Взаимодействие апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека с ДНК-интермедиатами и белками репарации и репликации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ДЫРХЕЕВА НАДЕЖДА СЕРГЕЕВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 ЧЕЛОВЕКА С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ И БЕЛКАМИ РЕПАРАЦИИ И РЕПЛИКАЦИИ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степен.. кандидата химических наук

Новосибирск - 2009

003482724

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научные руководители:

д.х.н., профессор, чл.-корр. РАН Лаврик Ольга Ивановна к.б.н., доцент Ходырева Светлана Николаевна

Официальные оппоненты:

д.х.н. Кубарева Елена Александровна к.б.н. Захарова Ольга Дмитриевна

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится " 12. " ноября 2009 г. в 1530 часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: Новосибирск, 630090, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте vmw.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан " " октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Макромолекула ДНК подвержена спонтанному разрушению, а также повреждениям под действием различных эндогенных продуктов и внеклеточных агентов природного и искусственного происхождения. В клетке существует несколько путей репарации ДНК. Система эксцизионной репарации оснований (ЭРО) удаляет поврежденные азотистые основания и апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты, образующиеся либо в результате спонтанной потери основания, либо под действием ДНК-гликозилаз, расщепляющих N-гликозидную связь поврежденных нуклеотидов. АР-сайты являются субстратами для АР-эндонуклеаз, например для АР-эндонуклеазы 1 человека (АРЕ1), разрезающих ДНК с 5'-стороны от AP-сайта, в результате чего образуется З'-ОН группа и 5'-дезоксирибозофосфат (dRp). Помимо эндонуклеазной, АРЕ1 обладает З'-фосфодиэстеразной, З'-фосфатазной и 3-5'-экзонуклеазной активностями. На сегодняшний день известна последовательность стадий и основные участники ЭРО, однако механизмы регуляции системы репарации остаются объектом пристального изучения. Предполагается, что действие всех белков-участников ЭРО координировано, а АРЕ1, возможно, играет роль одного из координаторов (Wilson and Kunkel, Nature Struct. Biol. 2000, 7, 176). Известно также, что APE1 может выщеплять неканонически спаренные нуклеотиды более эффективно, чем правильно спаренные. На основании этих данных было выдвинуто предположение (Chou and Cheng, Nature 2002, 415, 655), что APE1 может выполнять в ЭРО роль "корректора" ошибок, допущенных ДНК-полимеразой ß (ß-полимеразой).

Целью работы являлось исследование 3-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 и взаимодействия АРЕ1 с олигонуклеотидными ДНК-интермедиатами ЭРО и других процессов метаболизма ДНК, а также с ß-полимеразой и другими белками. В ходе работы решались следующие задачи: 1) исследование зависимости экзонуклеазной активности АРЕ1 от структурных особенностей ДНК-дуплекса, условий реакции и стабильности дуплекса; 2) анализ экзонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к природным нуклеотидам в составе канонической или неканонической пары, а также к ddNMP и к аналогам dNMP, содержащим вместо дезоксирибозы остаток морфолина; 3) анализ экзонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к аналогам dCMP замещенным по экзо-№положению фотоактивируемыми группами; 4) исследование с помощью методов задержки в геле и фотоаффинной модификации взаимодействия АРЕ1 с олигонуклеотидными ДНК-интермедиатами репарации и репликации ДНК, а также с ß-полимеразой, при совместном присутствии рекомбинантных очищенных белков и в клеточном экстракте; 5) исследование взаимного влияния АРЕ1 и ß-полимеразы на полимеразную и 3-5'-экзонуклеазную активности соответственно, а также на зависимость экзонуклеазной активности АРЕ1 от присутствия белковых факторов RPA

(репликативный белок А) и XRCC1 (белок, входящий в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению).

Научная новизна и практическая значимость. Проведено систематическое изучение в различных реакционных условиях (зависимость от солей и pH) 3—5'-экзонуклеазного гидролиза с З'-конца праймера, катализируемого АРЕ1, природных dNMP и их аналогов. Для нескольких типов ДНК-дуплексов впервые исследован гидролиз АРЕ1 всех возможных сочетаний пар природных dNMP в составе канонической или неканонической пары на З'-конце праймера, из нескольких типов ДНК-дуплексов. Показано, что аналоги dNMP с заменой дезоксирибозы на морфолин (З'-МогВ), расположенные на З'-конце праймера, в целом, более устойчивы к действию 3-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1, чем ddNMP. Для каждого ряда установлен максимально устойчивый аналог. Для фотоаффинной модификации белков и ДНК в АРЕ 1-содержащих системах рекомендован к применению один из четырех исследованных фотоактивируемых аналогов dCTP, который при встраивании в ДНК в качестве аналога З'-dCMP, наименее подвержен воздействию экзонуклеазной активности АРЕ1. Полученные в работе результаты позволяют рекомендовать условия реакции, в которых уровень 3'-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 высок, либо, наоборот, низок. Например, условия с низкой активностью необходимы для проведения экспериментов по фотоаффинной модификации в АРЕ 1-содержащих системах, чтобы фотоактивируемый аналог не выщеплялся с З'-конца праймера. Впервые на основании анализа данных термической денатурации ДНК-дуплексов и экзонуклеазного гидролиза, катализируемого АРЕ1, показано, что фермент при проявлении экзонуклеазной активности действует специфично в зависимости от природы группы, фланкирующей разрыв/брешь с 5'-стороны, и что эта активность АРЕ1 в значительной мере определяется способностью ДНК-дуплекса "подплавляться" с З'-конца. Впервые для частичного ДНК-дуплекса с утопленным З'-концом (ДНК-гес) показано, что АРЕ1 повышает активность ß-полимеразы, RPA ингибирует, a XRCC1, наоборот, стимулирует 3-5'-экзонуклеазную активность АРЕ1.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 1 обзор. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «Chemical and biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004; «International conference on chemical biology», Новосибирск, 2005; FEBS School «Chemistry meets biology», Спетсес, Греция, 2005; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006; «31st FEBS Congress», Стамбул, Турция, 2006; «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; «Russian-European workshop on DNA repair and epigenetic regulation of genome stability», Санкт-Петербург, 2008.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Работа изложена на 141 странице, содержит 33 рисунка, 16 таблиц и список цитируемой литературы из 190 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.3'-5'-экзонуклеазная активность АРЕ1

3'-5'-экзонуклеазная активность АРЕ1 ранее не считалась биологически значимой, поскольку она на несколько порядков ниже, чем АР-эндонуклеазная. Однако интерес к этой активности возник вновь, так как АРЕ1 была идентифицирована как экзонуклеаза, эффективно выщепляющая с З'-конца одноцепочечного разрыва некоторые аналоги нуклеотидов и неправильно (неканонически) спаренные нуклеотиды (Chou and Cheng, Nature 2002, 415, 655). На основании этих данных было выдвинуто предположение, что АРЕ1 может быть в ЭРО "корректором" ошибок, допущенных Р-полимеразой - основной полимеразой этого процесса, которая не имеет собственной корректирующей активности. Точность репарационного синтеза ДНК in vivo заметно выше обнаруживаемой in vitro, поэтому представляет интерес выявление факторов, повышающих точность синтеза в процессе репарации.

Таблица 1. Основные ДНК-дуплексы, используемые в работе

Структура и последовательность ДНК-дуплексов 5'—»3' 3'—»5' Обозначение

*pGGCGATTAAGTTGGG-X CCGCTAATTCAACCC-Y-TTGCAGTCCCAGAAGG ДНК-гес

р-5' *pGGCGATTAAGTTGGG-X AACGTCAGGGTCTTCC CCGCTAATTCAACCC -Y-TTGCAGTCCCAGAAGG ДНК(М,-р

pF-5' *pGGCGATTAAGTTGGG-X AACGTCAGGGTCTTCC CCGCTAATTCAACCC -Y-TTGCAGTCCCAGAAGG flHK(M)-pF

*pGGCGATTAAGTTGGG-X 5'AACGTCAGGGTCTTCC CCGCTAATTCAACCC- Y -TTGCAGTCCCAGAAGG ДНК(М,-ОН

5'-CATCCACA *pGGCGATTAAGTTGGG-X AACGTCAGGGTCTTCC CCGCTAATTCAACCC -Y-TTGCAGTCCCAGAAGG ДНК(М)-Аар

p-5' * pGGCGATTAAGTTGGG-X ACGTCAGGGTCTTCC CCGCTAATTCAACCC -Y-TTGCAGTCCCAGAAGG flHKlM)-gap

*р - [нР]-меченая фосфатная группа на 5'- конце олигонуклеотида.

X - с1ИМР, сШМР, З'-МогВ (ДНК), ГАВСМСМР, РАВСс1СМР, РАВСсЮМР или ИАРаСМР (ДНКМ), У

-аымр.

В настоящей работе при определении эффективности катализируемого АРЕ1 3'-5'-экзонуклеазного выщепления с З'-конца праймера природных сММР и их аналогов был исследован ряд параметров: зависимость активности от "каноничности" пары, которую формирует З'-концевой сПЧМР, влияние условий реакции (концентрации солей и рН) и структуры ДНК-дуплекса. Известно, что структура ДНК-дуплекса и, в частности, природа 5'-концевой группы,

фланкирующей одноцепочечный разрыв/брешь, заметно сказывается на 3-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1. В ходе работы было использовано несколько типов ДНК-структур: частичный ДНК-дуплекс с утопленным З'-концом (ДНК-гес); ДНК, в которой олигонуклеотид, фланкирующий разрыв с 5-конца, имел одноцепочечный 5'-концевой участок - флэп - (ДНК-flap); ДНК-дуплексы с разрывом, в котором запирающий олигонуклеотид с 5'-конца фланкирован гидроксильной (ДНК-ОН), фосфатной (ДНК-р) или З-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуранофосфатной (ДНК-pF) группами (табл. 1). 3-Гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуран (F) - аналог дезоксирибозы в составе синтетического AP-сайта, неспособный подвергаться ß-элиминированию. ДНК-дуплекс с S'-pF-группой, фланкирующей брешь или разрыв, можно рассматривать как модель ДНК-структуры, возникающей при переключении ЭРО с короткозаплаточного пути, в котором полимераза "встраивает" один нуютеотид, на длиннозаплаточный, с синтезом участка в 2-7 нуклеотидов. Такое переключение происходит в случае, когда ß-полимераза с помощью своей лиазной активности не может удалить модифицированный сахарофосфат, например 5'-pF группу. ДНК-flap моделирует структуру, возникающую в ходе длиннозаплаточной ЭРО при синтезе с вытеснением цепи. ДНК-структура с 5'-р группой в одноцепочечном разрыве (ДНК-р) является моделью интермедиата ЭРО, возникающего на этапе заполнения бреши и подлежащего лигированию. ДНК-структуры, содержащие 5'-гидроксильную группу в разрыве (ДНК-ОН), могут возникать вследствие потери фосфата. Экзонуклеазная активность АРЕ1 на различных ДНК-дуплексах снижалась согласно следующей закономерности: ОН > flap > rec > р > pF (рис. 1).

12 3 4 5 6 Рисунок 1. Влияние группы на 5'-конце разрыва на

АРЕ1: -+ + + ++ 3'-5'-экзонуклеазную активность АРЕ1 На рисунке

исжцтй представлен радиоавтограф геля после разделения

праймер is нт -» ««и»» я*** ^ «w» «цр, продуктов экзонуклеазной реакции. Условия

Г"хя>"ь' 1 " реанц,,,,. 25 Мм Hepes (pH 7.0), 50 мМ KCl, 1 мМ

экзонуклеазной реакции

АРЕ1 (5 нМ) инкубировали с 20 нМ ДНК-# о^ Ч дуплексом , содержащим сГГМР на З'-конце (в паре

^^ ^г Т/А) (структуры дуплексов представлены в табл. 1).

V "V "V Дорожка 1 - контроль без фермента.

Эффективность эндонуклеазной и экзонуклеазной реакций, катализируемых АРЕ1, зависит от условий реакции, при этом оптимальные условия для двух данных активностей различны. Была изучена зависимость эффективности экзонуклеазной активности от условий реакции: буферного состава, рН, концентрации ионов К+ и М§2+, необходимых для катализа реакции. В представленной работе для различных задач было использовано 20 реакционных условий. Экзонуклеазная активность АРЕ1 значительно повышалась в условиях снижения рН с 8.0 до 7.0 и концентрации солей КС1 и М§С12, по сравнению с оптимумом для эндонуклеазной активности.

1.1. Эюонуклеазное выщепление АРЕ1 природных нуклеотидов

На первом этапе работы была изучена экзонуклеазная активность АРЕ1 по выщеплению ёСМР и с)ТМР с З'-конца праймера в одноцепочечном разрыве, поскольку фотоактивируемые производные ёСТР (рис. 2), исследование выщепления которых описано в разделе 1.2, за счет сдвига таутомерного равновесия могут имитировать как (1СТР, так и сЗТТР. В исследовании использовано четыре типа ДНК-структур, два из которых имеют на З'-конце праймера каноническую пару (СЮ и Т/А, где первая буква - первый нуклеотид в праймере, атакуемый АРЕ1, вторая буква - нуклеотид в матрице напротив), а два других - неканоническую пару (ТАЗ и С/А). Структура ДНК-дуплексов приведена в табл. 1. Эффективность выщепления природных <1>)МР АР-эндонуклеазой 1 уменьшалась в ряду: С/А>ТЮ>Т/А>СЮ. Полученный рад трудно сопоставить с литературными данными, поскольку такое сочетание нуклеотидных пар на З'-конце праймера отличается от исследованных ранее. Авторы различных работ используют для исследования экзонуклеазной активности АРЕ1 ДНК-структуры с разнообразным сочетанием нуклеотидных пар Х/У, где X - (11>}МР на З'-конце праймера, выщепляемый АР-эндонуклеазой 1, а У - нуклеотид в матрице напротив. Из-за этого литературные данные по экзонуклеазной активности зачастую трудно сопоставить и проанализировать, как было и в нашем случае. Поэтому нами были исследованы все возможные сочетания пар Х/У в реакции экзонуклеазного гидролиза, катализируемого АРЕ1. В целом найденные закономерности подтвердили факт более эффективного выщепления остатка с1№ЛР из состава неканонической пары, по сравнению с канонической. Эффективность выщепления ёСМР, сГГМР и сЮМР с З'-конца праймера укладывается в ряд: С/С<С/А<С/С<С/Т, Т/А<Т/С<Т/С~Т/Т, С/С<С/С~С/А~С/Т. При наличии на З'-конце праймера одного из этих трех нуклеотидов, независимо от типа ДНК-дуплекса, наименее эффективно выщепляется из канонической пары (СЮ, Т/А, й/С). Однако для 3'-

концевого (1АМР эффективность выщепления не зависит от каноничности пары, а ряды эффективности гидролиза варьируют для разных типов ДНК-дуплексов.

1.2. Экзонуклеазное выщепление АРЕ1 фотоактивируемых аналогов <1СМР

Производные пиримидиновых дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов, замещенные

по экзо-Ы-положению фотоактивируемыми группами, являются эффективными субстратами всех исследованных ДНК-полимераз. Такое свойство данных производных используется для синтеза праймеров, содержащих на З'-конце фотореакционноспособный нуклеотид, с целью последующего их применения для аффинной модификации белков (Драчкова с соавт., Биоорган, химия 2001, 27, 197; Сафронов с соавт. Биоорган, химия 1997, 23, 576). Изучение эффективности выщепления данных аналогов важно при их применении в фотоаффинной модификации белков и ДНК в реконструированных системах, клеточных и ядерных экстрактах, содержащих АРЕ1, во избежание возможного выщепления З'-ёЫМР и снижения, вследствие этого, уровня модификации.

ООО "ОРОРО-Р-6- й- й-

«н-Ф

N,

FABO-dGTP - Ж-[(4-азидо -2,3.5,«-тетрафторбензилцяенамимаокси)-6утипоиси]-?-дезоксици™дин 5'-трифосфат

FABC-dCTP -экм-Ы-{2-(4-азвдо -2.3.5.6-тетрзфторбензмлшенаминооксимегил-кар6амип)-этил]-2'-двэтжсииитидин 5'-трифосфат

НМ

I

1 ^"^N^lfF

FAP-dCTP - 3K30-N-(2-N-(N-(4-a3Hao -2.5-дифтор-3-хлорлиридин-6-ил)-3-амннопролионил)-аминоэтил]-2'-дезо*смцитидин Б'-трмфосфат

FABG-dCTP - экэо-М-[4-<4-азидо -2.3.5.6-тетрафтор6визил«дем-гидразинокарбонил)-бутилкарбамиг)-2'-дезсжсициттин Б'-трифосфат

Рисунок 2. Структурные формулы и обозначения фотоактивируемых аналогов dCTP.

В работе было использовано четыре аналога dCTP (Ср), их структура в форме дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов и краткие обозначения приведены на рисунке 2. Структура линкера, присоединяющего фотоактивируемую группу к основанию по этому положению, может влиять на сдвиг таутомерного равновесия от амино-к иминоформе, изменяя свойства аналога субстрата в реакции элонгации праймера различными ДНК-полимеразами от dCTP-подобного к dTTP-подобному. Руководствуясь этим, для формирования ДНК-дуплексов были использованы два типа ДНК-матриц с dAMP (А) и dGMP (G) напротив Ср, находящегося на З'-конце праймера в одноцепочечном разрыве. Таким образом, были сформированы ДНК-дуплексы с предположительно каноническими (C/G) и неканоническими (Ср/А) парами на З'-конце праймера. Представляло интерес установить, существует ли корреляция между проявлением экзонуклеазной активности АРЕ1 и способностью аналога dNMP образовывать каноническую пару с основанием матрицы. Для оценки "каноничности" пары, образованной модифицированным аналогом и dNMP матрицы, было применено два подхода. Первый заключался во встраивании с помощью Р-полимеразы в З'-конец одноцепочечного разрыва природного dNTP после фотоаналога, поскольку известно, что после неправильно спаренных З'-концевых остатков dNMP удлинение цепи p-полимеразой проходит неэффективно (Beard et al., J. Biol. Chem. 2004, 279, 31921). Во втором случае изучали зависимость эффективности

лигирования одноцепочечного разрыва с фотоаналогом на З'-конце от того какой нуклеотид - А или G - находится напротив, поскольку наличие неканонической пары на З'-конце разрывов в ДНК снижает эффективность восстановления целостности сахарофосфатного остова Т4 ДНК-лигазой (Wu and Wallace, Gene 1989, 76, 245). Данные о «каноничности» пар нуклеотидов, полученные с использованием этих тестов, хорошо согласуются с субстратными свойствами аналогов dCTP в реакции элонгации праймера с помощью Р-полимеразы (Драчкова с соавт., Биоорган, химия 2001,27,197).

Кроме того, результаты этих тестов согласуются с данными по зависимости экзонуклеазного гидролиза фотоаналога АРЕ1 от природы нуклеотида- А или G, находящегося напротив фотоактивируемого аналога. По совокупности данных, FABGdCMP, FABCdCMP и FAPdCMP являются в большей степени аналогами dCMP (С), чем dTMP (Т), a FABOdCMP является в равной степени аналогом как С, так и Т. Для фотоаффинной модификации белков и ДНК в АРЕ 1-содержащих системах был рекомендован FAPdCTP, как наименее выщепляемый АРЕ1 в форме З'-концевого монофосфата.

1.3. Экзонуклеазное выщепление АРЕ1 З'-dNMP и их аналогов, модифицированных по рибозе

По литературным данным (Chou et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 31009) APE1 эффективно выщепляет такие модифицированные аналоги З'-dNMP как З'-азидо-З'-дезокситимидин и 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидин, применяемые в анти-ВИЧ терапии, а также аналоги с L-конфигурацией и P-L-диоксоланцитидин -терминатор репликации, используемый в некоторых антивирусных и антираковых схемах лечения. Аналоги dNTP, содержащие вместо дезоксирибозы остаток морфолина (МогВ, В=А, С, G или U, рис. 3), являются терминаторами элонгации ДНК благодаря введению модифицированного остатка dNMP по 3'-концу растущей цепи ДНК. На основании исследования субстратных свойств МогВ в реакции элонгации ДНК-праймера, катализируемой различными ДНК-полимеразами, были выдвинуты предположения о возможности использования МогВ в качестве избирательных ингибиторов обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (HIV-1 RT) (Лебедева с соавт., Биохимия 2005, 70, 1). Анализ экзонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к таким аналогам важен для поиска наиболее эффективных и стабильных путей ингибирования индуцируемого вирусом синтеза ДНК, поскольку 3'-5'-экзонуклеазное выщепление остатка аналога может полностью нейтрализовать его ингибирующее воздействие на синтез вирусной ДНК. В настоящей работе исследована способность АРЕ1 выщеплять с З'-конца праймера ДНК-дуплекса с

ООО О

"ОР-ОРОРО-; -О Ó" Ó- 0"

В = А, С, G, и

4N' H

Рисунок 3. Структурные формулы аналогов dNTP -морфолидатов (МогВ). В=А, С, G или U.

выступающей матричной цепью остатки морфолинонуклеозидтрифосфатов (3'-МогА, З'-МогС, З'-MorG, З'-MorU), по сравнению с природными dNMP и ddNMP. Были определены кинетические параметры реакции выщепления З'-концевых остатков природных dNMP и аналогов dNMP (ddNMP и З'-МогВ).

Параметр к^, практически не отличается для различных ДНК-структур, при этом четких зависимостей от того, какое основание входит в состав нуклеотида, не наблюдается. Параметр Кт, напротив, заметно изменяется для разных ДНК-структур. Таким образом, каталитическая эффективность реакции экзонуклеазного гидролиза, которая оценивалась по соотношению kca/Km (табл. 2), в значительной мере зависит от величины Km. ddNMP выщепляются АРЕ1 с З'-конца наиболее эффективно по сравнению с dNMP и З'-МогВ, независимо от того, какое азотистое основание входит в состав нуклеотида. В случае, когда в состав нуклеотидов и их аналогов входит С или А, более эффективно выщепляется dNMP, чем З'-МогВ, а в случае G и Т - наоборот. Для dNMP и ddNMP каталитическая эффективность экзонуклеазной реакции, катализируемой

АРЕ1, падает в ряду: A/T>C/G>G/C>T/A. Для

морфолидатов наблюдается совсем другая зависимость: 3'-МогА/Т>3'-MorU/A>3'-MorG/03'-MorC/G (табл. 2). Поскольку З'-МогВ являются менее подверженными гидролизу, чем ddNMP, З'-МогС в составе канонической пары является наименее выщепляемым АРЕ1 из исследованных терминирующих аналогов, модифицированных по остатку рибозы.

Таким образом, возможно, МогВ, и в особенности МогС, являются более предпочтительными противовирусными агентами, чем ddNTP.

1.4. 3 '-5 '-экзонуклеазная активность АРЕ1 и стабильность ДНК-дуплекса

В работе (Chou and Cheng, J. Biol. Chem. 2003, 278, 18289) было сделано предположение, что различия в оптимальных условиях экзонуклеазной и эндонуклеазной активностей АРЕ1 могут быть обусловлены влиянием ионной силы на изменение конформации белка. Мы предположили, что такие различия могут быть обусловлены еще и влиянием на стабильность ДНК-дуплекса. Термическая денатурация ДНК-дуплексов является информативным методом для выявления влияний структурных особенностей ДНК на ее стабильность.

Таблица 2. Каталитическая эффективность (kcai/Krax 1000, (мин нМ)"1) катализируемого АРЕ1 экзонуклеазного выщепления З'-dNMP и аналогов, модифицированных по рибозе

Аналог Основанйе^^ dNMP ddNMP З'-МогВ

А 1.5 19 1.1

С 0.94 1.7 0.58

G 0.69 1.6 0.70

Т 0.55 1.2 0.85

Для каждой точки проводилось 3-4 эксперимента. Расчетное значение полученных параметров усредняли. Разница между средним значением и крайним значением составляла не более 10% от среднего.

Для оценки возможного влияния различных реакционных условий на стабильность ДНК-дуплексов и эффективность экзонуклеазного выщепления АР-эндонуклеазой 1 ёЫМР с З'-конца праймеров были проведены эксперименты по анализу термостабильности и устойчивости к экзонуклеазному гидролизу в одних и тех же условиях.

■ % иерасщеплениого ДНК-еубстрат* " Тгморрятуря плавления (Тил), "С

днк-он

ДНК-Пар

ДНК-гес

ДНК-р

ДНК-pF

56 60 55 50

Т/А С/А Т/О C/G

Т/А С/А Т/О C/G

T/AC/AT/GC/G

Т/А СМ T/G C/G

Т/А С/А T/G С/С

Рисунок 4. Корреляция между эффективностью экзонуклеазной активности и термостабильностью ДНК-дуплекса, в зависимости от типа канонической/неканонической пары на З'-конце. Состав буфера: 50 мМ Tris-HCI pH 8.0, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCh,

Эксперименты проводили с различными типами ДНК-дуплексов, содержащих каноническую (Т/А и C/G) или неканоническую (T/G и С/А) пару на З'-конце. Сопоставление уровня 3'-5'-экзонуклеазной активности с термостабильностью ДНК-дуплексов показано на рис. 4. Термостабильность повышалась соответственно следующему ряду: С/А < T/G < Т/А < C/G для всех ДНК-дуплексов, независимо от типа (и присутствия) запирающего праймера. Выход продуктов экзонуклеазной реакции также снижался в соответствии с этим рядом (раздел 1.1). Таким образом, обнаружена корреляция между эффективностью экзонуклеазной активности и термостабильностью ДНК-дуплекса, в зависимости от типа канонической/неканонической пары на З'-конце.

АРЕ1 требуется, по крайней мере, четыре нуклеотида с 5'-стороны и три нуклеотида с З'-стороны от AP-сайта для проявления основной эндонуклеазной активности. Формы АРЕ1, содержащие мутации по аминокислотам, находящимся в активном центре эндонуклеазного гидролиза, имели значительно сниженную экзонуклеазную активность. Таким образом, группа, фланкирующая разрыв с З'-стороны, вероятно, находится в экзонуклеазной активном центре и может влиять на эффективность этой реакции. Методом термической денатурации проведен систематический анализ влияния 5'-концевой группы, фланкирующей разрыв, на стабильность различных типов ДНК-дуплексов в нескольких используемых для экзонуклеазной реакции АРЕ1 условиях. В качестве иллюстрации на рис. 5 приведены данные для одного из буферов и ДНК с парой А/С на З'-конце праймера.

Для всех исследованных типов ДНК-дуплексов с каноническими (Т/А и C/G) или неканоническими парами на З'-конце праймера термостабильность убывает в

следующем ряду: ОН > р > pF > rec > flap. Эффективность выщепления З'-dNMP АРЕ1 зависит от типа 5'-фланкирующей группы следующим образом: ОН > flap > rec > р > pF. Зависимость уровня экзонуклеазного гидролиза, катализируемого

АРЕ1, была сопоставлена с зависимостью термостабильности от природы 5'-группы. ДНК-структура с одноцепочечным разрывом, содержащая 5'-ОН группу (ДНК-ОН), оказалась наиболее стабильной, но экзонуклеазная активность на такой структуре также наиболее высока. В случае ДНК-дуплексов с различными 5'-группами не наблюдается корреляции между стабильностью дуплекса и экзонуклеазной активностью, и тип 5'-группы значительно влияет на эту активность.

Таким образом, экзонуклеазная активность АРЕ1 проявляет значительную специфичность по отношению к ДНК-субстрату на этапе узнавания ДНК-структуры ферментом, и, видимо, при этом имеет значение структура 5'-конца разрыва. В то же время, на эффективность катализа реакции экзонуклеазного гидролиза влияет стабильность ДНК-дуплекса, точнее, способность ДНК "подплавляться" с З'-конца разрыва.

2. Взаимодействие АРЕ1 с ДНК и другими белками

Помимо предположения о роли АРЕ1 как "корректора" ошибок, допущенных ß-полимеразой, существуют и другие модели взаимодействия этих двух белков-участников ЭРО. Находясь на AP-сайте, АРЕ1 способствует связыванию ß-полимеразы с нерасщепленным AP-сайтом ДНК, а также стимулирует как катализируемый ß-полимеразой синтез ДНК с вытеснением цепи, характерный для репарации по длиннозаплаточному пути, так и лиазную активность этого фермента (Sukhanova et al., Nucleic Acids Res. 2005, 33, 1222; Bennet et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA. 1997, 94, 7166). Эти результаты послужили основой для предположения о координации действий АРЕ1 и ß-полимеразы на начальных этапах короткозаплаточного пути ЭРО. По данным различных авторов АРЕ1 также стимулирует ферментативные активности различных ДНК-гликозилаз, флэпэндонуклеазы 1 и ДНК-лигазы I. Механизмы регуляции системы репарации

Температура, °С

Рисунок 5. Дифференциальные оптические кривые плавления для различных ДНК-дуплексов (ДНК-гес, ДНК-ОН, ДНК-р, ДНК-рЯ, ДНК-Пар). Структуры дуплексов приведены в табл. 1. На рисунке приведен пример плавления ДНК с парой А/С на З'-конце праймера в буфере, содержащем 50 мМ Тле-НС! рН 8.0, 50 мМ КС1, ЮмММвСЬ.

остаются объектом пристального изучения. Предполагается, что действие белков-участников ЭРО в ходе исправления повреждения координировано, а АРЕ1, возможно, играет роль одного из координаторов на протяжении всего процесса.

2.1. Фотоаффинная модификация и связывание с различными ДНК-дуплексами АРЕ1 и Р-полимеразы

Изучение взаимодействия АРЕ1 и Р-полимеразы с ДНК проводили с помощью методов задержки в геле и фотоаффинной модификации. ДНК-структуры, применяемые для фотоаффинной модификации, содержали на 3'-конце праймера модифицированный нуклеотид (Ср) с фотоактивируемой группой (рис. 2.). Набор структур (табл. 1), содержащих различные группы на 5'-конце одноцепочечного разрыва, был расширен по сравнению с ранее исследовавшимся. Для фотоаффинной модификации в АРЕ 1-содержащих системах нами был выбран наименее выщепляемый аналог dCMP (FAPdCMP) из четырех исследованных фотоактивируемых производных (раздел 1.2). На основании полученных результатов были подобраны такие условия фотоаффинной модификации, при которых З'-концевой FAPdCMP, комплементарный dGMP матрицы, незначительно выщеплялся АРЕ1.

Для очищенных рекомбинантных белков показано (данные не представлены), что АРЕ1 модифицируется наиболее эффективно ,HHKM-pF, а p-полимераза — ,DHKM-gap. ДНКм-рР представляет собой модель ДНК-структуры, возникающей при переключении ЭРО с короткозаплаточного пути на длиннозаплаточный. ,HHKM-gap имитирует ДНК-интермедиат, возникающий в ходе репарации ДНК и являющийся основным субстратом Р-полимеразы.

На рис. 6 Б приведены результаты электрофоретического разделения продуктов модификации белков клеточного экстракта эмбриональных фибробластов мыши (MEF), в котором присутствуют АРЕ1 и p-полимераза, с использованием шести предсинтезированных ДНК-структур, содержащих фотоактивируемую группу на З'-конце праймера. Чтобы исключить влияние неодинакового превращения различных исходных ДНК в фотоактивные ферментами экстракта, в данной работе для модификации использовали предсинтезированные ДНК. Фотоиндуцируемое присоединение ДНК к белкам MEF-экстракта, как и в предыдущих работах, когда включение фотоактивных dCMP осуществлялось ДНК-полимеразами экстракта (Lavrik et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 25541; Cistulli et al., DNA Repair 2004, 3, 581), приводило к мечению ограниченного числа белков. Методом иммунопреципитации два из основных наблюдаемых продуктов были идентифицированы как P-полимераза и АРЕ1 (рис. 6 А).

В целом для белков MEF-экстракта и очищенных белков АРЕ1 и Р-полимеразы наблюдалась одинаковая зависимость эффективности модификации от природы 5'-группы ДНК-субстрата. P-полимераза в MEF-экстракте наиболее эффективно присоединяется к flHKM-gap, как и рекомбинантный белок. АРЕ1 в

наиболее эффективно присоединяется к ДНК, содержащей 5'-pF-rpynny в одноцепочечном разрыве, как в MEF-экстракте (Рис. 6 Б, дор. 3 и Lavrik et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 25541; Cistulli et al., DNA Repair 2004, 3, 581), так и к рекомбинантному белку.

t- Продукты

А фотомодификации

белков MEF-экстракта

§. Антитела

(Oi----------J

¥ С =

!■ г

11=' ||

с в-

I s а

г ^ о

о ч> ш о. а. 2

с С о

1 2 3 4 кДа

кДа

37-

FEN-1?-

- p-non/FLAG-p-ron " АРЕ1

FLAG-|3-non— АРЕ1 - S

-37

Рисунок 6. Фотоаффинная модификация белков МЕР-экстракта. А) Идентификация белков МЕР-экстракта АРЕ1 и Р-полимеразы (р-пол) в составе аддуктов с ДНК методом иммунопреципитации. Предсинтезированную ДНКм-рР, содержащую фотореакционноспособную группу, инкубировали с МЕР-экстрактом. Реакционную смесь облучали УФ-светом (Х=312 нм). Продукты фотомодификации представлены на дорожке 1. Иммунопреципитацию смеси проводили с преиммунной сывороткой (дорожка 4), антителами к Р-полимеразе и АРЕ1 (дорожки 2 и 3 соответственно). К реакционной смеси (100 мкл) после УФ-облучения добавляли 20 мкл преиммунной сыворотки или антител против АРЕ1 или Р-полимеразы, инкубировали 1 ч при 4°С. Затем комплекс адсорбировали на протеин-в-агарозе (20 мкл), уравновешенной буфером, рекомендованным производителем. Далее реакционные смеси обрабатывали согласно протоколу производителя протеин-О-агарозы. Продукты, специфически адсорбированные на протеин-О-агарозе, анализировали электрофорезом методу Лэммли в 15% ПААГ. Справа указано положение маркера молекулярной массы. Б) Фотоаффинная модификация белков МЕР-экстракта различными фотореакционноспособными ДНК-структурами. Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 50 нМ ДНКм-рР и 0.5 мкМ АРЕ1/р-полимеразу (дорожки 7, 8) или 100 нМ ДНК и белки МЕР-экстракта (в конечной концентрации 3.0 мг/мл) (дорожки 1-6). Реакционную смесь инкубировали с МЕР-экстрактом и облучали УФ-светом (Х=312 нм). Продукты реакции разделяли электрофорезом по методу Лэммли в 15% ПААГ. Слева указано положение маркера молекулярной массы.

Для сопоставления с данными, полученными фотоаффинной модификацией, была определена способность АРЕ1 связываться с расширенным набором ДНК-структур с помощью метода задержки в геле (данные не представлены). Обнаруженные закономерности связывания АРЕ1 и (3-полимеразы с ДНК-структурами хорошо соответствуют ряду эффективности образования фотоиндуцируемых ковалентных сшивок АРЕ1 с подобными ДНК-структурами. АРЕ1, как и следовало ожидать, наиболее эффективно связывается с ДНК-субстратом с тетрагидрофураном в центре одной из целых цепей. Р-полимераза с

максимальной эффективностью связывается с ДНК-структурами, содержащими однонуклеотидную брешь с 5'-р-группой.

В одной из недавно опубликованных работ проанализировано взаимодействие АРЕ1 и p-полимеразы в ходе короткозаплаточной ЭРО на ДНК-структурах, моделирующих интермедиа™ этого пути репарации (Liu et al., J. Biol. Chem. 2007, 282, 13532). В указанной работе с помощью метода задержки в геле авторы обнаружили тройной комплекс АРЕ1-Р-полимераза-ДНК только на ДНК, содержащих 5'-pF-rpynny. В наших условиях тройной комплекс также обнаружен на АР-ДНК и на структурах с одноцепочечным разрывом или брешью (данные не представлены). Более эффективное образование тройного комплекса наблюдается с ДНК с брешью в один нуклеотид с 5'-р-группой (,HHK2-p(gap), ДНК-gap), по сравнению с ДНК-дуплексами с 5'-pF-rpynnoñ (ДНК2-рР и в еще большей степени ДНК-pF).

2.2. Взаимодействие АРЕ1 с fi-полимеразой, RPA uXRCCl наДНК-гес

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Продукты достройки

Прай мер * 16 нт

р-полимераза АРЕ1

+ + + + +

0 40

&

1 30 •в"

О 20

Г

ДНК-р ДНК-Р+АРЕ1 л ДНК-гее

ДНК-гвс+АРЕ1

Г

б 8 10 12 1* 16 18 20 &ремя реакции, мин

Рисунок 7. Стимуляция синтеза ДНК, проводимого Р-полимеразой в присутствии АРЕ1 на ДНК-гес. А) Разделение продуктов полимеразной реакции электрофорезом в 20% денатурирующем ПААГ. Положение инициирующего гтраймера длиной 16 нуклеотшюв указано слева. Реакционные смеси содержали 20 нМ ДНК с С Ю- (дорожки 1-7) или в/С-парами (дорожки 8-13) на З'-конце праймера, 0.06 мкМ р-полимеразу, 1 мкМ АРЕ1, где указано, и 5 мкМ смесь четырех сНч'ТР, а также компоненты буфера: 50 мМ Тля-НС! рН 8.0, 50 мМ КС1, 10 мМ М^Ь. Б) Кинетические кривые синтеза ДНК в присутствии и в отсутствие АРЕ1 в реакционной смеси того же состава на ДНК-р или ДНК-гес, содержащей З'-Т/А-пару.

Как описано в разделе 1, ДНК с утопленным З'-концом (ДНК-гес) является более предпочтительным субстратом для 3'-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 по сравнению с ДНК-р и ДНК-рР. Однако комплекс АРЕ1-ДНК с таким субстратом образуется менее эффективно, чем с ДНК-р и ДНК-рР, также как и комплекс этого субстрата с р-полимеразой и тройной комплекс АРЕ1-Р-полимераза-ДНК. Считается, что в ходе ЭРО не возникают структуры, подобные ДНК-гес. Такой ДНК-дуплекс может моделировать структуры, возникающие в ходе других процессов метаболизма ДНК, например в репликации ДНК. Многие белки-участники длиннозаплаточного пути ЭРО являются компонентами

системы репликации ДНК, связывая, таким образом, процессы ЭРО и репликации.

Ранее было показано (Sukhanova et al., Nucleic Acids Res. 2005, 33, 1222), что APE1 стимулирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый (3-полимеразой, на олигонуклеотидных ДНК-субстратах с 5'-р- и 5'-pF-rpynnaMH, фланкирующими одноцепочечный разрыв. Согласно результатам, полученным в настоящей работе, АРЕ1 стимулирует синтез ДНК, проводимый Р-полимеразой, и на ДНК-rec (рис. 7). Сродство АРЕ1 к ДНК-rec низкое, но, возможно, оно повышается в присутствии других белков-участников репарации, присутствующих in vivo.

На сегодняшний день существует множество опубликованных данных rio влиянию различных белков на активности ферментов-катализаторов основных этапов репарации. Общая схема системы ЭРО построена, но не до конца понятна целиком, в частности, недостаточно изучены всевозможные взаимные влияния белков на активности друг друга. В настоящей работе было исследовано влияние на экзонуклеазную активность АРЕ1 двух белковых факторов - RPA и XRCC1.

Рисунок 8. Связывание АРЕ1 и RPA с ДНК. Реакционные смеси содержали 20 нМ ДНК-rec или ДНК-pF с З'-С/А парой на конце праймера, АРЕ1 и/или RPA в концентрации 0.2 мкМ, 0.2% SDS где указано. Состав реакционного буфера. 50 мМ Tris-HCl рН 8.0, 50 мМ KCI, 10 мМ MgCh. Продукты реакции разделяли электрофорезом в ПААГ в неденатурирующих условиях. Дорожка 9 - [згР]-меченый одноцепочечный праймер.

RPA - трехсубъединичный белок, выполняющий функцию связывания одноцепочечных участков ДНК в эукариотических клетках, участвующий во многих процессах метаболизма ДНК. В литературе есть данные о возможном участии RPA в ЭРО. Так, было обнаружено, что RPA связывается с АР-сайт-содержащей дцДНК более эффективно, чем с неповрежденной дцДНК, хотя и не с такой высокой эффективностью, как с оцДНК (Fan et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 3889). Было показано, что экзонуклеазная активность АРЕ1 в присутствии RPA ингибировалась на всех исследованных ДНК-дуплексах (ДНК-flap, ДНК-гес, ДНК-pF и ДНК-р, структуры дуплексов приведены в табл. I). Если в случае ДНК-гес можно было предположить, что ингибирование происходит из-за связывания RPA с 5'-выступающим одноцепочечным участком, то причина ингибирования на

трех других ДНК-субстратах с одноцепочечиым разрывом не так очевидна. Для выяснения возможной причины такого ингибирующего эффекта параллельно с разделением продуктов экзонуклеазного выщепления электрофорезом в денатурирующих условиях пробы разделяли в ПААГ в неденатурирующих условиях (рис. 8). Оказалось, что в используемых реакционных условиях ЯРА образует комплекс со всеми четырьмя ДНК-субстратами, в том числе с ДНК-Аар, ДНК-рР и ДНК-р. По данным контроля, показывающего целостность ДНК-дуплекса (рис. 8, дорожки 2 и 11), в присутствии ЯРА доля двухкомпонентного олигонуклеотидного комплекса ДНК-гес (табл. 1) от суммарной радиоактивности в дорожке снижается с накоплением нижнего продукта (рис. 8, дорожки 7, 8), соответствующего по подвижности [32Р]-меченому олигонуклеотиду. В случае трехкомпонентных олигонуклеотидных комплексов ДНК-рР, ДНК-йар и ДНК-р доля полного трехкомпонентного ДНК-дуплекса также снижается, в основном за счет увеличения доли ДНК-дуплекса, соответствующего по подвижности ДНК-гес (рис. 8, дорожки 16, 17). Возможно, такое образование структуры ДНК-гес из ДНК-структур с одноцепочечиым разрывом происходит за счет "подплавления" 11РА ДНК-дуплексов с 5'-стороны разрыва. Можно предположить, что после расщепления по АР-сайту "подплавление" ДНК ЯРА способствует достройке нескольких нуклеотидов и таким образом стимулирует переключение ЭРО на длиннозаплаточный путь.

1 2 з

...................

Исходный | праймер 16 нт ->| Продукты Г| экзонуклеазнсй § реакции Ц

хр;сс1 - +

Т/А

+

т/с

+

Т

+ ТЯ

100 200 300 400 500 600 700 800 [ХЯСС1], нМ

Рисунок 9. Стимуляция 3'-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 в присутствии ХЯСС1 на ДНК-гес. А) Реакционные смеси содержали 4 нМ АРЕ1, 20 нМ ХШХ1, 10 нМ ДНК, 25 мМ Нереэ рН 7.0, 25 мМ К.С1 и 2 мМ М^Ь,. ДНК-дуплексы содержали Зl-dTMP на конце праймера в составе нуклеотидных пар Т/А (дорожки I, 2), Т/С (дорожки 3, 4), Т/О (дорожки 5, 6), Т/Т (дорожки 7, 8). Б) Реакционные смеси содержали такие же буферные компоненты (А), а также 10 нМ ДНК с З'-Т/в-парой на конце праймера, 4 нМ АРН1, ХЯСС1 в указанных концентрациях. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% ПААГ. В контрольной смеси без АРЕ1, но в присутствии ХЯСО не наблюдалось продуктов расщепления ДНК. В контрольном эксперименте показано, что в отличие от XR.CC!, БСА не вызывает повышения экзонуклеазной активности АРЕ1.

Мы обнаружили, что на эффективность выщепления З'-сПЧМР из ДНК-гес АР-эндонуклеазой 1 влияет присутствие ХКСС1 (рис. 9). Х11СС1 не обладает собственной ферментативной активностью, но играет важную роль в координации ЭРО. Этот белок увеличивает эффективность ЭРО, формируя

прочный комплекс с ДНК-лигазой III и стимулируя активность Р-полимеразы. Известно, что XRCC1 стимулирует АР-эндонуклеазную и З'-фосфодиэстеразную активности АРЕ1 (Vidal et al., EMBO J. 2001, 20, 6530). Согласно полученным нами результатам, XRCC1 также повышает эффективность 3'-5'-экзонуклеазного выщепления АР-эндонуклеазой 1 как канонических (рис. 9 А, дорожки 1, 2), так и неканонических пар (рис. 9 А, дорожки 3-8). Стимуляция экзонуклеазной активности АРЕ1, вызываемая XRCC1, имеет колоколообразную зависимость от концентрации последнего (рис. 9 Б). Однако при высоких концентрациях XRCC1 наблюдается ингибирование экзонуклеазной активности АРЕ1 (рис. 9 Б, последняя точка).

В настоящей работе были подобраны оптимальные условия реакции 3-5'-экзонуклеазного гидролиза, катализируемого АРЕ1, и исследована зависимость этого процесса от структуры ДНК. Кроме того, согласно полученным результатам по влиянию RPA и XRCC1 на экзонуклеазную активность АРЕ1, на нее, помимо условий реакции, может влиять присутствие других белков. Например, XRCC1 стимулирует экзонуклеазную активность АРЕ1. Разнообразие белков ш vivo позволяет предположить, что значительная стимуляция экзонуклеазной активности АРЕ1 возможна в присутствии какого-либо из белков, либо в присутствии ансамбля белков. С другой стороны, АРЕ1 также влияет на активности других ферментов, например, стимулируя синтез ДНК, проводимый Р-полимеразой, причем не только на интермедиатах ЭРО, но и на ДНК-rec. Следовательно, АРЕ1 как экзонуклеаза, корректирующая ошибки за р-полимеразой, может быть вовлечена в другие процессы метаболизма ДНК, и регулироваться различными белок-белковыми взаимодействиями участников этих процессов.

ВЫВОДЫ

1. Для ДНК-дуплексов нескольких типов проведено систематическое изучение зависимости катализируемого апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой 1 человека (АРЕ1) 3'-5'-экзонуклеазного гидролиза природных дезоксинуклеозидмонофосфатов (dNMP) в составе канонической или неканонической пары, от ионной силы и рН. Впервые исследованы все возможные сочетания пар нуклеотидов на З'-конце праймера. Показано, что: • З'-концевые dCMP, dGMP или dTMP независимо от типа ДНК-дуплекса (например ДНК с разрывом или частичный ДНК-дуплекс) менее эффективно выщепляются из канонических пар (C/G, Т/А, G/C), и, в целом, эффективность гидролиза укладывается в ряды C/G<C/A<C/C<C/T, T/A<T/G<T/C~T/T, G/C<G/G~G/A~G/T для разных типов ДНК. Эффективность выщепления 3'-концевого dAMP не зависит от каноничности пары, а ряды эффективности гидролиза варьируют в зависимости от типа ДНК-дуплекса.

• 3'-5'-экзонуклеазная активность АРЕ1 зависит от типа ДНК-дуплекса, а для ДНК с одноцепочечным разрывом - и от природы 5'-концевой группы. Предпочтительными субстратами являются частичный ДНК-дуплекс, ДНК с 5'-свисающим одноцепочечным участком (флэпом) или 5'-гидроксильной группой, по сравнению с ДНК с 5'-фосфатной или 5'-тетрагидрофуранофосфатной группой в одноцепочечном разрыве.

2. Показано, что З'-МогВ (аналоги ёИМР с заменой дезоксирибозы на морфолин) в целом менее подвержены катализируемому АРЕ1 3'-5'-экзонуклеазному гидролизу, чем остатки дидезоксинуклеозидмонофосфатов. Из исследованных аналогов З'-МогС в составе канонической пары МогСЛЗ является самым устойчивым к действию АРЕ1.

3. В различных реакционных условиях исследован катализируемый АРЕ1 3-5'-экзонуклеазный гидролиз аналогов с1СМР, замещенных по экзо-Ы-положению фотоактивируемыми группами:

• с использованием нескольких подходов, а именно: по эффективности встраивания природного сИЧТР после фотоаналога на З'-конце, по лигированию и по зависимости экзонуклеазной активности АРЕ1 от природы нуклеотида, находящегося напротив фотоактивируемого аналога, показано, что фотоактивируемые нуклеотиды могут имитировать как ёСМР, так и с1ТМР. Данные этих тестов хорошо согласуются с субстратными свойствами аналогов с1СТР в реакции элонгации праймеров Р-полимеразой. Из четырех исследованных фотоактивируемых аналогов <1СМР, три являются в большей степени аналогами с!СМР, чем сГГМР, а один в равной степени имитирует с!СМР и ёТМР.

• на основании полученных данных определены оптимальные реакционные условия для фотоаффинной модификации белков и ДНК в реконструированных системах, а также клеточных и ядерных экстрактах, содержащих АРЕ1, и предложено использование экзо-Ы-{2-[Ы-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]аминоэтил}-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата (РАРсЮТР), который, в форме З'-концевого монофосфата, наиболее устойчив к действию АРЕ1.

4. На основании анализа данных термической денатурации ДНК-дуплексов и 3-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1, впервые установлено, что специфичность экзонуклеазного гидролиза определяется природой группы, фланкирующей разрыв/брешь с 5'-стороны, а эффективность в значительной мере зависит от способности ДНК-дуплекса "подплавляться" с З'-конца.

5. Исследовано взаимодействие АРЕ1 с Р-полимеразой, репликативным белком А (ЯРА) и белком, входящим в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению (ХЯСС1), на частичном ДНК-дуплексе с утопленным З'-концом. Для такого ДНК-субстрата впервые показано, что АРЕ1 стимулирует синтез ДНК, катализируемый р-полимеразой, ХЯСС1 стимулирует, а ЯРА ингибирует 3'-5'-экзонуклеазную активность АРЕ1.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Дырхеева Н.С.. Ходырева С.Н., Суханова М.В., Сафронов И.В., Дежуров С.В., Лаврик О.И. 3'-5'-экзонуклеазная активность апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека по отношению к ДНК, содержащим dNMP и их модифицированные аналоги на З'-конце одноцепочечного разрыва // Биохимия. - 2006. - Т. 71. - С. 200-210.

2. Dvrkheeva N.S.. Lomzov А.А., Pyshnyi D.V., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Efficiency of exonucleolytic action of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 towards matched and mismatched dNMP at the 3' terminus of different oligomeric DNA structures correlates with thermal stability of DNA duplexes // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. - V. 764. - P. 699-706.

3. Дырхеева H.C.. Ходырева C.H., Лаврик О.И. Полифункциональная апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 человека: роль дополнительных функций // Молекуляр. Биология. - 2007. - Т. 41. - С. 450-466.

4. Дырхеева Н.С., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Взаимодействие Apel с ДНК-дуплексами, содержащими dNMP или модифицированный аналог dCMP на З'-конце // Международная конференция «Физико-химическая биология», посвященная юбилею академика Кнорре Д.Г. Новосибирск: Арта. - 2006. - С. 110-111.

5. Дырхеева Н.С.. Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Взаимодействие апуриновой/апуримидиновой эндонуклеазы 1 с различными ДНК-дуплексам и // Труды 3-го Международного форума «Актуальные проблемы современной науки» Ч. 11: Биологические науки. Изд-во СГТУ. - 2007. - С. 27-31.

6. Дырхеева Н.С.. Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Количественный анализ 3'-5'-экзонуклеазной реакции апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека с ДНК, содержащими в одноцепочечном разрыве природные dYMP или их модифицированные аналоги // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34. -С. 210-219.

7. Дырхеева Н.С.. Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Взаимодействие АРЕ1 и других репарационных белков с ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репарации и репликации ДНК // Биохимия. - 2008. - Т. 73. - С. 322-335.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001 Подписано к печати и в свет 06.10.2009 Формат бумаги 60x84. Печ. л. 1,1. Уч.-изд. л. 1,1. Тираж ПОЗаказ № 144 Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Общие свойства апурнновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека

1.2. Синтез АРЕ1 в клетке. АРЕ1 как окислительно-восстановительный фактор (Ref-1)

1.3. Участие АРЕ1 в эксцизионной репарации оснований ДНК

1.3. L Этапы эксцизионной репарации оснований

1.3.2. З'-фосфатазная ц З'-фосфодиостеразная активности

1.3.3. Взаимодействие АРЕ1 с белками ЭРО

1.3.4. ДНК-связывающая, эндонуклеазная и экзонуклеазная активности

АРЕ1. Особенности механизма эндонукчеазной реакции АРЕ

1.4. 3-5'-экзонуклеазная активность АРЕ

1.4.1. Удаление неспаренных и модифицированных пукяеотидов с З'-конца

1.4.2. Влияние типа ДНК-дуплекса на экзонуклеазную активность АР El

1.4.3. Экзонуклеазная активность АР El в зависимости от структурных особенностей 5 '-конца олигонуклеотида

1.4.4. Влияние условий реакции на экзонуклеазную и эндонуклеазную активности АРЕ1'

1.5. Инцизионная репарация нуклеотидов ДНК

1.6. Участие АРЕ! в апоптозе и других процессах

1.7. Роль АРЕ1 в развитии заболеваний

1.7.1. Уровень АРЕ1 при различных заболеваниях^

1.7.2. Терапия^

В 1953 г. в биологии была совершена революция, названная многими величайшим открытием двадцатого века - в статье Дж. Уотсона и Р. Крика было опубликовано [1], что ДНК состоит из двух цепей, уложенных в виде двойной спирали. К тому времени химическая природа и состав нуклеиновых кислот уже были определены, но построение модели двойной спирали ДНК дало толчок изучению механизмов передачи наследственной информации. Кроме того, Уотсон и Крик предсказали механизм репликации ДНК, но не учли того, что структура ДНК повреждается вследствие эндогенных и экзогенных воздействий, и нужны механизмы, обеспечивающие исправление возникающих повреждений.

Если провести аналогию между строением клетки и элементами, выполняющими схожие с ДНК функции у живых организмов и государств [2], в организме функцию хранения и воспроизведения информации выполняет мозг и центральная нервная система, в стране - школы, библиотеки, культура и искусство. В школах и культурных учреждениях, как и на уровне организма - в мозге и ЦНС, система передачи информации должна быть строго отлажена и подчиняться какому-то определенному механизму для качественной упорядоченной передачи, чтобы информация не искажалась и не терялась. В молекулах ДНК в ходе их собственного копирования накапливаются разнообразные ошибки, называемые мутациями. Более того, ДНК подвержена спонтанному разрушению, а также- воздействию различных эндогенных продуктов и внеклеточных агентов природного и искусственного происхождения, повреждающих эту макромолекулу. Всего в ДНК человека 3 биллиона пар оснований. Эта макромолекула подвержена повреждениям под действием алкилирующих (метилирование оснований) и окисляющих агентов (потеря и окисление оснований, дезаминирование, возникновение одноцепочечных разрывов), а также ионизирующей радиации, (возникновение двуцепочечных разрывов). Исследование механизмов сохранения целостности генома на сегодняшний день является одной из важнейших фундаментальных задач современной биохимии и молекулярной биологии.

В клетке существует несколько путей репарации ДНК. Поврежденные азотистые основания и апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты удаляет система эксцизионной репарации, оснований (ЭРО) [3]. АР-сайты возникают в ДНК путем спонтанного гидролиза И-гликозидной связи и при удалении поврежденного основания ДНК-гликозилазами. По оценочным данным в клетках млекопитающих образуется порядка 10000 АР-сайтов в сутки, преимущественно за счет апуринизации [4]. Незакодированные

АР-сайты мутагенны и цитотоксичны, представляя большую угрозу для выживания клетки. Таким образом, репарация АР-сайтов является одним из важных механизмов сохранения стабильности генома.

Система ЭРО инициируется либо спонтанной потерей азотистого основания, либо действием ДНК-гликозилаз, расщепляющих N-гликозидную связь поврежденных нуклеотидов. Как спонтанно образовавшиеся, так и образованные под действием повреждающих агентов и ДНК-гликозилаз АР-сайты являются субстратами для АР-эндонуклеаз, например для АР-эндонуклеазы 1 человека (АРЕ1). АРЕ1 инициирует репарацию АР-сайтов, расщепляя ДНК с 5'-стороны от АР-сайта, в результате образуется З'-ОН группа и 5'-дезоксирибозофосфат (dRp). Помимо эндонуклеазной активности АРЕ1 также обладает З'-фосфодиэстеразной, З'-фосфатазной и 3'-5'-экзонуклеазной активностями [5].

На сегодняшний день известна последовательность стадий и основные участники ЭРО [3], однако механизмы регуляции всей системы репарации в целом остаются объектом пристального изучения. Предполагается, что на протяжении всего процесса ЭРО действует механизм "передачи эстафетной палочки" от белка-участника к белку, где в роли "палочки" выступает ДНК [6]. Согласно этому механизму, действие всех белков-участников ЭРО координировано, а АРЕ1, возможно, играет роль одного из координаторов ЭРО, сопрягая начальный процесс выщепления поврежденного азотистого основания ДНК-гликозилазой и последующий синтез ДНК, проводимый ДНК-полимеразой р (Р-полимеразой).

В пользу согласованного действия АРЕ1 и Р-полимеразы можно рассматривать также тот факт, что АРЕ1 обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью по отношению к неканоническим парам [7-9]. ДНК-полимераза р, являющаяся основной ДНК-полимеразой ЭРО у млекопитающих, не обладает собственной корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью. Следует отметить, что точность репаративного синтеза ДНК in vivo заметно выше, чем in vitro [10]. Таким образом, представляет интерес поиск факторов, повышающих точность синтеза ДНК в процессе ЭРО. Поскольку известно, что АРЕ1 может выщеплять неправильно (неканонически) спаренные нуклеотиды более эффективно, чем правильно спаренные [7], было высказано предположение, что АРЕ1 может выполнять в ЭРО роль "корректора" ошибок, допущенных Р-полимеразой [7].

Целью настоящей работы являлось исследование экзонуклеазной активности АРЕ1 в зависимости от "каноничности" пары, которую формирует З'-концевой dNMP, от условий реакции и от структуры ДНК-дуплекса с использованием нескольких типов ДНКструктур. Кроме того, планировалось исследовать взаимодействие АРЕ1 с олигонуклеотидными ДНК-интермедиатами репарации и репликации ДНК, а также взаимное функциональное влияние АРЕ1, р-полимеразы и других белков репарации и репликации ДНК.

В ходе работы решались следующие задачи:

Исследование зависимости 3'-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 от типа ДНК-дуплекса (частичный дуплекс или дуплекс с разрывом/брешью), структурных особенностей 5'-конца олигонуклеотида, фланкирующего одноцепочечный разрыв, от условий реакции и от стабильности дуплекса в различных условиях реакции.

Анализ эффективности 3'-5'-экзонуклеазного выщепления с З'-конца праймера с помощью АРЕ1 природных нуклеотидов в составе канонической или неканонической пары, а также аналогов ёИМР, модифицированных по рибозе: (МЫМР и аналогов сММР, содержащих вместо дезоксирибозы остаток морфолина.

Анализ эффективности 3'-5'-экзонуклеазного выщепления аналогов ёСМР замещенных по экзо-И-положению фотоактивируемыми группами, с целью выяснения возможности дальнейшего применения таких аналогов для фотоаффинной модификации белков и ДНК в АРЕ 1-содержащих реконструированных системах, клеточных и ядерных экстрактах.

С помощью методов задержки в геле и фотоаффинной модификации планировалось исследовать взаимодействие АРЕ1 с различными олигонуклеотидными структурами и с р-полимеразой, в том числе при совместном присутствии рекомбинантных очищенных белков и в клеточном экстракте. Была поставлена задача изучить взаимодействие АРЕ1 с олигонуклеотидными ДНК-интермедиатами репарации и репликации ДНК, а также влияние р-полимеразы на комплексообразование АРЕ1 с такими ДНК.

Исследование взаимного влияния АРЕ1 и р-полимеразы на 3'-5'-экзонуклеазную и полимеразную активности соответственно, а также на зависимость 3'-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 от присутствия белковых факторов ЯРА (репликативный белок А) и ХЯСС1 (белок, входящий в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению).

выводы

1. Для ДНК-дуплексов нескольких типов проведено систематическое изучение зависимости катализируемого апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой 1 человека (АРЕ1) 3'-5'-экзонуклеазного гидролиза природных дезоксинуклеозидмонофосфатов (сПЯМР) в составе канонической или неканонической пары, от ионной силы и рН. Впервые исследованы все возможные сочетания пар нуклеотидов на З'-конце праймера. Показано, что:

• З'-концевые с!СМР, сЮМР или ёТМР независимо от типа ДНК-дуплекса (например ДНК с разрывом или частичный ДНК-дуплекс) менее эффективно выщепляются из канонических пар (СЮ, Т/А, О/С), и, в целом, эффективность гидролиза укладывается в ряды СЛл<С/А<С/С<С/Т, Т/А<Т/0<Т/С~Т/Т, 0/С<0ЛЗ~0/А~0/Т для разных типов ДНК. Эффективность выщепления З'-концевого ёАМР не зависит от каноничности пары, а ряды эффективности гидролиза варьируют в зависимости от типа ДНК-дуплекса.

• 3'-5'-экзонуклеазная активность АРЕ1 зависит от типа ДНК-дуплекса, а для ДНК с одноцепочечным разрывом — и от природы 5-концевой группы. Предпочтительными субстратами являются частичный ДНК-дуплекс, ДНК с 5'-свисающим одноцепочечным участком (флэпом) или 5'-гидроксильной группой, по сравнению с ДНК с 5'-фосфатной или 5-тетрагидрофуранофосфатной группой в одноцепочечном разрыве.

2. Показано, что З'-МогВ (аналоги ёНМР с заменой дезоксирибозы на морфолин) в целом менее подвержены катализируемому АРЕ1 3'-5'-экзонуклеазному гидролизу, чем остатки дидезоксинуклеозидмонофосфатов. Из исследованных аналогов З'-МогС в составе канонической пары МогС/О является самым устойчивым к действию АРЕ1.

3. В различных реакционных условиях исследован катализируемый АРЕ1 3—5'-экзонуклеазный гидролиз аналогов ёСМР, замещенных по экзо-К-положению фотоактивируемыми группами:

• с использованием нескольких подходов, а именно: по эффективности встраивания природного ёЫТР после фотоаналога на З'-конце, по лигированию и по зависимости экзонуклеазной активности АРЕ1 от природы нуклеотида, находящегося напротив фотоактивируемого аналога, показано, что фотоактивируемые нуклеотиды могут имитировать как с1СМР, так и сГГМР. Данные этих тестов хорошо согласуются с субстратными свойствами аналогов ёСТР в реакции элонгации праймеров р-полимеразой. Из четырех исследованных фотоактивируемых аналогов dCMP, три являются в большей степени аналогами ёСМР, чем ёТМР, а один в равной степени имитирует dCMP и dTMP.

• на основании полученных данных определены оптимальные реакционные условия для фотоаффинной модификации белков и ДНК в реконструированных системах, а также клеточных и ядерных экстрактах, содержащих АРЕ1, и предложено использование экзо-Ы-{2-[Н-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3-аминопропионил]аминоэтил}-2'-дезоксицитидин-5-трифосфата (РАРёСТР), который, в форме З'-концевого монофосфата, наиболее устойчив к действию АРЕ1.

4. На основании анализа данных термической денатурации ДНК-дуплексов и 3—5'-экзонуклеазной активности АРЕ1, впервые установлено, что специфичность экзонуклеазного гидролиза определяется природой группы, фланкирующей разрыв/брешь с 5'-стороны, а эффективность в значительной мере зависит от способности ДНК-дуплекса "подплавляться" с 3-конца.

5. Исследовано взаимодействие АРЕ1 с Р-полимеразой, репликативным белком А (ЯРА) и белком, входящим в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению (ХЯСС1) на частичном ДНК-дуплексе с утопленным З'-концом. Для такого ДНК-субстрата впервые показано, что. АРЕ1 стимулирует синтез ДНК, катализируемый Р-полимеразой, ХЯСС1 стимулирует, а ИРА ингибирует 3'-5'-экзонуклеазную активность АРЕ1.

1. Watson, J.D., Crick, F.H.C. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. 1953. -V. 171.-P. 737-738.

2. Янковский, H.K. Курс лекций «Основы биологии» для 1 курса ФМБФ МФТИ, 2007. — Режим доступа: http://www.bio.mipt.ru/student/files/biology/biolections.

3. Scharer ,O.D. DNA damage and repair // Angew. Chem. Int. Ed. 2003. - V. 42. - P. 2074-2946.

4. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. 1993. - V. 362.-P. 709-715.

5. Evans, A.R., Limp-Foster, M., Kelley, M.R. Going APE over ref-1 // Mutat. Res. 2000. -V. 461.-P. 83-108.

6. Wilson, S.H., Kunkel, T.A. Passing the baton in base excision repair // Nature Struct. Biol. -2000.-V. 7.-P. 176-178.

7. Chou, K.-M., Cheng, Y.-C. An exonucleolitic activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease on З'-mispaired DNA // Nature. 2002. - V. 415. - P. 655-659.

8. Wilson, D.M. III. Properties of and substrate determinants for the exonuclease activity of human apurinic endonuclease Apel // J. Mol. Biol. 2003. - V. 330. - P. 1027-1037.

9. Cistulli, C., Lavrik, O.I., Prasad, R., Hou, E., Wilson, S.H. AP endonuclease and poly(ADP-ribose) polymerase-1 interact with the same base excision repair intermediate // DNA Repair. 2004. - V. 3. - P. 581-591.

10. Lindahl, T. Suppression of spontaneous mutagenesis in human cells by DNA base excision repair // Mutat. Res. 2000. - V. 462. - P. 129-135.

11. Wilson, D.M. Ill, Barsky, D. The major human abasic endonuclease Apel: formation, consequences and repair of abasic lesions in DNA // Mutat. Res. 2001. - V. 484. - P. 283-307.

12. Krokan, H.E., Standal, R., Slupphaug, G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA // Biochemistry. 1997. - V. 68. - P. 255-285.

13. Fritz, G. Human APE/Ref-1 protein // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. - V. 32. - P. 925929.

14. Mol, C.D., Hosfield, D.J., Tainer, J.A. Abasic site recognition by two apurinic/apyrimidinic endonuclease families in DNA base excision repair: the 3'-ends justify the means // Mutat. Res. — 2000.-V. 460.-P. 211-229.

15. Strauss, P.R., Holt, C.M. Domain mapping of human apurinic/apyrimidinic endonuclease // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 14435-14441.

16. Tell, G., Crivellato, E., Pines, A., Paron, I., Pucillo, C., Manzini, G., Bandiera, A., Kelley, M.R., Di Loreto, C., Damante, G. Mitochondrial localization of APE/Ref-1 in thyroid cells // Mut. Res. 2001. - Y. 485. - P. 143-152.

17. Chattopadhyay, R., Wiederhold, L., Szczesny, B., Boldogh, I., Hazra, T.K., Izumi, T., Mitra, S. Identification and characterization of mitochondrial abasic (AP)-endonuclease in mammalian cells // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. P. 2067-2076.

18. Tell, G., Quadrifoglio, F., Tiribelli, C„ Kelley, M.R. The many functions of APEl/Ref-1: not only a DNA repair enzyme // Antioxid. Redox. Signal. 2009. — V. 11. - P. 571-574.

19. Xanthoudakis, S., Smeyne, R.J., Wallace, J.D., Curran, T. The redox/DNA repair protein, Ref-1, is essential for early embryonic development in mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. V. 93. - P. 8919-8923.

20. Fung, H., Demple, B. A vital role for Apel/Refl protein in repairing spontaneous DNA damage in human cells // Mol. Cell. 2005. - V. 17. - P. 463-470.

21. Izumi, T., Brown, D.B., Naidu, C.V., Bhakat, K.K., Maclnnes, M.A., Saito, H., Chen, D.J., Mitra, S. Two essential but distinct functions of the mammalian abasic endonuclease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - P. 5739-5743.

22. Flaherty, D.M., Monick, M.M., Hunninghake, G.W. AP endonucleases and the many functions of Ref-1 // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001. - V. 25. - P. 664-667.

23. Xanthoudakis, S., Curran, T. Identification and characterization of Ref-1, a nuclear protein that facilitates AP-1 DNA-binding activity // EMBO J. 1992. - V. 11. - P. 653-665.

24. Xanthoudakis, S., Miao, G., Wang, F., Pan, Y. C., Curran, T. Redox activation of Fos-Jun DNA binding activity is mediated by a DNA repair enzyme // EMBO J. 1992. - V. 11. - P. 3323-3335.

25. Hsieh, M.M., Hegde, V., Kelley, M.R., Deutsch, W.A. Activation of APE/Ref-1 redox activity is mediated by reactive oxygen species and PKC phosphorylation // Nucleic Acids Res. —• 2001.-V.29.-P. 3116-3122.

26. Kuninger, D.T., Izumi, Т., Papakonstantinou, J., Mitra, S. Human AP-endonuclease 1 and hn-RNP-L interacts with a nCaRE-like repressor element in the AP-endonuclease promoter // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. 823-829.

27. Ланцов, B.A. Репарация ДНК и канцерогенез: универсальные механизмы репарации у про- и эукариот и последствия их повреждения у человека // Молекуляр. биология; — 1998.-Т. 32.-С. 757-772.

28. Wilson, D.M. III, Thompson, L.H. Life without DNA repair // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 12754-12757.

29. Memislogu, A., Samson, L. Base excision repair in yeast and mammals // Mutat. Res. — 2000.-V. 451.-P. 39-51.

30. Nilsen, H., Krokan, H.E. Base excision repair in a network of defense and tolerance // Carcinogenesis. 2001. - V. 22. - P. 987-998.

31. Bennet, R.A.O., Wilson, D.M.III, Wong, D., Demple, B. Interaction of human apurinic endonuclease and DNA polymerase beta in the base excision repair pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 7166-7169.

32. Frosina, G., Fortini, P., Rossi, O., Carrozzino, F., Raspaglio, G., Cox, L.S., Lane,, D.P., Abbondandolo, A., Dogliotti, E. Two pathways for Base Excision Repair in mammalian cells // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 9573-9578.

33. Matsumoto, Y., Kim, K. Excision of deoxyribose phosphate residues by DNA polymerase beta during DNA repair // Science. 1995. - V. 269. - P. 699-702.

34. Piersen, C.E., Prasad, R., Wilson, S.H., Lloyd, R.S. Evidence for an imino intermediate in the DNA polymerase beta deoxyribose phosphate excision reaction // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271.-P. 17811-17815.

35. Fortini, P., Pascucci, B., Parlanti, E., Sobol, R.W., Wilson, S.H., Dogliotti, E. Different DNA polymerases are involved in the short- and long-patch base excision repair in mammalian cells // Biochemistry. 1998. - Y. 37. - P. 3575-3580.

36. Stucki, M., Pascucci, B., Parlanti, E., Fortini, P., Wilson, S.H., Hübscher, U., Dogliotti, E. Mammalian base excision repair by DNA polymerases 8 and s // Oncogene. 1998. - V. 17. — P. 835-843.

37. Podlutsky, A.J., Dianova, I.I., Podust, Y.N., Bohr, V.A., Dianov, G.L. Human DNA polymerase beta initiates DNA synthesis during long-patch repair of reduced AP sites in DNA // EMBO J. -2001. V. 20.-P. 1447-1482.

38. Klungland, A., Lindahl, T. Second pathway for completion of human DNA base excision repair: reconstitution with purified proteins and requirement for Dnase IV (FEN-1) // EMBO J. -1997.-V. 16.-P. 3341-3348.

39. Kim, K., Biade, S., Matsumoto, Y. Involvement of flap endonuclease 1 in Base Excision DNA Repair // J. Biol. Chem. 1998. - Y. 273. - P. 8842-8848.

40. Prasad, R., Dianov, G.R., Bohr, V.A., Wilson, S.H. FEN1 stimulation of DNA polymerase ß mediates an excision step in mammalian long patch Base Excision Repair // J. Biol. Chem. — 2000. V. 275. - P. 4460-4466.

41. Canitrot, Y., Frechet, M., Servant, L., Cazayx, C., Hoffman, J.-S. Overexpression of DNA-polymerase ß: a genomic instability enhancer process // FASEB J. 1999. - V. 13. - P. 11071111.

42. Cappelli, E., Taylor, R., Cevasco, M., Abbondandolo, A., Caldecott, K., Frosina, G. Involvement of XRCC1 and DNA ligase III gene products in DNA base excision repair // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 23970-23975.

43. Levin, D.S., McKenna, A.E., Motycka, T.A., Matsumoto, Y., Tomkinson, A.E. Interaction between PCNA and DNA ligase I is critical for joining of Okazaki fragments and long-patch base-excision repair // Curr. Biol. 2000. - V. 10. - P. 919-922.

44. David, S.S., Williams, S.D. Chemistry of glycosylases and endonucleases involved in base-excision repair // Chem. Rev. 1998. - V. 98. - P. 1221-1261.

45. Suh, D., Wilson, D.M.III, Povirk, L.F. 3'-Phosphodiesterase activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease at DNA double-strand break ends // Nucleic Acids Res. — 1997. V. 25. - P. 2495-2500.

46. Krokan, H.E., Nilsen, H., Skorpen, F., Otterlei, M., Slupphaug, G. Base excision repair of DNA in mammalian cells // FEBS Lett. 2000. - V. 476. - P. 73-77.

47. Parsons, J.L., Dianova, I.I., Dianov, G.L. APE1 is the major 3'-phosphoglycolate activity in human cell extracts //Nucleic Acids Research 2004. - V. 32. - P. 3531-3536.

48. Shida, T., Kaneda, K., Ogawa, T., Sekiguchi, J. Abasic site recognition mechanism by the Escherichia coli exonuclease III //Nucleic Acids Symp. Ser. 1999. -V. 23. - P. 195-196.

49. Rosenquist, T.A., Zaika, E., Fernandes, A.S., Zharkov, D.O., Miller, H., Grollman, A.P. The novel DNA glycosylase, NEIL1, protects mammalian cells from radiation-mediated cell death // DNA Repair. 2003. - V. 2. - P. 581-591.

50. Hill, J.W., Hazra, T.K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine DNA-glycosilase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair // Nucleic Acids Res. 2001. -V. 29. - P. 430-438.

51. Vidal, A.E., Hickson, I.D., Boiteux, S., Radicella, J.P. Mechanism of stimulation of the DNA glycosilase activity of hOGGl by the major human AP endonuclease: bypass of the AP lyase activity step // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. 1285-1292.

52. Hang, B., Singer, B. Protein-protein interactions involving DNA glycosylases // Chem. Res. Toxicol-2003.-V. 16.-P. 1181-1195.

53. Sidorenko, V.S., Nevinsky, G.A., Zharkov, D.O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease // DNA Repair. 2007. - V. 6. - P. 317328:

54. Sidorenko, V.S., Nevinsky, G.A., Zharkov, D.O. Specificity of stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP endonuclease //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. -V.368.-P. 175-179.

55. Singhai, R.K., Prasad, R., Wilson, S.H. DNA polymerase ß conducts the gap-filling step in uracil-initiated base excision repair in a bovine testis nuclear extracts // J. Biol. Chem. — 1995. — V. 270. P. 949-957.

56. Sobol, R.W., Horton, J.K., Kuhn, R., Gu, H., Singhai, R.K., Prasad, R., Rajewsky, K., Wilson, S.H. Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair // Nature. 1996,- V. 379. -P. 183-186.

57. Chen, D.S., Herman, T., Demple, B. Two distinct human DNA diesterases that hydrolyze 3'-blocking deoxyribose fragments from oxidized DNA // Nucleic Acids Res. 1991. - V. 19. -P. 5907-5914.

58. Horton, J.K., Srivastava, D.K., Zmudzka, B.Z., Wilson, S.H. Strategic down-regulation of DNA polymerase beta by antisense RNA sensitizes mammalian cells to specific DNA damaging agents //Nucleic Acids Res. 1995. -V. 23. - P. 3810-3815.

59. Abyzov, A., Uzun, A., Strauss P.R., Ilyin V.A. An AP Endonuclease 1-DNA polymerase b complex: theoretical prediction of interacting surfaces // PLoS. Comput. Biol. 2008. - V. 4. -el000066.

60. Chagovetz, A.M., Sweasy, J.B., Preston, B.D. Increased activity and fidelity of DNA polymerase beta on single-nucleotide gapped DNA // J. Biol. Chem. — 1997. V. 272. — P. 27501-27504.

61. Lebedeva, N.A., Khodyreva, S.N., Favre, A., Lavrik, O.I. AP endonuclease 1 has no biologically significant 3'-5' exonuclease activity // Biochem. Biophys. Res. Communs. — 2003. — V. 300.-P. 182-187.

62. Dianova, I.I., Bohr, V. A., Dianov, G.L. Interaction of human AP endonuclease 1 with flap endonuclease 1 and proliferating cell nuclear antigen involved in long-patch base excision repair // Biochemistry 2001. - V. 40. - P. 12639-12644.

63. Ranalli, T.A., Tom, S., Bambara, R.A. AP endonuclease 1 coordinates flap endonuclease 1 and DNA ligase I activity in long patch base excision repair // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. -P. 41715-41724.

64. Mol, C.D., Izumi, T., Mitra; S., Tainer, J. DNA bound structures and mutants reveal abasic DNA binding by APE1 DNA repair and coordination // Nature. 2000. - V. 430. - P. 451-455'.

65. Strauss, P.R., Beard, W.A., Patterson, T.A., Wilson, S.H. Substrate binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease indicates a Briggs-Haldane mechanism // J. Biol. Chem. — 1997. V. 272. - P. 1302-1307.

66. Wilson, D.M. III, Takeshita, M., Grollman, A.P., Demple, B. Incision activity of humanjapurinic endonuclease (Ape) at abasic site analogs in DNA // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. -P. 16002-16007.

67. Barzilay, G., Walker, L.J., Robson, C.N., Hickson, I.D. Site-directed mutagenesis of the human DNA repair enzyme HAP1: identification of residues important for AP endonuclease and RNase H activity //Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 1544-1550.

68. Mundle, S.T., Fattal, M.H., Melo, L.F., Coriolan, J.D., O'Regan, N.E., Strauss, P.R. Novel role of tyrosine in catalysis by human AP endonuclease 1 // DNA Repair. 2004. - V. 3. — P. 1447-1455.

69. Kane, C.M., Linn, S. Purification and characterization of an apurinic/apyrimidinic endonuclease from HeLa cells // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. - P. 3405-3414.

70. Masuda, Y., Bennet, R.A.O., Demple, B. Rapid dissociation of human apurinic endonuclease (Apel) from incised DNA induced by magnesium // J. Biol. Chem. 1998. — V. 273.-P. 30360-30365.

71. Oezguen, N., Schein, C.H., Peddi, S.R., Power, T.D., Izumi, T., Braun, W. A "moving metal mechanism" for substrate cleavage by the DNA repair endonuclease APE-1 // Proteins.— 2007.-V. 68.-P. 313-323.

72. McNeill, D.R., Narayana, A., Wong, H.-K., Wilson, D.M.III. Inhibition of Apel nuclease activity by lead, iron and cadmium // Toxicogenomics. 2004. - V. 112. - P. 799-804.

73. Wilson, D.M. III, Takeshita, M., Demple, B. Abasie site binding by the human apurinic endonuclease, Ape, and determination of the DNA contact sites // Nucleic Acids Res. 1997. -V. 25.-P." 933-939.

74. Erzberger, J.P., Barsky, D., Scharer, O.D., Colvin, M.E., Wilson, D.M.III. Elements inabasic site recognition by the major human and E. coli apurinic/apyrimidinic endonucleases //j

75. Nucleic Acids Res. -1998. V. 26. - P. 2771-2778.

76. Cuniasse, P., Fazakerly, G.V., Guschlbauer, W., Kaplan, B.E., Sowers, L.C. The abasic sites as a challenge to DNA polymerase. A nuclear magnetic resonance study of G, C and T opposite a model abasic site // J. Mol. Biol. 1990. - V. 213. - P. 303-314.

77. David-Cordonnier, M.H., Cunniffe, S.M., Hickson, I.D., O'Neill, P. Efficiency of incision of an AP site within clustered DNA damage by the major human AP endonuclease // Biochemistry. 2002. - V. 41. - P. 634-642.

78. Demple, В., Herman, Т., Chen, D.S. Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of DNA repair enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 11450-11454.

79. Chou, K.-M., Kukhanova, M., Cheng, Y.-C. A novel action of human apurinic/ apyrimidinic endonuclease//J. Biol. Chem. -2000. V. 275.-P. 31009-31015.

80. Parsons, J.L., Dianova, I.I., Dianov, G.L. APE 1-dependent repair of DNA single-strand breaks containing З'-end 8-oxoguanine // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - P. 2204-2209.

81. Liu, C., Pouliot, J.J., Nash, H.A. Repair of topoisomerase I covalent complexes in the absence of the tyrosyl-DNA phosphodiesterase Tdpl // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99.-P. 14970-14975.

82. Wong, D., DeMott, M.S., Demple, B. Modulation of the 3-5' exonuclease activity of human apurinic endonuclease (apel) by its 5' incised abasic DNA product // J. Biol. Chem.2003. V. 278. - P. 36242-36249.

83. Gros, L., Ischenko, A.A., Ide, H., Elder, R.H., Saparbaev, M.K. The major human AP endonuclease (Apel) is involved in the nucleotide incision repair pathway// Nucleic Acids Res. —2004.-V. 32.-P. 73-81.

84. Wilson, D.M.III. Apel abasic endonuclease activity is regulated by magnesium and potassium concentrations and is robust on alternative DNA structures // J. Mol. Biol. 2005. -V. 345.-P. 1003-1014.

85. Крутиков, B.M. Антимутагенная роль автономных 3'—5-экзонуклеаз // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38. - С. 823-833.

86. Burkovics, P., Szukacsov, V., Unk, I., Haracska, L. Human Ape2 protein has a 3-5' exonuclease activity that acts preferentially on mismatched base pairs // Nucleic Acids Res. — 2006. V. 34. - P. 2508-2515.

87. Ischenko, A.A., Saparbaev, M.K. Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage //Nature. 2002. - V. 415. - P. 183-187.

88. Marenstein, D.R., Wilson, D.M.III, Teebor, G.W. Human AP endonuclease (APE1) demonstrates endonucleolytic activity against AP sites in single-stranded DNA // DNA Repair. — 2003. — V. 3. P. 527-533.

89. Lowry, D.F., Hoyt, D.W., Khazi, F.A., Bagu, J., Lindsey, A.G., Wilson, D.M.III Investigation of the role of the histidine-aspartate pair in the human exonuclease Ill-like abasic endonuclease, Apel // J. Mol. Biol. 2003. - V. 329. - P. 311-322.

90. Lieberman, J., Fan, Z. Nuclear war: the granzyme A-bomb // Curr. Opin. Immunol. 2003. -V. 15.-P. 553-559.

91. Fan, J., Matsumoto, Y., Wilson, D.M.III. Nucleotide sequence and DNA secondary structure, as well as replication protein A, modulate the single-stranded abasic endonuclease activity of APE1 // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - P. 3889-3898.

92. Berquist, B.R., McNeill, D.R., Wilson, D.M.III. Characterization of abasic endonuclease activity of human Apel on alternative substrates, as well as effects of ATP and sequence context on AP site incision // J. Mol. Biol. 2008. - V. 379. - P. 17-27.

93. Fritz, G., Grosch, S., Tomicic, M., Kaina, B. APE/Ref-1 and the mammalian response toigenotoxic stress // Toxicology. 2003. - V. 93. - P. 67-78.

94. Xu, Y., Moore, D.H., Broshears, J., Liu, L., Wilson, T.M., Kelley, M.R. The apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE/ref-1) DNA repair enzyme is elevated in premalignant and malignant cervical cancer // Anticancer Res. 1997. - V. 17. - P. 3713-3719.

95. Moore, D.H., Michael, H., Tritt, R„ Parsons, S.H., Kelley, M.R. Alterations in the expression of the DNA repair/redox enzyme APE/ref-l in epithelial ovarian cancers // Clin. Cancer Res. 2000. - V. 6. - P. 602-609.

96. Bobola, M.S., Blank, A., Berger, M.S., Stevens, B.A., Silber, J.R. Apurinic/apyrimidinic endonuclease activity is elevated in human adult gliomas // Clinical Cancer Res. 2001. — V. 7. -P. 3510-3518.

97. Russo, D., Celano, M., Bulotta, S., Bruno, R., Arturi, F., Giannasio, P., Filetti, S., Damante, G., Tell, G. APE/Ref-1 is increased in nuclear fractions of human thyroid hyperfunctioning nodules // Mol. Cell. Endocrinol. 2002. - V. 194. - P. 71-76.

98. Sak, S.C., Harnden, P., Johnston, C.F., Paul, A.B., Kiltie, A.E. APE1 and XRCC1 protein expression levels predict cancer-specific survival following radical radiotherapy in bladder cancer // Clin. Cancer Res. 2005. - V. 11. - P. 6205-6211.

99. Tell, G., Pellizzari, L., Pucillo, C., Puglisi, F., Cesselli, D., Kelley, M.R., Di Loreto, C., Damante, G. TSH controls Ref-1 nuclear translocation in thyroid cells // J: Mol. Endocrinol. — 2000. — V. 24.-P. 383-390.

100. Ouellet, V., Le Page, C., Guyot, M.-C., Lussier, C., Tonin, P.N., Provencher, D.M., Mes-Masson, A.-M. SET complex in serous epithelial ovarian cancer // Int. J. Cancer. — 2006. — V. 119.-P. 2119-2126.

101. Tan, Z., Sun, N., Schreiber, S.S. Immunohistochemical localization of redox factor-1 (Ref-1) in Alzheimer's hippocampus //Neuroreport. 1998. - V. 9. - P. 2749-2752.

102. Kisby, G.E., Milne, J., Sweatt, C. Evidence of reduced DNA repair in amyotrophic lateral sclerosis brain tissue //Neuroreport. 1997. - V. 8. - P. 1337-1340.

103. Olkowski, Z.L. Mutant AP endonuclease in patients with amyotrophic lateral sclerosis // Neuroreport. 1998. - V. 9. - P. 239-242.

104. Edwards, M., Rassin, D.K., Izumi, T., Mitra, S., Perez-Polo, J.R. APE/Ref-1 Responses to oxidative stress in aged rats // J. Neurosci. Res. 1998. - V. 54. - P. 635-638.

105. Nguyen, C., Teo, J.L., Matsuda, A., Eguchi, M., Chi, E.Y., Henderson, W.R., Kahn, M. Chemogenomic identification of Ref-l/AP-1 as a therapeutic target for asthma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-V. 100.-P. 1169-1173.

106. Fishel, M.L., Kelley, M.R. The DNA base excision repair protein Apel/Ref-1 as a therapeutic and chemopreventive target // Mol. Aspects Med. 2007. - V. 28. - P. 375-395.

107. Anarbaev, R.O., Khodyreva, S.N., Zakharenko, A.L., Rechkunova, N.I., Lavrik, O.I. DNA polymerase activity in water-structured and confined environment of reverse micelles // J. Mol. Catal. 2005. - V. 33. - P. 29-34.

108. Henricksen, L.A., Umbricht, С.В., Wold, M.S. Recombinant replication protein A: expression, complex formation, and functional characterization // J. Biol. Chem. — 1994. — V. 269. P. 11121-11132.

109. Biade, S., Sobol, R.W., Wilson, S.H., Matsumoto, Y. Impairment of proliferating cell nuclear antigen-dependent apurinic/apyrimidinic site repair on linear DNA // J. Biol. Chem. — 1998.-V. 273.-P. 898-902.

110. Abramova, T.V., Bakharev, P.A., Vasilyeva, S.V., Silnikov, V.N. Synthesis of morpholine nucleoside triphosphates // Tetrahedron Lett. 2004 -V. 45. - P. 4361-4364.

111. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratoty Manual, 2nd ed. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. - 1659 p.

112. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

113. Скоупс, P. Методы очистки белков. Москва: Мир, 1985. — 342 с.

114. Корниш-Боуден, Э. Основы ферментативной кинетики. Москва: Мир, 1979.-280 с.

115. Lokhov, S.G., Pyshnyi, D.V. Thermodynamic and spectral properties of DNA miniduplexes with the terminal G x A mispairs and 3' or 5' dangling bases // FEBS Lett. 1997. -V. 420.-P. 134-138.

116. Beard, W.A., Shock, D.D., Wilson, S.H. Influence of DNA structure on DNA polymerase beta active site function: extension of mutagenic DNA intermediates // J. Biol. Chem. — 2004. — V. 279.-P. 31921-31929.

117. Wu, D.Y., Wallace, R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. - V. 76. - P. 245-254.

118. Summerton, J.E. Morpholino, siRNA, and S-DNA compared: impact of structure and mechanism of action on off-target effects and sequence specificity // Curr. Top. Med. Chem. -2007.-V. 7.-P. 651-660.

119. Wong, D., Demple, B. Modulation of the 5'-deoxyribose-5-phosphate lyase and DNA synthesis activities of mammalian DNA polymerase beta by apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 25268-25275.

120. Henner, W.D., Rodriguez, L.O., Hecht, S.M., Haseltine, W.A. Gamma Ray induced deoxyribonucleic acid strand breaks. 3' Glycolate termini // J. Biol. Chem. 1983. - V. 258. - P. 711-713.

121. Izumi Т., Schein, C.H., Oezguen, N., Feng, Y., Braun, W. Effects of backbone contacts 3' to the abasic site on the cleavage and the product binding by human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE1) // Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 684-689.

122. Shen, J.-C., Loeb, L.A. Mutations in the 8 loop of human APE1 alter binding and cleavageiof DNA containing an abasic site // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 46994-47001.

123. Mezzasalma, T.M., Kranz, J.K., Chan, W., Struble, G.T., Schalk-Hihi, C., Deckman, I.C., Springer, B.A., Todd, M.J. Enhancing recombinant protein quality and yield by protein stability profiling // J. Biomol. Screen. 2007. - V. 12. - P. 418-428.

124. Arakawa, Т., Timasheff, S.N. Preferential interactions of proteins with salts in concentrated solutions // Biochemistry. 1982. - V. 21. - P. 6545-6552.

125. SantaLucia, J.Jr., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. - V. 33. - P. 415^140.

126. Aboul-ela, F., Koh, D., Tinoco, I. Jr., Martin, F.H. Base-base mismatches. Thermals of double helix formation for dCA3XA3G+dCT3YT3G (X, Y=A, C, G, T) // Nucleic Acids Res. -1985.-V. 13.-P. 4811-4824.

127. Luisi, P.L., Giomini, M., Pileni, M.P., Robinson, B.H. Reverse micelles as hosts for proteins and small molecules // Biochem. Biophys. Acta. 1988. - V. 947. - P. 209-246.

128. Martinek, K., Klyachko, N.L., Kabanov, A.V., Khmelnitsky, Yu.L., Levashov, A.V. The second E.C. Slater lecture. Micellar enzymology: its relation to membranology // Biochem. Biophys. Acta. 1989. - V. 981. - P. 161-172.

129. Anarbaev, R.O., Elepov, I.B., Lavrik, O.I. Klenow fragment and DNA polymerase alpha-primase fromserva calf thymus in water-in-oil microemulsions // Biochim. Biophys. Acta. — 1998.-V. 1384.-P. 315-324.

130. Getzenberg, R.H., Pienta, K.J., Ward, W.S., Coffey, D.S. Nuclear structure and the three-dimensional organization of DNA // J. Cell. Biochem. 1991. - V. 47. - P. 289-299.

131. Beard, B.C., Wilson, S.H., Smerdon, M.J. Suppressed catalytic activity of base excision repair enzymes on rotationally positioned uracil in nucleosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003. V. 100. - P. 7465-7470.

132. Nilsen, H., Lindahl, Т., Verreault, A. DNA base excision repair of uracil residues in reconstituted nucleosome core particles // EMBO J. 2002. - V. 21. - P. 5943-5952.

133. Fortini, P., Dogliotti, E. Base damage and single-strand break repair: Mechanisms and functional significance of short- and long-patch repair subpathways // DNA Repair. 2007. - V. 6.-P. 398-409.

134. Almeida, K.H., Sobol, R.W. A unified view of base excision repair: lesion-dependent protein complexes regulated by post-translational modification // DNA Repair. 2007. - V. 6. -P. 695-711.

135. Суханова, M.B., Ходырева, C.H., Лаврик, О.И. Влияние поли(АОР-рибозо)-полимеразы-1 и ее апоптотического фрагмента 24 кДа на репарацию ДНК-дуплексов в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота // Биохимия. 2006. - Т. 71. — С. 909-923.

136. Prasad, R., Beard, W.A., Strauss, P.R., Wilson, S.H. Human DNA polymerase beta deoxyribose phosphate lyase. Substrate specificity and catalytic mechanism // J. Biol. Chem. -1998. V. 273. - P. 15263-15270.

137. Singhal, R.K., Wilson, S.H. Short gap-filling synthesis by DNA polymerase beta is processive//J. Biol. Chem. 1993.-V. 268.-P. 15906-15911.

138. Iftode, C., Daniely, Y., Borowiec, J.A. Replication protein A (RPA): the eukaryotic SSB // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1999. -V. 34. - P. 141-180.

139. DeMott, M.S., Zigman, S., Bambara, R.A. Replication protein A stimulates long patch DNA base excision repair // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 27492-27498.

140. Dianov, G.L., Jensen, B.R., Kenny, M.K., Bohr, V.A. Replication protein A stimulates proliferating cell nuclear antigen-dependent repair of abasic sites in DNA by human cell extracts //Biochemistry. 1999.-V. 38.-P. 11021-11025.

141. Georgaki, A., Hubscher, U. DNA unwinding by replication protein A is a property of the 70 kDa subunit and is facilitated-by phosphorylation of the 32 kDa subunit // Nucleic Acids Res.- 1993. -V. 21. P. 3659-3665.

142. Treuner, K., Ramsperger, U., Knippers, R. Replication protein A induces the unwinding of long double-stranded DNA regions // J. Mol. Biol. 1996. - V. 259. - P. 104-112.

143. Vidal, A.E., Boiteux, S., Hickson, I.D., Radicella, J.P. XRCC1 coordinates the initial and1 late stages of DNA abasic site repair through protein-protein interactions // EMBO J. 2001. -V. 20.-P. 6530-6539.

144. Hadi, M.Z., Ginalski, K., Nguyen, L.H., Wilson, D.M.III. Determinants in nuclease specificity of Ape 1 and Ape2, human homologues of Escherichia coli exonuclease III // J. Mol. Biol. 2002. - V. 316. - P. 853-866.

145. Bambara, R.A., Murante, R.S., Henricksen, L.A. Enzymes and reactions at the eukaryotici

146. DNA replication fork// J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 4647-4650.

147. Parlanti, E., Locatelli, G., Maga, G., Dogliotti, E. Human base excision repair complex is physically associated to DNA replication and cell cycle regulatory proteins // Nucleic Acids Res.- 2007. V. 35. - P. 1569-1577.

148. Jonsson, Z.O., Hindges, R., Hubscher, U. Regulation of DNA replication and repair proteins through interaction with the front side of proliferating cell nuclear antigen // EMBO J. -1998.-V. 17.-P. 2412-2425.

149. Tom, T.S., Henricksen, L.A., Bambara, R.A. Mechanism whereby proliferating cell nuclear antigen stimulates flap endonuclease 1 // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 10498-10505.

150. Tom T.S., Henricksen, L.A., Park, M.S., Bambara, R.A. DNA ligase I and proliferating cell nuclear antigen form a functional complex // J. Biol.Chem. 2001. - V. 276. - P. 24817-24825.

151. Fan, J., Wilson, D.M.III. Protein-protein interactions and posttranslational modifications in mammalian base excision repair // Free Radic. Biol. Med. 2005. - V. 38. - P. 1121-1138.