Синтез фрагментарных поли-(гликозилфосфатов) с помощью водородфосфонатного метода тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕЛШЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

УДК 547.455.6'! 18.057

ИВАНОВА Ирина Анатольевна

СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ ПОЛИ-(ГЛИКОЗИЛФОСФАТОВ) с помощью ВОДОРОДФОСФОНАТНОГО МЕТОДА

02.00.10. — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой ст-пени кандидата химических наук

/

-'/ ■ / / . /

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор В. Н. ШИБАЕВ, кандидат химических наук А. В. НИКОЛАЕВ

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Э. Е. НИФАНТЬЕВ, доктор химических наук, доцент В. К. ПОТАПОВ

Ведущая организация: Московский институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 1991 г.

в ^¿^асов на заседании специализированного совета К 002.62.02 по присуждению степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР, 117913, Москва, Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ АН СССР.

Автореферат разослан 1991 ^

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

Н. Я. ГРИГОРЬЕВА

; Л/.

Актуальность проблема. Поли(гликозилфосфаты) являются .слои-'^'iäAii биополимерами, построенными из повторяющихся моно- или оли-госахаридных звеньев, соединенных фосфодиэфирными связями через полуацетальную гидроксильную группу одного звена и один из спиртовых гадроксилов другого. Поли(гликозилфосфаты) входят в состав меточной стенки или капсулы многих микроорганизмов, определяя их иммунологическую специфичность. Это делает актуальной задачу разработки эффективных методов получения фрагментов такого рода биополимеров.

Синтез фосфодизфирных фрагментов поли(глпкозилфосфатов) -гликозилфосфосахаров (ГФС).- мало изучен. Немногочисленные примеры получения соединений этого клэсса, выполненные с использованием фосфатного диэфирного и фосфятного триэфирпого методов, почти все посвящены синтезу производных с (1-б)-фосфодиг?'?,нрной связью и свидетельствуют о пизкой эффективности этих подходов в синтезе ГФС. Недавно в Лаборатории химии углеводов ИОХ АН СССР им. Н.Д.Зелинского было показано, что водородфосфонатный (Н-фос-фонатный) метод получения фосфодиэфиров, ' основанный на промежуточном образовании диэфиров водородфосфоновой кислоты и их окислении, может быть эффективно использован в .синтезе (1-6)-связон-ннх ГФС. Синтез ГФС, связанных через вторичные гадроксилышс группы, а также получение олигомерных фрагментов полп(глпкозил-фосфатов) к началу данной работы оставались нерешенными задачами.

Цель работы. Настоящее исследование посвящено дальнейшей разработке Н-фосфонйтПого метода синтеза ГФС, а также его применению для получения более крупных структурных фрагментов поли(гликозил-фосфэтов). Были поставлены следующие задачи: 1) исследовать вп^. можпость применения П-фосфопатного метода для получения ГФС, связанных через вторичные гидрокеильные группы, с целью синтеза Фос-фоднзфирпых Фрашентов кипсулмшх антигенов бактерий Escherichia

coll K51 и Neisseria mentngitidia X. построенных из (1-3)- и (1-4)-связанных повторяющихся звеньев 2-ацетамидо-2-дезокси-а-1ь глюкопиранозклфосфата, соответственно; 2) изучить возможность ступенчатого синтеза олиго(гликозилфосфатов), содержащих (1-6)-связанныз остатки. a-D-маннопираиозилфосфата; 3) в случае успешного решения предыдущих задач синтезировать олигомерный фрагмент капсульного антигена бактерий Escherichia coli К51.

Научная новизна работы. Показана высокая эффективность использования Н-фосфонатного метода в синтезе Х'ФС, связанных через вторичные гидроксильные группа. Впервые осуществлен синтез ряда модельных (1-2)-. (1-3)- и (1-4)- связанных ыашюзилфосфогексози-дов ц получены соединения GlcNAc(a)1-P-3ClcNAc(ß)NPh и GlcNAc(a)--1 -P-4GlcNAc(ß)NPli (P - остаток фосфорной кислоты, NPh - остаток нитрофенола) - фосфодиэфирные фрагменты капсульных антигенов бактерий Escherichia coli К51 и Neisseria meningitidis X, соответственно. Разработана и впервые реализована схема ступенчатого синтеза олиго(гликозилфосфатов) Н-фосфонатным методом с использованием в качестве спиртовых компонентов в реакции Н-фосфонатной конденсации моногидроксильных соединений, содержащих фосфатные диэфирные группировки. По этой схеме проведены первые синтезы олигомерных фрагментов поли(гликозилфосфатов) - пентамоннозилтет-рвфосфата Н0-16Мап(а)1-р-]4-6Кап(а)Ме, соответствующего -структуре основной цепи внеклеточного фосфоманнана дрожжей Hansen'la capsulata Y~1842, и тетрагликозилтрифосфата H0-[3GlcNAc(a)1-Р-13 3GlcNAc(fJ)Nili, отвечающего структура капсульного антигена бактерий Escherichia coli К51.

Практическая ценность работы. Синтезированные фосфодшэфирные и олигомерные фрагменты природных поли(гликозилфосфатов) 'могут быть использованы для выяснения биологической роли и путей биосинтеза этих биополимеров. Синтезированные в виде п-нитрофе-

нилгликозидов фрагмента капсульпых антигенов бактерий Escherichia coli К51 и Neisseria meningitidis X могут служить исходными соединениями для получения искусственных антигенов и иммуносор-бентов.

АпроОакпя работы. Честь материала диссертации была представлена на V Европейском симпозиуме по химии и биохимии углеводов (Прага, 1989 г) н IV Советско-шведском симпозиуме по углеводам (Лунд, 1990).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, ' обзоре литературы ("Водородфосфонатный метод синтеза фосфодиэфи-ров. Сиптез гликозилфосфосахаров"), обсуждения полученных результатов, экспериментальной часта, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на •/£5"стр., содержит /Я таблиц, схем, библиография - /^ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез (1-2)-, (1-0)- и (1-4)- связанных иодэлькых гшкозилфосфосахаров

Н-ФосфонатинЯ подход был предложен в 1985-1986 г.г. как

эффективный метод полученця олигонуклеотидов. Применение его' в

синтезе ГФС (Г) предполагало получение производного гликозил-Н

фосфоната (А), его конденсацию с соответствующим монотадракенль

ным компонентом (Б), окисление образующегося дпэфира Н-фосфсновой

кислоты (В) до фосфата и удаление защитных групп.

■ ? здз-он (Б) q ■

Sijg(a)OH Sug(cOO-P-H -»- Sug^O-P-OSus' .-*- Sug(«)Q-P-OSug'

o~ h o"

(А) (В) - (Г)

Поскольку к моменту начала лонной .работы Н -фосфонатшй мпто; был использован только в синтезе .(1--G) связанных ФогФощч^исои, на первом эгнпо работа черед нами стоял л .'«плача нсслед'Чтния

эффективности такого подхода при получении ГФС, связанных через вторичные гидроксильные группы. Важным моментом явился также выбор наиболее подходящих О-заиитвых групп производного гликозил-Н-фосфоната с точки зрения удобства его выделения и эффективности образования фосфодиэфиров.

1.1. Использование О-бензилированного и 0-Сензоилированного производит маннозил-Н-фосфонатов.

Для решения поставленных задач на первом этапе нами было изучено взаимодействие производных а-Б-маннозил-Н-фосфонатов 4 и 5 с частично ацилированными производными Ц-маннозы 6-8 и Б-галак тозы 9, 10 со свободными вторичными гидроксилъными группами как в экваториальном, так и в аксиальном положении (см. схему 1). Такой выбор спиртовых компонентов позволяет оценить реакционную способность вторичных ОН-групп практически всех типов, встречающихся в природных гексозах. Применение 0-бензильных и О-бенооильных защитных групп в синтезе обусловливалось возможностью их удаления в нейтральных или основных условиях. Использование кислотолабильных защитных групп практически исключалось по причине нестабильности гликозилфосфатнсй связи ГФС в кислой среде.

1.1.1. Получение производных цаннозил-Н-фосфонатов ' Для получения гликозил-Н-фосфонатов был использован мстчд, заключающийся в обработке спиртов триимндазолидсфосфнтом (образуется в реакционной смеси из РС13 и имидазола в присутствии Еу) в ацетонитриле с последующим гидролизом имидазолидных групп действием 1М бикарбоната триэтиламмония (ТЕАВ). Исходными при этом служили тетрабензиловый эфир 2 и соединение 3, полученное с выходом 60Я селективным 1 -0-дебензоилированием пентабензоата 1_ действием Ме2Ш в ацетонитриле. Маннозил-Н-фосфонаты 4 и Ъ получали с выходом, близким к количественному и использовали в конденсации без хроматогрьфичеокой очистки. Строение манноэил-Н-

ЯО

АО

I [ЬВг

ЬгО 8гО

ОИе рие с

ЯО

* И)

Яо ОН

2 р=Пп

3 Я-Вг

До—]

НО- ОР1т,

но

г,

4 П=Пп

5 И-Вг О 8л

й г О ЯгО

ОН

«о

ОМв

ОВг. 10

а: Ме^/МеОТ; Ь: Р(Л3-1ш1!-Ег3Н-МеСТ: с: 1М ТЕАВ Схеиа 1

фосфонатов подтверждалось положениями резонанса этома Р (бр 0,а-1,6) в спектре 31Р-ЯМР и присутствием в спектре 'н-ЯМР дублетного гшн&ла связанного с ним протона с характерной константой р 640 Гц. Наблюдалось также дополнительное расщепление сигналов III, С1 и С2 за-счет спин спинового взаимодействия с атомом Р (''«'щ р"

8" ^''с! р""5, 3,1с2 р^б «-Конфигурация при С1 следовала ил

* ' п

характерных положений резонанг.а атомов 03 и С5 в спектре С-ЛМР.

1.1.2. Синтез спиртовых компонентов

Использованные в качестве спиртовых' компонентов соединения 8

и 10 получали частичным бензоилированием соответствующих глнкози

доп. Соединения б, 7. и 9 синтезировали из частично зпгаишгчшнх

с*

4,6-О-бензилилпювнх производных М, 12, 19, соответственно, г. применением одинаковой псслсдпвателыюптп операций (ехгмя ¿). Н(-глелпвн'.'елмч,1м пнвтплированисм н кислотным гидролизом их 111*41 рнщрли н диодн 1_5, 1_6 и 21. Лпльнсйшге бпнэоил'^юглшт прим'чч'.п к ноноачетитач ■)-ри-0 Л'ньоилын« соединений ГГ. 10 ь 12 Ил

Pii О

но

А,Ь

{QU

'О*-"оме чо-—'они

8гО

ß^O

ВаО-

d ? /OR1« ОМе вгО' '0Ме

И HI-H,H2=Bz

ü Ri=Ac,R2=Bj ¡7 RI-flc,R2=Bz б R^H.R^Bz

L2 RI = Bz,R2 = H rSR^Bz, R2=äc r'»Bz,R2»Ac 7RI-Bz,R2=H

i_3_ ri=ac,r'2=bz u RI-Bz,r2-ftc

Piv

HO

он.

19 r.h

20 r«ac

Ol

HO OMe

71

Biß

йо о Me s

ВгО-вгО )&г.

BcO. ßz.0

Oft t

OBn.

и

BJ)-

Шг

10

а: Асг0/Ру; b: 7056 АсОН; о: BzCl/Py; d: HCl/KeOII Cieua 2

заключительной стадии была использована методика дезацетилирова-ния действием HCl в МеОН. не затрагивающая бензоилыше защитные группы. В результате моногидроксильные производные 6, 7 и 9 выделяли с суммарными вцходами 53, 63 и 58%, соответственно.

1.1.3. Синтез заидщенид гликозилфосфосахаров Синтез защищенных ГФС 23-25 (схема 3) выполняли путем конденсашщ Н-фосфоната и соединений 6-8 с последующим окислением образующихся Н-фосфонодиэфиров без их ьыделония из реакцион ной смеси. Реакцию конденсации осуществляли в пиридине в присутствии 2,5 экв. триметилацетилхлорида (PlvCl) (5-10 мин, ¿0°). В квчествв окислителя использовали раствор Ig (2 экв.) в Э856 водной пиридине в присутствии BtjN. В результате О-защииенные

оие

о—р.

I

сг

о»е

0Не

23 И1-Вг, Я7=0п 29 Я ' = , Я2«Н 32 П 1 = Н?«=Ч

24 Н^Вг, П2*Вп 30 п'-Вг, Я? = Н

25 п'-В!, Я2=Пч 34 и'.пг=н

ВгО—I

}—О

К1 И й, - а,Ь,с)

4+10

а, Ь

10

а,Ь, с1

КО-,

ио-

О Ме

{^-Л-У ^7

о

он1

26 Я=Вг 35 Я=Н

27 Я

28 «' = 82, Яг=-и, 36 П1=Я7^Н

а: РМЛ/Ру;. Ь: ц/ру-Я^О: с: Н2/М-С; а: МеО№уНеОИ Схема 3

(1-2)--, (1-3)- и (1-4)-связанные мяшюзилфосфомнннпзидм 23-25 были выделены хроматографией на $10, е. выходмми Ш, 77 и 711?, соответственно.

Конденсация 0 бензоилиропянного Н фосфонятя 5 с соршиичшяни 9 и 10 и послолушео окпплений, вмтшлппнпын п онпснншп нише условиях, приводили к ¡«шитгшши гюнмо^ипфосфщ-.'шчктоаидпм 2ь и 27 с нмиодямп 67 и О!)';, саогветстврнио. В случая иеллльаоилния О

зз я -я яН

-в-

бензилированного Н-фосфоната 4_в реакции со спиртовым компонентом 10 выход (1-4)-связанного фосфодиэфира 28 составил 12%.

Таким образом, все изученные спиртовые компоненты, как с экваториальной, так и с аксиальной ориентацией ОН-группы гладко и быстро -вступали в реакцию гликозил-Н-фосфонилирования, образуя после окисления О-защищенные фосфодиэфиры. Использование О-бен-зоилированного производного наннозил-11-фосфоната в этой реакции оказалось практически столь же эффективно, как и его О-бензилиро-ванного аналога 4 (ср. выходы соединений 27 и £8).

1.1.4. Получвниа деблокированных гликозшфосфосахаров.

Перед удалением защитных групп для обеспечения полноты гидрирования фосфодиэфиры 23-25 переводили в Ка-соли обработкой дауэксом 50 КХ4№+). Последующее дебензилироваьие (Н2/Р(1-С) и дебензоилирование раствором МеОЯа в МеОН приводили к целевым ман-нооилфосфомшшозидам 32-34 (схема 3), которые выделяли ионообменной хроматографией на фрактогеле ЮЕАЕ ТБК ШС03"~) в линейном градиенте ТЕАВ. Побочными продуктами при этом являлись соответствующие фосфомоноэфиры метил-а-й-маннопиранозида, что объяснялось частичным расщеплением гликозилфосфатной связи при дезацилировании ироиводных 29-31. Поиск более мягких условий дебензоилировшшя показал, что понижение температуры, уменьшение времени обработки и концентрации НеОМа являются факторами, практически устраняющими или существенно замедляющими реакцию расщепления гликозилфосфатной связи. ' Найденные оптимальные условия получения фосфодиэфиров 32 (0,111 Мс01)аЛ1е0Н, 2,5ч, 1°), 33 (0.1Ы МеОЫа/МеОН, 22ч, 1°), 34 (0.05М МеОНа.'ЧеОН, 1,5ч, 20°) позволили' выделить эти соединения с выходами 58 , 77 и 85%, соответственно.

Разработанные условия были успешно использованы при деблокировании (1-2)- и (1-4)-связашшх манноэилфосфогалактозидов 26 и

-g-

27. Омыление этих соединений проводили 0,05 М раствором MeONa в МеОН с диоксшюм при 1°С. Незащищенные фосфодиэфиры 35 и 35 выделяли внионообменной хроматслфафией с выходами 88 и 7Ь%, соответственно.

Использование О-бензоилироввнного производного маннозил-Н-фосфоната 5_ позволило проводить одностадийное деблокирование защищенных фосфодиэфиров 26_ и 27, что представляется более привлекательным по сравнению с двухстадийнмм получением незащищенных ГФС 32-34 из соединений 23-25. Были разработани мягкие условия дебензоилирования защищенных фосфодиэфиров, обеспечивающие высокие выходы целевых ГФС.

1.2. Использование 0-(З-Сензолдтропионильного) производного маннозил-Н-фосфоната в синтезе гликозилфосфосахаров

Поскольку омыление ГОС 29-31 сопровождалось побочной реакцией частичного расщепления гликозилфосфатпой связи, мы также исследовали применение О-(З-бензоилпропионилыгаго) производного Н-фосфонатя 39 в реакции Н-фосфонатной конденсации с триацегятями 40 и (схема 4). Использование в синтезе 3-бензоилпропио пильных и ацетильных 0-зпиитннх г-рупп могло быть полезным для деблокирования защищенных ГФС в более мягких условиях. С другой стороны, использование З-бензоилпропионилышх i "pyrin обеспечивало достаточно высокую глдрофобность Н-фосфоната 39 , что было существенно при выделении этого производного.

Исходи™' для синтеза Н-фосфоната 39 служило соединение 37, полученное с невысоким выходом обработкой Р-мвннозы З-бешюил-пропиоиовой кислотой в пиридине а присутствии N.N' дициклогек силкарСодиимида и А дпметалпминопнридина. 1"го лезапилпронали диметиламином в анптонитриле г. образовннигм I 011 щюнзвояного 30 (общий выход 13%), которое превращали" в пюпинипт 39 по методике синтеза II фоефоиатив 4 и 5 (см. 1.1.1). Конденсация И-фос-^нзтя

■ ю-

Ы но) —/««оУ-ое .у „ (<*«?> —Е-*. №*.о\ п

37 38 39 н

я-рьс0(сн2)2с0

л.

Лс£>—! ео-1 «с т

/•—О. н . Ьо °

/ОТс \

^—^оме —У'о-Р——• 44 „^'„г^1""2'2

ОЛс О" о/г —

ск

н2«рш:о(сн ) со

40

39

но—1 й

-*0 п: Л

я2=рьс0(сн)с0

41

45 н'.н^.н

а: РШИСН^СООН-ВСС-ШАР-Ру; Ь: Ме21М/Ые(Ж; с: 1 )РС13-1тН-Е13М-ЫеШ.2)ТЕАВ; й: 1 )Р1уС1/Ру,«Ш2/Ру-Н20: в: МеОЯа/МеОН;

I: Е13И-Ме0и-Нг0 Схвиа 4

39 со спиртовыми компонентами 40 и 41 и последующее окисление, выполненные как описано выше (см. 1.1.3), приводили к фосфодиэфнрам 42 и 43 с выходами 64 и 72%, соответственно. Дезацилирование этих соединений било выполнено в болев мягких, чем дебензошшрование (си.1.1.4) условии; 0,02 М раствором МеОНа в МеОН с диоксином при 1°С (для 42) и действием Е^М в зодном ИеСН при 0°С_ (для 43). В'результате ГФС 44 и 45 были получены с выходами 82 к 71%. соответственно.

Таким образов, была продемонстрирована достаточно высокая реакционная способность О-(З-бензоилпропионильного) производного Н-фосфоната 3§, у.спольоивнние которого позволило проводить деблокирование защищенных ГФС ь мягких условиях.

-Ii-

Строение синтезированных ГФС 32-36, 44, 45^ подтверждалось

ГМ 1

данными спектроскопии Р-, Н- и С ЯМР. Сигналы в спектрах

31Р-ЯМР лежали в области, характерной для положений резонанса

диофиров фосфорной кислоты данной природы (öp -0.9 -.- -2,0). Тип

фосфодиэфирной связи следовал из положений резопанса и

повышенной иультиплетности сигн&тов СГ, НГ, СХ и ИХ (Х=2 для 32

и 35, Х=3 для 33, Х=4 для 34, 36 и 44, Х=6 для 45), связанной с

о

дополнительным расщеплением этих сигналов на атоме Р ( Jq р 5 - G,

Н Р 7 ~ 9 Кыла также отмечена дублетная форма сигналов не* Q

■ которых соседних атомов углерода ( Jß р 6 - 9 Гц) в спектрах ,3С-ЯМР.

Таким образом, Н-фосфолатный подход оказался аффективным методом получения ГФС, связанных через вторичные п дрокср лише группы. Это позволило синтезировать ряд 0-2)-. (1-3,- и (1-4)-спязапных фосфодиэфиров, которые являются .{оделышми пзеди пниями фрагментов природных лоли(глпкозилфосфатов). Сравнит; результатов использования производных' н-фоефопотоп 4, 5 и 39 с бснзилышми, бензоильными и З-бензоилпропионильными о-защитнния группами позволило сделать вывод, что более предпочтительным с точки зрения удобства выделения и эффективности образования целевых ГФС является использование 0-бензоильного производього 5.

2. Синтез диэфирнд фрагментов капсульных «тигенов бактерий Escherichia coll К51 и Neisseria meningitidis X

Следующим зтапом нашей работы явился синтез соединений 56 к 57 (схема С! - диэфприых фрагментов капсульных антигенов бактерий Escherichia coll К51 и Neisseria meningitidis X. построенных из (1-3)- и (1-4)-связанных повторявшихся звеньев 2-вцетвмидо-2-деэ-окси-а-П-тлюкопиранозилф'осфатя, соответственно. Синтез был рыпол-нен копденсаиисП Н-фосф!..пата 48 и частично бензоилиропшчшх п-шщтфншлгликозидоч 52 и 53 с погледушшш окислением и удалением

Лс—О

ftc—О --

Дс/ZV ¿г

tscherlchia coll K5I

ВгО

Вго --fOBz

At.HH 46

ВгО

6г°

42

■ Но

-F-ro^

Ли/*' о-

Neisseria meningitidis X

"8гО-

№ \ Р

Вг°

Дс^Я Н 48

ВгО

НО-1 «£>-. ВгО-

l—QOUfb. /—O.pifPh, у ^Ph.

Т—О?^

Д/ — JQ -yjq

ftc НИ

53

ЯсЧН

49

MM 50 R=H

si н-аi

tzO

AcM 52

RO

40 + 5?" C'd у

KO^—| О Сr Ro WH

О RO

OU Ph.

Ш

54 R»Bz 56 R«H

, а: Ь: I )РС13-1л|Н-Ег3Л-МеСН.2)ТЕАВ: с: 1 )Р1уС1/ • Ру,2)1^Ру-Б20; й: МеОНа/МеОЦ-диоксан Схема Б

защипых групп:

Исходным для получения Н-фосфоната 48 служила 2-ацетамидо-

3,4,В-три-0-бензоид-2-дезокси-а-1?-глюкопираноза 47. полученная селективным дебензшдарованиеи по 01 тетрабензоата 46 под

действием трет-бутиламина в ацетонитриле с метанолом. Н-Фосфонат tö был синтезироь«:! из а-1-ОН-производного 47 аналогично описанным выше соединениям 4, 5, 39 и был выделен хроматографией на S102 с выходом 985». Использованные в качестве спиртовых компонен тов монэгидроксильные производные 52 и 53 получали из единого предшественника - п-нитрофенилгликозида 49 . Превращение его в 3-ацетат 50_ через 4,6-0-оензилиденовое производное, последующее бензоилирование и 0-дезацетилирование действием HCl в МеОН с тетрагидрофураном приводили к 3-ОН-производному 52 с .общим выходом 70% С считая на 50). Соединение 53, содержащее гидроксиль-ную группу при С4, получали частичный ацилированием гликозида 49 бензоилхлоридом в пиридине (2 экв., -40°) с выходом 32%.

Конденсация дибензоатов 52 и 53 с эквимолярным количеством Н-фосфонага 48 в присутствии PlvCl и последующее окисление иодом приводили к защищенным фосфодизфирам 54 и 55 с выходом около 70%. При использовании в реакции 4üt52 50%-ного избытка Н-фосфоната 48 выход производного 54 увеличивался до 93Ж. Дебензоилирование фос-фодиэфиров 54 и 55 проводили в найденных ранее условиях (см. 1.1.4) действием 0,05 М раствора HeONa в МеОН с диоксеном при температуре 1°С. ГФС 56 и 57 были выделены ионообменной хроматографией с выходами 79 и 71 %, соответственно.

Таким образом, использование Н-фосфонатного метода позволило осуществить первый синтез фрагментов бактериальных поли(гликозил-фосфатов), связанных через вторичные гидроксильные группы.

Я. Синтез олигомэрного фрагмента основной цепи внеклеточного фосфоыаннана дроизей Hanaenula capsulata Y-1842 3.1. Выбор синтетического подюдз Продолжением нашего исследования явился синтез олигомерных фрагментов поли(гликозилфосфатов) Н-фосфонотньш методом с использованием стратегии ступенчатого наращивания цепи. В отличие от

олигонуклеотидного синтеза, где окисление всех атомов фосфора (III) проводят один раз в конце синтеза, нами была предложена иная схема ступенчатого наращивания, которая предполагает проведение окисления после каждой конденсации. Последнее было обусловлено возможностью расщепления гликозилфосфонатной связи при выделении и избирательном деблокировании продуктов конденсации - ди-эфиров Н-фосфоновой кислоты типа (В) (см. 1.). Реализация указанной схемы требовала в первую очередь выяснения возможности использования моногидроксилъных производных, содержащих фосфатные диэфир-ные группировки, в качестве спиртовых компонентов при проведении Н-фосфонатных конденсаций. Решение поставленной задачи предполагалось выполнить в ходе синтеза олигомерного фрагмента основной цепи внеклеточного фосфоманнанв дрожжей Напвепи1а сервиса У-1842, состоящей, из остатков а-В-маннопиранозилфосфата, соеди-. пенных фосфоднэфирными связями через С1 и Сб.

3.2. Ступенчатый синтез линейного пентамвнноззлтегрзфосфате

В качестве ключевого синтона, с помощью которого осуществляли' последовательное введение вдщозшфосфатных фрагментов, было выбрано производное Н-фосфпнэр 59 , , содержащее временную п,п'- диметокситритильнуйУгруппу 'п^и 06. Н-Фосфонвт 59 получали из 1-ОН-производного 53 аналогично соединениям 4, 5 (см. 1.1.1) с выделением продукта хроматографией на 510^ (949&1. Упомянутый выпе (см. 1.2) метал-2,3,4-три-0-ацетил-а-1)-маннопиранозид 41^ использовали в качестве первого акцептора, терминирующего цепь с восстпновливаюаего конца.

Первой стадией синтеза (см. схему 6) была конденсация Н-фосфонатв 59 с моногидроксильным производным 41 в присутствии 2,5 экп. Р1уС1 (15 20°) в пиридине. Образующийся диэфир Н-фосфо-

новой кислоты без выделения из реакционной см(,си окисляли раствором иодв (2 экв.) в 95%-иом водном пиридине. Последующее дстри-

Н О-

Мм

(ЗгО Ой* 5в и'^н

Я2=(ПвО)2ТГ

59 я1.нр(о)он

Н2«(ПвО)?Тг ь и1=цр(о)он.

Ас.0 ОНе 41

кО

J—I

цо ОЧг

6-И

I

О"

60 1ЬН, п=1

I

| а'Ь

61 Па(ПеО')2Тт

62 п=2

I 51

а-с

Г

63 Я=Н, п-3 5

а ,Ь

64 Р=Нг, п=.4

(в)! о — Ме

а: Р1уС1/Ру: Ь: 12/Ру-^О; о: 1 %№3С00Н/СН2С12; (1: МеСМо/МеОН Схвца 6

талирование 1%-ной СР3СООН в СН2С12 (1 ман.,0°) приводило к фос-фодиэфиру 60 (97%).

Следующая стадия, конденсация гликоэил-Н-фосфоната 59 (1,4 экв.) с фосфодиэфирным блоком 60 явилась критической для оценки выбранной стратегии ступенчатого наращивания. Продукт этой реакции и последующего окисления, проведенных в указанных выше условиях, олигомер у, был выделен с выходом 78%. Данные спектров 31Р- и 1Н-ПМР подтвердили, что продукт содержит две фосфатные ди-эфирныи груплы (6р -2.Е8. -2.92 /1:1/) и три-ианнопиранозиых звена (вц, 4,68, и , ,~5.80 и). Полученный результат свидетельствовал о том,- что наличие в составе спиртового компонента 60 диэфирной фосфатной группы не приводит в присутствии Р1уС1 к об-

п = 2

с

Об-

разованию побочных продуктов ее взаимодействия с Н-фосфонатом 59. Таким ббразом, дальнейшее удлинение цепи с помощью описанной последовательности реакций представлялось возможным.

Моногидроксильный трисахаридный блок 62 был получен из соединения 61 в результате детритилирования с выходом 97%. Следующей стадией ступенчатого наращивания цепи был синтез линейного тетраманнозилтрифосфатного производного, который включал в себя конденсацию соединений 59 (1,5 экв.) и 62 (1 экв.) с последующим окислением и детритилированием в приведенных выше условиях. Тет-расахаридный блок 63 был выделен также с высоким выходом (71%). Заключительную стадию наращивания цепи выполняли с использованием описапного выше (см. 1.1.1) бензоилированного маннозил-Н-фосфо-ната 5. О-Защищенное пентаманнозное производное 64 получали из соединений 5 и 63 по стандартной методике конденсации и окисления с выходом 72%. Дезацилирование олигомера 64 проводили действием 0,1 И раствора МеОГ)а в МеОН с диоксаном (1ч, 20°). Пентаманнозил-тетрнфосфат 65 выделяли ионообменной хроматографией с выходом 88% №р -1.12).

Наличие (1-6)-фосфодиэфирных связей в пентамере 65 определялось значениями химических сдвигов и дублетной или уширенной формой сигналов атомов С1, С5 и С6 соответствующих маннопиранозных звеньев вследствие спин-спинового взаимодействия с атомом Р через СОР и С С-О-Р-связи (см. таблицу). а-Конфигурация маннозилфос-фятных фрагментов следовала из положений резонанса СЗ'-СЗ"" и Г.Г)' -0Г>'"', которые были близки к химическим сдвигам 03 и С5 а-1>-мшшопирпнозилфосфота. Длина цепи олигомера 65 подтверждалась соотношениями суммарных интегральных интенсивностей СГ-СГ"' и свс.г;"' к интенеипностям 01 и С6"" соответственно н спектре Ч'; ЯМР, ранними 4:1;

Принциииплышй результат данной части работы состоит в де- ■

монстрации применения Н-фосфонатного метода для эффективного синтеза олиго(гликозилфосфата) с использованием стратегии ступенчатого наращивания цепи. Линейный пентаманнозилтетрафосфат §5 бил синтезирован с общим выходом ЗОЖ, считая на акцептор 4U Била показана возможность использования в качестве спиртовых компонентов олигомерннх блоков, содержащих фосфатные диэфирные группировки.

4. Синтез олигоыерного фрагмента капсульного антлгена бактерий Esherlchla coll К51 Заключительным этапом нашей работы было получение олигоыор ного фрагмента капсульного антигена бактерий Escherichia coll K5I (структура - cm.2J с использованием разработанной стратегии ступенчатого наращивания цепи. В ходе синтеза в качестве синто -нов, с помощью которых должно было осуществляться последовательное введение гликозилфосфатных фрагментов, нами были исследованы два соединения - производные гликозил — И-фосфоивтсв 73 и Ti. со -держащие временные п.п'-диметокситритильную и п-метоксибензильпую защитные группы при 03, соответственно (см.схему 7). Выбор димет-окситритильной и метоксибензильной групп обусловливался возможностью их избирательного удаления в присутствии бензоильннх, являющихся постоянными 0-зшштшми группами при наращивании цепи. В качестве первого акцептора, терминирующего цепь с восстанавливающего конца, было выбрано рассмотренное в разделе 2 производное п нитрофенил-Ы-яцетилглкжозаминида 52.

4.1. Синтез производных Н-фосфонатов Производные гликозил-Н-фосфонатов синтезировали из общего предшественника - трибензоата М-аиетилгликояамкна 63. Последний был получен исходя из описанного в литературе З-оцетата 66. Дебензшшрование (Hg/Pd-C) и последующее бензоилировнние образовавшегося триоле приводили к соединению 67 (72$), которое далее селективно 0-дезацетилироввли действием НС1 в UjOII с образованием

bD-i 62P-1 ЬР-\ &<?1_

ЛсМУ ^H ^^ н

66. 67 R»Ac 62 U 73.

6E R*H 70 72 74

69, 71, 73: R=(n«a)2Tr

70, 72, 74: R-rieOCgH^

Схема 7

шногидроксильного производного 68 (60%). 3-0-Диметокситритиловый эфир 6? получали с выходом 70% обработкой соединения 68 избытком п,п'-диыетокситритилперхлората в присутствии 2,4,6-коллидина в CHgClg. 1-0-Дебензоилирование трибензоата 69 диметиламином в апетопитриле приводило к а-производпому 71 с выходом 62%. Глико-зил-Н-фосфонвт 73'был получен обработкой соединения 71^ триимида-золидофосфитом в ацетонитриля с последующим гидролизом. После хроматографии на SlO^ выход продукта 73 составил 83%. Взаимодействие трибензоата 68 с п-метоксибензилгрихлорацетимида-том в присутствии 0,04 экв. трифторметансульфокислоты приводило к соединению ТО (56%), которое далее селективно дебензоилировали обработкой Ме2М1 с образованием а-1-ОН-производного 72 (67%). Н-Фосфонат 74 был получен из соединения 72 с выходом 96% в условиях синтеза соединения 73.

4.2. Попытка наращивания цепи с использованием 3-0-(п,п'-ди-кзтокситритальнзго) производного Н-фоефоната Первоначально была предпринята попытка нарашивания цепи с использованием 3-0-диметокситритильного производного Н-фосфоната '73. Конденсацию соединений 73 и 52 (см. схему 8). последующее окисление и датритилирование проводили в стандартных условиях №4.3.2). Однако после описанных операций ожидаемый фосфодиэфир 76 бил получен только с выходом 15%. Из реакционной смеси были .

Яд?

1—0

ПШ И 73 Н = (|»!вО)2Тг

ЬгО

ю

' I т

Ь.оГ

Шп с

Н О —Р—0

Ь- Щ

А/НЛС

/кцМ

75 Р«(Мв1|) 11 7 6 П=||

йгО.

(М/г

ВгО

I >МЛс

77 Х=Н

78 Х=1

7Ва Х-С5Н5Н+

79 Х=1

79а Х«СсНьМч

х-р=о

I

0~

7а/Ш,н,р

79/79а,Н2о

Схема 8

олтн,

л/нЯс

выделены также 3-фосфат 80 (9%) и симметричный пирофосфат 81 (11%). Исследование взаимодействия соединений 73 и 62 методом

тт

спектроскопии 01Р-ЯМР показало, что конденсация этих соединений гладко приводит к диастереомерным Н-фэсфонодиэфирш 77 (вр 7.33 и 9,06 /4:1/), и низкий выход защищенного фосфодизфира 76 связан с протеканием побочных процессов на стадии окисления производного 77_. Вероятно, наличие объемной диметокситритильной группы при Ш' создает значительное стерическое напряжение, в результате чего понижается стабильность гликозилфосфатной связи в диэфира 77 и первичном продукте его окисления иодом в водном пиридине и полон

гидриде 78. При этом, наряду с образованием фосфодиэфира 75, преобладающим становится процесс отщепления гликозильного заместителя в результате реакций гидролиза или сольволиза. Производное 79, получающееся при таком расщеплении, может гидролизоваться до фосфомоноэфира 80 или превращаться в пирофосфат 81 по схеме 0. При этом следует учитывать влияние пиридина как нуклеофильного катализатора, которое, по-видимому, имеет место в ходе реакций иодпроизводных . 78 и 79 и может приводить к образованию интермедиатов 788 и 79а.

Таким образом, использование временной 0-защитной диметокси-тритильной группы, весьма эффективной при получении (1-6)-связанного олигомера 65, в данном случае оказалось невозможным.

4.3. Использование З-О-п-негоксибэнзильного производного Н-фосфоната

Альтернативным решением задачи синтеза нужного олигомера явилось использование производного Н-фосфоната 74, содержащего менее объемную п-метоксибензильную защитную группу при 03. Конденсацию соединений 74 и 52 выполняли в стандартных условиях в присутствии Р1уС1, окисляя образующийся диэфир Н-фосфоновой кислоты иодом в 95Я-ном водном пиридине. После хроматографии на БШ, фосфодиэфир §2 (см.схему 9) был получен с выходом 74%. Последующее удаление метоксибензильной группы обработкой цериЕ/Шаммо -нийнитратом в водном аиетонитриле приводило к моногидроксильчому щюизводному 76 с выходом 67Х. Следующую стадию, конденсацию фос-фодиэфирного блока 76 с гликозил-Н-фосфонатом 74_ и последующее окисление проводили в условиях синтеза соединения 82. В результате тример 83 был получен с выходом 59«. Дебензилирование выполняли как описано выше, в результате чего моногидроксильный трисаха-рплный блок 84 был получен с выходом 12%. Заключительная стадия иормщившшя цепи включали конденсацию тригликозилдифосфпто 81 с

Ъ£>-

1—оо№\.

№ I -1

И МАс

74 Ч = ПвОС6и4СН2 52

48 Я«13г

О«Л>1ъ

02 Р-ПаОС6Н4СН2

76 Н=Н,

И

аЛ

|3 Я-ИвОС6Н4СН2>' п=2

84 п=2

о,4

85 И^Вг, п=3

А/НДС

а: Р1уС1/Ру; Ь: 12/Ру-Н20; с: Се(НН4)2(Ш3)6/МеСИ-11^,0; й: МеОЫа/МйОП-диоксан Схема 9

описанным выше (см.20 О-бензоилированным Н-фосфонатом 48. После окисления продуктов реакции и.хроматографического выделения выход защищенного тетрамера 85 составил 40%. Дебензоилирование тетра-гликоаилтрифосфата 85 проводили действием 0,05 М МеОМа в МеОИ с диоксаном при температуре 1°С. Тетрагликозилтрифосфат 85 выделяли ионообменной хроматографией с выходом 70$ (5р -0,69).

Для олигомера 85 наличие фосфодиэфирпых связей (1-3)-типа подтверждалось положениями и дублетной формой сигналов атомов СЗ-СЗ", СГ-СГ", С2-С2''' в спектре |3С-ЯМР (см.таблицу). «-Конфигурация гликозилфосфатных связей следовала из положений

Дзнныэ спектров С-ЯМР (Рг0) аляго(глккозилфосфатов) 65 и 86

1 65 86

Атом е,м.д.ис г.Гц) Атом 8,м.д.(ас р.Гц)

С1 102,3 С1 99,8

С2 71,2 С2 56,1 уш

СЗ 71,8 СЗ 79,3 д (5,3)

04 67,8 С4 70,6

С5 72.8 д (7,5) С5 77,4

СС 66,3 д (4.9) С6 61.8

С1'-С1' '' 97,7 уш С1 '.С1 " 95,7 д (6,0)

С2'-С2'" 71,9 Д (6,4) С2',С2" 54,5 Д (6,8)

СЗ'-СЗ'" 71,3 СЗ'.СЗ" 77,4д(Ь,3),77,8д(5,3)

С4'-С4''1 67,3 С4ЧС4" 70,3

С5'-С5''' 74,0 Д (6,5) С5',С5" 74,3

С6'-С6' ' 66,0 уш Сб'.Сб" 61,8

С1"" 97,7 уп СГ" 95,7 д (6,0)

С,?'''' 71,9 Д (6,4) С2"' 55.2 д (7.1)

СЗ"" 71,3 СЗ'" 72,1

С4" " 67.8 С4"' 70,9

С5 " " 15.г С5"' 74.1

С6"" 62.2 С6"' 61,8

резонанса С2':С2"' и С5'-С5"', характерных для 2-ацетпмидо-г-дезокси-а-Р-глюкопиранозилфосфата. Длина цели олигомера Со подтверждалась соотношением суммарных интенсивностей сигналов

C6-G6'" и СГ-СГ" к интенсивности С1, равным 4:3:1.

Таким образом, использование гликозил-Н-фосфоннтного метода позволило впервые синтезировать олигомершй фрагмепт бактериального К-антигепного полимера, построенного из гликозилфосфатних звеньев. Предложенный' подход открывает возмо;шости для направленного синтеза фрагментов поли(гликозилфосфатов) с заданной длиной цепи.

ШВОДЫ

1. Разработан водородфосфонатный метод синтеза гликозилфосфрсахн-ров, связанных через вторичные гидроксилыше группы. Осуществлен синтез (1-2)-, (1-3)- и (1-4)-связанных маннозилфосфогексозидов, являющихся модельными соединениями фрагментов природных поли(гли-козилфосфатов).

2. Впервые осуществлен синтез (1-3)- и (1-4)-связанных фосфоди-эфиров 2-ацетамидо-2-дезокси-В-глюкозы - фосфодиэфирных фрагментов кансулышх антигенов бактерий Escherichia coli К51 и Neisseria meningitidis X, соответственно.

3. Разработана схема ступенчатого синтеза олиго(гликозилфосфатов) водородфосфонетним методом, которая предполагает использование в качестве спиртовых компонентов в реакции водородфосфснитной конденсации моногидроксилышх соединений, содержащих фосфатные диэфирные группировки.

4. С помощью разработанных методов впервые осуществлен синтез олигоыерного фрагмента основной цепи внеклеточного фосфоманнана дрожжей Hanscnula capeulata Y-1842, пентаманнозилтетрафосфаса H0-[6Man(a)l-P-]4-6Han(a)Me.

5. Впервые осуществлен синтез олигомерного фрагмента капсульного гнтигена бактерий Escherichia coll К51, тетрпгликозилтрифосфага НО- &1сНАс (а) 1 -Р )3-ЗМ сЯАс ф)NFh.

-2 4-

Основноэ содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Николаев A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н., Кочетков Н.К. Использование водородфосфонатного подхода в синтезе (1-2)-, (1-3)- и (1-4)-связанных гликозилфосфосахаров // Биоорган, химия. Т.15 (1389). N6. С.047-849.

2. NlKolaev A.V., Ivanova I.A., Shlbaev V.U., Kochetkov N.K. Ilyclrogenphosphomte approach In (1-2)-. (1-3)- and (1-4)~llnked glycosyl phosphosugar зуп№ез1з // Abstracts of the European Carbohyclrate Syinposlum. Prague. 1989. P.A-9.

3. Николаев A.B., Иванова H.A., Шибаев B.H., Кочетков H.K. Фрагменты биополимеров, содержащие остатки гликозилфосфатов. 4.Синтез (1-2)-, (1-3)- и (1-4)-связанных гликозилфосфосахаров водородфос-фопатнкм методом // Биоорган, химия. Т.16 (1990). N5. С.674-684.

4. Николаев A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н., Кочетков Н.К. " Фрагменты биополимеров, содержащие остатки гликозилфосфатов. 5.

Синтез бензил-2-0- и метил-4-0-а-1Ьманнозилфосфо-р-Ю-галактози-дов и метил-4-0-а-Б-маннозилфосфо-о-0-глюкозида водородфосфо-натным методом // Биоорган.химия. Т.16 (1990). N8. С.1105-1117.

5. NlKolaev A.V., Ivanova I.A.. Shlbaev V.N., Kochetkov N.K. Application of the hydrogenpho3phomte approach In the зупШез1з of glycosyl pliosphosugars llnked througii secondary hydroxyl group3 // Carboliydr.Res. V.204 (1990).' P.65-78.

6. Николаев A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н. Синтез фосфодизфиров 2-ацетомидо~2-дезокси-1>-глюкозы - фрагментов полимеров капсул Escherichia coli К51 и Neisseria raenlngltldie X // Биоорган, химия. Т.16 (1990). N12. С.1693-1695.

7. Николаев A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н. Ступенчатый синтез линейного пентвманнозилтеграфосфата с использованием гликозил нолородфосфонятоп // Биооргш.химия. Т.16(1990). N12 G.1696-1699.