Модификация нуклеиновых кислот металлопорфириновыми производными олигонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Новосибирский институт биоорганической химии

На правах рукописи УДК 577.113.4/6

Фролова Елена Ивановна

МОДИФИКАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МЕТАЛЛОПОРФИРИНОВЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 1992

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научные руководители

академик РАН Кнорре Д.Г. чл.-корр. РАН Власов В.В.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Карпова Г.Г.

кандидат химических наук Ошевский С.И.

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. Ф.М.Белозерского МГУ

заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр.Лаврентьева.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии.

Авореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного

Защита состоится

часов на

совета, *чндидат химических наук

О.С.Федорова

Актуальность проблемы. Исследования последних лет доказали принципиальную возможность осуществления направленной химической модификации нуклеиновых кислот реакционноспособ-ными производными олигонуклеотидов и использования таких производных аля подавления экспрессии определенных генов. В настоящее время применение производных олигонуклеотидов в различных областях молекулярной биологии и фармакологии сдерживается их низкой эффективностью, которая определяется в основном несовершенством реакционноспособных групп, используемых при конструировании реагентов. Поэтому актуальной задачей является поиск таких группировок, которые в составе олигонуклеотидного производного могли бы с высокой эффективностью реагировать с нуклеиновой кислотой-мишенью. В связи с этим в последнее время все больше привлекают к себе внимание хелаты, координирующие ионы переходных металлов, такие как Fe-ЭДТА, Си-1,Ю-фенантролин, металлопорфирины. Эти комплексы способны расщеплять или модифицировать нуклеиновые кислоты в присутствии доноров активного кислорода или молекулярного кислорода и восстановителя. Среди хелатов наибольшее внимание привлекают порфирины, которые в силу уникальности своей электронной структуры обладают широк™ спектром полезных свойств, выделяющих их среди других металлокомплексов. Поэтому на основе металлопорфиринов могут быть созданы высокоэффективные реакционноспособные производные олигонуклеотидов.

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в получении нескольких типов металлопорфириновых производных олигонуклеотидов и исследовании механизма окислительной модификации нуклеиновых кислот такими соединениями.

Научная новизна. В настоящей работе впервые синтезированы производные олигонуклеотидов, содержащие на 3'- или 5'-концевых фосфатах железопорфириновые (геминоЕые) группы: железный комплекс диметиловаого эфира 2,4-ди[а-(2-гидрокси-этокси)этил]дейтеропорфирина IX (DDP), протогеган IX (Нет) и дейтерогемин IX (Dhem). Все эти группы относятся к одному классу природных порфиринов. Исследование механизма сайт-направленной модификации нуклеиновых кислот синтезированными геминовыми производными показгло, что эффективность и селек-

тивность жх реакции с ДНК практически не зависят ни от структуры боковых заместителей в порфириновом макроцикле, ни от способа связывания олигонуклеотида с порфириновой группой. Установлено, что в ходе модификации окислению подвергается гетероцикл гуанозинового остатка, в результате чего в ДНК преимущественно образуются апуриновые сайты. Впервые предложена кинетическая схема, описывашая процесс модификации нуклеиновых кислот геминовыми производными олигонуклео-•гидов, и оценено влияние побочных реакций - окислительной деградации геминовой. группы и каталитического разложения окислителя - на эффективность модификации.

Практическая ценность. Предложенные в работе новые реакционно способные производные олигонухлеотидов, содержащие железопорфириновые группы, способны эффективно и высокоселективно модифицировать нуклеиновые кислоты в окислительно-восстановительных условиях. Это открывает возможность создания на их основе реагентов для надавленного воздействия на клеточные нуклеиновые кислоты. Детальное исследование механизма модификации позволило предложить метод сайт-специфичного расщепления нуклеиновых кислот с образованием в сайте расщепления свободных 5'- и 3'-фосфатных концов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на III Всесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Тбилиси, 1987), на Международном симпозиуме "Переспективы терапевтического и диагностического применения олигонуклео-тидных производных" (Новосибирск, 1988), на IV Всесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Киев, 1989), на Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотида: проблемы и области практического использования" (Москва, 1991), на Международном симпозиуме "Антисенс-олигонуклеотиды и рибонуклеазы Н" (Франция, 1992)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, списка цитируемой литератур» из 177 наименований и содержит 9 таблиц и 19 рисунков.

СОДЕРЖАШЕ РАБОТЫ

1. Синтез геминовых производных олигонуклеотидов.

Поскольку к началу этой работы не существовало методов синтеза производных олигонуклеотидов, содержащих порфирино-вые группы, перед нами в первую очередь встала задача их синтеза. Было предложено два способа присоединения порфири-новых групп к концевым фосфатам олигонуклеотидов: на основе защищенных олигонуклеотидов и на основе деблокированных олигонуклеотидов. Для синтеза на основе защищенных олигонуклео-■ тидов использовали модифицированную порфириновую группу, содержащую две гидроксильные группы по 2 и 4 положениям макроцикла, соответственно - диметиловый эфир 2,4-ди[а-(2-гид-роксиэтокси)этил]дейтеропорфирина ix (ddp). Присоединение этого порфирина или его железного комплекса (fe(ill)ddp) к 5'- или 3'-концевому фосфату олигонуклеотида осуществлялось в ходе гомогенного фосфотриэфирного синтеза при помощи конденсирующего реагента 2,4,6-триизопропилбензолсульфонил-хлорида в присутствии нуклеофильного катализатора 1-метилимидазола. Присоединение олигонуклеотида с равной вероятностью осуществлялось по одной из ОН-групп (либо во 2, либо в 4 положениях). Выход на стадии конденсации был количественным. Вторая ОН-группа в ходе синтеза подвергалась сульфонилированию. Конечный продукт, порфириновое производное олигонуклеотида, представлял собой смесь двух изомеров, которые практически не различались по своим хроматографичес-ким свойтвам. Доказательством структуры полученных соединений послужили данные 1Н-ЯМР (для дитимидилата), электронной спектроскопии и их хроматографические свойства. Окончательная структура производных олигонуклеотидов, содержащих Ре(iii)ddp группу представлена ниже. Были синтезированы следующие Fe (iii )ddp-производные олигонуклеотидов:

fe(iii)ddp-tgaccctcttcccatt (i)

fe(iii)ddp-gtgcacga (ii)

fe(iii)ddp-ttcccatt (iii)

о-сн2-сн2-сж'

НэС

СНЭ I

сн-о-сн2-сн2-ск"

,-СНз

СН(СНЭ)2

(СН3)2|

нс^^Сн

0=3=0

I

или

в' = остаток олигонуклеотида СН(СНа)я

ТК"

(сн3 ^нс^/^сн (СНа )г

гг"= остаток олигонуклеотида

о=з=о I

Во втором методе синтеза порфириновых производных оли-гонуклеотидов были использованы наиболее доступные природные порфирины - протогемин IX и дейтерогемин IX, которые отличаются только заместителями по 2 и 4 положениям макроцикла, а в 6 и 8 положениях оба содержат остатки пропионовой кислоты, за которые может быть проведено ковалентное связывание с олигонуклеотидом. Присоединение таких геминовых групп к деблокированным олигонуклеотидам осуществляли путем ацилиро-вания ангидридом гемина в присутствии нуклеофильного катализатора (1-гидроксибензотриазола) аминогруппы спейсера, предварительно введенного по 5'- или 3'-концу олигонуклеотида. При отношении ангидрида гемина к олигонуклеотиду 2:1 выход целевого продукта составил 29-32%. Появление побочных продуктов при увеличении концентрации ангидрида гемина не позволило повысить выход целевого продукта. Однако это метод позволил использовать наиболее доступные геминовые группы и проводить синтез с деблокированными олигонуклеотидами.

о*=сн2 СНз

СНэ

,-сн3

протогемин IX (Нет)

дейтергемин IX (Шет)

С помощью этого метода были синтезировании следушие производные олигонуклеотидов:

1) протогеминовые производные: Нет-рТСАСССТСТТСССАТТ (IV)

рТСАСССТСТ1СССАТТр-Нет (V)

2) дейтерогеминовые производные: Шет-рТСАСССТСТТСССАТТ (VI)

рТСАСССТСТТСССТТАр-Шет (УН)

2. Исследование окислительной модификации нуклеиновых кислот геминовыми гтроизводгрдт олигонуклеотидов Для исследования эффективности и селективности модификации ДНК геминовыми производными олигонуклеотидов был использован 302-нуклеотидный фрагмент одноцепочечной ДНК, последовательность которого идентична последовательности фрагмента РНК вируса клещевого энцефалита [Бросалина Е.Б. и др. 1986]. Реагенты, использованные для модификации этой ДНК-мишени, содержали протогеминовую (IV и У), дейтерогеминовую (VI и УН) или Ре(III)Б1®-группу (I) либо на 5'-, либо на 3'-концевом фосфате и были комплементарны последовательности 259-274 мишени.

Модификацию фрагмента этими производными проводили в условиях образования комплементарного комплекса и в присутствии в качестве окислителя пероксида водорода. Продукты модификации, получаемые во всех случаях, на резличались. На рис.1 в качестве примера представлен радиоавтограф результатов разделения продуктов модификации фрагмента ДНК дейтеро-геминовым производными (У1) и (УН). При модификации ДНК как

5'- , так и З'-гемиеовыми производными в присутствии перок-сида водорода наблюдалось образование продуктов, имеющих меньшую электрофоретическую подвижность, чем исходный фрагмент, и являющихся результатом ковалентного связывания реагента с мишенью (дорожки 3 и 5). При исключении из реакционной системы либо реагента, либо пероксида водорода модификации ДНК не наблюдалось (дорожки 1 и 2). Обработка модифицированной ДНК пиперидином приводила к исчезновению медленно-мигрирующих продуктов и селективному расщеплению ДНК по гуа-нозинам, расположенным при образовании комплементарного комплекса вблизи геминовой группы: дгч 5'-производных по в275 и 0376 (дорожка 6)

11

3' -ТАССТС00АСТСССАСААа<Х;ТААСТТСС-5'

шмшшшш

РеРог-рТСАСССТСТТСССАИ и для 3'-производных по С25в (дорожка 4):

1

3' -ТАССТС®1АСТОСКЖ1ААС(3<}ТАА(5ТТСО-5'

ШШШШШЦ

рТСАСССТСТТСССАТТ-рРеРог где рог - порфириновая группа.

Кроме того, для всех производных наблюдалось расщепление в олигогуаниловой области С17-С34, содержащей 18 остатков гуа-нозина, где исследуемые реагенты могут образовывать несовершенные дуплексы за счет образования С-С и б-т пар. Модификация З'-геминовыми производными (дорожка 4) приводила также к расщеплению по остатку С179, удаленному от сайта связывания олигонуклеотида. Расщепление по 0179 наблюдалось также в работе [Бросалина Е.Б. и др. 1986] при модификации этого фрагмента ДНК 3'-алкилирупцими производными тетрадекануклеотида рЮАСССТСТТСССА. Этот результат объяснялся формированием третичной структуры ДНК-мишени, в результате чего С179 оказывается сближенным с реакционной группой олигонуклеотидного реагента, находящегося в дуплексе с участком 259-274 ДНК. Образующиеся продукты расщепления обладают электрофоретичес-кой подвижностью идентичной контрольным фрагментам расщепле-

ния по пуринам методом Максама-Гилберта. Это указывает на образования в сайте расщепления 5'-фосфатных концов. При модификации дейтерогеминовыми (VI) и Fe(IIIДОР-производными гексадекануклеотида (I) наблюдалось также незначительное прямое расщепления нуклеиновой цепи (3-5$).

Количественные характеристики модификации ДНК тремя испытанными 5'-гемижт&ми производными, представленные в табл.1, позволяют сделать вывод, что эффективность модификации ДНК производными олигонуклеотидов, содержащими железо-порфириновые группы природного типа (производные дейтеропор-фирина IX), практически не зависит ни от боковых заместителей в порфириновом макроцикле, ни от точки связывания олиго-нуклеотида с порфирином: 6 или 8 положения в случае гемино-вых и дейтерогеминовых производных и 2 или 4 положения в случае Fe(lllJDDP-производных. А'в Í 2 3 4 5 В

Рис.1. Электрофореграмма результатов разделения гель-электрофорезом продуктов модификации 32р-меченного 302-звен-hotq фрагмента ДНК дейтерогеми- -новыми производными (71) и (VII): (1) - фрагмент ДНК, инкубированный в присутствии Ю_3М HgOg; (2) - фрагмент ДНК, инкубированный в присутствии 5-ю-бм реагента (YI); (3) и (4) - фрагмент ДНК, инкубированный в присутствии 10_3м hgog и 5-Ю"бм реагента (VII); (5) и (6) - фрагмент ДНК, инкубированный в присутствии 10_3М HgOg и 5-ю-бм реагента (YI). Модифицированная ДНК, анализировавшаяся на дорожках 4 и 6, перед проведением гель-электрофореза подвергалась обработке 1М пиперидином при 90°С в течение 30 минут. Реакцию модификации проводили в течение 1ч при 25°с в буфере состава: 50 тМ трис-HCl, 0.1.М NaCl, 0,1 мг/мл тРНК.

ТАБЛИЦА 1. Сравнение эффективности модификации ДНК-мишени различными 5'-геминовыми производными гексадека-нуклеотида РТСАСССТСТТСССАТТ. Условия проведения экспериментов аналогичны условиям, указанным в подписи к рис.1

Реагенты, использованные для модификации Выход ковалентных аддуктов Выход продуктов пиперидин-индуцированного расщепления

Hem-pTGACCCTCTTCCCAIT (IV) 40$ 52$

Dhem-pTGACCCTCTTCCCATT (VI) 44$ 60$

Fe(III)DDP-pTGACCCTCTTCCCATT (I) 37$ 66$

Выход пиперидин-индуцированного расщепления превышал выход, ковалентных аддуктов, что указывало на наличие "скрытых" модификаций, не влияпаих на элзктрофоретическую подвижность фрагмента, но расщепляющихся после пиперидиновой обработки. Эксперименты по пиперидиновой обработке отдельных продуктов модификации 5'-Fe(III)DDP-производным (I) позволили оценить, что выход "скрытых" модификаций в этих условиях составляет 41$.

Исследование зависимости эффективности модификации от концентрации окислителя показали, что при оптимальной концентрации пероксида водорода степень пиперидин-лабильной модификации достигает 90$.

3. Исследование природы "скрытых" модификаций нуклеиновых кислот, индуцируемых геминовыми производными олигонуклеотидов

Исследование конечных продуктов окислительной модификации ДНК геминовыми производными олигонуклеотидов проводили на частично самокомплементарном реагенте, конструкция которого совмещаадая в одной молекуле одновременно две функции: мишень и реагент, облегчала задачу выделения продуктов модификации:

123kt«TI

Fe(III)DDPpGTGCACGA

ПИН

AGCACGTGpFe(III)DOP (II)

Реакцию модификации проводили при концентрации окислителя (монопероксофталата магния) равной 5-10-3 м-1. В этих условиях наряду с максимальной модификацией наблюдалась также полная деструкция геминовой группы, что облегчало разделение продуктов реакции. Кроме того, при модификации в присутствии монопероксофталата магния не происходило образование ковалентных аддуктов и прямых разрывов цепи, основными были "скрытые" модификации. Продукты модификации" анализировали несколькими методами, результаты которых представлены в табл.2.

В результате ферментативного гидролиза олигонуклеотид-ного продукта было установлено, что в нем отсутствует один остаток дезоксигуанозина. Использование дополнительных обработок модифицированного реагента позволило установить, что модификации подвергается преимущественна остаток гуанозина, расположенный вблизи геминовой группы при образовании комплементарного комплекса. Основной продукт, составляющий 80% модификации, содержит апуриновый сайт и расщепляется при нагревании, минорный продукт (>20%) содержит модифицированный нуклеозид и расщепляется только при пиперидиновой обработки. Этот нуклеозид был выделен и оказалось, что по своим спектральным характеристикам он не соответствует ни одному из описанных в литературе продуктов окисления гуанозина. Низкий выход этого нуклеозида не позволил получить его в количестве достаточном для установления его полной структуры.

Таким образом, совокупность представленных данных позволяет сделать вывод, что основной путь модификации ДНК Ре(Ш)-порфириновыми производными олигонуклеотидов заключается в окислительной деградации гетероцикла гуанозина, приводящей преимущественно к образованию апуриновых сайтов (8055) и в меньшей степени модифицированного нуклеозида (2056). Окисление ДНК по 2'-дезоксирибозе не происходит, поскольку по результатам обращеннофазовой хроматографии продуктов окисления Ре(шдар-рСТОСАсал не происходит выделение свободного гетероцикла гуанина, которое можно, было бы ожидать при окислении 2'-дезоксирибозы гуанозина.

Таблица 2.

N Методы анализа Результаты Выводы

1 Ионообменная Продукт модификации Не происходит рас-

хроматография не отличается по заря- щепления олигонук-

продуктов ду от исходного олиго- леотидной цепи и об-

модификации. нуклеотида. зование ковалентных аддуктов.

2 Обращеннофазо- Смесь олигонуклеотид- Происходит деструк-

вая хроматог- ных продуктов, облада- ция геминовой группы

рафия продук- ющих близкой хроматог- отсутствуют свобод-

тов модифика- рафической подвиж- ные гетероциклы.

ции. ностью между собой, но отличающиеся от исходного реагента и от рСТ<ЗСАСС!А.

3 Ферментативный Состав олигонуклеотид- Происходит модифика-

гидролиз про- ного продукта отлича- ция гуанозина, сопро

дуктов до нук- ется от состава исход- вождаицаяся деструк-

леозидов, об- ного реагента: С - 2, цией гетероцикла

ращеннофазовая б - 2, т - 1, А - 2.

хроматография.

4 Нагревание Выделяются продукты: В результате модифи-

продуктов мо- а) 2'-дезоксиаденозин- кации образуется

фикации при 5'-монофосфат, апуриновый сайт по

рН7.5, обра- б) Х-рСТССАС (¿80$), положению G7 с выхо-

щеннофазовая В) Х-рСТ(5САССА (*20%). дом ¿80%.

хроматография.

5 Нагревание Выделяются продукты: Образуются продукт,

продуктов мо- а) 2'-дезоксиаденозин- содержащий по положе

фикации в при- 5'-монофосфат, нию G7 модифицирован

сутствии пипе- б) Х-рОТССАС (гЭ02), ный нуклеозид (S20Ï)

ридина, обра- В) Х-рбТ + САС (*10Я. и продукт, модифици-

щеннофазовая рованный по G3 и G7

хроматография. одновременно (*10$).

4. Кинетические закономерности адресованной модификации нуклеиновых кислот геминовыми производными олигонуклеотидов При проведении адресованной модификации желательно добиться высокой степени модификац. ч нуклеиновой мишени. В связи с этим важное значение имеют кинетические характеристики процесса модификации и, в частности, соотношение скоростей модификации со скоростями побочных реакций, влияпцих на эффективность адресованной модификации. В процессе модификации нуклеиновых кислот геминовыми производными олигонуклеотидов имеет место параллельное расходование реагентов, участвующих в реакции. Это, во-первых, окислительная деструкция геминовой группы в составе производного олигонуклео-тида и, во-вторых, разложение пероксида водорода, катализируемое геминовой группой. В простейшем случае троцесс может

быть описан схемой: рг

К[Н2°2]

рх

кЛНрСц] Кг,

Р + X а * ^ > Р + И <-- Рй

где р - модифицируемый биополимер, X - реагент, й - неревк-ционноспособный продукт X, РХ - комплекс биополимера с реагентом, Рй - продукт модификации, РИ - комплекс биополимера с продуктом в, кх> кг - константы ассоциации биополимера с реагентом и продуктом и, соответственно, к0 - константа скорости модификации биополимера, к^ - константа скорости деструкции геминовой группы.

В первом приближении при небольших избытках пероксида водорода как деструкция гемина, так и расходование пероксида водорода могут быть описаны как реакции второго порядка следующими уравнениями:

^=-к(1[х][н2о2] , 2^2322.-к-инНгО,] (1)

где X - реагент, \1?Ог - пероксид водорода, кй и к - соответствуйте константы скорости.

Интегрирование этих уравнений приводит к следующим выражениям для зависимости концентраций реагента и н^ от времени:

(h -n-x )-х

[X]=—2-2-2--(2)

h0-exp[kd-(h0-n-x0)-t] -n-xQ

[Hn ] - •ho'"p[kd- (Vn-xo'-t] (3)

^ 2 vq exp[kd. (h0-n-x0)-t]- n-xQ

где xQ и hQ - начальные концентрации реагента x и пероксида водорода HgOg, соответственно, a n = k*/kd.

Обработка экспериментальных данных по деструкции геми-новой группы в составе реагента Fe(III)DDP-pTTCCCATT в отсутствии матрицы по уравнению (2) с помощью программы нелинейной регрессии позволила провести подгонку значений kd и n при разных начальных значениях hQ и xQ. Оказалось, что при невысоких избытках пероксида водорода по отношению к геминовому производному олигонуклеотида эти кинетические кривые хорошо описываются полученным уравнением и величип n и kd мало зависят от hQ и xQ и варьирует в пределах n=40±12, a kd=78*320 М-1мин-1.

Накопление продукта модификации также является реакцией второго порядка и в условиях избытка реагента описывается следующим уравнением.

= VWIPX1 (4)

Полагая, что выполняется условие квазиравновесия для образования комплексов рх и pz, а также, что кх=кг, и учитывая выражения (2) и (3) дифференциальное уравнение для накопления [pz] (5) можно переписать в виде:

d[pz] . _. Pq-[pz1 <уа-*о>2-(h0-n-x0)-t]

Ht — ----5- 15)

{ho"exp[kd' (ho~n'xo)'tl - n'xo> или после интегрирования:

1Ш

Uh'

lkd-(1+Kx-x0)-h0

1-n-xQ/hJ}

Lexp[kd- (h0-n-x0)-t]-n-x0/hQ

(6)

Таким образом, степень модификации мишени [рг]/р0 в соответствии с этим уравнением зависит от начальных концентраций реагента х0 и пероксида водорода 110. Для обработки экспери-

ментальных данных последнее уравнение было приведено к более простому выражению:

№ 1 - ехр! -*-

где к(1) = к0'Кх-(Ь0^п-х0)-хо/(1+Кх-х0)

-А]}

(7)

к (2) = кй-Ь0 А = п'хо/Ьо

(8) (9) (10)

Для проверки выполнимости предложенной схемы была исследована эффективность модификации в модельном дуплексе при различных начальных концентрациях реагента ха и пероксида водорода ьп.- А

рТСААТвввААвА

шит

ТТАСССТТрРв(Ш)ООР Из экспериментальных зависимостей эффективности модификации от времени по уравнению (7) с помощью программы нелинейной регрессии были оценены величины к(1) и к(2) при определенном выше среднем значении п=35. По уравнению (9), описывающему зависимость к(2) от ьо, из данных, представленных на рис.2,б, было найдено значение константы деструкции гемино-вой группы кй=152±б ы~1мин~1. Полученное значение к^ хорошо согласуются с величиной, полученной по уравнению (2). Из зависимости к(1) от начальной концентрации реагента, представленной на рис.з,а, были определены значения ^=(1,0±0,6)-10^ М-1 и ко=42,3±6,0 М_1мин~1.

Предельная степень модификации при I —► ® описывается двумя уравнениями: при ь0*п-х0

—-— = 1 - ехр

V1

кЛ (1 +

при Ь0»1-х0 СРг]„

= 1 - ехр

кЛ ТГТ

Ухо Кх-хо}

(11)

(12)

При больших концентрациях реагента, когда к^-х,-,»! предельная степень модификации равна:

[р21я

= 1

ехр

(13)

се>

0,00 -1-1-1-»

0.00 1.00 , [ реагент ]"1ра , н

Рис.2, (а) зависимость параметра к(1) от концентрации реагента при постоянной концентрации пероксида водорода (5-Ю-4 М);

(б) зависимость параметра к(2) от концентрации пероксида водорода при постоянной концентрации реагента (1-ю~® М);

(в) зависимость предельной степени модификации от концентрации реагента при постоянной концентрации пероксида водорода (5-ю-4 Ы).

Зависимость предельной степени модификации от начальной концентрации реагента, представленная на рис.3,с, была использована для определения значения к. Рассчитанное по

С

уравнению (12) значение к^. составляет (3»40±0,38)-1Сг ы и имеет меньшую статистичесткую ошибку, чем значение к^., полученное по уравнению (8).

Таким образом, предлоаенная кинетическая схема в первом приближении хорошо описывает полученные результаты. Из нее следует, что предельная степень модификации мишени при х0 —♦ ® зависит только от отношения к0/кй (13). Для исследованной системы это отношение составило 0,33 и, следова-

тельно, предельная степень модификации ~ 0,3, что хорошо согласуется с экспериментальными данными. Однако при модификации 302-звенного фрагмента ДНК геминовым производным гек-садекануклеотида (I) предельная степень модификации составила 0,9. Ло-видимому, структура комплементарного комплекса может влиять на значение к0 за счет более оптимальной ориентации оксокомплекса но отношению к сайту окисления. Кроме того, предельная степень модификации будет увеличиваться с уменьшением скорости деструкции геминовой группы к^, что зависит от структуры лорфириновой группы.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые производные дезоксирибоолигонуклеоти-дов для сайт-направленной модификации нуклеиновых кислот, содержащие на 5'- или 3'-концевом фосфате остаток Ге(III)-порфирина:

а) присоединение диметилового эфира 2,4-ди[а-(2-гидрок-сиэтокси)этил]дейтеропорфирина ix (бвр ) или его комплекса с ионом железа осуществляли в ходе триэфирного синтеза, используя порфириновую группу в качестве ОН-компонента, выход на стадии конденсации превышал 90®.

б) присоединение наиболее распространенных в дрироде пор-фиринов - протогемина IX и дейтерогемина IX - осуществляли путем ацилирования аминогруппы спейсера, предварительно введенного по 5'- или 3*-концевому фосфату олигонук-леотида, ангидридом гемина в присутствии нуклеофильного катализатора.

2. Изучена сайт-направленная модификация фрагмента одноцепо-чечной ДНК комплементарными ей Ре(III)-порфириновыми производными гексадекануклеотида рЮЛСССТСТТСССАТТ в присутствии пероксида водорода. Показано, что все испытанные производные способны эффективно (до 90%) и селективно модифицировать фрагмент ДНК по ближайшим к сайту образования дуплекса гуанозиновым остаткам. В результате модификации наблюдается образование нескольких типов продуктов: 1) ковалентных аддуктов между мишенью и реагентом, 2) "скрытых" модификаций, к расщеплению цепи ДНК после обработки пиперидином, 3) деградации ДНК. Установлено, что

для всех исследованных Ре(ш)-порфириновых групп природного типа (производные дейтерогемина IX)' эффективность и направленность модификации ДНК практически одинакова," т.е., не зависит ни от боковых заместителей в порфирино-вом макроцикле, ни от точки связывания олигонуклеотида с порфирином.

3. Исследованы продукты окислительной модификации нуклеиновых кислот РеШПЭДР-производными на примере модельного частично самокомплементарного олигонуклеотида рСТССАССА, содержащего эту группу. Показано, что основным процессом является окислительная деструкция ароматического кольца гуанина, находящегося вблизи сайта связывания реагента. В результате «реакции происходит преимущественно апуриниза-ция (г80%) и, с малым выходом, образование "пиперидин-лабильных" продуктов (¿20%), содержащих модифицированный нуклеозид, отличающийся по своим характеристикам от всех известных продуктов окисления гуанозина. На основании этого предложен эффективный способ расщепления нуклеиновых кислот модификацией Ре(Ш)-порфириновыми производными олигонуклеотидов с последупцей обработкой трипептидом Ьуз-Тгр-ЬуБ. В результате образуются свободные фосфатные концевые группы в сайте расщепления.

4. Предложена кинетическая схема процесса адресованной модификации нуклеиновых кислот Ре(III)-порфириновыми производными олигонуклеотидов, учитывавшая протекание двух параллельных процессов: деструкцию порфириновой группы в составе производного олигонуклеотида и каталитическое разложение окислителя (пероксида водорода). Получены уравнения, описывапцие зависимость от времени деструкции Ре(Ш)-порфириновой группы в реагенте и процесса модификации нуклеиновой мишени. Для модели рТСАатс<хааса (мишень) - Ре(III^БР-рТТСССАТТ (реагент) определены эффективная константа связывания реагента • с мишенью КХ=(3,40±0,38)-105"М-1 и кинетические константы процесса: константа скорости деструкции порфириновой группы в производном олигонуклеотида ^=152*6 М-1 мин"1 и константа скорости модификации нуклеиновой мишени ко=42,3±б,0 М~1мин"1.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в

следующих сообщениях;

1. Иванова Е.М., Мамаев C.B., Федорова О.С., Фролова Е.И. Комплементарно-адресованная модификация одноцепочечного фрагмента ДНК лселезопорфириновыми производными олигонук-леотидов.//Биоорг.химия. 1988. Т.14. С.551-554.

2. Prolova, E.I., Ivanova, E.I., Zarytova, У.P., Abramo-va, T.Y. and yiasaov, У.У. Porphyrin-linked oligonucleotides: sinthesis and sequence-specific modification of ssDNA. //FEBS Lett. 1990. У.269. P.101-104.

3. Prolovâ,. E.I., Komorova, N.I., Ivanova, E.M., Ponomariov, G.y., Kirillova, G.y., yia3S0v, У.У. New porphyrin-linked oligonucleotide derivatives for sequence-specific chemical modification of DNA. Nucl.Acid.Symposium Series. 1991. N,24. P.286.