСАО СССТАТСС

Есо31 I б'ЧЗСТСТСК'

ЕзрЗ I 5' -ССТСТСМ'

АЫ26 I 5'-ОТСТОЙ*

^следования специфичности новых метилаз было определение узнав-змого участка. Так как исследуемые метилазы были выделены из зктериальных штаммов - продуцентов сайт-специфических эндо-рклеаз, а характеристики субстратной специфичности сопуствущих зстриктаз были определены, то решение задачи сводилось к демон-грации идентичности участков, узнабаемых соответствующей зстриктазой и метилазой. В большинстве случаев такие эксперименты доводятся в ходе выделения метилаз и исходя из этих данных предлагается узнаваемый сайт метилазы. Таким образом, было продв-энстрировано, что исследуемые метилазы узнают нуклеотидные после-звательности: АШ26 I - 5'-ОТСТС; Есо31 I - 5'-ССТСТС и ЕзрЗ I -'-СвТСТС (рис.1; А, Б, В, дорожи 4, 9, 14). Дополнительными {спериментами на ДНК рВИ322 было показано, что М.А1и>26 I защищает Ж от воздействия рестриктаз Есо31 I и ЕврЗ I, но ДНК рВЙ322, этилированная и.ЕарЗ I неустойчива к действию й.ЕсоЗ? I, а .Есо31 I не защищает. ДНК от воздействия Н.ЕзрЗ I (рис.1; А, Б, В, эрохки 5, 6, 16, 11). Этим было доказано, что сайтом М.ЕсоЗ* I зляется гексануклеотид б'-ССТСТС, а и.ЕзрЗ I - гексануклеотид '-ССТСТС, т.е. часть сайта не является субстратом для М,Еоо31 I и .ЕзрЗ I. В случае А1ш26 I таких доказательств получить не удалось.

а Б в

пг-.:;.. • -

(■Ъ

Рис.1 Метилазы А1ш26 I (А), Есо31 I (Б), ЕзрЗ Г (В) защищают -К рВИ322 от рестрикционных эндонуклеаз А1ю26 I, Есо31 I. зрЗ I. ДНК рВН322 (дорожка 1). ДНК рВ11322 обработана ,А1ш26 I (дорокка 2), Я.Есо31 I (дорожка 7), ЕзрЗ I (дорожка 12).

- ДНК метилирована М.А1и>2б I (дорожка 3) и обработана Н.А1и>26 I цорохжа 4), В..Есо31 I (дорожка 5), И.ЕзрЗ Г (дорожка 6).

- ДНК метилирована М.ЕсоЗ? Г (дорожка 8) и обработана Ъ.Есо31 I цорожка 9), К.А1и>26 I (дорожка 10), Я.ЕэрЗ I (дорокка 11).

- ДНК метилирована и.ЕзрЗ I (дорокка 13) и обработана И.ЕзрЗ I цорокка 14), к.А1и)26 I (дорожка 15), В..Есо31 I (дорокка 16).

1.2.2. Идентификация основания, модифицируемого ыотилазами А1ь>26 I, Есо31 1 и ЕзрЗ I

Стандартная процедура определения природы модифицируемого основания включает метилирование ДНК-фрагментов исследуемой мотилазой в присутствии %-БАМ, последующий гидролиз меченой ДНК до мономерных компонентов и сравнение образовавшегося радиоактивного продукта со стандартами в различных хроматографических условиях. В таком случае метил-меченый продукт является единственным радиоактивным соединением и поэтому его идентификации не препятствуют присутствующие мажорные основания. Наиболее популяр- ными методами являются бумажная и тонкослойная хроматография. В настоящей работе для определения природы модифицируемого основания оыл использован метод ВЭЖХ. В качестве субстратов использовали синтетические олигонуклоотидные дуплексы, имеющие узнаваемый участок исследуемых метилаз, которые метилировали соответствующими

Для М.АЫ26 I и М.ЕС031 I Для М.ЕзрЗ I

5'-ССвС 3'- йСС

СТСТС

САССССТ (I) 5'- ССС от (И) З'-АТССО

гшж стстсс

СС (I) ест (II)

ферментами в присутствии ^Н-БАЫ. Стандартами минорных нуклеозидов служили га4йСуй; ш5йСу<1; го6<ЭА<1о. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Определение природа основания, модифицируемого метилазами А1ю26 I, Есо31 I и ЕзрЗ I

Метилаза Сайт ^Н-радиоактивность (орт)

узнавания т4ЙСу~ т5йМо

1 Л1и£6 I етСТС 75 4270 20600

2 ЕС031 I Ш1СТС 67 50% 5068

3 ЕзрЗ I СйТСТС 80 3675 3115

Полученные данные показали, что все три исследуемые метшюзы образуют два вида метилированных продуктов - ш5С и ш6А. Результаты эксперимента указывали на возможность открытия ДНК метилаз нового

типа, которые при взаимодействии с субстратом образуют два вида метилированных оснований. Однако зто можно было отнести и к артефакту, возможному из-за недостаточной очистки препаратов метилаз, хотя использование коротких синтетических субстратов, имеющих только определенный сайг, эту возможность в какой-то степени исключило.

Дальнейшая серия экспериментов была посвящена выяснению этого вопроса. Функциональную чистоту М.Есо31 I проверяли следующим способом: в плазмиде pBR322 при помощи R.G3U I был разрушен единст-. венный сайт и.Есо31 I и такой субстрат обрабатывали Ы.Есо31 I в присутствии радиоактивного SAM. В случае М.£зрЗ I, ДНК фага фХ174, не имеющую сайтов узнавания этого фермента, метилировали исследуемой мэтилазой в присутствии 3H-SAM. В таком случае обе исследуемые метилазы не еводили радиоактивную метку в ДНК. Для проверки функциональной чистоты \k.Alw26 I не удалось подобрать подходящего ДНК-субстрата. Поэтому чистоту препарата проверяли путем обработки метилазой в присутствии 3H-SAM синтетических дуплексов, имеющих только часть узнаваемого участка. И в этом случав был получен отрицательный результат, т.е. метилаза не метилировала таких олигодуплексов. Этими экспериментами было доказано, что работали с функционально чистыми ферментами, а полученные результаты относится к нетривиальным случаям.

1.2.3. Локализация модифицированного основания в узнаваемой

сайте «етилаз Alw26 I, Есо31 I и ЕзрЗ I

Для полной характеристики специфичности исследуемых метилаз нукно было определить местоположение модифицированных оснований в узнаваемом участке, так как определение природы модифицируемого основания не дает информации о локализации метилированного основания в сайте. В настоящей работе был применен метод синтетических олигонуклеотидов. Этот метод удобен для всех возмокных типов метилированных оснований. Стратегия определения заключается в анализе структуры синтетического субстрата, содержащего 5'-32Р-концевую и [эН-метил]-метку по месту модификации. Для этого были использованы те же олигонуклеотидные дуплексы, которые применялись в ходе определения природы модифицируемого основания. Олигонуклеотиды, составляющие дуплекс, по отдельности фосфорили-

ровали при помощи Т4-полинуклеотидкиназы в присутствии Э27~АТР и АТР и отжигали в рабочем буфере исследуемых метилаз. Соответствующие дуплексы метилировали -метилазами в присутствш 3H-SAN. Анал! олигонуклетидного дуплекса, содержащего двойную метку, осуществляли методом нуклеотидных карт, включающим частичный гидролиз и последующее двухмерное разделение образовавшихся меченых олиго-нуклеотидов [Jay,1974]. Радиоактивные зоны, соответствующие Э2Р-меченым продукта?-! гидролиза, локализовали радиоавтографией, соответствующие 32Р-радиоактивные зоны выскребали, элюировали и просчитывали 3Н- и 3 Р-радиоактивность. Минимальной длины олиго-пуклеотид, содержащий двойную радиоактивную метку, указывает на место метилирования. Результаты, полученные в ходе эксперимента, представлены па рис.2 и в таблицах 2-4.

MAlw26 I т?г>г г r.rl

III У-32рССОСИТЛГаССАСОСТ-Т 5 J-G с с

III] j-ccclsuiifilGGTajp-s

■ i.-г

к.

4. £

MEcoil 1

; А G Л С CIC А С G С Т -I ~ Т С Т С GIG Т а -У

S.

L.

S.:

МЕ»рЗ I

I) ff- 32р С G CKJ А С АС С|С С -J

II] J-ATGCGICTCTfr CIG G Т

а б в

Рис.2 Двухмерное разделение продуктов частичного гидролиза

олигодуплексов,модифицированных метилазами а) АШ26 г, б) Есо31 I в) ЕзрЗ I. (специфичность М.А1Ю26 I и М.Есо31 I определена с использованием одного и того ке олигонуклеотидного дуплекса.)

Таблица 2 Распределение 3Н- и 32Р-радиоактивности в продуктах

метилировашюго

{астичного гидролиза олигонуклеотидного дуплекса 1.АШ26 I

5 • -32рСССС! САШ IССАСССТ

3'-

сса|стстс|аст 32р (И)

(I)

Продукты Олигонуклеотид частичного гидролиза

Измеренная радиоактивность (ерш)

3,7

н

32

Р

3Н /32Р

4 рСССС 86 75 1,15

I 5 рССССС 75 96 0.78

6 рОСйССА 132 103 1,28

7 рСССССАС „ 97 82 1,18

в рСССССАСА , 1296 192 6,75

9 рСССССАСАС 2779 385 7,22

3 рТСС 166 353 0,47

II 4 ртссс 119 309 0,39

5 рТСССТ „ 129 230 0,56

6 рТСССТС* 739 384 1,92

7 рТСССТСТ . 420 315 1,33

8 рТССЙТСТС 793 428 1,85

Таблица 3 Распределение радиоактивности в продуктах {астичного гидролиза олигонуклеотидного дуплекса, .гадифицированного М.Есо31 I

5'-32рСССС

3'-

ссс

ш стстос

САСйСТ СТ 32р

(I) (И)

Продукты Олигонуклеотид частичного гидролиза

Измеренная радиоактивность (ерт)

Н

32г

~3Н /32Р_

I 4 рссас

5 рССССС

6 рссассА

7 рСССССАС „

8 рСССССАСА*

9 рСССССАСАС

II

рТСС

ртссс ртссст „

рТСССТС* рТСССТСТ

49 56 59 63 351 150

8 рТСССТСТС"

148

95 82 1230 1580 2556

97 110 89 87 152 72

410

300 230 350 420 385

0,50 0,50 0,66 0,72 2,31 2,08

0,36

0,32

0,35

3,5

3,7

6,64

Таблица 4 Распределение радиоактивности в продуктах частичного гидрлиза олигонуклеотидного дуплекса, модифицированного М.ЕзрЗ I

Э2рССС|СШСС

5'

3'-

ATGCG CTCTGC

СС GGT

32.

(I) (И)

Продукты Олигонуклеотид частичного гидролиза

Измеренная радиоактивность (ерш) ~эГ

н

32,

^Н /Э2Р

1 э pCGC 6Ш 616 o,r¿

4 pCGCCG 607 1604 0,38

5 pCGCCGA 502 1610 0,31

6 pCGCCGAG , 449 1135 0,38

7 pCGCCGAGA* 1358 674 2,01 .

8 pCGCCGAGAC 2856 1527 1,87

II 3 pTGG 155 430 0,36

4 pTGGC 131 289 0,45

5 pTGGCG 83 232 0,36 0,50

6 pTGGCGT 4 87 172

7 pTGGCGTC . 230 200 1,15

8 pTGGCGTCT* . 295 280 1,05 '1,08

' 9 pTGGCGTCTC 932 866

Полученные данные свидетельствует о том, что все исследуемые метилазы модифицируют аденин и цитозин в комплементарных цепях узнаваемого участка следущим образом:

M.AIW26 I

ö'-G Т m5C Т С з'-С m6A G A G

М.ЕС031 I М.ЕэрЗ I

ö'-G G Т т5С Т С 5*-С G Т Ш5С Т С

з'-С С Ш6А G A G 3 -G С П16А G A G

Это был неокиданный результат, который позволил констатировать факт, что исследованные нами метилазы Alw26 I, Ego31 I и ЕврЗ I, способны модифицировать два различных основания в комплементарных цепях узнаваемой последовательности. Такой случай среди Ферментов рестрикции-модификации в литературе не был описан. До настоящего времени имелись лишь данные о способности метилаз Ils типа модифицировать основания только одной природы (А или С) в одной (McClelland M.,1985, Bolton В. J. ,19891 или в обеих. [Landry Р.,1989, Looney H.С., Wilson G.,19911 комплементарных цепях узна-г'ч-'Мого сайта. Полученные нага данные были подтверждены данными

клонирования и секвенирования генов метилаз Alu>26 I и Есо31 I в, аминокислотных последовательностях которых были идентифицированы домены, свойственные Н6-метиладениновым и 5-метилцитозиновым метилазам [Битинайте, Тиминскас, неопубл. данные].

2. Исследования ферментов рестрикции-модификации Есо57 I

Рестрикционная эндонуклеаза была обнаружена и выделена из штамма Esherichta coll RFL 57. Методом картирования были определены приблизительные положения сайтов на ДНК известной структуры. При помощи компьютерного анализа был установлен предполагаемый участок'узнавания В..Есо57 I - 5'-CTGAAG. Место расщепления субстрата (одновременно и подтверждение структуры узнаваемого участка) было определено методом секвенирования по Максаму-Гилберту меченого по 5'-концу небольшого субфрагмента ДНК PBR322, в паралельной дорокке анализируя подвкность того же меченого фрагмента, обработанного R.Eco57 I. Таким образом было установлено, что рестрикционная эндонуклеаза Есо57 I узнает нуклеотидную последовательность 5'-CTGAAG и расщепляет ДНК за пределами узнаваемого участка на расстоянии 16 и 14 нуклеотидов.

В ходе дальнейших исследований было обнаружено, что высоко-очищенный препарат рестрикционной эндонуклеазы Есо57 I проявляет метилазную активность. В начале это было отнесено тому, что в ходе хроматографии эндонуклеаза все-таки не полностью отделяется от метилззы и поэтому препарат рестриктазы проявляет метилазную активность. Выделение рестриктазы при помощи разных схем результатов не изменило. В дальнейших экспериментах был определен молекулярный вес эндонуклеазы и метилазы в денатурирующих (SDS-электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле) и нативных (гель-хроматография на Sephadex G-200) условиях.' Совпадение молекулярной массы денатурированной (108 kDa) и нативной (104 kDa) формы эндонуклеазы рестрикции Есо57 I указывало па то, что фермент состоит из одн£й полипептидной цепи.

Исследование потребности в кофакторе дали неожиданные результаты. Наряду с выявленной абсолютной необходимостью присутствия йоноп магния в реакционной смеси, стимулирующее действие проявляет SAM, в то время как АТР на активность рестриктазы не влияет. Следует отметить, что полного специфического фрэгментирования ДНК

рестриктазой Есо57 I получить не удалось. Это, вероятно, можно обьяснить тем, что в присутствии SAM проявляется метилазная активность, а в отсутствии его полного расщепления субстрата не наблюдается, возможно, из-за пониженной активности зндонуклеазы.

Дальнейшие эксперименты были нацелены на определение природы модифицируемого основания и локализации его в узнаваемом участке в препаратах рестриктазы и метилазы Есо57 I. Для этого синтезировали олигонуклеотидный дуплекс, содержащий сайт узнавания Есо57 I следующего состава:

5'-' GCG!CTGAAG|CCAG (I) 3•-TTTTCGC j GACTTC]GGT (II)

2.1 Определение природа основашм,модифицируемого и.Есо57 I и Е.Есо57 I н локализация его в сайтах узнавания

Для определения природы модифицированного основания олигонуклеотидный дуплекс по отдельности метилировали Ч.Есо57 I и В..Есо57 I в присутствии '^Н-БАМ и исчерпывающий гилролизат 3Н-ме-тилированного субстрата анализировали методом ВЭЖХ в присутствии Есех трех'минорных стандартных нуклеозидов.3Н- радиоактивность, совпавшая с т6с1Ас1о стандартом, указывала на модификацию аденина с образованием ю6А в узнаваемой последовательности нуклеотидов как в случае М.Есо57 I так и рестриктазы Еоо57 I (таблица 6).

Таблица 5 Определение природы основания, модифицируемого И.и и.Еоо57 I при помощи ВЭЖХ.

Фермент _____Распределение 3Н-радиоактивности

т4Оу1 ' т^Оуй т^Ас1о

U.EG057 I 95 60 .40665

R.EC057 I 80. 95 58810

Для определения местоположения метилированного аденина в узнаваемом участке М.Есо5.7 I и R.£co57 I каждый олигонуклеотид (I

и II ) отдельно фосЛорилировали при помощи Т4-полшуклеотид-.киназы, 732-АТР и АТР. Олигонуклеотидный дуплекс отжигали в рабочем буфере и метилировали его по отдельности М.Есо57 I и R.Eco57 I в прсутствии %-SAM. После удаления непрореагировавшего 3H-SAM олигонуклеотида с двойкой радиоактивной меткой разделяли при помощи электрофореза в 20% полиакриламидном геле;в денатурирующих условиях. Соответствующие Э2Р-радиоактивные зоны элюировали и в аликвоте просчитывали 32Р и %-радиоактивность.

Таблица 6 Измерение радиоактивности в отдельных

олигонуклеотидах после разделения цепей в 20% ПААГ, модифицированного М.Есо57 I и R.Есо57 I олигонуклеотидного дуплекса.

Фермент

олигонуклеотид с двойной меткой

Измеренная радиоактивность

н

32г

Н.ЕС057 I 5*-GCGCTGAAGCCAG 30833

ITTTCGCGACTTCGGT-5' 12054

R.Е0057 I

5'-GCGCTGAAGCCAG TTTTCGCGACTTCGGTC

9801 8885

6718 117

1896 1347

Из полученных данных видно, что метилаза Есо57 I способна модифицировать аденин в обеих цепях асимметрического сайта, а рестриктаза Есо57 I модифицирует аденин только в последовательности 5'-СТСААС.

Для определения местоположения модифицированного аденина в последовательности 5'-СТСАА0 узнаваемого участка И. и М.Есо57 I олигонуклеотид I, выделенный из полиакриламидного геля, подвергали частичному гидролизу и полученный гидролизэт анализировали методом нуклеотидных карт. Результаты измерения радиоактивности модифицированного олигонуклеотида 5'-рССССТСААСССАй представлены на рис 4 и в таблице 7.

5' 32рС СССТСААСССАС

Рис. 4 Двухмерная хроматография модифицированного олигонуклеотид! рССССГСААСССАС а) в случае Е.Есо57 1,0) в случае Ы.Есо57 I

Таблица 8 Распределение радиоактивности в продуктах

частичного гидролиза М. и й. Есо57 I метилированного ' олигонуклеотида рССОСТСААСССАО

Исследуемый Продукы Измеренная радиоактивность (срга

частичного -32"

фермент гидолиза Н

Ы.ЕС057 I 2 рСС 52 68 • 0.7

3 рССС 33 77 0.4

4 рСССС 50 104 0.4

5 ]Х}СССТ 47 55 0,8

6 рССС(Ж} 40 78 0.5

7 рассстсА 4 48 70 0,6

8 рССССТСАА* 275 93 2.9

9 рССОСТСААС 440 274 1 ,ь

Е.ЕС057 I 2 рос 105 122 0.8

рвсс 82 201 0,4

4 рССОС 70 •173 0,4

5 рссаст 54 91 0.6

6 рССССТС 62 105 . 0,6

7 рССОСТСА „ 130 126 1 .0

8 рОСССТСАА* 3866 214 18,1

9 рССССТСААС* 5295 375 14,2

10 рССССТСААСС 6162 276 22,2

Самый короткий олигонуклеотид, содержащий двойную радиоактивную метку - pGCGCTGAA и указывает на место метилирования. Определение положения метилированного аденина в комплементарной цепи 5'-CTTCAG отпало, так как в последовательности олигонук-леотида II имеется единственный аденин. В случае рестриктазы Есо57 I (таблица 7) в этой цепи модификация не происходит.'1 Из полученных данных видно, что исследуемые ферменты рестрикции-модификации Есо57 I модифицируют аденин в узнаваемом участке следующим образом:

U.EC057 I R.ЕС057 I

5'-С Т G А ш6А G ' 5'-С Т G А Ш6А G

З'-G т6А С Т Т С З'-G ACT ТС

Таким образом, при -исследовании функциональной специфичности ферментов R-M системы Есо57 I были получены неожиданные результаты. Наиболее интересным представляется тот факт, что гомогенный препарат рестриктазы проявляет кроме эндонуклеазной и метилирующую активность. Такое свойство в ряду ферментов 11-го класса до настоящего времени не было обнаружено. Эти данные хорошо согласуются с данными о стимулирующем влиянии SAM на активность эндонуклеазы, а такяе с неспособностью эндонуклеазы полностью расщеплять свой субстрат. Дополнительно можно сказать, что гомогенный (данные SDS-электрофореза ) белок R.Есо57 I имеет необычно большую молекулярную массу (108 kDa), что также указывает на возможность слияния двух энзиматических активностей в один полипептид.- Окончательное подтверждение этого, однако, было получено только после секвенирования гена R.Есо57 I, в котором были обнаружены консервативные домены, определяющие метилазную активность рестриктазы [Janulaltls, 1992, in press].

3. Исследование ферментов рм из Serratia тагсезсепз Sb.

Serratia тагсезсепз Sb является источником рестрикционной эндонуклеазы Sma I, которая расщепляет 5'-ссслссо последовательность в месте, отмеченном стрелкой [Mulder, 1989]. Ранее нами было установлено, что активность эндонуклеазы in vitro иигиби-руется С5-метилированием центрального CG динуклеотида, также как и присутствием и^-метилцитозина в любом положении узнаваемой последовательности [Butkus, 1987]. Анализ ДНК Serratia marcescens показал наличие-двух продуктов биометилирования: ш5С и юьА, а также отсутствие m4C (Ehrlich, 1987; Butkus, 1987]. Так как в сайте не содержится аденинового основания, а ДНК этого микроорганизма устойчива к действию эндонуклеазы Sma I, было предположено, что т5С участвует в защите ДНК от расщепления R.Sma I In vivo. Другими словами, m5C является продуктом действия специфической метилазы Sma I, модифицирующей ДНК по сайтам узнавания рестриктазы Sma I [Butkus, 1987]. Ранее предпринятые в нашей лаборатории многочисленные попытки выделить метилазу Srn I с целью прямого доказательства ее специфичности, а также аналогичные■ усилия других исследователей [Heldman, 1989], не увенчались успехом. Вернуться к этой проблеме побудила публикация результатов клонирования и секБенироБания гонов рестрикции- модификации Sma I (Heldman, 1989], а также большая степень гомологии с U.Cfr9 1 (Kllmasauskas, 1989] и Хю I (Lubys, In presa], которые указывали на то, что М.Sma I может обладать Ы4-метилцитозиновой специфичностью.

Во время хроматографии клеточного экстракта S.тагсезсепз на гепаринсефарозе некоторые фракции обладали метилазной активностью, т.е. в присутствии SAM были способны защищать ДНК от воздействия R.Srn I (рис.5). Дальнейшие стадии очистки оказались невозможными, так как после дирлиза фермент быстро терял активность. Не удалось каким-либо путем стабилизировать активность метилазной фракции, и ь дальнейших экспериментах решили использовать частично очищенный, только что выделенный препарат метилазы. Нестабильность препарата и была причиной, из-за которой не удалось обнаружить метилазную активность In vitro.

1 5 9 13 17 21 25 29 33 •тл

Рис.5 Анализ метилазной активности во фракциях 5.тагсеасепз. Фракции 17-23 защищают ДНК от к.5ша I.

Для определения специфичности М.Бта I синтезировали самокомплементарный олигонуклеотид 5 -ССАССССССТСС, который метилировали в присутствии 3Н-5АМ. Препарат метилазы Бт I оказался способным катализировать перенос метальных групп от • 3Н-БАМ на додекануклеотид йССАСССОСХгГСС. Использование короткого Бта 1-специфического субстрата предохраняло от возможного проявления активности других метилаз, возмокно, присутствующих из-за недостаточной отчистки препарата. В качестве контроля реакцию метилирования проводили с температурно ингибированной метилазой в присутствии ЭН-5АМ. Также была не исключена возможность, что исследуемая метилаза узнает только часть последовательности СШХ)С, но это на самом деле маловероятно, так как К.Бта I модифицирует сайты хозяйской ДНК, исполняя завдтную функцию от Ш.Бта I. В дальнейшем эксперименте анализировали олигонуклеотид, модифицирований Ы.Бт I с целью определения ее специфичности. Аликвоту метилированного.олигонуклеотида гидро-лизировали до дезоксинуклеозидов и анализировали методом ВЭЛСХ в присутствии стандартных минорных нуклеозидов т4£Юуй, т^йСуй, т5(1Айо в условиях, позволяющих разделить все минорные компоненты. ^Н-радиоактивный пик (31400. срга, 98% суммарной радиоактивности), совпавший со стандартом От^Суй, показывал метилазу Бта I как ^-метилцитозиновую, Результат эксперимента хорошо согласуется с результатами секвенсирования гена_ П.Бта I [Не1(1тап, 1989), так как метилазы, имеющие ТБРРУ—(К,И) регионы, характеризуются как

^-метилцитозиновые; такие консервативные домены не обнаружены в 5-метилцитозиновых ДНК-метилазах [Kllmasauskas, 1989 1. Неудачная попытка обнаружить остаток ш4С в хромосомной ДНК S.тагсезсепз могла быть из-за недостатка узнаваемых сайтов в хозяйском геноме. Чувствительность метода ВЭЖХ оказалась недостаточной для обнаружения т4С в ДНК Б.тагсезсепз [Ehrlich, 1987; Butkus, 19871,. так как сайтов, модифицированных Sm I могло быть в несколько раз меньше, чем уровень чувствительности метода. Локализация модифицированного основания в участке узнавания Srna I была установлена методом нуклеотидных карт. Для этого 3Н-метилированный олигонуклеотид GGACCCGGGTCC фосфорилировали 32т-АТФ и АТФ и приготовили частичный гидролизат. Смесь образовавшихся нуклеотидов с двойной радиоактивной меткой разделяли электрофорезом на ацетилцелюллозе при pH 3,5, а затем гомохроматографией в тонком слое DEAE-целюллозы во взаимоперпендикулярных направлениях. Зоны, соответствующие 32Р-меченым продуктам, локализовали радиоавтографией (рис.6), элюировали и просчитывали 3Н- и 32Р-радиоактивность. Олигонуклео-тидом минимальной длины, содержащим двойную метку, оказался пентануклеотид pGGACC (табл.8). Таким образом, в исследуемом . додекануклеотиде 3Н-метилированным является пятое звено с 5 -конца. Следовательно, метилаза Sma I модифицирует средний (второй) остаток цитозина в узнаваемом сайте Cm4CCGGG.

Таблица 8 Содержание 3К- и 32Р-радиоактивности в продуках

частичного гидролиза U.Sma I модифицированного субстрата.

Продукты Метилированный частичного олигонуклеотид гидролиза

Измеренная радиоактивность (срт)

32т

3Н / 32Р

pGGACCCGGGTCC

2 pGG

3 pGGA

4 pGGAC „

5 pGGACC*

6 pGGACCC

40 50 90 150 240

HO 100 250 120 1ß0

0,3 0,5 0,4 1.3 1.6

:'2p GGAICCCCGGI ТСС . TTCjGCGCCClAGG p

» * • *c

Рис.6 Двухмерная хроматография модифицированного U.Sma I олигонуклеотида 32PGGACCCGGGTCC

Таким образом, специфичности U.Sma I и ранее исследованной \L.Cfr9 I окзались идентичными - Cm4CCGGG [Kllmasauskas, 19901. Структурная и функциональная идентичность мезду метилазами вероятно указывает на близкий путь эволюции. Наоборот,- соответствующие рестрикционные эндонуклеазы не являются истинными изошизомерами, так как R.Sra I расщепляет узнаваемый байт в середине нуклеотидной последовательности [Mulder, 1989), a R.Cfr9 1-е образованием 5'-тетрануклеотида [Янулайтис, 1.984]. Никакого совпадения между последовательностями аминокислот в случае рестриктаз не найдено tLubys, in ргевз]. Это может означать различный эволюционный путь рестриктазы и метилазы в системах рестрикции-модификации Sm I и С/г9 I.

Основные вывода

1. Впервые обнаружены и исследованы новые метилазы АШ26 I, Есо31 I и ЕзрЗ I, способные модифицировать различные основания в комплементарных цепях узнаваемого участка.

2. Исследованы ферменты системы Н-М Есо57 I. Установлено, что гомогенный препарат рестрикционной эндонуклеазы Есо57 I -' бифункциональный фермент, обладающий свойством и расщеплять, и модифицировать ДНК. Это впервые обнаружено среди ферментов II типа.

3. Определена специфичность метилазы Бта I и установлено, что она относится к М4-метилцитозиновым метилазам, а не к 5-метилци-тозиновым, как было предположено другими авторами.

4. В ходе работы определена субстратная специфичность 4-ех новых рестриктаз: А1т26 I, Есо31 I, ЕзрЗ I, Есо57 I.

5. Метод синтетических олигонуклеотидов предложен в качестве универсального для определения специфичности рестриктаз и метилаз.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Manellene Z., Bltlnalte J., Grlgalte R., Menkevlclus S., Kllmasauskas S., Butkus V., Janulaltls A. AIw26 I.Eco3l I,Esp3 I type lis methyltransrerases capable or modifying different bases In complementary DNA strands. - Methabollsm ard Enzymology or nucleic Acids Including Gene and Protein Engineering, Publishing House or the Slovak Academy or Science, 1991, p.309-314.

2. Bltlnalte J., Grlgalte .R., Manellene Z., Butkus v., and Janulaltls A. Esp3 I - a novel type Us restriction endonuclease Ггот Hamia alvel that recognises the sequence 5,-ССТСТС(И)1/5-3' - Nucl.Aclds Res., 1991, v.19, No.18, p.5076.

3. Bltlnalte J., Manellene Z., Menkevlclus S., Kllmasauskas S., Butkus V. and Janulaltls A. Alw26 I, Eco31 I and'Esp3 I type'lis methyltransferases modirylng cytoslne and adenine In

complementary strands of the target DNA. - Nucl. Acids Res., 1992, (in press).

4. Butkus V.V., Petrausklene L.J., Manellene Z.P., Kllmasauskas S.J. Laueys V.S., Janulaltls A.A. Cleavage or methylated CCCGGG sequences containing either N4-methylcytoslne and 5-rcethylcy-toslne with Msp I, Нра II, Sma I, Xma I, СГг9 I restriction endonucleases. - Nucleic Acids Res., 1987, v.15, No.17,

p.7091-7102.

5. Kllmasauskas S., Steponavlclene D., Manellene Z., Petrusyte 11., Butkus V. and Janulaltls A. M.Sraa I.is an N4-mehylcytoslne speciric DNA-methyläse, - Nucl.Acids Res., 1990, v.18, No.22, p.6607-6609.

6. Janulaltls A., Petrusyte M., Manellene Z. and Butkus V., Purification and properties or Eco57 I restriction endonuclease and methylase - prototypes or the enzymes оГ а new class(type IV), Nucl. Acids Res.,1992 (In press).

7. Bltlnalte J., Manellene Z., Grlgalte R., Menkevlclus S., Butkus У., Janulaltls A. Alw26 I, Eco31 I, ЕзрЗ I, type lis methyltransrerases are capable or modirylng dliTerent bases In complamentary DNA strands. - Abstract, Second NEB workshop on biological DNA modiricatlon, 1990, Berlin, p.128.

8. Григайте P.C., Манялене З.П, Битинайте Ю.Б., Буткус В.В., Янулайткс A.A. Новая сайт-специфическая эндодезоксирибонуклеаза ЕзрЗ I из Ervinla species. Тезисы докладов всесоюзного снгшозша, 1989, Вильнюс, с.19.

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА.ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОЮ ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ'РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ км. М.В.ЛОМОНОСОВА' МАНЯЛЕНЕ ЗИТА.ПРАНО .

ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ НОВОГО ТИПА БУМАГА ТИПОГРАФСКАЯ 60x84 1/16. ТИРАЖ 100 ЭКЗ. ЗАКАЗ 556. УСЛ.ПЕЧ.Л.1.00. ОТПЕЧАТАНО РОТАПРИНТОМ В ИНСТИТУТЕ ИНФОРМАЦИИ ЛИТВЫ.2000.ВИЛЬНЮС,ТОТОРЮ 27.