Кристаллизация и рентгеноструктурное исследование различных кристаллических форм бактериальных ферментов: β-глюкозидазы, эндонуклеазы и глутамил-эндопептидазы тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

РГ6 од

О 1! ФЕВ

На правах рукописи

БЛАГОВА Елена Валентиновна

УДК 548.737

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И РЕ1ПТЕ НОСТРУКГУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ФОРМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ: Р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ, ЭНДОНУКЛЕАЗЫ И ГЛУТАМИЛ-ЭНДОПЕПТИДАЗЫ.

Специальность 01.04.18 - Кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

Научные руководители:

доктор химических наук И.П. Куранова

доцент, кандидат физико-математических наук A.M. Михайлов

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук проф. Л.А. Фейгин (ИКРАН)

кандидат химических наук

Т.В. Демидкина (ИМБ РАН)

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

_ /о '—~

Зашита диссертации состоится '¿Ь.' 1998 г. в " -" на заседании

Диссертационного совета Д.002.58.01 в Институте кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

Автореферат разослан " "_199 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат физико-математических наук В.М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

А КТУАЛЪНОСТЬ ТЕМЫ. Исследование пространственных груктур биологических макромолекул методом рентгеноструктурного 1алта в настоящее время является одним из важнейших направлений элекулярной биологии. Несмотря на крупные достижения в гструментальном и математическом обеспечении рентгеноструктурных хледований, получение белка в виде достаточно больших и совершенных энокристаллов до сих пор является узким местом белковой металлографии, а преодоление трудностей кристаллизации во многом чределяет успех рентгеноструктурного исследования белка в целом.

Объектами кристаллографического изучения в данной работе были абраны бактериальные белки: (}-глюкозидаза Bacillus circulans var 'kalophilus, эндонуклеаза Serratia marcescens и глутамил-эндопептидаза icillus intermedins.

р-Глюкозидаза принадлежит к семейству ферментов, участвующих метаболизме углеводов всех живых организмов - от бактерий и низших ибов до млекопитающих. Она относится к классу гидролаз и, являясь [ним из компонентов ферментативного комплекса, превращающего ¡ллюлозу в глюкозу, катализирует последнюю стадию этого процесса. Под йствием р-глюкозидазы целлобиоза, образующаяся при расщеплении ллюлозы, гвдролизуется до глюкозы. р-Глюкозидаза выделена из калофильного штамма бактерий Bacillus circulans var. alkalophilus. :лки алкалофильных организмов, обладающие повышенной тойчивостью в щелочной среде, до сих пор мало изучены и представляют обый интерес для структурного исследования.

Эндонуклеазьг, действующие на внутренние межнуклеотидные язи в молекулах как ДНК, так и РНК, осуществляют деполимеризацию клеиновых кислот в основном до олигонуклеотидов. Эндонуклеаза rratia marcescens расщепляет РНК, ДНК, а также соответствующие

одно- и двухнитевые гомополимеры с образованием 5" -фосфорилированных олигонуклеотидов и, согласно последним данным, обладает противоопухолевой и противовирусной активностью, что, в частности, инициировало структурное исследование этого фермента.

Глутамил-эндопептидазы (протеиназы) катализируют гидролиз пептидных связей в полипептидной цепи белка. Протеиназа Bacillus intermedius по механизму действия относится к подклассу сериновых протеиназ. Она избирательно ускоряет гидролиз пептидных связей, образованных глутаминовой и аспарагиновой кислотами. Протеиназы, обладающие такой специфичностью, наименее изучены в структурном плане.

Каждый из трех выбранных белков катализирует важный ферментативный процесс. Получение пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов этих белков и определение пространственных структур позволит понять механизм их функционирования, из чего следует актуальность данного исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - поиск условий кристаллизации трех бактериальных белков - ß-глюкозидазы Bacillus circulans var Alkalophilus, эцдонуклеазы Serratia marcescens и глутамил-эндопептидазы Bacillus intermedius, выращивание кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного исследования, и изучение влияния некоторых факторов (значения pH, введения низкомолекулярных добавок) на скорость роста, размер и качество кристаллов. Целью работы было также кристаллографическое исследование полученных кристаллов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Разработанные методики позволили получить гомогенные высокоочищенные препараты трех белков. В работе впервые найдены условия их кристаллизации и получены пригодные для рентгеновского исследования кристаллы.

Изученное в работе влияние низкомолекулярных добавок и pH белкового раствора на форму и качество кристаллов ß-глюкозидазы имеет

щее значение и может быть использовано для улучшения качества тковых кристаллов.

На кристаллах эндонуклеазы проведен комплекс металлографических исследований. Уточнение атомной модели тонуклеазы при разрешении 1.7 Â позволило достоверно определить гменты вторичной структуры в молекуле данного белка.

Впервые получены кристаллы глутамил-эндопептидазы, пригодные i проведения рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Предложенные методические разработки позволяют получать сокогомогенные препараты и выращивать крупные кристаллы белков, игодные для рентгеноструктурного исследования.

Полученные в настоящей работе результаты являются основой для ределения пространственной структуры (î-глюкозидазы. Данные такого да позволют понять механизм каталитической активности и объснить вышенную термостабильность и устойчивость в щелочной среде данного рмента.

Эндонуклеаза, обладающая противоопухолевой и противовирусной гивностью, используется при разработке терапевтических препаратов. :рмент представляет также интерес для структурно-функциональных :ледований нуклеиновых кислот и для препаративного получения 5'-клеотвдов. Знание пространственной организации эндонуклеазы зволяет начать работы по модификации функционально важных остатков )Го фермента методом направленного метагенеза. Появилась возможность ^ения комплексов фермента с различными аналогами субстратов.

Glu, Asp - специфичная протеиназа (глутамил-эндопептидаза) пользуется в пищевой, парфюмерной и медицинской промышленности, в лтюсти, для приготавления мазей для заживления ран. Выращенные исталлы глутамипэндопептидазы, соответствующие требованиям эуктурных исследований, и полученный набор дифракционных

отражений являются основой для определения структуры данного бел] при высоком разрешении.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 6 рабе Список публикаций приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, четырех гла выводов, списка цитируемой литературы. Она изложена на 159 страница содержит 25 рисунков и 10 таблиц.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались 1 Всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилисси 1990), на X конгрессе международного Союза Кристаллографов (Бордо 1990), на V VI международных конференциях по росту кристаллов биологическ! макромолекул (Сан-Диего 1991, Хиросима 1995), на II советско-испанскс симпозиуме по физике и свойствам кристаллов (Москва 1992), на 3 международной конференции по росту кристаллов (Голландия 1995), I конференции по химии протеолитических ферментов (Москва 1997), на съезде Биохимического общества РАН (Москва 1997).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ. Во введении обоснована актуальность тем исследования, содержится постановка задачи и краткое изложен! диссертационной работы.

ГЛАВА Л КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ (литературный обзор).

В обзоре изложены основные принципы и методы кристаллизацг и успехи, достигнутые в этой области. Специфика кристаллизации белке в значительной степени связана с особой природой самого объект Высокие молекулярные веса, ограниченная стабильность, сложный состг сред для растворения, склонность к агрегации и денатурации, доступное" в малых количествах, длительное время роста кристаллов затрудняк поиск условий кристаллизации белка.

Для белков, предназначенных для кристаллизации, важно не лысо отсутствие примесей, но и целостность полипептидной цепи и 'нформационная гомогенность /1/. Поэтому получение кристаллов для нтгеновского эксперимента требует высокого уровня чистоты белкового епарата. Методики очистки варьируются, исходя из особенностей ойств конкретного белка /2/. Гомогенность препарата контролируется алитическими методами /3/. Работе по кристаллизации предшествует кже изучение растворимости белка, т.е. установление фазовых состояний лка при определенных параметрах системы /4/. Кристаллизация чинается после достижения белковым раствором пересыщенного стояния.

Все используемые в настоящее время методы кристаллизации нованы на медленном достижении минимума растворимости белка. >иск условий кристаллизации осуществляют, варьируя такие параметры, к концентрация белка, величина ионной силы и природа ионов, природа фера и значение рН, температура, содержание низкомолекулярных бавок и органических растворителей. Введение детергентов в исталлизационные пробы препятствует спонтанной агрегации кромолекул и делает возможным получение кристаллов мембранных лков 151. Сравнительно недавно разработанные методы кристаллизации лков на подложке, в геле, в центрифуге и в невесомости позволяют лучать высокоупорядоченные кристаллы, обладающие высокими фракционными свойствами. В тех случаях, когда не удается спроизвести условия кристаллизации или получить крупные кристаллы, езвычайно ценным и результативным оказалось использование метода есения затравок /6/. В последнее время широкое применение находит тод криокристаллографии макромолекул /7/, позволяющий снизить циационное разрушение кристаллов, расширить их дифракционное поле, также провести полное рентгенографическое исследование тонких и больших по размеру кристаллов. Процесс получения монокристаллов лков можно облегчить и ускорить за счет автоматизации приготовления

и внесения растворов осадителей в белковые пробы. При этом повышае точность и воспроизводимость результатов.

ГЛАВА 2, ИССЛЕДОВАНИЕ р-ГЛЮКОЗИДАЗЫ Bacillus circuit var Alkalophilus.

р-Глюкозидаза (молекулярная масса 50 Кда) относится к кла( гидролаз и принадлежит к группе ферментов, гвдролизующих арил глюкозиды и олигосахариды. Предпочтительными субстратами глюкозидазы являются нитрофенил-Р-глюкозиды, целлобиоза и лактс Р-Глюкозидаза из алкалофильного штамма бактерий Bacillus circulons i Alkalophilus с оптимумом активности при щелочных значениях рН (6.0-9 была выделена и очищена /8/.

Рис. 1. Кристаллы р-глюкозидазы, выращенные при добавлении 3% МЩ резервуарный раствор.

Кристаллы фермента, пригодные для рентгеноструктурнс анализа, получены методом диффузии паров растворителя при комната температуре из растворов, содержащих 0.5-1.0 % белка и 12-15 сульфата аммония в 20 мМ калий фосфатном буфере, рН 7.0. В качестве

¡зервуарных растворов использовали 28-32 %-ный сульфат аммония с рН 0-6.3, содержащий 1.5-3.0 % МПД. Добавление МПД только в ¡зервуарный раствор оказалось необходимым и достаточным условием 5разования хорошо ограненных тетрагональных бипирамидальных эисталлов размером 0.5-0.8 мм (Рис.1). Установлено, что принципиальным 1Я получения упорядоченных кристаллов является и значение рН :зервуарного раствора, которое должно быть на 0.5-0.7 единиц рН ниже, :м величина рН белкового раствора.

Полученные кристаллы принадлежали к пространственной группе 122 и имели следующие параметры элементарной ячейки: а=Ь=241.6 А; =121.3 А. Они давали разрешение до 2.7 А, но имели высокую эзаичность (0.9°), препятствующую их дальнейшему рентгеновскому ¡следованию.

Чтобы улучшить качество кристаллов р-глюкозидазы, шсталлизацию проводили в описанных выше условиях в присутствии в Яковом растворе ряда низкомолекулярных добавок, которые могут влиять I степень совершенства кристаллов. В качестве таких соединений ¡пользовали МПД, спермин, глюкозу, ПЭГ 400, диоксан, тритон Х-100. роведенные эксперименты показали, что в большинстве исследованных [учаев (кристаллизация в присутствии глюкозы, спермина, диоксана, •итона Х-100) введение в белковый раствор низкомолекулярных добавок еличивает упорядоченность кристаллов, расширяя их дифракционное те. Добавление в раствор для кристаллизации тритона приводило к менению габитуса кристаллов. Введение в каплю 3% МПД снижало, хотя незначительно, степень мозаичности.

По-видимому, механизм влияния таких добавок, как МПД, тритон -100 и диоксан, на формирование кристаллов одинаков. Экранируя дрофобные участки на поверхности глобулы, эти амфифильные единения способствуют более регулярной упаковке белковых молекул.

Одновременно повышается растворимость белка в условиях эксперимента, в результате чего уменьшается число зародышей в единице объема и увеличивается размер кристаллов.

Возрастание степени упорядоченности кристаллической решетки наблюдали при введении глюкозы и спермина. Спермин, содержащий в своем составе, кроме гидрофобной цепи, две заряженные аминогруппы, вероятно, изменяет распределение зарядов на поверхности белковой глобулы. Глюкоза, являясь продуктом реакции, катализируемой Р-глюкозвдазой, может избирательно связываться в активном центре и стабилизировать конформацию фермента, тем самым способствуя упорядочению кристаллической решетки.

Скорости роста кристаллов Р-глюкозидазы изучали в буферах различной природы при одном и том же значение рН (Рис.2), при различных значениях рН (Рис.3), а также в присутствии добавок МПД, глюкозы и спермина (Рис.4,5). По оси ординат на рисунках 2-5 - размер кристалла. Одно деление на оси ординат - 0.11 мм. Скорость роста оценивали, измеряя через определенные промежутки времени наибольший линейный размер кристалла в плоскости, перпендикулярной оси четвертого порядка. Оказалось, что скорость образования и роста кристаллов зависит главным образом от значения рН, при котором ведется кристаллизация. Уменьшение величины рН увеличивало скорость роста кристаллов р-глюкозидазы. Введение добавок не оказывало на нее существенного влияния.

Эксперименты по кристаллизации р-глюкозидазы показывают перспективность применения низкомсшекулярных добавок для изменения кристаллографических характеристик белковых кристаллов и регулирования числа зародышей. Перечисленные выше низкомолекулярные соединения можно использовать, чтобы повысить разрешение или изменить габитус кристаллов

I, от га.

2 - /

онед.

2 4 6 8 10 12 14 16

и суки

с. 2. Скорость роста кристаллов -люкозидазы при рН 7.0: 1-20 мМ ЭРЯ-буфер, 2 - 20 мМ К-фосфатный фер.

Лсужи

;с, 4. Влияние низкомолекулярных 5авок на скорость роста кристаллов глюкозидазы (20 мМ МЕБ-буфер, [ 6.0): 1 - добавка 5 мМ спермина, ■ добавка 10 мМ глюкозы, 3 - добавка з МПД, 4 - без добавок.

I I I I I I I 1,1 I I I I I I 2 4 6 8 10 12 14

и суток

Рис. 3. Скорость роста кристаллов р-глюкозидазы при различных значениях рН: 1 - 20 мМ К-фосфатный буфер, рН 7.0, 2 - 20 мМ МЕБ-буфер, рН 6.0.

4 от©

Рис. 5. Скорость роста кристаллов Р-глюкозидазы с добавкой 10 мМ глюкозы: 1 - 20 мМ МОР5-буфер, рН 7.0, 2 - 20 мМ МЕ5-буфер, рН 6.0.

ГЛАВА 2, ИССЛЕДОВАНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ Serratia marcescens.

Нуклеаза Serratia marcescens катализирует расщепление 3' фосфодиэфирных связей одно-, и двухцепочечных ДНК и РНК с образованием moho-, ди-, три- и тетра- 5'-монофосфат-нуклеотидов. При этом не обнаруживается предпочтения к какому-либо основанию. Молекула белка является димером, состоящим из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 30 кДа. Каждая полипептидная цепь содержит 245 аминокислотных остатков 191. Наибольшая активность фермента наблюдается при значениях pH 8.0 - 8.5 /10/ в присутствии ионов Mg2+ при молярном отношении Mg/фосфор субстрата, равном 3:1.

Энзиматически гомогенный препарат эндонуклеазы выделяли из фильтрата культуральной среды Serraría marcescens штамма BIO Ml с использованием двухстадийной процедуры очистки, включающей лигандобменную хроматографию на хелатном сорбенте на основе органического носителя TSK-Gel Toyopearl HW-55, содержащего в качестве лигацда остатки иминодиуксусной кислоты в комплексе с ионами Си2+, и ионобменную хроматографию на фосфоцеллюлозе /11/. По данными электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS белок был локализован в одной четко очерченной зоне (Рис. 6-2), что свидетельствовало о его гомогенности. Однако, данные электрофореза в неденатурирующих условиях (без SDS) показали наличие двух белковых полос примерно равной интенсивности (Рис. 6-3). При изоэлектрофокусировании также обнаружили в препарате две энзиматически активные белковые компоненты с pi 7,1 и 6.7. Анализ N-концевых аминокислотных остатков дансильным методом показал наличие остатков Glu и Asp, что также свидетельствовало о структурной гетерогенности исходной нуклеазы и о необходимости доработки методики очистки. Дополнительная стадия очистки на DEAE-Toyopearl позволила выделить 3 изоформы эндонуклеазы с отличающимися N-концевыми

следовательностями: эндонуклеазы Бпц, 8т2 и Бт^. Единственным пичием между полным ферментом {Бт^) и другими двумя изоформами и 5>пз) была гетерогенность Ы-концевого участка, в котором гутствовали три или одна аминокислота соответственно. Различие в поении Ы-концевых фрагментов объясняет появление двух основных эформ фермента, различающихся соответствующими

оматографическими свойствами и значениями изоэлектрических точек.

[с. 6. Электрофорез в полиакриламвдном геле в присутствии БОБ (1-2), з БОв (3-5): 1 - белковые маркеры; 2,3 - препарат после хроматографии фосфоцеллюлозе; 4 - эцдонуклеаза 5 - эндонуклеаза 8т\

Для экспериментов по кристаллизации использовали изоформу И. Кристаллы эидонуклеазы получали методом диффузии паров створителя в "висячей" и "лежачей" капле, а также диализом через лупроницаемую мембрану в микродиализных трубочках. Наибольшие по змеру и лучшие по качеству кристаллы, пригодные для нтгеноструктурного исследования, получали, когда к раствору белка с нцентрацией 10 мг/мл в 10 мМ ТШв-НО буфере, рН 8.3, содержащем 5 И сульфата магния, добавляли 4 М водный раствор сульфата аммония с [ 7.0 до концентрации 8-20 % (об.). Насыщающий раствор содержал

сульфат аммония в концентрации 28-40% (об.). Кристаллизация проводилась при температуре 4°С. В кристаллизационных пробах одновременно присутствовали кристаллы двух форм: удлиненные (1:4) призмы и ромбические призмы, преимущественно образующиеся при добавлении к раствору белка диоксана до конечной концентрации 3 %. Кристаллы появлялись в течение 2 недель, а их рост продолжался 1.5-2 месяца. Обе формы кристаллов размером 0.7 х 0.3 х 0.2 мм (призматические) и 0.4 х 0.4 х 0.2 мм (ромбические призмы) были пригодны доя рентгеноструктурного исследования (Рис. 7а,б).

Третья форма кристаллов была получена в аналогичных условиях, но при более высоком значении рН белкового раствора. Кристаллизация проводилась в ТЫБ-НО буфере, рН 9.1 методом диффузии паров в лежачей капле. Концентрация белка составляла 6-10 мг/мл. В качестве осадителя использовали сульфат аммония с концентрацией 28 - 32%. Полученные кристаллы в форме шестиугольных пластин (Рис. 7в) имели толщину порядка 0.05 - 0.08 мм и оказались непригодными для рентгеновского исследования.

Рис. 7. Кристаллы эндонуклеазы Зт 1: а - удлиненные призмы, б -ромбические призмы, в - гексагональные пластины

Для рентгеновского эксперимента использовали кристаллы в виде эямоугольных призм, устойчивые к воздействию рентгеновского щучения (интенсивности контрольных отражений уменьшались на 10% в ;чение 3-х суток). Дифракционные отражения на рентгенограммах от мученных кристаллов наблюдались до углов, соответствующих 1нимальным межплоскостным расстояниям, равным 1.6 Ä.

По прецессионным рентгенограммам определена симметрия металлов. На дифрактометре Syntex P2i уточнены параметры [ементарной ячейки. Кристаллы эндонуклеазы принадлежат к >торомбической пространственной группе P2i2j2 с параметрами [ементарной ячейки а=106.7, Ь=74.8, с=69.0 А. Плотность упаковки фактеризуется значением параметра Метьюза, равным 2.3 А3/Да, что »ответствует двум молекулам белка в независимой части кристаллической [ейки.

Изоморфные тяжелоатомные производные эндонуклеазы Sm\ стучены путем настаивания кристаллов нативного белка в растворах 0.5 М K2Pt(SCN)4 и 1.0 mM U02(Ac)2.

Набор интенсивностей рентгеновских дифракционных отражений * кристаллов нативного белка до разрешения 1.7 А собран на пучке XII i накопительном кольце DORIS (EMBL, с/о DESY, Гамбург, Германия) с ¡пользованием детектора "Imaging Plate".

Атомную модель молекулы эндонуклеазы Sni] уточняли методом 1именьших квадратов с помощью программы PROLSQ /12/ из комплекса металлографических программ ССР4 /13/. При уточнении в качестве ;ходной атомной модели эндонуклеазы Sm\ использовали модель нуклеазы п 191. Стартовая модель, помимо 3694 неводородных атомов двух молекул ужа содержала 224 молекулы растворителя. Начальное значение -фактора в области разрешения от 10,0 Ä до 1,7 А составляло 25.6%.

Уточнение проводилось в 7 этапов. Каждый этап состоял из 20 циклов с последующей корректировкой и дополнением модели. Корректировка основывалась на анализе разностных синтезов Фурье с коэффициентами (2F0-FC, Фс) и (F0-Fc, фс), где F0, Fc - экспериментальные и рассчитанные модули структурных факторов, <рс>- фазы структурных факторов, рассчитанные по модели.

Окончательная модель молекулы эндонуклеазы Sm\ содержит 3720 неводородных атомов двух молекул белка и 451 молекулы воды. Среднеквадратичные отклонения длин и углов химических связей модели от идеальных равны 0.011 Â и 1.9° соответственно. Окончательный R-фактор в области разрешения от 10.0 Â до 1.7 Â равен 16.6 %.

Элементы вторичной структуры в молекуле эндонуклеазы Sm\ были определены на основе анализа системы водородных связей между атомами основной цепи. Топологические схемы укладки полипептидной цепи молекулы эндонуклеазы по данным работы /9/ и после проведенного уточнения представлены на Рис. 8а,Ь. В части цепи, образующей верхний слой молекулы (участок от Asp49 до Arg 136) и участвующей в связывании субстрата, обнаружены изменения. Изменения имеются также в С-концевом субдомене (участок от А1а196 до Gly242), принимающим участие в образовании функционально активного димера.

ГЛАВА ± ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛУТАМИЛ-ЭНДОПЕПТИДАЗЫ

Bacillus intermedius.

Глутамил-эндопептидазы (Glu, Asp- специфичные протеиназы) относятся к группе сериновых протеиназ и гидролизуют пептидные связи дикарбоновых аминокислот.

Несмотря на многочисленные попытки закристаллизовать ферменты данного класса, до сих пор только для одной из Glu-, Asp-специфичных глутамил-эндопептидаз (Si. griseus) были получены

Рис. 8. Топологические схемы хода полипептидной цепи в молекуле эвдонуклеазы Sm: а. - по результатам равоты /9/, Ь. - после проведенного уточнения.

кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного исследования /14/. Поэтому задача приготовления кристаллов Glu, Asp- специфичных протеиназ остается актуальной. Опыты по кристаллизации глутамил-эндопептидазы Bacillus intermedius проводили методом диффузии паров растворителя в варианте висячей капли в диапазоне pH от 3.8 до 7.5 при

концентрации белка 10 мг/мл при комнатной температуре и при 4°С. Наилучшие кристаллы были получены, когда кристаллизационную каплю объемом 5 мкл, содержащую протеиназу в концентрации 9 мг/мл, 0.5 М калий-фосфатный буфер, рН 7.0 и 3% МПД, уравновешивали против 1.2 -1.3 М калий-фосфатного буфера, рН 7.0, не содержащего МПД. Поскольку размер полученных кристаллов оказался недостаточным для проведения их рентгеновского исследования (порядка 0.1-0.15 мм в наибольшем измерении), была использована кристаллизация с внесением затравок.

Затравочные кристаллы вносили в капли, содержащие белок и осадитель, концентрации которых были предварительно подобраны таким образом, чтобы внесение затравок не приводило к спонтанному образованию новых зародышей. Был приготовлен раствор с концентрацией белка 0.6% и концентрацией фосфата калия 0.5 М. Этот раствор помещали на силиконированные стекла в виде капель объемом 15 - 20 мкл и в течение 3-4 дней уравновешивали против 1.2 М фосфата калия, рН 7.0.

С помощью петель размером 0.15 - 0.2 мм, которые обычно используют для замораживания кристаллов при проведнии криосъемки, в каждую заранее уравновешенную против раствора осрдителя каплю переносили от двух до пяти кристаллов.

Через 2-4 дня после внесения затравок вырастали кристаллы в виде призм размером 0.25-0.3 х 0.15-0.2 х 0.07-0.15 мм (Рис. 9). Эти кристаллы использовались для рентгеноструктурного исследования.

Кристаллы глутамил-эндопептидазы принадлежали к пространственной группе С2 и имели следующие параметры элементарной ячейки: а=61.61; Ь=56.11; с=60.60; 3=117.57°. Поле дифракции рентгеновских лучей достигало углов, соответствующих разрешению 2.2 А.

Получен набор интенсивностей рентгеновских дифракционных отражений от кристаллов нативной глутамил-эндопептидазы Bacillus intermedius при разрешении 1.68 А на пучке синхротронного излучения (EMBL, Гамбург). Набор включает 20715 отражений, его полнота составляет 99.8 %, R(I)merge - 3.7. Недавно установлена аминокислотная последовательность фермента, что позволяет продолжить исследование, применяя для решения структуры глутамил-эндопептидазы Bacillus intermedius метод молекулярного замещения. Его применение, однако, затруднено из-за недостаточной гомологии аминокислотной последовательности данного фермента с первичными структурами других ферментов этой группы. Ведется поиск тяжелоатомных производных глутамил-эндопептидазы, необходимых для определения пространственной структуры белка методом изоморфных замещений.

Рис. 9. Кристалл глутамил-эндопептидазы В. intermedius, полученный методом внесения затравок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Найдены условия получения кристаллов р-глюкозидазы Bacillus circulons var Alkalophilus, пригодных для рентгеноструктурного исследования. Определена их пространственная группа и параметры элементарной ячейки.

2. Исследовано влияние низкомолекулярных добавок и изменение рН белкового раствора на упорядоченность кристаллов р-глюкозидазы и их габитус. Показано, что введение добавок расширяет дифракционное поле кристаллов и снижает их мозаичность.

3. Изучена зависимость скорости роста кристаллов р-глюкозидазы от природы буфера, значения рН белкового раствора и присутствия низкомолекулярных добавок. Показано, что скорость роста кристаллов определяется главным образом значением рН, при котором ведется кристаллизация.

4. Выделены три изоформы эндонуклазы Serratia marcescens, разработана методика выращивания кристаллов эндонуклеазы, пригодных для рентгеноструктурного исследования. Для одного из изоферментов получены три различные формы кристаллов и две кристаллических тяжелоатомных производных. Определена их пространственная группа и параметры элементарной ячейки.

5. Получены наборы интенсивностей дифракционных отражений для кристаллов нативной эндонуклеазы при разрешении 1.7 À и двух тяжелоатомных производных при разрешении 5.2 и 4.5 Â.

6. На основании проведенного уточнения атомной модели эндонуклеазы при разрешении 1.7 À найдены изменения топологической схемы укладки полипептидной цепи молекулы, более достоверно определены элементы вторичной структуры в молекуле данного белка.

7. Методом внесения затравок получены кристаллы глутамил-эндопептидазы Bacillus intermedius, пригодные для рентгеноструктурного исследования. Определена их пространственная группа, параметры

элементарной ячейки и получен набор интенсивностей дифракционных отражений для кристаллов нативного белка при разрешении 1.68 А.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ

РАБОТАХ:

1. Благова Е.В., Куранова И.П., Паавилайнен С., Корпела Т. Влияние низкомолекулярных добавок на кристаллизацию ß-глюкозидазы Bacillus circulans vor Alkalophilus. Кристаллография, 1996, 41, N5, 948-953.

2. Blagova E.V., Morgunova E.Yu., Bannikova G.E., Dementiev A.A., Mikchailov A.M., Shlyapnikov S.V., Varlamov V.P., Vainshtein B.K. Crystallization and preliminary X-ray investigation of the Serratia marcescens nuclease. Butll. Soc. Cat. Sei., 1992, 13, N1, 383-392.

3. Bannikova G.E., Blagova E.V., Dementiev A.A., Morgunova E.Yu., Mikchailov A.M., Shlyapnikov S.V., Varlamov V.P., Vainshtein B.K. Two isoforms of Serratia marcescens nuclease. Crystallization and preliminary X-ray investigation of the enzyme. Biochem. Int., 1991, 24, N5, 813-822.

Банникова Г.Е., Благова E.B., Дементьев A.A., Моргунова Е.Ю., Михайлов A.M., Шляпников С.В.6 Варламов В.П., Вайнштейн Б.К. Разделение изоформ и кристаллизация эндонуклеазы Serratia marcescens. Биоорг. химия, 1990, 16, N12, 1678-1682 5. Lunin V.Yu., Levdikov V.M., Shlyapnikov S.V., Blagova E.V., Lunin V.V., Mikhailov A.M. Three-dimensional structure of Serratia marcescens nuclease at 1.7 A resolution and mechanism of its action. FEBS Lett., 1997, 412, 217-222. 3. Лещинская И.Б., Шакиров E.B., Ицкович Е.Л., Балабан Н.П., Марданова A.M., Шарипова М.Р., Благова Е.В., Левдиков В.М., Куранова И.П., Руденская Г.Н., Степанов В.М. Глутамил-эндопептидаза Bacillus intermedins 3-19. Выделение , свойства,

кристаллизация. Биоорг. химия, 1997..........

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ I. McPherson A. Preparation and analysis of protein crystals. J. Wiley, N.Y., 1982.

!. Scopes R,K. Protein purification: principles and practice, 2nd ed. Springer Verlag, Berlin, N.Y., 1987.

3. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. "Наука", М., 1983.

4. Schein С.Н. Solubility as a function of protein structure and solvent components. Biotechnology, 1990, 8, 308-317.

5. Garavito R.M., Markovic-Housley Z., Jenkins J. The growth and characterization of membrane protein crystals. J. Crystal Growth, 1986, 76, N 1-3, 701-709.

6. Stura E.A., Wilson I.A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J. Crystal Growth, 1991, 110, 270-282.

7. Watenpaugh K.D. Macromolecular crystallography at cryogenic temperatures. Curr. Op. Struct. Biol., 1991, 1, 1012-1015.

8. Paavilainen S., Hellman J., Korpela T. Purification, characterization, gene cloning and sequencing of a new (3-glucosidase from Bacillus circulans subsp. alkalophilus. Appl. Env. Microbiol., 1993, 59, N3, 927-932.

9. Miller M.D., Tanner J., Alpaugh M., Benedik M.J., Krause K.L. 2.1 A structure of Serratia endonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA. Nature Struct. Biol., 1994, 1, 461-468.

10. Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Егорова Г.С., Таняшин В.И., Третьяк Т.М. Получение и характеристика высокоочищенного препарата нухлеазы Serratia marcescetis. Биохимия, 1974, 39, вып.1, 116-122.

11. Филимонова М.Н., Дементьев А.А., Лещинская И.Б., Бакулина Г,Ю., Шляпников С.В. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens. Биохимия, 1991, 56, 508-512.

12. Konnert, J.H. & Hendrickson, W.A. A restrained-parameter thermal-factor refinement procedure. Acta Crystallogr., 1980, 36, 344-350.

13. CCP4 - Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr., 1994, 50, 760-763.

14. Nienaber V.L., Breddam K., Birktoft J.J. A glutamic acid specific serine protease utilizes a novel histidine triade in substrate binding. Biochemistry, 1993, 32, N43, 11469-11475.