Применение методов теоретической химии для изучения механизма действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 и выбора среды проведения ферментативной реакции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

005055528

на правах рукописи

Халиуллин Ильяс Галиевич

Применение методов теоретической химии для изучения механизма действия О-аминопеитидазы из ОсЬгоЬас1гиш апШгорц апуриновой/апиримиднновой эндонуклеазы человека 1 н выбора среды проведения ферментативной реакции

02.00.15 - кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва 2012

005055528

Работа выполнена в отделе биокинетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Швядас Витаутас-Юозапас Каятоно

Официальные оппоненты:

заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Института молекулярной биологии имени В.А. Энгсльгардта РАН

доктор химических наук, профессор Михайлов Сергей Николаевич

профессор Кафедры биоинженерии Биологического факультета МГУ

доктор физико-математических наук Шайтан Константин Вольдемарович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится «//» декабря 2012 года в 15.00 на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, сгр.11, кафедра химической этимологии Химического факультета МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «09» ноября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.х.н

И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Целенаправленное изменение каталитических свойств ферментов, дизайн новых ингибиторов ферментов и условий проведения ферментативных реакций представляют собой важные и сложные задачи как с точки зрения фундаментальной, так и прикладной науки. Сегодня очевидно, что решение проблем такого уровня сложности не может быть основано на чрезвычайно трудоемких эмпирических подходах и требует рационального использования достижений современной теоретической химии, которые становятся все более доступными с развитием высокоприозводительных вычислительных методов. Таким образом, рациональный дизайн ферментов с заданными свойствами, создание новых лекарственных препаратов, оптимизация биотехнологий представляют собой комплексное наукоемкое направление, чрезвычайно актуальное в настоящее время.

Цели и задачи исследования

В настоящей работе была поставлена задача исследовать возможности применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Необходимо было изучить механизм реакций, катализируемых D-аминопептидазой из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека 1 (АРЕ1), использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и его ингибиторов была предпринята попытка in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в нетрадиционных (органических) средах.

Научная новизна работы

В результате выполнения работы предложен согласованный механизм действия АРЕ1 с описанием и распределением ролей аминокислотных остатков активного центра в каталитическом механизме. Установлен основной принцип механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков, в том числе D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, который заключается в формировании необычной конфигурации каталитической триады. При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты DAP с расширенной субстратной специфичностью. Мутантные формы фермента получены и протестированы, показана их каталитическая активность по отношению к производным D-лейцина и D-фенилаланина. Выявлен аминокислотный остаток, определяющий высокую стереоселективность действия D-аминопептидазы.

Разработан и валидирован алгоритм выбора среды проведения биокаталитических реакции, выход в которых ограничен термодинамическим равновесием в растворе.

Практическая значимость работы

С использованием методов теоретической химии создана мутантная форма О-аминопептидазы из ОсИгоЬас1гит аШЬгорг с расширенной субстратной специфичностью. Сформированное представление о механизме действия АРЕ1 позволило провести эффективный виртуальный скрининг новых ингибиторов фермента - лидерных соединений на пути создания лекарственных средств для онкологических заболеваний. Выявленный механизм действия О-аминопептидазы важен для понимания особенностей механизма действия других ферментов семейства пенициллин-связывающих белков, в частности, транспептидаз, ответственных за синтез клеточной стенки бактерий, и бета-лактамаз, обеспечивающих резистентность бактерий к действию бета-лактамных антибиотиков, при поиске более эффективных бета-лактамных антибиотиков. Разработанный алгоритм оптимизации условий проведения биокаталитических реакций (выбора наилучшего растворителя) позволяет проводить оптимизацию среды проведения биокаталитических превращений с целью увеличения выхода целевого продукта.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были представлены на следующих международных научных конференциях, посвященных биокатализу и биотрансформациям: «Биокатализ в нетрадиционных средах» (2008 г., Москва, Россия), «Биокат 2010» (2010 г., Гамбург, Германия), «Ломоносов-2010», (2010 г., Москва), «Биотранс 2011» (2011 г., Джиардини Наксос, Италия).

Публикации

По материалам диссертации подготовлены и опубликованы 3 статьи в рецензируемых научных журналах, 4 тезисов докладов международных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих разделов: «Список сокращений», «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Основные результаты и выводы», «Список использованной литературы». Объем диссертации составляет 92 страницы машинописного текста и включает 33 рисунка, 8 таблиц и 101 библиографическую ссылку.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека

Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра

По результатам расчета ионизационных состояний остатков активного центра установлено, что в условиях оптимума протекания реакции гидролиза фосфоэфирной связи (рН 7-8) остаток His309 находится в протонированной форме (расчетное значение рКа равное 8,6 совпадает со значением рК2 экспериментально определенного рН-профиля активности фермента), а остаток Asp210 - в депротонированной (расчетное значение рКа равное 6,2 близко к значению рК[ рН-профиля активности фермента 6,6). Таким образом, можно заключить, что функцию общего основания при катализе выполняет депротонированный отрицательно заряженный остаток Asp210, в то время как положительно заряженный в условиях оптимума реакции остаток His309 участвует в связывании отрицательно заряженной фосфатной группы субстрата и стабилизации переходного состояния.

Связывание субстрата в активном центре фермента

Стартовая сольватированная модель фермент-субстратного комплекса АРЕ1 была создана на основе кристаллографических структур 1DE8 и 1DE9 из банка данных PDB. Оптимизация позиций атомов модели (прежде всего, координат добавленных атомов водорода) была проведена путем двухстадийной минимизации энергии системы. На первой стадии проводили молекулярно-механическую минимизацию с целью удаления наибольших напряжений в системе. На второй стадии осуществляли более тонкую настройку структуры активного центра при помощи гибридной КМ/ММ минимизации энергии с использованием гамильтониана RM1. Стабильность полученной структуры была подтверждена в результате молекулярно-динамической симуляции продолжительностью 1000 пс.

Анализ полученной модели показывает, что связывание субстрата в активном центре апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы сопровождается образованием большого количества связей и взаимодействий различной природы. Среди них следует выделить гидрофобные взаимодействия дезоксирибозы АР-сайта в гидрофобном кармане, образованном остатками Leu282, Phe266 и Тгр280. Свободная гидроксильная группа дезоксирибозы АР-сайта также образует водородную связь с карбонильной группой основной цепи А1а230. Фосфатная группа, расположенная на З'-конце АР-сайта, удерживается положительным зарядом остатка Argl77. Атакуемая фосфатная группа электростатически взаимодействует с ионом магния и образует водородные связи с боковыми радикалами остатков Asnl74, Asn212 и His309. Гидроксильная группа остатка Туг171 направлена в сторону 5'-атома кислорода уходящей группы.

Ориентация атакующей молекулы воды обеспечивается взаимодействием с общим основанием Азр210, карбонильной группой остатка АэгйП и боковым радикалом остатка ШвЗОЭ. Реакционноспособная конформация карбоксильной группы общего основания А8р210 в ферменте поддерживается взаимодействием бокового радикала с аминогруппой основной цепи остатка Азп212 (Рис. 1).

Каталитическое расщепление фосфодиэфирной связи: атака активированной молекулы воды

Ориентированная и поляризованная под действием зарядов остатков Азр210, ШбЗОЭ и иона металла молекула воды способна атаковать фосфатную группу субстрата, одновременно передавая протон общему основанию - остатку Азр210. Образующийся в результате атаки интермедиат в виде тригональной бипирамиды стабилизирован следующими взаимодействиями в активном центре фермента: атомы кислорода в «вершинах» бипирамиды участвуют в образовании водородных связей с боковыми радикалами остатков Н1э309 и Туг171; плоскость треугольника в «основании» бипирамиды расположена между остатками Азп174, Азп212 и ионом магния (Рис. 2).

Данные по мутагенезу Туг 171, приведенные в литературе, указывают на критическую роль этого остатка в механизме действия АРЕ1, однако, в отличие от ранее сделанных предположений, мы предполагаем другую роль Туг171 в катализе. Близкое расположение положительных зарядов иона магния и остатка А^156 должно способствовать облегченному отрыву протона от гидроксильной группы Туг 171, поэтому мы рассматриваем данный остаток в качестве потенциального донора протона для уходящей группы, являющейся сильным основанием. Менее значительное влияние мутаций по положению 171 на связывание субстрата по

Рис. 1. Активный центр в модели фермент-субстратного комплекса АРЕ1-ДНК. Стрелка указывает направление нуклеофшьной атаки.

сравнению с падением каталитической активности объясняется слабо выраженным взаимодействием остатка с субстратом на ранних стадиях реакции, предшествующих каталитическому акту, что полностью согласуется со сделанным предположением. В ходе каталитического превращения, по-видимому, происходит сближение уходящей группы с боковым радикалом остатка Туг171, что обеспечивает дополнительную стабилизацию интермедиата реакции, и передача протона на уходящую группу становится возможной.

При дальнейшем протекании реакции менее стабилизированная, находящаяся в плоскости основания и направленная в сторону остатка Азп212 связь Р-0 превращается в двойную Р=0. Одновременно с этим разрывается связь Р-О, направленная к остатку Туг171, и уходящая группа забирает протон у гидроксильной группы тирозина, оставляя оксианион, стабилизированный окружением, а именно близкорасположенными положительными зарядами остатков А^156 и иона магния (Рис. 2). Восстановление каталитически активного состояния активного центра (депротонирование общего основания Азр210 и протонирование остатка Туг171) происходит в результате взаимодействия с молекулами воды из внешней среды.

Анализ связывания субстрата и поиск механизмозависимых ингибиторов

В связывании субстрата и стабилизации переходного состояния в ходе реакции участвует множество зарядов и полярных групп, характер этих взаимодействий и ионогенное состояние аминокислотных остатков активного центра определяют требования к структуре соединений, способных связываться в активном центре АРЕ1. При конструировании эффективных ингибиторов фермента следует реализовать, по крайней мере, наиболее важные взаимодействия. Существование гидрофобного участка связывания наряду с множеством полярных и различно заряженных групп осложняет поиск низкомолекулярных соединений подходящей структуры.

Схематичное изображение строения и превращения интермедиата в виде тригоналыюй бипирамиды в реакции гидролиза, катализируемой АРЕ1.

Рис. 2.

Аминокислоты являются тем классом природных соединений, в структуре которых одновременно имеются заместители различной природы, способные осуществить гидрофобные, электростатические взаимодействия, выступить донором или акцептором водородных связей. Для выяснения особенностей взаимодействия фермента с потенциальными ингибиторами такого строения было проведено молекулярное моделирование связывания различных аминокислот (в том числе 6-гидрокси-ДОФА) и их производных в активном центре АРЕ1 с учетом ионизации как самого потенциального ингибитора, так и аминокислотных остатков активного центра фермента.

Анализ результатов молекулярного моделирования показывает, что наличие карбоксильной группы позволяет выбранным соединениям связываться с ионом металла и остатком №$309, в то время как гидрофобный заместитель, например фенильный радикал, может располагаться в гидрофобном кармане связывания дезоксирибозы (Рис. 3). Введение гидроксильных заместителей в фенильный радикал может приводить к образованию дополнительных водородных связей с полярными остатками активного центра фермента. Кроме того, одним из возможных факторов, определяющих эффективность ингибирования, является связывание ингибитора с заряженным остатком общего основания АэрИО.

В настоящее время продолжаются поиски эффективных ингибиторов апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, основанные на уточненных данных по участию остатков активного центра фермента в каталитическом процессе.

Рис. 3. Расположение субстрата (А) и потенциального ингибитора (Б) в активном центре полноатомной модели АРЕ1. Желтым цветом показаны остатки гидрофобного кармана: РИе266, Тгр280 и Ьеи282.

Механизм действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi

Анализ структуры D-аминопептидазы. Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра

Визуальный анализ структуры D-аминопептидазы (PDB ID 1EI5) выявляет пару близкорасположенных остатков Туг153 и Lys65 в окружении каталитического остатка Ser62 с примерно равным расстоянием от нуклеофильного атома Оу серина. При расчете ионизационных свойств аминокислотных остатков активного центра D-аминопептидазы было обнаружено значительно более низкое значение рКа остатка Lys65, равное 7.8, по сравнению с обычными значениями рКа остатков лизина в белках (10-11). Следует отметить также довольно высокое значение рКа, найденное для остатка Туг 153, равное 11.8.

Атомы азота и кислорода трех указанных остатков образуют почти равносторонний треугольник в пространстве активного центра (Рис. 4). Такое их расположение создает особую конфигурацию каталитической триады, в которой протон гидроксильной группы серина направлен внутрь треугольника и поделен между всеми тремя атомами. Возможность подобной организации триады обусловлена весьма необычными свойствами аминокислотного остатка Lys65, способного акцептировать протон в нейтральной и слабощелочной среде, обеспечивая высокую реакционную способность остатка Ser62.

Рис. 4. Стереоизображение активного центра Э-аминопептидазы, показывающее структурную организацию каталитической триады. Выделены остатки 8ег62, ЬуБбЗ, Тугі53, Азп155, Ніз287 и Аэр225.

Экспериментальное изучение рН-профиля активности О АР

Экспериментальные данные хорошо согласуются с результатами молекулярного моделирования и предполагаемой ролью остатка Ьув65 в функционировании каталитической триады. Исследование показало, что рН-профиль каталитической активности Б-аминопептидазы имеет стандартную колоколообразную форму со значениями рК| и рК2 равными 7.4 и 8.8 соответственно (Рис. 5). Значение 7.4 на основании результатов молекулярного моделирования ионизационных свойств было отнесено к остатку Ьувбб.

0,35-

г 0,25 -

£ —. -ї

I 0,2' =* 0,15 -

0,05

7,5

\

рН

8,5

Рис. 5. рН-профиль каталитической активности О-аминопептидазы. Расчетная кривая построена по уравнению V = \1/(1+[Н*]/К1+К2/[Н*]) со значениями у0, рК1 и рК.2 равными 0.53, 7.4 и 8.8, соответственно.

Описание механизма действия О-аминопептидазы

Как и в случае других сериновых гидролаз, реакция, катализируемая Б-аминопептидазой, протекает по трехстадийной схеме через стадии образования промежуточного ковалентного ацилфермента и последующего его гидролиза (или переноса ацильной части на внешний нуклеофил в реакциях ацильного переноса). Особенности организации каталитической триады фермента и низкое значение рКа остатка Ьуэбб, по-видимому, обуславливает следующую роль этого остатка в механизме реакций, катализируемых Э-аминопептидазой:

• Незаряженный в условиях рН-оптимума ферментативной реакции остаток Ьувбб, действуя в качестве общего основания при атаке Оу атома 8ег62 по

карбонильной группе субстрата, принимает протон с атакующей ОН-группы при образовании тетраэдрического интермедиата на стадии ацилирования.

• С разрушением тетраэдрического интермедиата и образованием ацилфермента уходящая группа принимает близко расположенный и образующий с ней водородную связь протон гидроксильной группы остатка Тут153, значение рКа которого понижается за счет близко расположенного положительного заряда остатка Ьу$65. Одновременно с этим получившийся нестабилизированный оксианион, будучи более сильным основанием, депротонирует остаток лизина.

• Процесс деацилирования каталитического остатка серина фермента протекает посредством активации молекулы воды (или другого внешнего нуклеофила) при совместном действии двух остатков ЬуБб5 и Туг153 и передачи протона «по цепочке» от нуклеофила к остатку Туг153, а от остатка Туг153 к Ьув65 с образованием второго тетраэдрического интермедиата.

• Одновременно с разрушением второго тетраэдрического интермедиата и последующим отрывом ацильной части субстрата (выделением второго продукта реакции) образующийся оксианион Бег62 депротонирует остаток ЬуБб5, и фермент приходит к первоначальному состоянию.

Следует отметить, что за время каталитического акта не происходит как таковой передачи протона. Он остается поделенным между остатками «каталитического треугольника». Именно это, на наш взгляд, и обеспечивает высокую активность О-аминопептидазы и других ферментов класса пенициллин-связывающих белков, для которых величины каталитических констант достигают тысяч сек"1.

Указанный механизм действия О-аминопептидазы хорошо согласуется с экспериментальными данными по мутагенезу, показавшими важность пары остатков Ьув65 и 8ег62 для осуществления катализа, а также с результатами и выводами, полученными в расчетных работах, где утверждается главенствующая роль консервативного остатка Туг153 на стадии деацилирования. Предложенный механизм может быть распространен и на родственный О-аминопептидазе фермент амидазу Б-аминокислот из ОскгоЪас\гит ап1кгор1 (ОАА), расчет ионизационных свойств остатков активного центра которого показывает, что величина рКа консервативного остатка ЬувбЗ (аналогичного Ьуз65 в О-аминопептидазе) также сильно понижено и равно 6.3. Падение активности фермента, связанное с протонированием общего основания при значениях рН ниже рКа, соответствует рН-профилю активности ОАА, представленному в литературных источниках.

Дизайн субстратной специфичности О-аминопептидазы

Бионнформатический анализ семейства белков, гомологичных О-аминопептидазе, молекулярное моделирование мутантных форм

Для сбора и анализа данных по семейству пенициллин-связывающих белков, включающего О-аминопептидазы, Б-амидазы аминокислот, щелочные О-пептидазы и бета-лактамазы классов А и С, был проведен поиск гомологов О-аминопептидазы из

11

Ochrobactrum anthropi по первичной и третичной структуре в банках данных белковых последовательностей UniProt и белковых структур PDB. Полученная в результате выборка из 734 гомологов по первичной структуре и 24 гомологов по третичной структуре была профильтрована и наиболее информативные последовательности отобраны для проведения множественного выравнивания по первичной и третичной структуре. Выравнивание трехмерных структур показало, что область активного центра D-аминопептидазы обладает достоверным сходством с D-амидазами аминокислот, щелочными D-пептидазами и бета-лакгамазами как на уровне аминокислотной последовательности, так и на уровне пространственной организации.

Определение групп-специфичных позиций в активных центрах пенициллин-связывающих белков проводилось с использованием программного обеспечения ZEBRA, ранее разработанного в нашей лаборатории. Следующие позиции в структуре D-аминопептидазы были определены как групп-специфичные: W114, W222, А226, С61, L291,1220, Т196, D225 (Рис. 6, нумерация по структуре 1EI5, остатки приведены в порядке уменьшения степени специфичности).

По каждой из позиций был составлен список рекомендуемых замен на аминокислотные остатки, наиболее часто встречающиеся в группах по специфичности. В соответствии со списком замен была сформирована библиотека структур мутантных форм О-аминопептидазы, всего 1981 структура. С учетом числа подготовленных лигандов (38 штук), количество пар «фермент-субстрат» для проведения докинга достигло 75278.

Рис. 6.

Выбранные для дизайна й-амино-пептидазы групп-специфичные позиции, варьирование которых обуславливает изменение функциональных свойств в семействе пенициллин-связывающих белков.

Виртуальный скрининг библиотеки мутантных ферментов, обоснование выбора позиций и замен для экспериментального получения

Из-за значительного количества возможных мутантных вариантов по групп-специфичным позициям для экспериментального получения и исследования свойств было решено рекомендовать мутантные формы D-аминопептидазы, содержащие не более трех замен. Основными мутациями явились замены пары остатков триптофана - 222 и 114, характеризующихся наибольшей степенью специфичности при биоинформатическом анализе ферментов семейства и перекрывающих значительный объем активного центра фермента в области связывания ацильной части субстрата. По результатам скрининга библиотеки мутантов, способных превращать ароматические субстраты, такие как амиды D-His, D-Phe и D-Tyr, высокую оценку получала замена W222H. Предпочтение остатка гистидина в позиции 222 может быть объяснено образованием стекингового взаимодействия бокового радикала гистидина с ароматическим кольцом субстрата. Для разветвленных алифатических субстратов мутация W222H также была предпочтительной наряду с W222V и W222T. Для остальных субстратов замена W222H также находилась среди лучших результатов скрининга. Таким образом, мутация W222H была отобрана, как наиболее эффективная с точки зрения расширения субстратной специфичности D-аминопептидазы.

Наиболее высоко оцененные по результатам скрининга мутанты с расширенной специфичностью либо не содержали замены по позиции 114, либо содержали замену W114L. Для гарантированного увеличения объема кармана субстратной специфичности было принято решение осуществить замену по позиции 114. Поскольку в структуре нативной D-аминопептидазы (DAP д.т.) боковой радикал остатка W114 участвует в образовании водородной связи с остатком D225, нарушение которой могло повлиять на активность или стабильность фермента, для тестирования была выбрана пара замен по 114 положению на рекомендованный лейцин и гистидин, напоминающий по своей структуре остаток триптофана. В последнем случае (замена W114H) сохраняется взаимодействие боковых радикалов остатков в позициях 114 и 225, тогда как в первом появляется возможность для дополнительных гидрофобных взаимодействий в активном центре фермента, что важно для субстратов с разветвленным алифатическим радикалом.

По результатам молекулярного моделирования предполагалось, что замена W222H будет приводить к улучшению связывания ароматических субстратов за счет образования стекингового взаимодействия развернутого бокового радикала остатка гистидина и фенильного кольца субстрата. Однако для обеспечения соответствующего разворота необходимо провести сопутствующую мутацию остатка в положении 220. Замена I220T, предсказанная в результате виртуального скрининга, способствует развороту кольца гистидина за счет образования дополнительной водородной связи между боковыми радикалами остатков Т220 и Н222 (Рис. 7). Дополнительно была протестирована возможность простого укорачивания бокового радикала 11е220 до Val (мутация I220V) без введения дополнительной водородной

Таким образом, для препаративного получения были выбраны следующие мутантные варианты D-аминопептидазы: одиночный W222H (DAP1), двойной W222H/W114L (DAP2), тройные W222H/W114171220V (DAP3V) с высокой гидрофобностью и W222H/W114H/I220T (DAP3T) с низкой гидрофобностью сайта связывания субстрата. Прогнозируемое расширение пространства кармана субстратной специфичности после введения трех мутаций показано на Рис. 8.

связи с сохранением гидрофобного остатка по положению 220, также способствующего развороту кольца гистидина.

Для уменьшения числа рекомендованных мутантов было решено объединить мутации, вводящие гидрофобные остатки в активный центр Б-аминопептидазы.

Рис. 7.

Моделирование взаимодействия ароматических колец субстрата и бокового радикала остатка His 222. Дополнительно выделен остаток Т220.

Рис. 8. Иллюстрация поверхности кармана субстратной специфичности О-аминопептидазы до (слева) и после введения мутаций (справа).

Результаты скрининга показывают, что одиночный мутант Trp222His способен успешно связывать субстраты D-MetNH2, D-CysNH2, D-LeuNH2, D-IleNH2, а также D-AsnNH2. Двойной мутант W222H/W222L способен связывать D-MetNH2, D-IleNH2, L-beta-PheNH2, D-ValNH2, D-HisNH2 и D-CysNH2. Наиболее эффективным предполагался тройной мутант по трем обнаруженным групп-специфичным позициям Trp222His, Тф114Leu, Ile220Val, способный по результатам проведенного in silico исследования связывать и гидролизовать D-PheNH2, D-IleNH2, D-CysNH2, D-ValNH2, D-AlaNH2 и L-P-PheNH2.

Экспериментальное исследование субстратной специфичности полученных мутантных форм D-аминопептидазы

По результатам спектрофотометрических исследований концентрация активных центров составила около 10"5 М для всех полученных образцов мутантных вариантов D-аминопептидазы. Экспериментальные значения кинетических констант, определенные в ходе исследования субстратной специфичности мутантных вариантов фермента приведены в Таблице 1.

Все исследованные мутанты D-аминопептидазы обладали активностью по отношению к специфическому субстрату фермента дикого типа - иа/гя-нитроанилиду D-аланина. Активность в отношении более объемного субстрата - иара-нитроанилида D-лейцина, проявлял только тройной мутант DAP3T. Рассчитанные значения Км и k,;at в данной паре «фермент-субстрат» составили, соответственно, 2,2 мМ и 22 сек"1. Оба тройных мутанта DAP3V и DAP3T были активны в отношении D-фенилаланинамида, однако ни один из исследуемых мутантных ферментов не был способен гидролизовать L-фенилаланинамид. Таким образом, введенные мутации позволили существенно расширить субстратную специфичность фермента и сохранить его высокую стереоспецифичность.

Таблица 1. Экспериментальные значения кинетических параметров гидролиза субстратов мутантными О-аминопептидазами с расширенной субстратной

специфичностью.

\ D-Ala-pNA D-Leu-pNA D-Phe-NH2

kcatj СЄК Км, шМ кса/Км, М^хсек"1 kcat» СЄК Км, mM kcat/KM> М_1хсек'' кса/Км, М"'хмин"'

DAP д.т. 620 0.6 1.0x10" - - - -

DAP3V 560 3.6 1.65x10і - - - 17

DAP3T 220 6.9 3.2x10" 22 2.2 1.0x10" 48

Кинетические эксперименты по гидролизу хромогенного субстрата 0-А1а-рИА в присутствии необратимого ингибитора сериновых протеаз фенилметил-сульфонилфторида (РМБР) показали связывание этого ингибитора в активном центре

тройного мутанта БАРЗТ (Рис. 9). В остальных случаях влияние РМЭР на кинетику реакции гидролиза специфичного цветного субстрата обнаружено не было.

О 10 20 30 40 50 60 70

Время, мин

Рис. 9. Интегральные кривые накопления продукта гидролиза пара-нитроанилида П-аланина мутантной формой О-аминопептидазы БАРЗТ в отсутствие (синий) и при наличии (красный) РБМР в реакционной смеси.

Таким образом, в результате рационального дизайна фермента с использованием методов теоретической химии удалось получить мутантные варианты Э-аминопептидазы с расширенной субстратной специфичностью, наиболее удачным из которых является тройной мутант БАРЗТ, содержащий замены \У222НЛУ114Н/1220Т.

Разработка метода виртуального скрининга наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций

Описание алгоритма

Рассмотрим стандартную равновесную реакцию: аА + ЬВ+>сС + (Юг

для которой термодинамическая константа равновесия, основанная на активностях, ас а'*

будет равна: Кл = ——(1). Данное значение не зависит от состава среды (включая

ал'ав

природу растворителя). Константа КЙг также может быть определена

как Kth = Kt • Kr (2), где Kx - отношение мольных долей реагентов в точке равновесия,

ус ■rd

а Ку равно: К = (3). Если имеется действительная предсказательная модель

Ул'Ув

для оценки коэффициентов активности для интересующей системы, становится возможным рассчитать значение Kth при любом заданном составе смеси. Ранее было показано, что метод COSMO-RS дает хорошие результаты при расчете реакционных систем ферментативных реакций, используемых в данной работе. При известном значении Kth для данной реакции можно предсказать значение Кх, а значит и выход реакции при практически любых условиях, влияющих на коэффициенты активности.

Если целью расчета является предсказание точки равновесия реакции ab initio, то есть без каких-либо экспериментальных данных, необходимы сложные полные вычисления энергий Гиббса стабильных состояний реагентов и продуктов. Разработанный алгоритм не является аЪ initio методом и основан на использовании экспериментально определенного значения Kth интересующей реакции. Это значение может быть рассчитано при помощи COSMO-RS из результатов измерений концентраций в точке равновесия для всех соединений при одном единственном составе реакционной смеси. Далее, используя полученное значение Kth, разработанный метод позволяет предсказать состояние равновесия в практически любых смесях, включая любой растворитель известной структуры и в системах без стороннего растворителя (с учетом того, что реакционная смесь гомогенная и находится в жидком состоянии, и когда, например, растворителем является вещество, вступающее в реакцию).

Метод представляет собой минимизацию энергии Гиббса и может быть описан следующими шагами:

1. Предварительная DFT-оптимизация структур, применение диэлектрического потенциала COSMO для каждого соединения реакционной смеси и растворителя-кандидата, включая анализ конформеров.

2. Расчет референсного значения Kth реакции из экспериментальных данных в точке равновесия в единственных условиях с использованием COSMO-RS для определения коэффициентов активности.

3. Начальная оценка концентраций субстратов и продуктов и, следовательно, значения Кх.

4. Расчет значения Ку средствами COSMOtherm.

5. Расчет текущего значения Kth и сравнение его с референсным значением, предварительно рассчитанным на шаге 2.

6. Изменение концентраций субстратов и продуктов в ту или иную сторону в зависимости от результатов, полученных на предыдущем шаге, расчет нового значения Кх.

7. Повторение шагов 4-6 до достижения порога сходимости значения Kth (выбирается пользователем, обычно составляет 5%).

Блок-схема алгоритма представлена на Рис. 10.

Расчет направления

смещения «равновесия»

Изменение концентраций, расчет Кх

Расчет коэффициентов активности в cosmo therm

г

Расчет э К начения h

Рис. 10.

Блок-схема разработанного алгоритма.

/ Вывод J результата

Референсное значение Kth также может быть получено с использованием разработанной программы. При указании нулевого значения порога сходимости программа производит расчет значение коэффициентов активности компонентов с указанными значениями концентраций и выводит в качестве результата искомое значение термодинамической константы, которое и используется при дальнейших расчетах.

Шаг 6 представляет собой простую линейную интерполяцию концентрации между текущим и одним из предыдущих значений методом деления отрезка пополам. Полученное значение концентрации используется на следующей итерации расчета. Направление интерполяции в сторону увеличения или уменьшения концентрации выбирается в зависимости от соотношения «текущего» и референсного значений Kth, при этом в качестве «предыдущих» сохраняются те значения концентраций, отрезок образованный которыми новое значение делит пополам (Рис. 11).

Алгоритм реализован на языке программирования Perl. Среднее время выполнения программы составляет 5 минут, за которое алгоритм совершает 6-8 итераций приближения. Это позволяет проводить выбор наилучшего растворителя для реакции в течение нескольких часов даже с учетом необходимой DFT-оптимизации структур реагентов. Для работы алгоритма требуются предварительно установленные в системе интерпретатор языка Perl версии 5.8.3 и выше и пакет программ COSMOtherm версии 2.1 и выше.

итерация п+1

/

итерация п

!

\

\ итерация п+2 ^^

Предыдущие значения

Рис. 11. Схема выбора нового значения концентрации на шаге 6 разработанного

алгоритма.

Валидация разработанного метода виртуального скрининга растворителя

Для оценки точности предсказаний с использованием разработанного алгоритма были использованы результаты экспериментальных исследований двух реакций, катализируемых липазами в органических средах: 1) эстерификация додекановой-1 (лауриновой) кислоты ментолом; 2) эстерификация лауриновой кислоты додеканолом-1. Ранее было показано, что СОвМО-Яв обеспечивает достаточную точность в расчетах коэффициентов активностей для данных систем.

Результаты расчетов и экспериментальные данные литературных источников обобщены в Таблицах 2 и 3. Наилучшее значение Кх с точки зрения выхода реакции выделено полужирным шрифтом. По результатам исследования видно, что хотя не всегда удается точно предсказать значение константы Кх, для выбора оптимального растворителя реакции зачастую достаточно результатов одного экспериментального исследования положения равновесия. Особую важность в этом случае приобретает точность полученных экспериментальных данных. Вычисления имеют некоторую тенденцию завышать по сравнению с остальными значение рассчитываемой константы для растворителя, предоставляющего референсное значение КШ. Это может быть связано с тем, что в этом случае итеративное приближение не проводится, так как в качестве входных данных задаются экспериментально полученные равновесные значения концентраций. Данный эффект может быть минимизирован при помощи уменьшения задаваемого порога сходимости, что приводит к увеличению числа итераций и более длительному расчету, а также чревато возможным достижением в процессе вычислений значения машинной точности чисел, при котором не будет обеспечен выход из бесконечного цикла.

Некоторая неопределенность в выборе наилучшего растворителя в случае со второй реакционной системой (Таблица 3) связана с относительно малым влиянием растворителя на выход в данной реакции (коэффициент вариации экспериментальных значений log Rx для четырех лучших растворителей менее 10%).

Исходный текст программы, реализующий разработанный алгоритм, приведен в приложениях к основному тексту диссертации.

Заключение

Выполнение диссертационной работы позволило получить важный опыт применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Изучение механизмов действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека 1 (АРЕ1) дало возможность использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и его ингибиторов был получен ценный опыт in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в органических средах. В целом выполненная работа показала плодотворность сочетания методов теоретической химии и экспериментального исследования при решении научных и прикладных задач.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

• Предложен согласованный механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, показано, что общим основанием при катализе является остаток Asp210, а донором протона для уходящей группы - остаток Туг171.

• Установлены основные принципы механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков и показано, что в случае D-аминопептидазы и амидазы D-аминокислот из Ochrobactrum anthropi общим основанием при катализе является остаток Lys65(63) с необычно низким значением рКа.

• При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, обладающие расширенной субстратной специфичностью; изменение каталитических свойств мутантных ферментов подтверждено экспериментально.

• На основе метода COSMO-RS разработан и реализован алгоритм виртуального скрининга растворителя, позволяющий провести выбор оптимальной среды для проведения биокаталитического превращения и достичь максимального выхода целевого продукта.

Таблица 2. Экспериментальные и предсказанные значения log Кх для реакции эстерификации лауриновой кислоты ментолом.

Растворитель в эксперименте Экспериментальное значение log Кх Референсное значение log К,ь Предсказанное значение log Кх для растворителя

Гептан Циклогексан 224-ТМП Толуол Ацетонитрил 2-Метилбуганол-2

Гептан 1.26 2.08 1.26 1.40 0.90 1.03 1.39 1.12

Циклогексан 1.41 2.24 1.02 1.41 0.87 1.02 1.38 1.10

224-ТМП* 1.23 2.04 1.03 1.40 1.23 1.03 1.39 1.12

Толуол 1.02 2.07 0.88 1.27 0.79 1.02 1.23 1.00

Ацетонитрил 0.52 2.04 0.45 0.64 0.43 0.43 0.52 0.43

2-Метилбутанол-2 0.63 2.04 0.53 0.66 0.47 0.52 0.46 0.63

Таблица 3. Экспериментальные и предсказанные значения log Кх для реакции эстерификации лауриновой кислоты додеканолом-1.

Растворитель в эксперименте Экспериментальное значение log Кх Референсное значение log Kth Предсказанное значение log Кх для растворителя

Гексан Гептан Циклогексан 224-ТМП Толуол

Гексан 1.63 2.18 1.63 1.46 1.42 1.46 1.36

Гептан 1.55 2.19 1.60 1.55 1.59 1.61 1.50

Циклогексан 1.38 2.00 1.42 1.44 1.38 1.43 1.31

224-ТМП 1.39 2.00 1.37 1.38 1.35 1.39 1.29

Толуол 1.18 2.05 1.66 1.68 1.64 0.88 1.18

*224-ТМП = 2,2,4-триметилпентан

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.Г. Халиуллин, Д.А. Суплатов, Д.Н. Шалаева, М. Оцука, Я. Асано, В.К. Швядас, «Биоинформатический анализ и молекулярное моделирование участия Lys65 в каталитической триаде D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi», Acta Naturae, 2010, т. 2, № 5, с. 70-74.

2. P. Braiuca, I. Khaliullin, V. Svedas, L. Knapic, M. Fermeglia, P. J. Hailing, and L. Gardossi, "BESSICC, a COSMO-RS based tool for in silico solvent screening of biocatalysed reactions," Biotechnology and Bioengineering, 2012, vol. 109, no. 7, pp. 1864-1868.

3. И.Г. Халиуллин, Д.К. Нилов, И.В. Шаповалова, В.К. Швядас, «Построение механистической полноатомной модели апуриновой / апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1 для виртуального скрининга новых ингибиторов», Acta Naturae, 2012, т. 4, № 13, с. 83-89.

4. I. Khaliullin, V. Svedas, P. Braiuca, L. Gardossi, "In silico solvent selection for biocatalysed reactions by COSMO-RS method," 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional media", Moscow, Russia, June 12-15, 2008.

5. I. Khaliullin, D. Suplatov, V. Svedas, Y. Asano, M. Otsuka, D. Shalaeva, "The Role of Lys65 Residue in the Catalytic Triad of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi Revealed by Bioinformatic Analysis and Molecular Modeling," Proc. 5th Internat. Congress on Biocatalysis Biocat2010, Hamburg, Germany, August 29 -September 2, 2010, p. 196.

6. Shalaeva D.N., Suplatov D.A., Khaliullin I.G., Svedas V.K., "Bioinformatics insight into structural determinants of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi substrate specificity to amino acid derivatives," Международная конференция «Ломоносов-2010», 2010, Москва.

7. I. Khaliullin, К. Tokunan, M. Himi, D. Suplatov, D. Shalaeva, Y. Asano, V. Svedas, "Bioinformatic analysis and molecular modeling to predict mutations widening substrate specificity of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi," Book of Abstracts, 10th International Symposium on biocatalysis, BioTrans-2011, Giardini Naxos, Italy, October 2-6, 2011, p. 149.

Подписано в печать 08.11.2012 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1607. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,0.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Пенициллин-связывающие белки. Б-аминопептидаза из ОсЬгоЬас^ит апШгор

1.1.1. Общие сведения.

1.1.2. Механизм действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков по данным литературных источников.

1.1.3. Мутагенетические исследования Э-аминопептидазы.

1.2. Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 человека.

1.2.1. Общие сведения.

1.2.2. Механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ1 по данным литературных источников.

1.3. Оптимизация условий проведения биокаталитических процессов в органических растворителях. Метод С08М0-118.

1.4. Методы теоритичсской химии, наиболее часто применяемые в энзимологии и биотехнологии.

1.4.1. Расстановка атомов водорода в кристаллографических структурах. Расчет состояний ионизации аминокислотных остатков.

1.4.2. Метод моделирования мутантных форм ферментов.

1.4.3. Метод молекулярной динамики.

1.4.4. Метод молекулярного докинга.

2. Постановка задачи.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Методы моделирования.

3.1.1. Общее программное обеспечение и средства, использованные при моделировании.

3.1.2. Моделирование структур мутантных форм ферментов.

3.1.3. Моделирование субстратной специфичности и механизма действия Э-аминопептидазы из ОсЬгоЬайгат апШгор!.

3.1.4. Моделирование структуры фермент-субстратного комплекса апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 (АРЕ1).

3.2. Материалы и методы экспериментального исследования.

3.2.1. Изучение рН-профиля активности О-аминопептидазы.

3.2.2. Изучение субстратной специфичности О-аминопептидазы и ее мутантов.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека АРЕ

4.1.1. Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра

4.1.2. Связывание субстрата в активном центре фермента.

4.1.3. Каталитическое расщепление фосфодиэфирной связи: атака активированной молекулы воды.

4.1.4. Анализ связывания субстрата и поиск механизмозависимых ингибиторов

4.2. Механизм действия О-аминопептидазы из ОсЬгоЬас1гит ап^гор!.

4.2.1. Анализ структуры О-аминопептидазы. Молекулярное моделирование ионизационных состояний остатков активного центра.

4.2.2. Экспериментальное изучение рН-профиля активности ОАР.

4.2.3. Предлагаемый механизм действия О-аминопептидазы.

4.2.4. Механизмы действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков

4.3. Дизайн субстратной специфичности О-аминопептидазы.

4.3.1. Биоинформатический анализ семейства белков, гомологичных О-аминопептидазе, молекулярное моделирование мутантных форм.

4.3.2. Виртуальный скрининг и обоснование выбора позиций и замен для экспериментального получения.

4.3.3. Экспериментальное исследование субстратной специфичности полученных мутантных форм О-аминопептидазы.

4.4. Разработка метода виртуального скрининга наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций.

4.4.1. Описание алгоритма.

4.4.2. Валидация разработанного метода виртуального скрининга растворителя

Рациональный дизайн ферментов с заданными свойствами, создание новых лекарственных препаратов, оптимизация биотехнологий представляют собой комплексное наукоемкое направление, чрезвычайно актуальное в настоящее время. Целенаправленное изменение каталитических свойств ферментов, дизайн новых ингибиторов ферментов и оптимизация условий проведения ферментативных реакций представляют собой важные и сложные задачи как с точки зрения фундаментальной, гак и прикладной науки. Сегодня очевидно, что решение проблем такого уровня сложности не может быть основано только лишь на чрезвычайно трудоемких эмпирических подходах и требует рационального использования достижений современной теоретической химии. Действительно, методы теоретической химии приобретают все большее значение при проведении исследовательских работ. Постоянно возрастающие производительность и доступность компьютерных систем и программных продуктов позволяют исследователям, прежде не имевшим отношения к моделированию, применять вычислительные методы для решения широкого круга своих задач. Не так давно применение расчетных методов в биохимии, молекулярной биологии и энзимологии было ограничено из-за чрезвычайной сложности и размера биологических систем. В настоящее время разработано множество методов для использования в биотехнологии. Это такие методы, как: классическая и гибридная молекулярная динамика, молекулярный докинг, предсказание трехмерной структуры биополимеров, расчет состояний ионизации аминокислотных остатков и другие.

В настоящей работе была поставлена задача исследовать возможности применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Необходимо было изучить механизм реакций, катализируемых D-аминопептидазой из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой человека 1 (АРЕ1) и использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и ингибиторов была предпринята попытка in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в нетрадиционных (органических) средах.

1. Обзор литературы

1.1. Пенициллин-связывающие белки. D-аминопептидаза из Ochrobactrum anthropi

1.1.1. Общие сведения

Э-аминокислоты служат важным элементом при создании многих продуктов пищевой, агрохимической и фармацевтической промышленности (Рис. 1). Производными О-аминокислот являются, например, бета-лактамные антибиотики ампициллин и амоксициллин, заменитель сахара алитам.

СООН

Amoxicillin (Antibiotics) (D-/»-Hyd roxyph enylglycin e) cooh

Loxiglumide (Bowel disorder) (D-Glutamic acid)

0 COOH

GYKI-14766 (Thrombin inhibitor) (D-Phenyialanine)

C02H0

LK 423 (Anti inflammatory) (D-Glutamic acid)

Nateglinide (Antidiabetic) (D-Phenyialanine) Г f3c

Fluvalinate (Insecticide) (D-Valine) nh2 ,, о

НООС

Alitame(Synthetic sweetner) (D- Alanine)

Рис. 1. Примеры соединений различных отраслей химической промышленности, являющихся производными О-аминокислот.

При разделении рацемических смесей аминокислот и их производных в основном используются процессы специфичные к Ь-формам, как например, стереоселективное ацилирование/деацилирование по аминогруппе. Э-аминокислоты и их производные в таком случае обычно являются побочным продуктом процесса и не вступают в реакцию. В широко используемом процессе синтеза аминокислот по Штрекеру (Рис. 2) на первой стадии из альдегида и цианида получается рацемическая смесь аминонитрилов. На второй стадии смесь подвергается либо полному гидролизу с образованием рацематов аминокислот, либо частичному гидролизу с образованием рацематов амидов аминокислот. Последние представляют интерес в первую очередь как активированные доноры ацильной части в реакциях ферментативного ацильного переноса. Наличие биокатализатора, способного принимать в качестве субстрата стереоселективно Э-форму ацильного донора позволило бы существенно расширить возможности получения производных Э-аминокислот.

Э^ескег ЭуШЬваБ мн

РСНО-

Ас)20

СООН

1ЧН2 А

N4 Ас

Р^СООН

Асу1азе

1\1Н2 1

Р СООН

Н СЫ Н Х01МН2

Рис. 2. Способы получения О-аминокислот: традиционный (вверху) и с использованием

О-стереоспецифичных гидролаз.

В природе Б-аминокислоты содержатся в составе пептидогликановой оболочки, которая образует сетчатую структуру на поверхности плазматической мембраны бактерий. Поперечная сшивка пептидогликана производится ферментами транспептидазами, являющимися стереоспецифичными ЭО-карбоксипептидазами. На ингибировании этих ферментов основан механизм противобактериального действия бета-лактамных антибиотиков, образующих с транспептидазами ковалентные ацилферментные комплексы. Для защиты от бета-лактамных антибиотиков бактерии выработали ферменты бета-лактамазы, являющиеся по-видимому усовершенствованными в процессе эволюции транспептидазами [1]. В семейство так называемых пенициллин-связывающих белков (РВР) помимо Р-лактамаз классов А и С и транспептидаз, участвующих в построении бактериальной клеточной стенки, входит ряд других ферментов, проявляющих активность в отношении производных Б-аминокислот: О-аминопептидазы, щелочные Э-эндопептидазы, другие ОО-карбоксипептидазы.

О-аминопептидаза из ОсИгоЬас1гит аткгор1 является уникальным ферментом по своему строению и свойству катализировать расщепление широкого ряда производных О-аланина с высокой стереоселективностью [2]. Фермент представляет собой сериновую гидролазу и действует в виде гомодимера, отдельные субъединицы которого организованы в трехдоменную структуру [3] и имеют молекулярную массу 122 кДа.

Ы-концевой домен А (остатки 3-331) фермента состоит из двух участков - а/р и а. Участок а/р образован основным Р-листом из 5 антипараллельных тяжей и тремя фланкирующими его а-спиралями. Три дополнительных Р-тяжа лежат перпендикулярно плоскости основного Р-листа. Второй участок каталитического домена образован восемью а спиралями. Такая структура совпадает с классической укладкой сериновых бета-лактамаз [3]. Другие два домена - В (остатки 341-418) и С (остатки 422-510) - имеют структуру антипараллельных Р-бочек, образованных восемью тяжами. Домен В образует пять водородных связей с доменом А посредством петли между Р-тяжами (остатки 408411), а также три водородные связи, гидрофобный контакт и два солевых мостика с доменом С. В свою очередь, домен С образует близкий контакт с а участком каталитического домена. Петля 476-486 домена С (у петля) лежит между спиральным и а/р участками, участвуя в формировании полости связывания субстрата (Рис. 3).

Рис. 3. Структура мономера Э-аминопептидазы по данным работы [3] (РОВ 1е15). Домены А (каталитический), В и С показаны синим, зеленым и оранжевым соответственно. Красным и сиреневым показаны у и О петли доменов С и А.

Непосредственно в реакции в качестве атакующего нуклеофила выступает атом Оу остатка 8ег62 фермента. Аналогично традиционным сериновым протеазам ЫН группа остовной части каталитического 8ег62 образует оксианионный центр фермента (Рис. 4). Вторым остатком, составляющим оксианионный центр, является А1а290.

А1а290 \ г

Рис. 4. Каталитические остатки и связывание амида О-аланина в активном центре

Изначально, Э-аминопептидаза была ошибочно отнесена к цистеиновым гидролазам из-за своей подверженности ингибированию тяжелыми металлами [2], однако, в более поздней работе [4] авторами было отмечено сходство аминокислотных последовательностей Э-аминопептидазы с бактериальными ферментами бета-лактамазой и ОО-карбоксипептидазой. В частности найдены консервативные мотивы ЯХХК, УХЫ, и НХв (см. ниже) и изучено ингибирование фермента производными 6-аминопеницилановой кислоты. На основании полученных данных фермент был отнесен к семейству пенициллин-связьгвающих белков (РВР). Биологическая роль О-аминопептидазы не выяснена. Возможно, фермент принимает участие в метаболизме О-аланина - структурного составляющего пептидогликана.

Как уже было отмечено, О-аминопептидаза из ОсИгоЬаКит аШИгорг катализирует стереоселективное расщепление широкого ряда производных О-аланина [2]. Было также показано, что данный фермент также способен катализировать процесс ацильного переноса на 3-аминопентан с использованием амида или метилового эфира О-аланина в качестве донора ацильной части [5]. Процесс переноса протекает с высокой стереоселективностью, что позволяет использовать ацильный донор в виде рацемата. Тем

О-аминопептидазы. не менее, узкая субстратная специфичность, ограниченная производными небольших по размеру аминокислот (Таблица 1), не позволяет широко применять Э-аминопептидазу в качестве биокатализатора для получения производных Э-аминокислот. Кроме того, фермент, по-видимому, не обладает выраженной специфичностью по отношению к нуклеофилыюй (амидной) части субстрата.

Таблица 1. Субстратная специфичность О-аминопептидазы по отношению к ацилыюй и нуклеофилыюй части субстрата по данным работы [2].

Субстрат Относительная активность(%)

Б-аланин амид 100

Глицин амид 44

Б-серин амид 29

Б-треонин амид 9

О-метионин амид 2

Субстрат Относительная активность(%)

Б-аланин-п-нитроанилид 96 тетрапептид Б-аланина 89 трипептид Э-аланина 92

Б-аланин бензиламид 72

О-аланин н-бутиламид 66

В качестве другого примера возможного применения Б-аминопептидазы, при совместном ее использовании с а-амино-е-капролактам рацемазой, активной в отношении амидов аминокислот [6], была показана возможность получения оптически чистого Б-аланина из Ь-аланинамида [7].

Обобщая, можно сказать, что фермент Э-аминопептидаза из Ос1ггоЬас(гит аШкгорг является хорошей платформой для создания нового биокатализатора, который может быть использован для получения важных производных Б-амипокислот.

Основные результаты и выводы

• Предложен согласованный механизм действия апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, показано, что общим основанием при катализе является остаток Азр210, а донором протона для уходящей группы - остаток Туг171.

• Установлены основные принципы механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков и показано, что в случае Б-аминопептидазы и амидазы Э-аминокислот из ОскгоЬас1гит ап1кгор1 общим основанием при катализе является остаток Ьуэ65(63) с необычно низким значением рКа.

• При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты 13-аминопептидазы из ОсЬгоЪаМгит ап1кгорг, обладающие расширенной субстратной специфичностью; изменение каталитических свойств мутантных ферментов подтверждено экспериментально.

• На основе метода СОБМО-ЯЗ разработан и реализован алгоритм виртуального скрининга растворителя, позволяющий провести выбор оптимальной среды для проведения биокаталитического превращения и достичь максимального выхода целевого продукта.

Благодарности

Работа была поддержана грантами Министерства образования и науки Российской федерации (в том числе совместный с ЕС проект "И^ЕЫЕ" по рациональному дизайну ферментов в рамках 7-ой Рамочной Программы), а также совместным грантом РФФИ и общества продвижения науки Японии 09-08-92104-ЯФа.

Автор выражает благодарность коллективу лаборатории прикладного вычислительного биокатализа факультета химии и фармации Университета Триеста (Италия) и лично проф. Л. Гардосси, коллективу центра биотехнологических исследований Университета префектуры Тояма (Япония) и лично проф. Я. Асано, а также всем сотрудникам отдела биокинетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ.

Заключение

В ходе выполнения данной работы:

1) Проведен расчет ионизационных состояний остатков активного центра апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 и гибридное КМ/ММ моделирование фермент-субстратного комплекса АРЕ1-ДНК, содержащего молекулу воды, способную атаковать субстрат. В результате проведенного исследования показано, что функцию общего основания в каталитическом механизме, по всей видимости, выполняет остаток Азр210, а остаток ГПз309, находясь в протонированной (заряженной) форме, участвует в связывании фосфатной группы субстрата. Анализ молекулярно-динамической траектории фермент-субстратного комплекса показывает его высокую реакционноспособность и свидетельствует об адекватности проведенного молекулярного моделирования.

Выявлены наиболее важные взаимодействия в активном центре, определяющие эффективность связывания субстрата и потенциальных ингибиторов фермента, представляющих интерес в качестве перспективных сопровождающих препаратов в химио- и радиотерапии онкологических заболеваний. Выдвинуто предположение о роли Туг171 активного центра АРЕ1 как остатка, способного отдать протон уходящей группе субстрата. Таким образом, проведенное исследование позволило установить согласованный механизм действия фермента, обобщающий данные молекулярного моделирования, экспериментальные результаты кинетических исследований и другие сведения литературы, с описанием и распределением ролей аминокислотных остатков активного центра в каталитическом механизме. В дальнейшей работе планируется применить гибридные квантово-механические методы более высокого порядка для расчета энергетического барьера реакции, катализируемой эндонуклеазой АРЕ1 в соответствии с предложенным механизмом, и провести поиск эффективных ингибиторов с использованием построенной механистической полноатомной модели фермента.

2) Проведен биоинформатический анализ семейства пенициллин-связывающих белков и определены консервативные аминокислотные остатки. Установлен основной принцип механизма действия ферментов семейства пенициллин-связывающих белков, в том числе О-аминопептидазы из ОскгоЬас1гит апШгор1, который заключается в формировании необычной конфигурации каталитической триады. При помощи молекулярного моделирования показано, что консервативный остаток ЬуБб5 имеет необычно низкое значение рКа, которое подтверждено также экспериментальным исследованием рН-профиля каталитической активности О-аминопептидазы. Полученные данные позволили установить роль остатка Lys65 в механизме действия D-аминопептидазы и родственных ферментов как общего основания, ответственного за передачу протона от каталитического остатка Ser62 к остатку Туг153 и обратно на стадиях образования и расщепления промежуточного ацилфермента.

При помощи методов теоретической химии предсказаны мутантные варианты DAP с расширенной субстратной специфичностью. Мутантные формы фермента получены и протестированы, показана их каталитическая активность по отношению к производным D-лейцина и D-фенилаланина. Выявлен аминокислотный остаток, определяющий высокую стереоселективность действия D-аминопептидазы.

3) Разработан и протестирован основанный на COSMO-RS метод скрининга наилучшего растворителя для биокаталитичсских реакций, протекающих в неводных средах. Показано, что для удовлетворительного выбора наилучшего растворителя достаточно результатов экспериментального исследования равновесия в одних единственных условиях.

Выполнение диссертационной работы позволило получить важный опыт применения методов теоретической химии в сочетании с экспериментальными данными для решения задач биокатализа и биотехнологии. Изучение механизмов действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi (DAP) и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 (АРЕ1) дало возможность использовать эти знания для получения ферментного препарата с измененной субстратной специфичностью, а также поиска новых ингибиторов. Наряду с использованием методов теоретической химии для дизайна каталитических свойств фермента и его ингибиторов был получен ценный опыт in silico подбора наилучшего растворителя для проведения биокаталитических реакций, протекающих в органических средах. В целом выполненная работа показала плодотворность сочетания методов теоретической химии и экспериментального исследования при решении научных и прикладных задач.

1. Lee, W. et al. A 1.2-A snapshot of the final step of bacterial cell wall biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 1427-31 (2001).

2. Asano, Y., Nakazavva, A., Kato, Y. & Kondo, K. Properties of a novel D-stereospecific aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi. The Journal of biological chemistry 264, 14233-9 (1989).

3. Bompard-Gilles, C. et al. Crystal structure of a D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi, a new member of the "penicillin-recognizing enzyme" family. Structure 8, 971-80 (2000).

4. Asano, Y., Kato, Y., Yamada, A. & Kondo, K. Structural similarity of D-aminopeptidase to carboxypeptidase DD and .beta.-lactamases. Biochemistry 31, 2316-2328 (1992).

5. Kato, Y., Asano, Y., Nakazawa, A. & Kondo, K. First stereoselective synthesis of D-amino acid N-alkyl amide catalyzed by D-aminopeptidase. Tetrahedron 45, 5743-5754 (1989).

6. Asano, Y. & Yamaguchi, S. Discovery of amino acid amides as new substrates for a-amino-e-caprolactam racemase from Achromobacter obae. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 36, 2229 (2005).

7. Asano, Y. & Yamaguchi, S. Dynamic kinetic resolution of amino acid amide catalyzed by D-aminopeptidase and alpha-amino-epsilon-caprolactam racemase. Journal of the American Chemical Society 127, 7696-7 (2005).

8. Okazaki, S. et al. Crystal structure and functional characterization of a D-stereospecific amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3, a new member of the penicillin-recognizing proteins. Journal of molecular biology 368, 79-91 (2007).

9. Okazaki, S., Suzuki, A., Komeda, H., Asano, Y. & Yamane, T. Deduced catalytic mechanism of D-amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3. Journal of synchrotron radiation 15, 250-3 (2008).

10. Massova, I. & Kollman, P. pKa, MM, and QM studies of mechanisms of beta-lactamases and penicillin-binding proteins: acylation step. Journal of computational chemistry 23, 1559-76 (2002).

11. Ke, Y.-Y. & Lin, T.-H. A theoretical study on the activation of Ser70 in the acylation mechanism of cephalosporin antibiotics. Biophysical chemistry 114, 103-13 (2005).

12. Chen, Y., McReynolds, A. & Shoichet, В. K. Re-examining the role of Lys67 in class С beta-lactamase catalysis. Protein science: a publication of the Protein Society 18, 662-9 (2009).

13. Komeda, H. & Asano, Y. Gene cloning, nucleotide sequencing, and purification and characterization of the D-stereospecific amino-acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3. European journal of biochemistry / FEBS 267, 2028-35 (2000).

14. Sharma, S. & Bandyopadhyay, P. Investigation of the acylation mechanism of class С beta-lactamase: pKa calculation, molecular dynamics simulation and quantum mechanical calculation. Journal of molecular modeling 18, 481-92 (2012).

15. Delmarcelle, M. et al. Specificity inversion of Ochrobactrum anthropi D-aminopeptidase to a D,D-carboxypeptidase with new penicillin binding activity by directed mutagenesis. Protein science: a publication of the Protein Society 14, 2296-303 (2005).

16. Asano, Y. & Yamaguchi, K. Mutants of d-aminopeptidase with increased thermal stability. Journal of Fermentation and Bioengineering 79, 614-616(1995).

17. Lindahl, Т., Wood, R.D. Quality Control by DNA Repair. Science 286, 1897-1905 (1999).

18. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature 411, 366-74 (2001).

19. Речкунова Н.И., Красикова Ю.С., Лаврик О.И. // Биохимия. 201 1. Т. 76. С. 32-^15.

20. Abbotts, R. & Madhusudan, S. Human АР endonuclease 1 (APE1): from mechanistic insights to druggable target in cancer. Cancer treatment reviews 36, 425-35 (2010).

21. Liu, Y. & Wilson, S. H. DNA base excision repair: a mechanism of trinucleotide repeat expansion. Trends in biochemical sciences 37, 162-72 (2012).

22. Невинский Г.A. // Биохимия. 2011. Т. 76. С. 115-141.

23. Wilson, D.M. & Simeonov, A. Small molecule inhibitors of DNA repair nuclease activities of APE 1. Cellular and molecular life sciences : С MLS 67, 3621-31 (2010).

24. Дырхеева H.C., Ходырева C.H., Лаврик О.И. // Молекуляр. биология. 2007. Т. 41. С. 450466.

25. Fishel, М. L. & Kelley, М. R. The DNA base excision repair protein Apel/Ref-1 as a therapeutic and chemopreventive target. Molecular aspects of medicine 28, 375-95 (2007).

26. Gorman, M. A. et al. The crystal structure of the human DNA repair endonuclease HAP1 suggests the recognition of extra-helical deoxyribose at DNA abasic sites. The EMBO journal 16, 654858 (1997).

27. Mol, C.D., Izumi, Т., Mitra, S. & Tainer, J.A. DNA-bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1 and DNA repair coordination corrected. Nature 403, 451-6 (2000).

28. Mol, C.D., Hosfield, D.J. & Tainer, J.A. Abasic site recognition by two apurinic/apyrimidinic endonuclease families in DNA base excision repair: the 3' ends justify the means. Mutation research 460, 211-29 (2000).

29. Beernink, P.T. et al. Two divalent metal ions in the active site of a new ciystal form of human apurinic/apyrimidinic endonuclease, Apel: implications for the catalytic mechanism. Journal of molecular biology 307, 1023-34 (2001).

30. Lowry, D.F. et al. Investigation of the Role of the Histidine-Aspartate Pair in the Human Exonuclease Ill-like Abasic Endonuclease, APE1. Journal of Molecular Biology 329, 311-322 (2003).

31. Oezguen, N. et al. A "Moving Metal Mechanism" for Substrate Cleavage by the DNA Repair Endonuclease APE-1. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics 68, 313-323 (2007).

32. Lipton, A. et al. Characterization of Mg2+ Binding to the DNA Repair Protein Apurinic/Apyrimidic Endonuclease 1 via Solid-State 25Mg NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society 130, 9332-9341 (2008).

33. Mundle, S.T. et al. Novel role of tyrosine in catalysis by human AP endonuclease 1. DNA repair 3, 1447-55 (2004).

34. Mundle, S.T., Delaney, J.C., Essigmann, J.M., and Strauss, P.R. Enzymatic mechanism of human apurinic/apyrimidinic endonuclease against a THF AP site model substrate. Biochemistry 48, 19-26 (2009).

35. Borjigin, M., Arenaz, P. & Stec, B. Chinese hamster AP endonuclease operates by a two-metal ion assisted catalytic mechanism. FEBS letters 586, 242-7 (2012).

36. Claon, P. A. & Akoh, C. C. Enzymatic synthesis of geraniol and citronellol esters by direct esterification in n-hexane. Biotechnology Letters 15, 1211-1216 (1993).

37. Molinari, F., Villa, R. & Aragozzini, F. Production of geranyl acetate and other acetates by direct esterification catalyzed by mycelium of Rhizopus delemar in organic solvent. Biotechnology Letters 20, 41 —44 (1998).

38. Tewari, Y. B. Thermodynamics of the Lipase-Catalyzed Esterification of 1-Dodecanoic Acid and 1-Dodecanol in Organic Solvents. Journal of Chemical & Engineering Data 43, 750-755 (1998).

39. Hailing, P. J. Solvent selection for biocatalysis in mainly organic systems: predictions of effects on equilibrium position. Biotechnology and bioengineering35, 691-701 (1990).

40. Tewari, Y. B. & Bunk, D. M. Thermodynamics of the lipase-catalyzed esterification of glycerol and n-octanoic acid in organic solvents and in the neat reaction mixture. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 15, 135-145 (2001).

41. Tewari, Y. B., Schantz, m. M. & Vanderah, D. J. Thermodynamics of the Lipase-Catalyzed Esterification of 1-Dodecanoic Acid with (-)-Menthol in Organic Solvents. Journal of Chemical & Engineering Data 44, 641-647 (1999).

42. Tewari, Y. B. Thermodynamics of the lipase-catalyzed transesterification of (-)-menthol and dodecyl dodecanoate in organic solvents. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 9, 83-90 (2000).

43. Valivety, R. H., Johnston, G. A., Sucking, C. J. & Hailing, P. J. Solvent effects on biocatalysis in organic-systems equilibrium position and rates of lipase catalyzed esterification. Biotechnology and bioengineering 38, 1137-1143 (1991).

44. Castillo, E., Torres-gavilán, A., Sandoval, G. & Marty, A. Lipases and Phospholipases. 861, 383400 (Humana Press: Totowa, NJ, 2012).

45. Klamt, A., Jonas, V., Bürger, T. & Lohrenz, J. C. W. Refinement and Parametrization of COSMO-RS. The Journal of Physical Chemistry A 102, 5074-5085 (1998).

46. Klamt, A. Conductor-like Screening Model for Real Solvents: A New Approach to the Quantitative Calculation of Solvation Phenomena. The Journal of Physical Chemistry 99, 2224-2235 (1995).

47. Klamt. A. COSMO and COSMO-RS. In: Schleyer PvR and Allinger L, editors. Encyclopedia of Computational Chemistry. New York: John Wiley & Sons. 604-615 (1998).

48. Fermeglia, M., Braiuca, P., Gardossi, L., Priel, S. & Hailing, P. J. In silico prediction of medium effects on esterification equilibrium using the COSMO-RS method. Biotechnology progress 22, 1146-52 (1995).

49. Grob, S. & Hasse, H. Thermodynamics of Phase and Chemical Equilibrium in a Strongly Nonideal Esterification System. Journal of Chemical & Engineering Data 50, 92-101 (2005).

50. Chen, B., Guo, Z., Tan, T. & Xu, X. Structures of ionic liquids dictate the conversion and selectivity of enzymatic glycerolysis: theoretical characterization by COSMO-RS. Biotechnology and bioengineering 99, 18-29 (2008).

51. Guo, Z., Chen, B., Lopez Murillo, R., Tan, T. & Xu, X. Functional dependency of structures of ionic liquids: do substituents govern the selectivity of enzymatic glycerolysis? Organic & biomolecular chemistry 4, 2772-6 (2006).

52. Peters, M., Greiner, L. & Leonhard, K. Illustrating computational solvent screening: Prediction of standard Gibbs energies of reaction in solution. AIChE Journal 54, 2729-2734 (2008).

53. Peters, M. et al. Systematic Approach to Solvent Selection for Biphasic Systems with a Combination of COSMO-RS and a Dynamic Modeling Tool. Engineering in Life Sciences 8, 546-552 (2008).

54. Spieß, A. C. et al. Prediction of partition coefficients using COSMO-RS: Solvent screening for maximum conversion in biocatalytic two-phase reaction systems. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification 47, 1034-1041 (2008).

55. Klamt, A. "COSMO-RS: From Quantum Chemistry to Fluid Phase Thermodynamics and Drug Design", Elsevier Science Ltd., Amsterdam, The Netherlands (2005).

56. Davies, M. N., Toseland, C. P., Moss, D. S. & Flower, D. R. Benchmarking pKa prediction. BMC biochemistry 7, 18 (2006).

57. Li, H., Robertson, A. D. & Jensen, J. H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. Proteins 61, 704-21 (2005).

58. Bas, D. C., Rogers, D. M. & Jensen, J. H. Very fast prediction and rationalization of pKa values for protein-ligand complexes. Proteins 73, 765-83 (2008).

59. Dunbrack, R. L. & Karplus, M. Backbone-dependent rotamer library for proteins. Application to side-chain prediction. Journal of molecular biology 230, 543-74 (1993).

60. URL: http://www.salilab.org/modeller/aboutmodeller.html

61. Hockney, R.W., Goel, S.P., and Eastwood, J. Quiet high resolution computer models of a plasma. J. Comp. Phys., 14, 148-158 (1974).

62. Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., and Schulten, K. Molecular dynamics study of unbinding of the Avidin-Biotin complex. Biophysical J., 72, 1568-1581 (1997).

63. Isralewitz, B., Gao, M., and Shulten, K. Steered molecular dynamics and mechanical functions of proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 11, 224-230 (2001).

64. Crespo, A., Marti, M.A., Estrin, D.A., and Roitberg, A.E. Multiple-steering QM-MM calculation of the free energy profde in chorismate mutase. J. Am. Chem. Soc., 127, 6940-6941 (2005).

65. Jensen, M.O., Park, S., Tajkhorshi, E., and Schulten, K. Energetics of glycerol conduction through aquaglyceroporin GlpF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 673 1-6736 (2002).

66. Jarzynsky, C. Non-equilibrium equality for free energy differences. Phys. Rev. Lett., 78, 26902693 (1997).

67. Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D., and van Drunen, R. GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Com. Phys. Comm., 91, 43-56 (1995).

68. Walker, R.C., Crowley, M.F., and Case, D.A. The implementation of a fast and efficient hybrid QM/MM potential method within the Amber 9.0 sander module. ./. Computat. Chem., 29, 1019-1031 (2008).

69. Solis, F.J. and Wets, R.J.-B. Minimization by random search techniques. Math. Operations Res., 6, 19-30 (1981).

70. Morris, G. M„ Goodsell, D. S., Halliday, R.S., Huey, R„ Hart, W. E„ Belew, R. K. and Olson, A. J. Automated docking using a lamarckian genetic algorithm and empirical binding free energy function. J. Comput. Chem., 19, 1639-1662 (1998).

71. URL: http://autodock.scripps.edu/

72. Ahlrichs, R., Baer, M., Haeser, M., Horn, H., and Koelmel, C. Electronic Structure Calculations on Workstation Computers: The Program System TURBOMOLE. Chem. Phys. Lett., 162(3), 165-169, (1989).

73. Klamt, A. & Schiiiirmann, G. COSMO: a new approach to dielectric screening in solvents with explicit expressions for the screening energy and its gradient. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2 230, 799-805 (1993).

74. Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research 25, 3389-402 (1997).

75. Notredame, C., Higgins, D. G. & Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of molecular biology 302, 205-17 (2000).

76. Katoh, K., Asimenos, G. & Toh, H. Multiple alignment of DNA sequences with MAFFT. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 537, 39-64 (2009).

77. Do, C. B., Mahabhashyam, M. S. P., Brudno, M. & Batzoglou, S. ProbCons: Probabilistic consistency-based multiple sequence alignment. Genome research 15. 330-40 (2005).

78. Krissinel, E. & Henrick, K. Secondary-structure matching (SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 60, 2256-68 (2004).

79. Konagurthu, A. S„ Whisstock, J. C„ Stuckey, P. J. & Lesk, A. M. MUSTANG: a multiple structural alignment algorithm. Proteins 64, 559-74 (2006).

80. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M. A., Clamp, M. & Barton, G. J. Jalview Version 2 -a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics 25, 1189-91 (2009).

81. The PyMOL Molecular Graphics System, Version l.Orl, Schrodinger, LLC. URL: http://www.pymol.org/

82. ACD/ChemSketch Freeware, version 8.17. Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, ON, Canada. URL: http://www.acdlabs.com

83. Case D.A. et al. AMBER 10. University of California. San Francisco (2008).

84. Walker, R. C., Crowley, M. F. & Case, D. A. The implementation of a fast and accurate QM/MM potential method in Amber. Journal of computational chemistry 29, 1019-31 (2008).

85. Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: visual molecular dynamics. Journal of molecular graphics 14, 33-8, 27-8 (1996).

86. Hornak, V. et al. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins 65, 712-25 (2006).

87. Chen, J., Dupradeau, F.-Y., Case, D. A., Turner, C. J. & Stubbe, J. Nuclear magnetic resonance structural studies and molecular modeling of duplex DNA containing normal and 4'-oxidized abasic sites. Biochemistry 46, 3096-107 (2007).

88. Rocha, G. B., Freire, R. O., Simas, A. M. & Stewart, J. J. P. RM1: a reparameterization of AMI for H, C, N, O, P, S, F, CI, Br, and I. Journal of computational chemistry 27, 1101-11 (2006).

89. SciDAVis: a free application for Scientific Data Analysis and Visualization. URL: http://scidavis.sourceforge.net/

90. Pace, C.N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G. & Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein science: a publication of the Protein Society 4, 2411-23 (1995).

91. Simeonov, A. et al. Identification and characterization of inhibitors of human apurinic/apyrimidinic endonuclease APE1. PloS one 4, e5740 (2009).