Роль конформационных изменений в функционировании неорганической пирофосфатазы Escherichia coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ вмени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

I

На правах рукописи

МОИСЕЕВ Виктор Михайлович

РОЛЬ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ Е5СНЕМСН1А СОИ

02.00.10 - биоорганическая химия

I

Автореферат

МОСКВА-2005

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в отделе химии белка НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Аваева Светлана Михайловна кандидат химических наук, доцент Родина Елена Валерьевна

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич

доктор химических наук, Судьина Галина Федоровна

Институт биоорганической химии им. М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится 29 ноября 2005 года в 16.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, д.1, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 28 октября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук ——у Смирнова И.Г.

20

17746

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время существование глобулярного белка в растворе принято рассматривать как набор информационных состояний, между которыми существует равновесие. Из многочисленных переходов между конформациями лишь малая часть необходима для проявления биологической активности белков, в том числе ферментов. Выявление структурных перестроек, участвующих в ферментативном катализе, и выяснение их роли в функционировании ферментов является одной из проблем современной биохимии.

Объектом исследования в настоящей работе является неорганическая пирофосфатаза из Escherichia coli. Растворимые неорганические пирофосфатазы (КФ 3.6.1.1.; РРазы) катализируют гидролиз неорганического пирофосфата до двух молекул ортофосфата. Структура РРаз семейства I, к которым относится изучаемый фермент, очень лабильна и в ходе функционирования, несомненно, проходит через большое количество конформационных состояний. Анализ пространственных структур РРаз позволяет выявить некоторые из специфических перестроек, которые, в частности, включают подвижные участки 97-101 и 141-149, обрамляющие вход в активный центр. Консервативность данных неупорядоченных участков в структурах РРаз из разных источников, а также схожесть наблюдаемых перестроек для РРаз Е. coli и S.cerevisiae позволяют предположить, что подвижность данных структурных элементов, а также лабильность структуры в целом могут играть важную роль в катализе. Поскольку РРазы являются одними из наиболее эффективных катализаторов, то исследование вклада конформационной подвижности их структуры в ферментативную активность представляется актуальной задачей.

Цель н задачи исследования. Настоящая работа посвящена выяснению роли структурной лабильности в функционировании РРазы Е coli. Для выполнения работы были сформулированы следующие задачи:

1. изучение свойств мутантных РРаз Е. coli с заменами остатков глицина в неупорядоченных участках 97-101 (далее петля П) и 141-149 (далее петля III);

2. определение параметров термической и химической денатурации нативной РРазы Е. coli и ряда мутантных вариантов. Оценка вклада введенных мутаций и связывания лигандов в стабильность глобулярной структуры РРазы;

3. выяснение возможной роли остатка Asp67 в катализе РРазы Е. coli.

Научная новизна и практическая значимость работы. В диссертационной работе охарактеризованы две не описанные ранее мутантные формы пирофосфатазы E.coli с заменами GlylOOAla и Glyl47Val, в которых конформационная гибкость участков 97-101 и 141-149 искусственно снижена. Установлено, что замены остатков глицина в подвижных петлях снижают скорости конформационных перестроек, необходимых для принятия активной конформации фермента при связывании субстрата. Введение замен привело к значительному снижению каталитической константы гидролиза субстрата. Причиной снижения кса является замедленный уход продуктов реакции. Установлено, что максимальное равновесное количество связанного с ферментом пирофосфата при его синтезе из фосфата магния для варианта GlylOOAla в 2 раза и для варианта Glyl47Val в 5 раз превышает уровень, характерный для нативной РРазы.

Определена энтальпия термической денатурации нативной РРазы Е. coli и мутантных вариантов GlylOOAla и Glyl47Val, а также ряда вариантов с единичными заменами в различных областях молекулы. Количественно охарактеризовано стабилизирующее влияние Mg2* на РРазу Е. coli.

Изучена денатурация WT и ряда мутантных РРаз под действием гуанидингидрохлорида. Рассмотрены две модели денатурации РРазы, рассчитаны соответствующие изменения свободной энергии. Установлено, что введение мутаций снижает стабильность глобулярной структуры РРазы. Показано, что добавление свободного пирофосфата увеличивает энергию денатурации нативного фермента.

Анализ рентгенострухтурных данных и изучение pH-зависимости иягибярования РРазы фторид-ионом позволил высказать новое предположение о роли остатка Asp67 в катализе неорганической пирофосфатазы Е. coli.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты диссертации были представлены на Ш Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002 г.), Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004), 29 Конгрессе Европейского Биохимического сообщества FEBS-2004 (Варшава, 2004), 3 международном конгрессе по пирофосфатазам (Бирмингем, 2004).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на //f страницах и содержит^О рисунков

таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Актуальной задачей современной биохимии является выяснение роли конформагоюниых перестроек в функционировании белков. Практически елпктвеиннм методом выявления коиформацнонных изменений является наложение структур, полученных реиттеноструктуриым анализом. Неорганическая пирофосфатаза (РРаза) в этом 01 ношении относится к хорошо щученным объектам, к нестоящему времени решено большое количество структур фермента в комплексе с различными лнгандамн. Сравнительный анализ различных комплексов, имитирующих различные состояния фермента, выявляет конформяхионные изменения по ходу катализа для неорганической пнрофосфатазы Е. соН. Настоящая работа посвящена выяснению возможной роли наблюдаемых перестроек для функционирования фермента.

Растворимые неорганические пнрофосфатазы (РРвзы) катализируют гидроли! пнрофосфата (РР,) с образованием двух фосфатов (Р<). Бактериальные РРвзы семейства I, к которым относится изучаемый объект, представляют ообой гомогекеамеры, построенные нз

одинаковых мономеров. Субьединица (мономер) пнрофосфатазы является о дно доменным белком. Основу глобулы составляет стабильный гидрофобный кор. Активный центр фермента представляет собой полость диаметром около 20 А, основание которой опирается на гидрофобный кор.

Основными структурными элементами, перестройки которых обнаруживаются при наложении структур В-РРпц являются многие боковые группы (в том числе остатки, не относящиеся к активному центру), а также некоторые участки пвлипетпидной цени. К ним относятся три неупорядоченные области, обрамляющие вход в полость актнвиого центра и обозначаемые здесь н далее как петли I, П и ПТ (рис. I). Петли II и (П имеют высокий В-фмгтор, что означает их высокую коиформациони>ю подвижность. Несмотря на это, в отжтчие от других подвижных элементов основной пеня, эти петли сохраняют консервативное строение в

Рис. I. Пмпи'м» С1РЛ>Ч)Р РРязы Е.соН. Поляисш идоим цепь окрашена по возрастанию В-фактора С^ятмвв (от сижгв цвета к цжииму). Полость активного центра заполнена нонами магния (вияелеим зеленым цветам) н пнрвфосфатом (красно-желтым цветом).

прокариотических и эукариотических РРазах. Поэтому было высказано предположение, что их лабильность может играть определенную роль в функционировании фермента.

Для выявления возможной роли подвижности петель П и Ш были получены мутантные ферменты, в которых гибкость данных участков искусственно снижена. Легкость конформационных переходов во многом определяется наличием остатков глицина. Для решения поставленной задачи в данной работе были охарактеризованы мутантные варианты пирофосфатазы Е. coli с заменами консервативных остатков глицина, GlylOOAla и Glyl47Val, в петлях II и ГО, соответственно.

Следующая часть работы посвящена количественной характеристике стабильности/подвижности глобулярной структуры РРазы и оценке вклада в нее некоторых факторов, таких как введение мутаций и связывание лигандов. Для этого была изучена термическая и химическая денатурация нативного фермента и некоторых мутантных вариантов и рассчитаны термодинамические параметры денатурации. В последней части работы проанализирована возможная роль остатка Asp67 в катализе РРазой E.coli. Для этого исследована pH-зависимость ингибирования Б-РРазы фторид-ионом, а также использованы последние данные «рентгеноструктурной кинетики» фермента.

Характеристика мутантных вариантов с искусственно сниженной подвижностью петель.

Связывание ионов магния. Для того, чтобы неорганическая пирофосфатаза смогла проявлять каталитическую активность, необходимо предварительно насытить ее активный центр ионами магния. Mg2* при этом занимает активаторные центры связывания MI и М2. Равновесие в случае нативного фермента устанавливается быстро, т.е. достаточно добавить Mg2* в реакционную смесь вместе с субстратом и ферментом. Дальнейшее связывание субстрата (пирофосфата магния, MgPP,) тоже является быстрым процессом. Максимальная активность для нативного фермента составляет ~ 600 ME (pH 9,0, I мМ Mg2*, 40 мкМ MgPP,). Таким образом, измерение ферментативной активности нативной РРазы не требует предварительной инкубации ее с ионами магния.

Измеренная в аналогичных условиях пирофосфатазная активность мутантных вариантов GlylOOAla и Glyl47Val оказалась очень низкой (рис. 2) и составила около 10 и 20 МЕ, соответственно. Значения Кт для обоих вариантов были очень высоки (табл. 1). В то же время, предварительная инкубация GlylOOAla и Glyl47Val пирофосфатаз с ионами магния значительно улучшает их каталитические свойства, причем степень их изменения зависит от времени прединкубации и от концентрации Mg2*. Увеличение максимальной скорости гидролиза субстрата и снижение Кт происходит уже при выдерживании этих ферментов с 5

мМ М^ в течение 2 часов, однако наилучшие результаты проявляются после инкубации с 10 мМ в течение 15-20 часов (рис. 2, табл. 1). Дальнейшее выдерживание 01у100А1а и С1у147Уа1 РРаз с не приводит к заметным изменениям. Поэтому все дальнейшие кинетические измерения проводили после предварительной инкубации данных мутантных РРаз с 10 мМ в течение 15-20 часов при 4 "С. Прединкубированные ферменты сохраняли свою активность в течение двух недель. Однако даже после прединкубации максимальная скорость гидролиза и значения мутантных вариантов все же не достигают значений нативной РРазы.

Оугасма 300 Эу147Ма1

во ш >—1 гочааи, 10ыМК& 250 111 I_ -200 §150 4/-----* т * * 20 часов, ЮыМКЦ^

2 |40 / 2чая,5М1>4?

120 к" ' {„■ 2чтя,5шМЦГ

вевщвЛщ/баи! •—----- 50 1 ■ш-■-■-■-1 бштЛтбеш/

oJ 1———- 01 Р—.— щ 1

ю

20

(ИРР^мсМ

30

40

10

20

[А/^ТЦмсМ

30

40

Рис. 2. Зависимость каталитической активности мутантных РРаз С1у100А1а и С1у147Уа1 от предварительной инкубации с ионами

Поскольку причиной такого аномального поведения мутантных ферментов могло быть снижение сродства ахтиваторных центров связывания к были определены

константы диссоциации комплексов мутантных ферментов с

Для апоферментов константы диссоциации комплексов с в центрах М1 и М2 (соответственно, К<|1 и Ка2) определяли спектрофотометрическим титрованием (табл. 2).

Связывание ионов металла приводит к появлению дифференциальных спектров, при этом за заполнением центра М1 можно следить по появлению минимума при длине волны 290 нм, а за заполнением центра М2 - по появлению максимума при длине волны 246 нм.

Таблица 1. Влияние прединкубации с на кинетические параметры гидролиза МвРР,.

РРаза Условия Ут, прединкубации МЕ/мг ^чп» мкМ

\УТ 600 0,9-1,1

без прединкубации ] 1,8±0,7 27±3

СТу100А1а 2 часа с 5 мМ М^ 28,8±0,5 1,4±0,2

15-20 часов с 10 мМ б6±1 1,3±0,2

без прединкубации 18±4 34±15

СТу147Уа1 2 часа с 5 мМ М^ 49,1±0,6 1,8±0,1

15-20 часов с 10 мМ 305±5 2,1±0,2

Константы диссоциации комплексов РРаз GlylOOAla и Glyl47Val с Mg2* в присутствии субстрата определяли из зависимости каталитической активности от концентрации свободного Mg2*. Мутантные

,„ . _ 2+ Таблица 2. Константы диссоциации

ферменты прединкубировали с 10 мМ М£= и затем, Mg2+ в центрах М1 и М2.

добавляя аликвоту фермента в реакционную смесь РРаза К^!, мкМ Ка2, мМ

значительно большего объема, измеряли активность _50±10 1,46±0,02

в присутствии различных концентраций свободного _GlylOOAla_40±3_1,05±0,40

„ . в „ . Glyl47Val 74±8 1,12*0,13

Mg^ . Полученные данные (табл. 3) обрабатывали с -

помощью уравнения:

где Ао - максимальное потенциальное значение скорости гидролиза в отсутствие

, _ ингибирования;

л =-2 > л, — константа диссоциации Mg в

К л +[Mg2* ]+ _— активаторном центре;

К, К, - константа диссоциации Mg2* в

ингибиторном центре.

Поскольку РРаза активна только после заполнения центра более низкого сродства, М2, то значение К„ рассчитанное из полученного профиля, соответствует IQ2.

Полученные в обоих экспериментах результаты показывают, что константы диссоциации Kjl и Kd2 для мутантных ферментов практически не отличаются от соответствующих величин для нативной РРазы. Следовательно, мутации GlylOOAla и Glyl47Val не приводят к ухудшению сродства РРазы к ахтиваторным центрам М1 и М2, но равновесие устанавливается гораздо медленнее.

Помимо констант диссоциации

Таблица 3. Константы диссоциации активаторного и ингибиторного центров акгиваторных центров, полученный профиль

связывания

Mg2*.

- дает возможность оценить сродство РРазы к

Фермент Кр, МЕ/мг К* мхМ К-,, мМ

WT 594±15 200±40 16±2 ингибиторному центру. Нативная

GlylOOAla 57,7±2,6 23,2±5,4 43,5±1,3 пирофосфатаза Е. coli в присутствии Glyl47Val 196,9+5Д 94111 126±37 повышенных концентраций свободного Mg2* ингибируется. Ранее было показано, что причиной ингибирования является заполнение ионом магния центра связывания М4 (рис. 3). Для нативной РРазы ингибирование ярко выражено и константа ингибирования (К,) составляет порядка 16 мМ (табл. 3). Изученные варианты GlylOOAla и Glyl47Val также показывают ингибирование при концентрации свободного Mg2* выше 1 мМ, однако снижение активности для обоих мутантных РРаз очень слабо выражено. Значение К, для GlylOOAla возросло по сравнению с иативным ферментом в 3 раза, а для Glyl47Val константу диссоциации можно лишь приблизительно оценить. Снижение сродства к ингибиторному центру нельзя строго расценивать как результат

замены данных конкретных остатков гпнцина, т.к. многие другие единичные мутации Е-РРазы приводят к аналогичному результату. По-видимому, строение центра М4 нарушается в результате перестроек структуры РРазы при введении мутаций.

N. Asp971 Напротив, необходимость

>102] СКУ

Су Туг141 Arg43

1 \мз, \ • 4

Авр70 M.I~-JW.....

PPl

Asp67o •

TyrS5.

Рис. 3. Схема активного центра Е-РРазы в комплексе с ионами металла и субстратом. Центры связывания активагорных ионов металла М1-МЗ показаны серым цветом, ингибиторного иона М4 - незакрашенным кружком.

прединкубации с Mg2* для проявления каталитической активности является уникальным свойством мутантных РРаз GlylOOAla и Glyl47Val с заменами остатков глицина. Ни один из трех десятков изученных мутантных вариантов Е-РРазы не облачал подобной характеристикой. Следовательно, можно сделать вывод, что обнаруженное свойство является следствием увеличения конформационной жесткости петель П (в случае GlylOOAla) или III (в случае Glyl47Val варианта). Под увеличением жесткости в данном случае подразумевается замедление скорости переходов между возможными конформациями этих петель. Иными словами, обнаруженные из анализа кристаллических структур перестройки петель П и Ш, которыми сопровождается связывание Mg2*, происходят гораздо медленнее в случае GlylOOAla и Glyl47Val вариантов. Резкое снижение активности и ухудшение сродства к субстрату для вариантов без прединкубации показывают, что обнаруженные перестройки необходимы, чтобы фермент принял компетентную конформацию дм следующей стадии катализа -связывания субстрата.

Во всех дальнейших экспериментах мутантные варианты GlylOOAla и Glyl47Val были предварительно прединкубированы с 10 мМ Mg2* в течение суток.

pH-независимые кинетические параметры. Для определения pH-независимых значений кинетических параметров была снята pH-зависимость скорости гидролиза MgPPi мутантными РРазами GlylOOAla и Glyl47Val при различных концентрациях субстрата. Для обоих мутантных вариантов сохраняется колоколообразный профиль pH-зависимости как ксл, так и кет/Кчто дает возможность рассчитать рК, титруемых каталитически важных трупп белка (табл. 4). Основным итогом мутации остатков глицина является снижение кинетических констант гидролиза по сравнению с нативной РРазой. Величина fc* для варианта GlylOOAla составляет порядка 4%, а для варианта Glyl47Val - 25% от наггивного фермента. Эффективность катализа ксл/Кт для обоих мутантных вариантов снижается на два

Таблица 4. рН-независимые параметры

ОуЮОА1а в1у147Уа1

389±80 14,3±0,6 101*5

АГт(мкМ) 0,13*0,06 0,27*0,07 1,4*0,2

ка/Кт (мкМ"' с' ') 3038±800 54*10 75±6

Р^ЕН2 7,75±0,50 8,31*0,20 7,59*0,12

Р^ЕН 8,67*0,50 9,13*0,20 938*0,13

7,56*0,25 6,78*0,10 7,45±0,08

рЛГнн 8,96*0,20 9,38*0,08 10,09*0,09

порядка. Значение рН-независимой константы Михаэлиса возрастает на порядок для 01у147Уа1, но всего в два раза для С1у100А1а, поэтому потеря активности пирофосфатазы при введении мутаций только частично связана с ухудшением сродства к субстрату. Скорость-лимитирующей стадией катализа в условиях насыщения субстратом является уход обоих продуктов, поэтому снижение ксл показывает, что конформационная гибкость обеих петель необходима не только для принятия компетентной конформации при связывании субстрата, но и для эффективного ухода продуктов.

Синтез тюофоаЬата в активном иентре РРазы. Наряду с гидролизом пирофосфата, РРаза катализирует обратный процесс - синтез пирофосфата из двух фосфатов. По ходу катализа в каждый момент времени в активном центре конкурируют два процесса - уход

фосфатов и синтез из них РР;. Равновесие Р/РР, в активном центре зависит от соотношения скоростей этих процессов. Если насытить активный центр фосфат-ионами, то образованный из них РР, (который прочно связан с ферментом) можно определить количественно. На рисунке 4 показана зависимость количества связанного с ферментом РР, от концентрации М§Р, в растворе для нативной РРазы и двух мутантных РРаз С1у100А1а и С1у147Уа1, полученная после установления равновесия Р|/РР| в активном центре ферментов. Из хода

У,

20

РОТ. им

эо

Рис. 4. Зависимость количества связанного в активном центре РР| от концентрации для РРазы и мутантных вариантов С1у100А1аиС1у147Уа1.

кривой можно заключить, что в результате мутации остатков глицина критического ухудшения сродства к фосфатам не наблюдается. Полученные данные показывают, что при концентрациях \lgPi вплоть до 20 мМ количество синтезируемого пирофосфата в активном центре мутантных РРаз низко и сравнимо с аналогичным значением для нативной пирофосфатазы. При более высоких концентрациях фосфата наблюдается существенное отличие. Максимальный уровень равновесной концентрации синтезируемого пирофосфата,

[ЕРР,]![Е,\ для GlylOOAla в два раза, а для Glyl47Val варианта в пять раз выше, чем для иативного фермент.

Наблюдаемое отличие показывает, что изучаемые мутантные РРазы характеризуются более высоким соотношением скоростей синтеза РР, и ухода Р„ чем нативный фермент. Как показывает сравнение кристаллических структур, в результате собственно гидролиза или синтеза происходят минимальные конформационные изменения, а вот уход фосфатов (или их связывание в обратной реакции) сопровождается заметными перестройками, в том числе включающими петли П и III. По-видимому, замедление конформационных переходов при замене остатков глицина приводит к тому, что фосфаты после гидролиза не успевают выйти из активного центра, поэтому равновесие РР/Р, в них смешено в сторону РР, по сравнению с нативным ферментом, что и приводит к повышению наблюдаемого уровня [EPP\\l[Et], Это подтверждает высказанное выше предположение о том, что конформационная гибкость мутированных петель играет важную роль в уходе продуктов.

Стабильность структуры РРазы.

Чтобы количественно оценить, насколько конформационная стабильность структуры РРазы изменяется в результате введенных мутаций, были определены термодинамические параметры денатурации нативной РРазы и ряда мутантных вариантов.

Термическая денатурация.

Эффективные параметры термоденатурации нативной РРазы были определены методом дифференциальной сканирующей калориметрии (рис. 5). При повторном прогреве образцов воспроизводилась базовая линия, что показывает, что процесс термической денатурации РРазы Е coli и ее мутантных вариантов необратим. Определенные значения Тт (температуры максимального теплопоглощения) и А# (калориметрической энтальпии) приведены в таблице 5.

Апоформа нативной РРазы характеризуется высокой температурой плавления (Гт=73°С) и высокой кооперативностыо денатурации (параметр к, определяемый как ширина пика плавления на половине высоты (рис. 5, таблица 5). При плавлении нативной РРазы в присутствии 10 мМ Mg2'1' значение Тт увеличивается более чем на 10°С, а энтальпия денатурации возрастает втрое. Увеличение Тт и Д# для холоформы объясняется стабилизирующим действием Mg*1" на структуру РРазы. Действительно, в холоформе Mg24' заполняет центры М1 и М2, и, кроме того, способен связываться в области контакта между тримерами.

Сложнее объяснить другое отличие кривых плавления ало- и холоформы нативной РРазы. Пик плавления апоформы симметричен, в то время как кривая для холоформы имеет

т 120

rs. WT+Mg** г f\

1 / \ / i' \ / i \ / н \

apoWT/ \ l ДА

65 70

75 80 85 Tufnepfrypa. *С

90 95 100

Рис. S. Дифференциальная сканирующая калориметрия ало- и холоформы (10 мМ Mg24) нативной РРазы Е. coli.

имеет сложную форму (рис. 5). Наиболее точно эта кривая может быть описана суммой трех гауссиан, из которых две соответствуют основным пикам с Тт 85,6°С и 91,7°С, а третья - минорному пику с Тт 88,1°С. Суммарная величина энталыши денатурации составляет ДЯ=1580 кДж/моль (табл. 5). Сложная форма кривой плавления означает, что на пути от полностью свернутого белка к полностью развернутому существуют термодинамически устойчивые

Е-РРаза Та, "С АН, кДж/моль ДЛЯ, кДж/моль ¿fc°C

ano-WT 12» 440 - 4,7

WT lOMMMg2* 85.6 88,1 91.7 1580 1140 5,4 2.7 4.8

промежуточные состояния. Как уже говорилось, молекула РРазы однодоменна, поэтому наличие нескольких пиков на кривой плавления трудно отнести к последовательной денатурации различных частей глобулы, как это принято в подобных случаях. Наличие пиков с разными Тт нельзя также

Таблица 5. Паоаметоы теомической денаттоапии.

объяснить денатурацией различных олигомерных форм РРазы, поскольку присутствие Mg2* и высокая концентрация белка, используемая в эксперименте, делают маловероятной диссоциацию гексамера в процессе плавления. Возможно, в холоформе РРазы стабилизируются несколько конформационных состояний, переход между которыми затруднен по тем или иным причинам.

В работе определяли также термодинамические параметры денатурации ряда мутантных РРаз Е. coli с единичными заменами в разных частях молекулы. РРазы с увеличенной жесткостью петель П и Ш, GlylOOAla и Glyl47Val, характеризуются снижением как Тт, так и АЯ. Однако и для большинства остальных исследованных мутантных вариантов (E145Q, YS5F, D65N, D26A, а также РРаза, химически модифицированная по остатку Lysl46 диальдещдным производным АТР) наблюдается снижение Тт и/или АН. Таким образом, дестабилизация структуры не является уникальным свойством мутантных РРаз GlylOOAla и Glyl47Val. Наблюдаемые отличия свидетельствуют скорее об общей дестабилизации пространственной структуры РРазы в результате нарушения нативной сети нековалентных взаимодействий.

Химическая денатурация.

Определение параметра {(ЗиНСПи-}. Под действием гуаиидингидрохлорвда (С5иНС1) гидролитическая активность РРазы снижается и через несколько часов выходит на постоянное ненулевое значение, определяемое долей свернутых (активных) молекул в общем числе молекул фермента. В данной работе строили профиль равновесной денатурации, для чего измеряли остаточную каталитическую активность РРазы после инкубации с <ЗиНС! в течение 20-24 часов.

Графики зависимости остаточной активности от концентрации <ЗиНС1 представлены на рис. 6. Обработка полученных зависимостей дала возможность рассчитать параметры [(ЗиНС1]|/2 - концентрацию денатурата, при которой половина молекул фермента находится

в активном состоянии. 120

3 4 5 ДОиНО], м

Рис. 6. Остаточная активность РРазы после

Нативная РРаза имеет очень высокое значение [СтиНО]^. Для апоформы РРазы значение этой величины составляет 4,5 М, а для холоформы (в присутствии 10 мМ М^^ это значение возрастает до 5,3 М (табл. 6). Некоторая остаточная активность сохраняется даже при концентрации денатуракга 8 М.

Отсутствие дополнительных ступеней

инкубации с GuHCl: (1) - апоформа, W - т ^We зависимости активности от холоформа (10 мМ Mg**). ^

концентрации GuHCl свидетельствует о том,

что денатурацию РРаз можно формально рассматривать как простую мономолекулярную

реакцию, когда белок переходит из одного состояния в другое без промежуточных

термодинамически устойчивых состояний. Только нативное (N) и денатурированное (U)

состояния белковой молекулы наблюдаются в заметных количествах, что позволяет описать

процесс денатурации с помощью модели двух состояний. Согласно этой модели, в системе

нативная и денатурированная формы белка существуют в равновесии: N«-»U. Полученные

данные были использованы для расчета энергии денатурации, АСде^НгО).

Природа денатурированного состояния. Величина ДС^НгО) определяется константой равновесия между нативным и денатурированным состоянием белка, N«-»U. Однако для расчета константы равновесия необходимо знать олигомерную природу денатурированной формы. В обычных условиях РРаза Е. coli существует в виде гомогексамера. Присутствие химического денатуранта способствует разрушению контактов

между субъединицами, поэтому олигомеряая природа денатурированного состояния может

В данной работе исследовали изменение олигомерного состава РРазы Е. coli при денатурации. Для этого после инкубации

фермента с определенной концентрацией GuHCl денатурант быстро отделяли центрифугированием на спин-колонке, и

полученный раствор разделяли с помощью ВЭЖХ. Результаты показывают (рис. 7), что в ходе денатурации гексамерная Е-РРаза диссоциирует с параллельным образованием тримеров и мономеров. Последние обнаруживаются при концентрации GuHCl выше 4 М. Полученные данные не позволяют точно определить относительные количества олигомерных форм Е-РРазы, поскольку в процессе денатурации пики отдельных форм уширяются, что отражает изменение компактности белковой глобулы, и начинают перекрываться. Тем не менее, результаты подтверждают, что после инкубации в присутствии GuHCl гексамерная Е-РРаза частично диссоциирует.

Расчет энергии денатураиии. Полученные данные показывают, что денатурация Е-РРазы протекает по сложному механизму, при каждой концентрации GuHCl в растворе сосуществуют молекулы различного олигомерного состава в различной степени денатурации. Поэтому в данной работе для расчета константы равновесия, а следовательно, и ДСдга(Н20) использованы две модели, соответствующие двум крайним случаям Модель (I) соответствует равновесию гексамер«-»денатурированный гексамер (H«-»Uh), рассчитанная по ней величина AGÄC„(H20) отражает энергетические затраты собственно на денатурацию. Модель (II) соответствует равновесию гексамер«-»6 денатурированных мономеров (H«-»6Um), и рассчитанная по этой модели величина Д0ден(Н20) включает дополнительно энергетические затраты на разрушение олигомерных контактов. Таким образом, в таблице 6

Рис. 7. Профили элюции ВЭЖХ растворов нативной РРазы после инкубации с виНО и отделения денатурата. В таблице справа приведены времена удерживания основных пиков.

представлены значения энергии денатурации АСди^НгО), рассчитанные согласно двум моделям. Их можно рассматривать как нижнюю и верхнюю границы диапазона, в который попадает истинное значение АСгдоОДО).

Таблица 6. Параметры химической денатурации нативной РРазы Е. coli.

Параметры денатурации

H«UH н««им [GuHCl]w,-,---

Лягаяды ДСд.ЩгО), ЛДС.ЛЬО), т, AGmJfifi), AAG«(HjO), ж,

М

кДж кДж кДж кДж кДж кДж

МОЛЬ МОЛЬ МОЯЬ-М МОЛЬ МОЛЬ МОЛЬ-U

тег 4^5 29±2 - ^7±1 257±3 = -23±1

lOiiMMg2* 5,3 49±6 20 -9±1 259413 2 -19±3

1 мМ PPi 4,4 58±4 29 -13±1 369±12 112 -48±3

Коэффициент пропорциональности т - это мера изменения площади гидрофобной поверхности, обращенной в растворитель, при денатурации.

Влияние лигандов на стабильность РРазы. Свободный пирофосфат, в отличие от пирофосфата магния, не является субстратом РРазы, однако согласно кинетическим данным

он может связываться в эффекторном центре РРазы и активировать фермент. Аллостерическая активация РРазы предполагает, что структура фермента изменяется при связывании свободного PPj. Как видно на рис. 8, присутствие эффектора практически не меняет параметр [GuHC1]i/2. Тем не менее, независимо от используемой для расчета модели, значение энергии денатурации резко возрастает по сравнению с апоформой фермента (табл. 6). Это происходит за счет значительного увеличения коэффициента пропорциональности при вычислении Д(/дс„(Н20), параметра т. Возможно, стабилизация структуры происходит за счет того, что связывание РР, инициирует образование контактов между структурными элементами белка, которые в отсутствие эффектора не связаны. Не исключено также, что перестройка структуры при связывании РР, приводит к изолированию гидрофобных участков молекулы, которые в апоформе РРазы экспонированы, поэтому изменение общей гидрофобной поверхности при денатурации выше

[GuHcq. м

Рис. 8. Профиль денатурации WT РРазы и ее комплексов с Mg2* или PPi под действием GuHCl.

для комплекса фермента с РР,. Так или иначе, связывание эффектора существенно стабилизирует глобулу.

В отличие от свободного пирофосфата, в случае стабилизации РРазы под действием ионов магния параметр [GuHC1]i/2 значительно увеличивается. Вероятно, причина такой разницы - в определении доли денатурированных молекул по изменению каталитической активности. Ионы магния, связываясь в активном центре, стабилизируют в основном кор глобулы, поэтому каталитическая активность сохраняется до более высоких концентраций денатуранта, несмотря на то, что поверхностные структурные элементы уже частично денатурировали. Свободный пирофосфат, согласно этой логике, связывается таким образом, что поверхностные элементы структуры закрепляются более прочно. Это приводит к затрудненному началу денатурации, но как только поверхностные петли все-таки плавятся, оставшаяся структура денатурирует с высокой степенью кооперативности.

Влияние мутаиий на энергию денатураиии. В работе была определена энергия денатурации мутантных вариантов РРазы E.coli (GlylOOAla, Glyl47Val, Glu31Ala, Asp26Ala). Денатурация мутантных ферментов следует тем же закономерностям, которые наблюдаются и для нативной Е-РРазы. Полученные значения ДСда^НгО) были использованы для количественной оценки вклада мутаций в стабильность РРазы. Результаты показывают, что из изученных вариантов РРазы Е. coli наибольшее снижение стабильности белка наблюдается при замене остатка GlylOO. Облегчение денатурации может быть связано с тем, что в результате мутации GlylOO конформация петли II искажается за счет неоптимальных торсионных углов, и петля может частично отодвигаться от поверхности глобулы, уменьшая количество контактов с поверхностью и облегчая доступ молекулам денатуранта. Для мутантного варианта Glyl47Val значение MG, рассчитанное по модели (H«-»Uh), составляет почти -20 кДж/моль. Вместе с тем, если энергию денатурации определять по модели (H<-»6Um), то для этого варианта наблюдается некоторая стабилизация (MG = 1S кДж/моль). Такое различие может говорить о том, что мутация Glyl47Val, облегчая собственно денатурацию, повышает энергетические затраты на диссоциацию гексамера. Значения AAG для вариантов Glu31Ala и Asp26Ala низки, что говорит о незначительном вкладе этих остатков в стабильность глобулярной структуры.

Данная часть исследования продемонстрировала, как направленное введение мутаций помогает выявлять существенные для функционирования фермента перестройки, включающие полипешидную цепь. Не менее важным является понимание роли перестроек боковых групп, сопровождающих превращение субстрата. Ниже проанализирована возможная роль в катализе разворота боковой группы Asp67.

Роль остатка Asp67 в функционирования РРазы Е. coli.

F является обратимым ингибитором гидролитической реакции. В присутствии РР, он связывается в активном центре РРазы, замещая нуклеофильную частицу W, и делая гидролиз фосфоангидридной связи невозможным. Это свойство позволяет получить стабильный фермент-субстратный комплекс, в котором W, замещена на F. Снижение концентрации ингибитора в смеси приводит к восстановлению гидролитической активности РРазы E.coli. Недавно на основании этих свойств были получены пространственные структуры В-РРазы в двух последовательных каталитических состояниях: 1) фермент-субстратный комплекс, стабилизированный F, и 2) комплекс фермента с одним из фосфатов - продуктов реакции -после диссоциации другого фосфата. Обе структуры сняты с одного кристалла и уточнены с очень высоким разрешением, поэтому их сравнительный анализ позволил обнаружить новые детали динамической перестройки структуры РРазы по ходу катализа.

Одним из конформационных изменений, не обнаруженных ранее, является возможный разворот боковой группы остатка активного центра Asp67. Для этого остатка наблюдаются два альтернативных положения в зависимости от того, что связано в активном центре, - пнрофосфагт или фосфат (рис. 9). В первом случае карбоксильная группа Asp67 является прямым лигандом фторид-иона, который в кристалле занимает место атакующего нуклеофила W,. Во втором случае Asp67 лигаидирует соответствующий атом Onu только через молекулу воды, которая, в свою очередь, входит в координационную сферу иона металла М4.

• ш

Рис. 9. Альтернативные положения боковой группы остатка Asp67 в структурах комплексов Е-РРазы с PPj и Pj. Показаны ионы марганца М1-МЗ р.^ (имеют одинаковое положение в обеих структурах).

Фторид-ион связан только в структуре комплекса с PPi и занимает место атакующего нуклеофила W,. Asp6 (Рн) Показаны также ион М4 и молекула воды (структура комплекса с Pi).

Asp67(R)

В фермент-субстратном комплексе нуклеофильная молекула воды W, связана одновременно с двумя ионами металла-активатора, М1 и М2, и поляризована за счет этого взаимодействия. В присутствии подходящего акцептора протона она может превратиться в более активный гидроксид-ион ОН". Ранее в литературе было высказано предположение, что роль акцептора протона от W, выполняет карбоксильная группа Asp67, поскольку она является единственным белковым лигандом F/ W, во всех известных структурах РРаз Е. coli

или 5сегеуйгае. Однако структура, изображенная на рис. 9, снята при рН 5, в то время как рН-оптимум действия Е-РРазы лежит около 8,5. В этих условиях акцептирование Н* карбоксильной группой предполагает повышенное значение ее рК,. Известно, что из всех мутантных вариантов Е-РРазы Азр67Азп обладает уникальной особенностью - его сродство к К и стабильность полученного фермент-субстратного производного резко повышены. Причины этого до сих пор были непонятны. Чтобы прояснить этот вопрос, а также выяснить возможную роль наблюдаемого смещения боковой группы Азр67, в данной работе была изучена рН-зависимостъ сродства нативной Е-РРазы и А$р67Ая1 варианта к фторид-иону.

рН-зашисимостъ ингибирования РРазы фторид-ионом.

Различия ингибирования Лтопид-ионом при Мт?*- и Мп2*- активируемом гидролизе. В работе определяли константу ингибирования фторидом-ионом (К,) гидролиза РР, нативной Е-РРазой в присутствии либо Мп2+. Для этого измеряли скорость гидролиза РР1 в присутствии фиксированной концентрации субстрата и катиона-активатора либо Мп2+) при возрастающих концентрациях Р. В случае нативной Е-РРазы как для М{р+-, так и Мп2+-актнвируемого гидролиза наблюдается увеличение К, с ростом рН, т.е. происходит снижение сродства фермента к фторид-иону. Два катиона, однако, существенно различаются по двум параметрам: во-первых, собственно величиной К„ а во-вторых, значением рН, при котором К, изменяется наиболее сильно. В случае активации фермента значение К, лежит в микромолярной шкале (при 5 мМ М^ и рН 7,4 = 35,8 мкМ), в то время как при активации РРазы Мп2+ значение К, переходит в область миллимолярных концентраций (при

50 мкМ Мп2+ К, = 2,8 мМ).

3-2 3.1 3.0

5 2.9

» 2.8

2.7

26

2.6

в 8 7.0 12 7.4 РН

в

7

в

рн

9

10

Рис. 10. рН-зависимость К\ в координатах Диксона-Уэбба для Мп2+-активнруемого гидролиза РРазы (а) и М^-акгавируемого гидролиза (б) для АУТ РРазы (/) и мутантного варианта А$р67А$п (2).

Линеаризация данных в координатах Диксона-Уэбба (рис. 10) показывает, что в случае активации Мп2+ тангенс угла наклона составляет 0,96, что соответствует ионизация единственной группы с рАГ, 7,3. В случае М^-активнруемого гидролиза наклон имеет очень низкое значение (около 0,2), поэтому рН-зависимость нельзя строго приписать ионизации единственной титруемой группы. Тем не менее, полученные данные однозначно показывают, что рН-переход, отвечающий за изменение сродства РРазы к К, происходит в случае активации на две единицы рН выше, чем в случае активации Мп2+.

Природа рН-зависимости сродства РРазы к Г, Возможной причиной ухудшения сродства к Г с ростом рН может быть ионизация группы белка, с которой связывается фторид-ион. Для Е-РРазы единственной такой группой является карбоксильная группа АБр67. Логично предположить, что в протонированной форме Азр67 связывается с Г прочнее, чем в форме отрицательно заряженного карбоксилата В этом случае область рН, в которой наблюдается наиболее сильное изменение К„ соответствует рК, Азр67, и его карбоксилат действительно мог бы акцептировать протон от в области рН-оптимума.

Чтобы проверить высказанное предположение, аналогичная рН-зависимость для М^-активируемого гидролиза РР, была снята для мутантной РРазы А«р67Ая1. Однако для этого варианта сохраняется общий характер кривой и наклон в координатах Диксона-Уэбба, хотя значение рН-перехода слегка смещается (менее чем на 0,3 единицы рН) в более щелочную область. Сохранение рН-зависимости К\ для РРазы, в которой титруемая группа Авр67 элиминирована, свидетельствует о том, что изменение сродства к Р вызвано какой-либо другой причиной. Таким образом, предположение о повышенном значении р/Г, Авр67 не подтверждается полученными результатами. Поэтому вопрос о возможности акцептирования протона этой группой при оптимальном для катализа рН 8-8,5 остается открытым.

Другим возможным объяснением ухудшения сродства фермента к I7" с ростом рН является ионизация какой-либо другой группы активного центра. Карбоксильные труппы -лиганды ионов металла - исключаются из рассмотрения, т.к. вероятность для них иметь столь высокие значения рК, очень низка. В работе была исследована рН-зависимость ингибирования М^-зависимого гидролиза под действием мутантных Е-РРаз с заменами остатков - лигандов пирофосфата: Агд43СТп (с удалением основного белкового лиганда группы Р2) и Туг55РЬе (с удалением основного белкового лиганда группы Р1). Однако для них тоже сохраняется характерная для нативного фермента форма рН-профиля Кь а также значение тангенса угла наклона в координатах Диксона-Уэбба и область рН-перехода Следовательно, и эти остатки не определяют наблюдаемую зависимость.

Альтернативным объяснением рН-зависимости К, может быть ионизация замещаемой молекулы воды (W,). Если определяемое значение рН-перехода является не истиной

константой ионизации определенной группы, а некоторой эффективной величиной (на что указывает низкий наклон прямой в координатах Диксона-Уэбба), то на него может влиять прочность связывания замещаемой частицы с ионами металла М1 и М2. В этом случае незаряженная молекула воды будет легче уходить от двух ионов металла, чем заряженный гидроксид-ион, и в этом случае равновесие ионизации W, (НгО-'ЬГ+ОН") действительно может чувствоваться при изучении ингибирования фторид-ионом. В этом случае значение рН-псрсхода отражает рАГ, атакующей молекулы воды. Для Мп2'-активируемого гидролиза эта величина составляет около 7,3, а для Mg2+-aKTHBHpyevoro гидролиза - около 9. Данное предположение могло бы объяснить наблюдаемую разницу в сродстве Mg2+- или Мп2*-активируемой РРазы к фторид-иону, поскольку, согласно полученным данным, при одном и том же значении рН в активном центре фермента может находиться либо (в случае Mg2*) нсионизованная молекула воды, либо (в случае Мп2*) ОН", и от этого зависят легкость обмена данной частицы на F.

Участие А.чр67 в акцептировании tf от W„ Как указывалось выше, в литературе остатку Asp67 приписывается роль акцептора протона при генерировании ОН" из W,. Однако полученные данные по рН-зависимости ингибирования Е-РРазы фторидом не подтверждают, что эта группа имеет повышенное значение рА', Кроме того, анализ распределения молекул воды в активном центре фермент-субстратного комплекса Е-РРазы показывает, что протон от W, может быть акцептирован и транспортирован в окружающий раствор без участия карбоксильной группы Asp67. Существует непрерывная цепочка молекул воды, связанных короткими водородными связями (менее 2,8 А), которая начинается от W, и заканчиваете* на поверхности глобулы (рис. 11). Позиции всех молекул вода в данной цепочке строго упорядочены за счет контактов с консервативными белковыми остатками. По такой цепочке протон может лепсо передаваться с помощью эффекта тумпеяироаания на m»epx»ucifc глобулы, где он захватывается анионами буферного раствора. После гидролиза ОН' входит в состав электрофильного фосфата Р2 и вместе с ним покидает активный центр, а между ионами М1 и М2 связывается новая молекула воды W„ и цикл повторяется, включая выброс протона на поверхность. Поскольку карбоксильная группа Asp67 не входит • цепочку туннелирования, то участие этого остатка в катализе как акцептора протона необязательно, ему достаточно лишь усилить поляризацию О-Н связи в W» Это объясняет ненулевую остаточную активность Asp67Asn варианта Е-РРазы (4 % от иативного фермента).

Ов7 )

"он

Г 007'

Р?0 I

р?0 ]

юг у=а- - »6 н3й

1 (~К34

Г 132 г=0 )|8 Н,Й—'

К34

н i ОН- • О -НЫ Н н

Зн • о +1»

м

<566 -=о " -Мб

<366 ^=о -н8 у,

Рис. 11. Туянелирование Н* от на поверхность глобулы по цепочке структурированных молекул воды.

Альтернативное предположение о роли Авр67 в катализе вытекает из совместного анализа полученных данных по свойствам АврбТАэп РРазы, с одной стороны, и обнаруженного разворота боковой группы А$р67 после ухода одного из фосфатов, с другой стороны. Уход фосфата из электрофильиого центра Р2 подразумевает разрыв связей, образованных атомом Оки (бывший кислородный атом \Уа) и ионами металла М1 и М2. Моделью этого процесса является восстановление активности Е-РРазы, ингибированной фторид-ионом, в результате снижения концентрации Г. В этом случае ион Г замещается на молекулу воды, для этого должен произойти разрыв связей между Г и теми же ионами металла М1 и М2. Свойства Авр67А5п Е-РРазы показывают, что удаление отрицательного заряда на этом остатке приводит к резкому увеличению сродства фермента к Г, и ингибирование становится практически необратимым. Отсюда можно сделать вывод, что депротонированная карбоксильная группа остатка Авр67 облегчает освобождение Г из сферы действия М1 и М2. С точки зрения катализа, это означает, (1) что именно Азр67 контролирует высвобождение Ок„ в процессе ухода Р2; и (2) что карбоксильная группа Авр67 должна быть ионизована для оптимального катализа.

Таким образом, в работе высказано предположение, что роль Азр67 в катализе Е-РРазой заключается, во-первых, в дополнительной поляризации связи 0-Н в нуклеофильной молекуле воды \Уа при генерировании ОН"; и, во-вторых, в освобождении кислородного атома Они в процессе ухода электрофильного фосфата Р2.

ВЫВОДЫ

1 Замены остатков глицина GlylOOAla и Glyl47Val РРазы Е. coli приводят к следующим изменениям свойств фермента:

- резкое уменьшение скоростей конформацнонных перестроек после заполнения активаторных центров связывания Mg2', необходимых для последующего связывания субстрата;

- существенное уменьшение каталитической константы гидролиза субстрата за счет более медленного ухода продуктов реакции;

- снижение стабильности РРазы в условиях термической и химической денатурации;

- увеличение равновесного количества связанного с РРазой пирофосфата при насыщении активного центра фосфатом магния.

2. Определены значения энтальпии денатурации нативной РРазы E.coli, мутаэтных вариантов GlylOOAla, Glyl47Val и ряда вариантов с единичными заменами в различных областях молекулы РРазы. Показано, что в присутствии 10 мМ Mg2* энтальпия денатурации нативной РРазы возрастает на 1140 кДж/моль.

3. Рассмотрены две модели протекания химической денатурации нативной РРазы E.coli и мутантных РРаз GlylOOAla и Glyl47Val. Рассчитаны соответствующие изменения свободной энергии денатурации, количественно охарактеризовано влияние лигандов на стабильность структуры нативной РРазы.

4. Предложена модель, согласно которой роль Asp67 в катализе Е-РРазой, наряду с поляризацией связи О-Н в нуклеофильной молекуле воды W„, заключается в освобождении кислородного атома Оки в процессе ухода электрофильного фосфата Р2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Моисеев В.М., Родина Е.В., Аваева С.М. (2005) Влияние замен консервативных остатков глицина GlylOO и Glyl47 на стабильность неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70,1030-1040.

Моисеев В.М., Родина Е.В., Курилова СЛ., Воробьева Н.Н., Назарова Т.И., Аваева С.М. (2005) Замены остатков глицина GlylOO и Glyl47 в консервативных петлях снижают скорости конформационных перестроек неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70,1041-1050.

Моисеев В.М., Родина Е.В. (2002) Роль подвижных петель в функционировании неорганической пирофосфатазы Eschericia coli. Тезисы научных докладов III Съезда Биохимического общества, с. 595.

Моисеев В.М., Суханова И.Ф., Родина Е.В. (2004) Природа атакующего нуклеофила в реакции гидролиза пирофосфата неорганической пирофосфатазой Е. coli. Тезисы 8 Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", с. 62. Moiseev V., Rodina E.V., Kurilova S.A. (2004) Homologous glycine residues in inorganic pyrophosphatase. 29* Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, EJB, 271 (Supplement 1), p. 80.

Rodina, E., Vorobyeva, N., Kurilova, S., Nazarova, Т., Vainonen, Ju., Sitnik, Т., Suhanova, I., Moiseev, V., Pavlova, O., Avaeva, S. (2004) Conformational flexibility of E. coli soluble inorganic pyrophosphatase: a new role for the enzyme regulation In vivo. Proceedings of the 3rd International Meeting on Inorganic Pyrophosphatases "Recent Advances in Inorganic Pyrophosphatase Research", p. 51.

№20 235

РНБ Русский фонд

2006-4 17746

Подписано в печать 26 октября 2005 г. Заказ 509. Формат 60 х 90/16. Тираж 190 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

1. Введение.

2. Роль петель в функционировании белков (обзор литературы).

2.1. Конформационные изменения в белковых структурах.

2.2. Строение петель.

2.3. Конформационные изменения петель и их участие в функционировании белков.

2.4; Роль остатков глицина в формировании структуры и обеспечении г конформационной подвижности активного центра.

3. Конформационные изменения в структуре неорганической пирофосфатазы обзор литературы).

3.1. Связывание ионов металла.

3.2. Связывание субстрата.

3.3: Гидролиз субстрата.

3.4. Уход продуктов.

4. Роль конформационных изменений в функционировании неорганической пирофосфатазы Escherichia coli (обсуждение результатов);.

4.1; Исследование мутантных вариантов Е-РРазы GlylOOAla и Glyl47Val.

4.2. Количественная оценка стабильности структуры РРазы.

4.3. Роль остатка Asp67 в функционировании РРазы Е. coli.

5. Экспериментальная часть.

Выводы.

Пространственная структура белков стабилизирована сетью нековаленгных взаимодействий. В отличие or комплементарных взаимодействий, стабилизирующих структуру нуклеиновых кислот, контакты между аминокислотными остатками в белках неспецифичны, что создает основу для. многочисленных возможностей перебора партнеров практически для любой функциональной группы. Это свойство, а также лабильность нековалентных взаимодействий приводят к уникальной особенности глобулярной структуры белков: их молекулы существуют в виде равновесного набора близких конформаций, и это равновесие легко сдвигается при взаимодействии с различными лигаидами. В результате в процессе функционирования белки неизбежно претерпевают конформационные изменения, которые могут включать как основную полипептидную цепь, так и боковые группы аминокислотных остатков и значительно варьировать по амплитуде и скорости. Часть структурных перестроек лежит в основе таких жизненно важных свойств белков, как рецепция, аллостерическая регуляция или ферментативный катализ. Однако некоторые конформационные изменения являются г «конкомитантными», т.е. просто неизбежно сопровождают функционирование белка, не влияя на его биологическую активность; другие же изменения могут, наоборот, приводить к снижению биологической активности, являясь затратной статьей энергетического баланса.

На сегодняшний день наиболее широко распространенным способом выявления конформационных изменений является сравнительный анализ пространственных структур белков. В частности, для ферментов используют наложение кристаллических структур, полученных в различных условиях, имитирующих отдельные: стадии каталитического процесса. Выяснение возможной роли наблюдаемых перестроек в катализе является отдельной задачей. Для этой цели анализ пространственных структур комбинируют с сайт-направленным мутагенезом. Интерпретация; результатов исследования мутантных вариантов часто затруднена как раз из-за лабильности белковой структуры. Даже щадящие единичные замены аминокислотных остатков могут приводить не только к локальным изменениям структуры в месте мутации, но и к перебору партнеров в сети нековалентных взаимодействий в других частях глобулы. Тем не менее, совместный анализ данных, полученных разными методами, иногда позволяет соотнести изменение изучаемого свойства с конкретной введенной мутацией.

Целью данной работы было изучение функциональной роли конформационных изменений неорганической иирофосфатазы Escherichia coli (Е-РРазы) на различных стадиях катализа. Объект данного исследования является хорошо охарактеризованным ферментом. Для нативной Е-РРазы получено около десяти кристаллических структур в комплексе с различными лигандами. Сравнительный анализ лих структур позволяет предположить, какими конформационными изменениями сопровождается катализ. Помимо боковых групп остатков активного центра, наблюдается смещение боковых групп многих других аминокислотных остатков по всей глобуле.- Кроме того, наблюдаются перестройки; (смещение или скручивание) подвижных элементов полипептидной цепи - различных петель и обоих концевых участков. Сравнение этих результатов с аналогичным наложением для другого представителя; растворимых РРаз, фермента из пекарских дрожжей S. ccrevisiue, показывает удивительное сходство конформационных перестроек, которые происходят с отдельными неупорядоченными участками структуры на одних и тех же стадиях катализа в двух РРазах. К ним относятся, в частности, р-шпилька.95-102 (далее:петля II) и участок 141-149 (далее петля III). Эти участки цепи имеют низкую гомологию первичных структур, но сходны по пространственному строению и содержат в своем составе: остатки глицина. Предварительный анализ первичных структур 80 растворимых РРаз из различных прокариотических и эукариотических: организмов показал, что положение остатков глицина в данных структурных элементах может варьировать, но их наличие является обязательным условием. Этот факт позволил предположить, что либо само строение данных участков, либо их: конформационная подвижность (обусловленная» обязательным ; наличием глицинов) может оказаться важным фактором в проявлении s каталитической активности РРаз. Для проверки высказанного предположения ¡в работе были ; охарактеризованы мутантные варианты Е- РРазы с заменами t ключевых остатков > глицина. 01у100А1аи Glvl47Val. с искусственно сниженной гибкостью петель II и III.

Чтобы охарактеризовать вклад различных факторов в стабильность глобулярной! структуры : фермента, в работе была определена энергия термической ¡ и химической ; денатурации Е-РРазы и ее мутантных вариантов.

При анализе полученных недавно рентгеноструктурных данных обнаружилось неизвестное ранее смещение : боковой группы остатка активного центра Asp67. Чтобы выяснить возможную роль, наблюдаемой; перестройки; в катализе,, в г данной? работе изучена рН-зависимость ингибирования фторид-ионом гидролиза субстрата нативной Е-РРазой и мутантным вариантом Asp67Asn.

Обзор литературы состоит из двух глав. Первая глава посвящена неструктурированным; элементам белковой молекулы - петлям; В ней описаны, закономерности строения петельных регионов, роль петель при функционировании белков. Во второй главе рассмотрены известные на сегодняшний день конформационные изменения в структуре неорганической пирофосфатазы по ходу катализа.

выводы

1. Замены остатков глицина GlylOOAla и Glyl47Val РРазы Е. coli приводят к следующим изменениям свойств фермента:

- резкое уменьшение скоростей конформационных перестроек после заполнения активаторных центров связывания Mg2\ необходимых для последующего связывания субстрата;

- существенное уменьшение каталитической константы гидролиза субстрата за счет более медленного ухода продуктов реакции;

- снижение стабильности РРазы в условиях термической; и химической; денатурации;

- увеличение равновесного количества связанного с РРазой пирофосфата при; насыщении активного центра фосфатом магния.

2. Определены значения энтальпии денатурации нативной РРазы E.coli, мутантных вариантовt GlylOOAla, Glyl47Val и ряда вариантов с единичными заменами в различных областях молекулы РРазы. Показано, что в присутствии 10 мМ Mg2+ энтальпия денатурации нативной РРазы возрастает на 1140 кДж/моль.

3. Рассмотрены две модели протекания химической денатурации нативной РРазы E.coli и мутантных РРаз GlylOOAla и Glyl47Val. Рассчитаны соответствующие изменения свободной энергии денатурации, количественно охарактеризовано влияние лигандов на стабильность структуры нативной РРазы.

4. Предложена модель, согласно которой роль Asp67 в катализе Е-РРазой, наряду с поляризацией связи О-Н в нуклеофильной молекуле воды Wa, заключается в освобождении кислородного атома Onu в процессе ухода электрофильного фосфата Р2.

1. Carlson; H.A., McCammon, . J.A. (2000) Accommodating Protein Flexibility in Computational Drug Design: MoL Pharm:, 57, 213-218.

2. Carrell, RIW., Gooptu;. B. (1998) Conformational! changes and< disease — serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin: Struc. Biol., 8, 799-809.

3. Kumara, S., Nussinov, R. (2001) How do thermophilic proteins deal with heat? Cell. Mol.LifeSci., 58; 1216-1233.

4. Dubey, A., Sharma, G., Mavroidis, C., Tomassone, M.S., Nikitczuk, K., Yarmush, M.L. (2004) Computational: Studies of Viral Protein Nano-Actuator. J. Comput: Theor; Nanosci., 1, 1-11.

5. Petsko, G;A., Ringe, D. (2004) in Protein structure:and function. New Science Press Ltd, London; p. 195.

6. Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., Bourne, P.E: (2000) The protein data bank. Nucleic Acids Res., 28, 235-242.

7. Gutteridge, A., Thornton, J., (2004) Conformational change in substrate binding, catalysis and product release: an open and shut case? FEBS Letters, 567, 67-73.

8. Gerstein; M., Krebs, W. (1998) A database of macromolecular motions. Nucleic Acids Res:. 26, 4280-4290.

9. Kuntz, I.D. (1972) Protein folding. J. Am. Chem. Soc, 94, 4009-4012.

10. Rose, G.D.; Gierasch. L.M., Smith. J .A. (1985) Turns in peptides and proteins. Adv. Prot. Chem:. 37,1-109;

11. Venkatachalam, C.M. (1968) Stereochemical criteria for polypeptides and proteins. V. Conformation of a system of three linked peptide units. Biopolymers, 6, 1425-1436.

12. Fuchs, P.F.J., Alix, A.J.P. (2005) High accuracy prediction of p-turns and their types using propensities and multiple alignments. Prot., 59,3 828-839.

13. Oliva, В., Bates, P.A., Querol, E., Aviles, F.X., Sternberg, M.J.E. (1997) An automated classification of the structure of protein loops .J. Mol. Biol., 266, 814-830.

14. Kawasaki, H., Kretsinger, R.H. (1995) Calcium binding proteins 1 :EF-hands. Prot: Profiles, 2, 305-490.

15. Wierenga, R.K., Terpstra, P., Hoi, W.G.J. (1986) Prediction of the occurrence of the-ADP-binding: alpha beta alpha fold in proteins, using an amino acid sequence fingerprint: J. Mol. Biol., 187; 101-107.

16. Saraste, M., Sibbald, PR., Wittinghofer, A. (1990) The P-loop: a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sci., 15, 430-434.

17. Mathews, B.W. (1972) The у -turn. Evidence for a new folded conformation in Ш proteins. Mucromolecules, 5, 818-819.

18. Wilmot, C.M., Thornton, J.M. (1990) P-turns and their distortions: a proposed new nomenclature. Prot. Eng. . 3, 479-494.

19. Hutchinson, E.G., Thornton, J.M. (1994) A revised set of potentials for beta-turn formation in proteins. Prot. Sci., 3, 2207-2216.

20. Schellman, C. (1980) The aL conformation at the ends of helices. In: Protein folding. Ed. Jaenicke, R., Amsterdam, Elsevier, p. 53-61.

21. Milner-White, E.J. (1988) Recurring loop motif in proteins that occurs in right handed and left handed forms. J. Mol. BioL, 199, 503-511.

22. Milner-White, E;J„ Nissink, J.W., Allen, F.H., Duddv, W.J. (2004) Recurring main-chain anion-binding motifs in short polypeptides: nests. Acta Cryst:, D60, 1935-1942.

23. Gunasekaran, К., Ma, В., Nussinov, R. (2003) Triggering loops and enzyme Function: identification of loop that trigger and modulate movements. J. Mol. Biol:, 332, 143159.

24. Joseph, D., Petsko, G.A., Karplus, M. (1990) Anatomy of a conformation change: hinged "Lid" motion of the triosephosphate isomerase loop. Science, 249, 1425-1428.

25. Nicholson, L.K., Yamazaki, Т. Torchia, D.A., Grzesiek, S„ Bax, A. Stahl, S.J. (1995) Flexibility and function in HIV-Г protease. Nature Struct. Biol., 2, 274-280.•

26. Derewenda, Z.S. (1994) Structure and function of lipases. Adv. Prot. Chem., 45, 1 -52.

27. Lebioda, L., Stec, B. (1991) Mechanism of enolaser the crystal structure of enolase-Mg'^-2-phosphoglycerate/phosphoenolpyruvate complex at 2,2 A resolution. Biochemistry, 30, 2817-2822.

28. Beaman, T.W., Vogel, K.W., Drueckhammer, D.G., Blanchard, J.S., Roderick, S.L. (2002) Acyl group specificity at the active site of tetrahydridipicolinate N-succinyltransferase. Prot. Sci., 11, 974-979.

29. Koshland, D. (1998) Conformational changes: how small is big enough? -/Va/. Med., 4, 1112-1114.

30. Shi, D., Morizono, H., Yu, X., Tonga, L., Allewell, N.M., Tuchman, M. (2001) Human ornithine transcarbamylase: crystallographic insights into substrate recognition and conformational changes. Biochem. J., 354, 501-509.

31. Huntley, J.J., Scrofani, S.D.B., Osborne, M.J., Wright, P.E., Dyson, H.J. (2000) Dynamics of the metallo-P-Iactamase from bacteroides fragilis in the presence and absence of a tight-binding inhibitor. Biochemistry. 39, 13356-13364.

32. Huntley, J.J., Fast, W., Benkovic, S.J., Wright, P.E., Dyson, H.J. (2003) Role of a solvent-exposed tryptophan in the recognition and binding of antibiotic substrates for a metallo-beta-lactamase. Prot. Sci., 12, 1368-1375.

33. Chin, D., Means, A.R. (2000) Calmodulin: a prototypical calcium sensor. Trends Cell Biol., 10,322 328.

34. Ye, Y., Lee, H.-W.,Yang, W., Shealy, S.J., Wilkins, A.L., Liu, Z., Torshin, I., Harrison, R:, Wohlhueter, R., Yang, J.J. (2001) Metal binding affinity and structural : properties of an isolated EF-Ioop in a scaffold protein. Prot. Eng., 14, 1001-1013.

35. Cook, B.C., Rudolph, A.E., Kurumbail, R.G., Porche-Sorbet, R:, Miletich, J.P. (2000) Directed glycosylation of human coagulation factor X at residue 333. J. Biol. Chem., 275,38774-38779.

36. Soejima; K., Yuguchi, M., Mizuguchi, J., Tomokiyo, K., Nakashima, T., Nakagaki, T., Iwanaga, S. (2002) The 99 and 170 loop-modified factor Vila mutants show enhanced catalytic activity without tissue factor. J. Biol. Chem. , 277, 49027-49035;

37. Huang, Z., Prusiner, S.B;, Cohen. F.E. (1996) Structures of prion proteins: and; conformational models for prion diseases. Scrapie prions: a three-dimensional model; of an infectious fragment. Fold Des:, l, 13-19.

38. Kuwabara. Y. Nishino. T. Okamoto. K. Matsumura. T., Eger, B.T. Pai. E.F., Nishino, T. (2003) Unique amino acids cluster for switching from the dehydrogenase to oxidase form of xanthine oxidoreductase. Proc. Natl. Acad. Sci., 100, 8170-8175 .

39. Okano, Y., Mizohata, E., Xie, Y., Matsumura, H., Sugawara, H., Inoue, T., Yokota, A., Kai, Y. (2002) X-ray structure of Galdieria Rubisco complexed with one sulfate ion per active site. FEBS Letters, 527, 33-36.

40. Duff, A.P., Andrews, T.J., Curmi, P.M.G. (2000) The transition between the open and closed states of rubisco is triggered by the inter-phosphate distance of the bound bisphosphate. J. Mol. Biol., 298, 903-916.

41. Hoff, R.H, Hengge, A.C., Wu, L., Keng, Y.-F., Zhang, Z.-Y. (2000) Effects on general acid catalysis from mutations of the invariant tryptophan and arginine residues in the protein tyrosine phosphatase from Yersinia. Biochemistry, 39. 46-54.

42. Scapin; G., Patel, S., Patel, V., Kennedy, В., Asante-Appiah, E. (2001) The structure of. apo protein-tyrosine phosphatase IB C215S mutant: more than just an S ~>0 change. Prot. Sci., 10; 1596-1605.

43. Hellal-Levy, C., Fagart, J!, Souque, A., Wurtz, J.-M., Moras, D;, Rafestin-Oblin, M.-E. (2000) Crucial role of the HI 1-H12 loop in stabilizing the active conformation of the human mineralocorticoid receptor.Mol. Endocrinol., 14; 1210-1221.

44. Hughes, SJ., Tanner, J.A., Hindley, A.D., Miller, A.D., Gould; LR. (2003) Functional asymmetry in the lysyl-tRNA synthetase explored by molecular dynamics, free energy calculations andexperiment; BMC Struct. Biol., 3, 5-25;

45. Варфоломеев, С.Д., Упоров,. И.В;, Федоров, E.Bl (2002) Биоинформатика и молекулярное моделирование в химической энзимологии. Активные центры гидролаз. Биохимия, 67, 1328-1340.

46. Seibert, A.L., Liu, J., Hanck, D.A., Blumenthal; К.М; (2003) Arg-14 loop of site 3 anemone toxins: effects of glycine replacement on toxin affinity. Biochemistry, 42, 14515-14521.

47. Bavkov, A. A., Fabrichniy, I. P., Pohjanjoki, P., Zyryanov, А. В., Lahti, R: (2000) Fluoride effects along the reaction pathway of pyrophosphatase: evidence for a second enzyme-pyrophosphate intermediate. Biochemistry, 39, 11939-11947.

48. Gonzalez. M.A., Webb, M.R., Welsh. K.M. Cooperman; B.S. (1984) Evidence that catalysis by yeast inorganic pyrophosphatase proceeds by direct phosphoryl transfer to water and not via a phosphoryl enzyme intermediate. Biochemistry, 23, 797.

49. Zyryanov, A.B., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R„ Baykov, A.A. (2001) The electrophilic and leaving group phosphates in the catalytic mechanism of yeast pyrophosphatase. J. Biol. Chem., 276; 17629-17634

50. Арутюнян, Э.Г., Оганесян; В.Ю. Оганесян. H.H., Терзян, С.С., Попов. А.Н. Рубинский, С.В., Вайнштейн, Б.К., Назарова, Т.И., Курилова, С.А., Воробьева,

51. H.H., Аваева, C.M. (1996) Структура неорганической пирофосфатазы Е. coli и ее комплекса с ионом Мп:" при разрешении 2.2 А. Кристаллография. 41; 84-96

52. Kankare, J., Salminen, Т., Lahti, R., Cooperman, В. S., Baykov, А. A., Goldman, A. (1996) Crystallographic identification of metal-binding sites in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, 35, 4670-4677

53. Avaeva. S.M. Rodina. E.V. Kurilova. S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N. (1996) Effect of D42N substitution in; Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2r binding. FEBS Letters, 392, 91-94.

54. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N., Harutyunyan, E.H., Oganessyan, V.Yu. (1995) Mg2+ activation of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. FEBS Letters,377, 44-46.

55. Baykov, A. A., Hyytia, Т., Volk, S. E., Kasho, V. N„ Vener, A. V., Goldman, A., Lahti. R., Cooperman, B. S. (1996) Catalysis by Escherichia coli i inorganic pyrophosphatase: pH and Mg:* dependence. Biochemistry, 35, 4655-4661.

56. Вайнонен, Ю.П. (2002) Получение н изучение свойств олигомерных форм неорганической ; пирофосфатазы Escherichia coli; : активация пирофосфатом. Дис. канд. хим. наук, МГУ, Москва:

57. Shestakov, A.S., Baykov, A.A., Avaeva, S.M. (1989) Tightly bound pyrophosphate in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. FEBS Letters, 262, 194-196

58. Baykov, A.A., Shestakov, A.S., Kasho, V.N.,, Vener, A.V., Ivanov, A.H. (1990) Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., 194, 879-887.

59. Зырянов. А.Б. (2002) Сравнение каталитических механизмов растворимых пирофосфатаз двух семейств. Дис. канд. хим. наук, МГУ. Москва.

60. Hochachka, P.W. (1999) The metabolic implications of intracellular circulation. Proc. Nat. Acad. Sci., 96, 12233-12239.

61. Goguadze, N.G., Hammerstad-Pedersen, J.M., Khoshtariya, D.E., Ulstrup, J: (1991) Conformational; dynamics and. solvent, viscosity effects in carboxvpeptidase A catalyzed benzoylglycvlphenvllactate hydrolysis. Eur. J. Biochem., 200,! 423-429:

62. Gonnelli, M., Strambini; G.B. (1993) Glycerol effects on protein flexibility: a tryptophan phosphorescence study. Biophys. X. 65. 131-137.

63. Kukita, F. (1997) Solvent-dependent rate-limiting steps in the conformational change of sodium channel gating in squid giant axon. J. Physiol., 498, 109-133.

64. Jacob, M., Schmid, F.X. (1999) Protein folding as a diffusional process. Biochemistry, 38, 13773-13779.

65. Ситник, Т.С., Лваева, С.М. (2005) Катионный кластер аминокислотных остатков? неорганической; пирофосфатазы Escherichia coli как возможный; центр связывания эффектора. Биоорган. химия, 31, 251-258.

66. Вайнонен, Ю.П., Воробьева, H.H., Родина, E.B., Назарова, Т.И:, Курилова, С.А., Скоблов, Ю.С., Аваева, С.М. (2005) Свободный PPi активирует гидролиз MgPPi неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70, 85-96.

67. Pedroso, I., Irun, M.P., Machicado, C., Sancho, J. (2002) Four-state equilibrium unfolding of an scFv antibody fragment. Biochemistry, 41, 9873-9884.

68. Ml. Уверский, B.H., Птицын, О.Б. (1996) Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков; сильными денатурантами. I Карбоангидраза В. Мол. Биол., 30, 1124-1134.

69. Del Vecchio, P., Graziano, G., Granata, V., Barone, G., Mandrich, L., Manco, G., Rossi, M. (2002) Temperature- and; denaturent-induced unfolding: of two thermophilic esterases. Biochemistry, 41Д 1364-1371.

70. Tanford; C. (1970) Protein denaturation. C. Theoretical models for the mechanism of denaturation. Adv. Prot. Chem., 24, 1-95.

71. Morgan, C.J., Wilkins, D.K., Smith, L.J., Kawata, Y., Dobson, C.M. (2000) Л compact monomeric intermediate identified by NMR in the denaturation of dimeric triose phosphate isomerase. J. Xiol. Rial., 300, 11-16.

72. Baykov, A.A., Fabrichniy, LP., Pohjanjoki, P., Zyryanov,. Л.В., Lahti, R. (2000). Fluoride effect along the reaction pathway of pyrophosphatase: evidence for a second enzyme pyrophosphate intermediate. Biochemistry, 39. 11939-11947.

73. Baykov, A.A., Avaeva, S.M. (1981) A simple and sensitive apparatus for continuous monitoring of orthophosphate in; the presence of acid-labile compounds. Anal. Biochem:, 116, 1-4.

74. Thompson, J.D., Higgins, D.G. Gibbson. T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucl. Acids Res., 22, 46734680.

75. Kraulis, P. (1991) MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. Appl. Cryst:, 24, 946-950.

76. Шафранский, Ю.А. Байков. A.A. Андрукович. П.Ф., Аваева. C.M. (1977) Сравнительное изучение кинетики Mg:* активируемого гидролизапирофосфата и триполифосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия 42, 1244-1254.

77. Kapyla, J., Hyytia, Т., Lahti, R., Goldman, A., Baykov, A.A., Cooperman, B.S. (1995) Effect of D97E substitution on the kinetic and thermodynamic properties of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry 34, 792-800.