Синтез фрагментов поли (гликозилфосфатов) с помощью водородфосфонатного метода тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

УДК 547.455.64 18.057

ИВАНОВА Ирина Анатольевна

СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ ПОЛИ-(ГЛИКОЗИЛФОСФАТОВ) с помощью ВОДОРОДФОСФОНАТНОГО МЕТОДА

02.00.10. — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор В. Н. ШИБАЕВ, кандидат химических наук А. В. НИКОЛАЕВ

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Э. Е. НИФАНТЬЕВ, доктор химических наук, доцент В. К. ПОТАПОВ

Ведущая организация: Московский институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «<&£» ¡-/ОЛ&рА, 1991 г. в часов на заседании специализированного совета К 002.62.02 по присуждению степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР, 117913, Москва, Ленинский проспект, 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ АН СССР.

Автореферат разослан <Ж/т?<яЕр^ 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор химических наук

Н. Я. ГРИГОРЬЕВА

Актуальность проблемы. Поли(гликозилфосфаты) является .елож ными биополимерами,__построенными_из повторяющихся моно- или оли-госахаридных звеньев, соединенных фосфодиэфирными связями через полуацетальную гидроксильную группу одного звена и один из спиртовых гидроксилов другого. Поли(глякозилфосфаты) входят в состав клеточной стенки или капсулы многих микроорганизмов, определяя их иммунологическую специфичность. Это делает актуальной задачу разработки эффективных методов получения фрагментов такого рода биополимеров.

Синтез фосфодиэфирных фрагментов поли(гликозилфосфатов) -гликозилфосфосахвров (ГФС),- мало изучен. Немногочисленные примеры получения соединений этого класса, выполненные с использованием фосфатного диэфирного и фосфитного триэфирного методов, почти все посвяшенн синтезу производных с (1-6)-фосфо.1шэФирпой связью и свидетельствуют о низкой эффективности этих подходов в синтезе ГФС. Недавно в Лаборатории химии углеводов ИОХ АН СССР им. И.Д.Зелинского было показано, что водородфосфопатпый (Л-фос фонатпый) метод получения фосфодиэфиров, основанный на процежу точном образовании диэфиров водородфосфоновой кислоты и их окис лении, может быть эффективно использован в синтезе (1-6)-связлн них ГФС, Синтез ГФС, связанных через вторичные гидроксильные группы, а также получение олигомерных фрагментов поли(гликозилфосфатов) к началу данной работы оставались нерешенными задачами.

Цель работы. Настоящее исследование посвящено дальнейшей раз работке Н-фосфонатНого метода синтеза ГФС, в также его применению для получения более крупных структурных фрагментов поли(гликозил 'фосфатов). Были поставлены следующие задачи: 1) исследовать можность применения Н фосфотштного метода для получения ГФО, свя зашшх через вторичные гидроксильные группы, с целью синтеза фос фодиэфирных фрагментов капсульннх антигенов бактерий ЕвсйегШиа

coli K51 и Neisseria meningitidis X. построенных из (1-3)- и (1-4)-связанных повторяющихся звеньев 2-ацетамидо-2-дезокси-а-1>-глюкопирэнозилфосфата, соответственно; 2) изучить возможность ступенчатого синтеза олиго(гликозилфосфатов), содержащих (1-6)-связанныз остатки a-D-маннопиранозилфосфата; 3) в случае успешного решения предыдущих задач синтезировать олигомерный фрагмент капсульного антигена бактерий Escherichia coli К51.

• Научная новизна работы. Показана высокая эффективность использования Н-фосфонатного метода в синтезе ГФС, связанных через вторичные гадроксильные группы. Впервые осуществлен синтез ряда модельных (1-2)-. (1-3)- и (1-4)- связанных мшшозилфосфогексози-дов ч получены соединения GlcNAc(a)1-P-3GlcNAc(ß)NPh и GlcNAc(a)--1 -P-4GlcNAc(ß)NPh (Р - остаток фосфорной кислоты, NPh - остаток нитрофенола) - фосфодиэфирные фрагменты капсульных антигенов бактерий Escherichia coli К51 и Neisseria meningitidis X, соответственно. Разработана и впервые реализовала схема ступенчатого синтеза олиго(гликозилфосфатов) Н-фосфонатным методом с использованием в качестве спиртовых компонентов в реакции Н-фосфонатной конденсации моногидроксильных соединений, содержащих фосфатные диэфирные группировки. По этой схеме проведены первые синтезы олигомерных фрагментов поли(гликозилфосфатов) - пентаманнозилтет-рафосфата Н0-16Мап(а)1-р-)4-6Мап(а)Ме, соответствующего - структуре основной цепи внеклеточного фосфоманнана дрожжей Hansen^'la capsulata Y-1842, и тетрагликозилтрифосфата НО- C3GlcNAc (а) 1 -Р- J3 3GlcNAc(ß)NPli. отвечающего структуре капсульного антигена бактерий Escherichia coli К51.

Практическая ценность работы. Синтезированные фосфодиэфирные и олигомерные фрагменты природных поли(гликозилфосфатов) ' могут быть использованы для выяснения биологической роли и путей биосинтеза этих биополимеров. Синтезированные в виде п-нитрофе-

----------нилгликозидов- фрагменты капсульных - антигенов бактерий Escherichia - -----------

coli К51 и Neisseria meningitidis X могут служить исходными соединениями для получения искусственны* антигенов и иммунос.ор-бентов.

Апробация работа. Часть материала диссертации была представлена на V Европейском симпозиуме по химии и биохимии углеводов (Прага, 1989 г) и XV Советско-шведском симпозиуме по углеводам (Дуня, 1990).

Структура и объём работа. Диссертация состоит из введения, ' обзора литературы ("Водородфосфонатный метод синтеза фосфодиэфи-ров. Синтез гликозилфосфосахаров''). обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на стр., содержит таблиц, схем, библиография -/-^"ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ i. Синтез Я-2)-, (1-3)- и (1--0- связанны* модельных

гликозилфосфосахаров Н-Фосфонатинй подход был предложен в ¡985-1986 г.г. как эффективный метод получения олигонуклеотидов. Применение его н синтезе ГФС (Г) предполагало получение производного гликачил-Н фосфоната (А), его конденсацию с соответствующим моногидроксиль ным компонентом (Б), окисление образующегося диэфира Н-фосфсновой кислота (В) до фосфата и удаление защитных групп.

О Sus'OH (Б) „

Sug(a)OH -*■ Sug(a)0-P-H-Sug(a)0-P-CSug' Sug(a)Q-F-05uß'

0' k 0~

(А) (В) (Г)

Поскольку к моменту начали данной .работа II фосфонотный мсти,, бил иснользонап только н синтезе (1. f') связанных фосфолчгфиром, па персам э.апе рчеоти иерид нпмп стояла ¡т^чча исследопппия

эффективности такого подхода при получении ГФС, связанных через вторичные гидроксильные группы. Важньш моментом явился также выбор наиболее подходящих О-защитных групп производного гликозил-Н-фосфоната с точки зрения удобства его .выделения и эффективности образования фосфодиэфиров.

1.1. Использование О-бензилированного и О-бензоилированного производных цаннозил-Н-фосфонатов.

Для решения поставленных задач на первом этапе нами было изучено взаимодействие производных сН)-маннозил-Н~фосфонатов 4 и 5 с частично ацилированными производными Б-маннозы 6-8 и Б-галак тозы 9, 1_0 со свободными вторичными гидроксильными группами как в экваториальном, так и в аксиальном положении (см. схему 1). Такой выбор спиртовых компонентов позволяет оценить реакционную способность вторичных ОН-групп практически всех типов, встречающихся в природных гексозах. Применение О-бензильных и О-бензоильных защитных групп в синтезе обусловливалось возможностью их удаления в нейтральных или основных условиях. Использование кислотолабильных защитных групп практически исключалось по причине нестабильности гликозилфосфатной связи ГФС в кислой среде.

1.1.1. Получение производных маннозил-Н-фосфонатов ' Для получения гликозил-Н-фосфонатов был использован метод, заключающийся в обработке спиртов триимидазолидофосфитом ■ (образуется в реакционной смеси из РС13 и имидазола в присутствии Е^Ч) в ацетонитриле с последующим гидролизом имидазолидных групп действием 1Ц бикарбоната триэтиламмония (ТЕАВ). Исходными при этом служили тетрабензиловый эфир 2 и соединение 3, полученное с выходом 60% селективным 1-0-дебензоилированием пентабензоата 1 действием Ме2Ш в ацетонитриле. Маннозил-Н-фосфонаты 4 и 5 получали с выходом, близким к количественному и использовали в конденсации без хроматографиаеской очистки. Строение маннозил-Н-

R 0-

(OR

RO

I FbHz

ftzO Rz.0

RO

OH

Ко -04

2 R=Bn

3 FUHz

Ro-i__- -

О

R0 - OPIm^

ОЙ2

оме

R.0

ло

4 R-Hn

5 R^e? ORz.

■• s •

or С

I

H

Hz О

-Ofln. Ьго^^^-оме

OH Ofe.

10

a: Me2NH/MeCN; b: PC^-ImH-EtgN-MeCN: о: 1M TEAB Схема 1

фосфонатов подтверждалось положениями резонанса атома Р (6р O.c'i

1

1,6) в спектре °Т-ЯМР и присутствием в спектре 'II ЯМР дублетного гшиала связанного с ним протоне с характерной константой !,)ц р R40 Гц. Наблюдалось также дополнительное растепление сигналов 111. 01 и 02 за счет спин спинового взаимодействия с атомом Р С!<1ц, р'' 8, 'Jj,, i'q2 р^6 I'll), а Конфигурация при 01 следовала ил

характерных положений резонанса атомов 03 и С5 в спектре ЛИР. 1.1.2. Синтез спиртонд компонентов Использованные в качестве спиртовых компонентов соединения 8 и 1_0 получали частичным Сонзоилированием соответствующих гликози доп. Соединения 6, 7. и 9 синтезировали из частично загашенных 4.6-0-бенаилидгиовых производных И, 12, 19, соответственно, ° с применением о.цшякочой последовательности nmpnunfl (пхгм.ч х>. Иоследони'.'илмшм аш;тшшровтшем и кислотным гидролизом их мрсн ри.цн.пн 1! диоды 15, IS и 21. мЯЛЬНоПикч; (Vn:>on.irip"i«iiui<; ii|пти->.1 l• л > к мшкюиитатам три О ч'/ш&онлмшх соединений I V". Ш и ¿2. Ип

Htf -i °гО

HO OMfc 15 RI=flc,RZ=Bi I6_ R^«Bz, R2=Ac

&г.О

Ohe

¡7 RI-AO,R2=B2 ü R,.BZ,R2-AC

<\ 0-p K&

oN-"оме

IJ fl'-H.R^Bz L2 RI=Bz,R2»H

nI = Ac,R^=Bz 14 RI = Bz,R2=.flc

Plv

19 R-H 70 R-Ac

Oftc

21

cflc

21

6 RI=»H,R2»Bz

7 RI«Bz,R2=H

OH

9

HO OMe uo—оме I f

GH üäs

8 10

a: ACgO/Py; b: 70% AcOH; o: BzCl/Py; d: HCl/MeOH Cieua 2

заключительной стадии была использована методика дезацетилирова-ния действием HCl в UeOH, не затрагивающая бензоильные защитные группы. В результате ыоногидроксильные производные 6, 7 и 9 выделяли с суммарными выходами 63, 63 и 58ä>, соответственно.

1.1.3. Синтез защищенных гликозилфосфосахаров Синтез защищенных ГФС 23-25 (схема 3) выполняли путем конденсации Н-фосфоната £ и соединений S-8 с последующим окислением образующихся Н-фосфонодиэфиров без их выделения из реакцион ной смеси. Реакцию конденсации осуществляли в пиридине в присутствии 2,5 экв. триметилацетилхлорида (PlvCl) (5-10 мин, 20°). В качества окислителя использовали раствор Ig (2 экв.) в 90% водном пиридине в присутствии Et^N. В результате О-защищегные

о не

оме

оме

23 П1 — в г, И7,--0г 29 я'-Вг, П2-н 32 ЯГ=П7=Н

24 я'-вг, 30 п1-02, и7 = н 33 ц1тц2,ц

25 П^Вг, 31 я'-вг, 34 н1.я2=н

ВгО

Й.0-

ОВп.

А 4 Ю

26 Я=В7

35 Я^Н

27 Я

2В н'=-Ч2, (Г--

а: Р1уС1/Ту: Ь: 1?/Ру-Н?0; с: Н?/Р(1-С; а: МеШа/ИвОН Схема Э

<1-2)-, (1-3)- и (1-4)-связвлнне маппозилфосфоманнозилм 23-25 были выделены хроматографией на ?,!0? с ■ выходнми В7. 7/ и 7[», соответственно.

Когслрнсяпия 0 бен'лшдиропятшоп) н фопфоп'птн 5 г: тщтпчммни 9 и 10 и последующее окисление, пмпгитоппыв в онигяпян* рн'вч условиях. пршюднлн к 'чилитттним и.'.мипиии^псФчггпчито^идя» «¡ь и 27 с мшда.ш 67 и СоогветствРннв. В случае, ислельзопгния О

бензилированного Н-фосфоната 4. в реакции со спиртовым компонентом 1_0 выход (1-4)-связанного фосфоди эфира 28 составил 12%,

Таким образом, все изученные спиртовые компоненты, квк с экваториальной, так и с аксиальной ориентацией ОН-группы гладко и быстро -вступали в реакцию гликозил-Н-фосфонилирования, образуя после окисления О-защищенные фосфодиэфиры. Использование О-бен-зоилированного производного маннозил-Н-фосфоната 5 в этой реакции оказалось практически столь же эффективно, как и его О-бензилиро-ванного аналога 4 (ср. выходы соединений 27 и 28).

1.1.4. Получение деблокированных гликозялфосфосахаров. Перед удалением защитных групп для обеспечения полноты гидрирования фосфодиэфиры 23-25 переводили в Ш-сош обработкой дауэксом 50 Ш№+). Последующее дебензилирование (Н2/Рс1-С) и дббензошшрование раствором МеОЯа в МеОН приводили к целевым ман-нозилфосфоманнозидам 32-34 (схема 3), которые выделяли ионообменной хроматографией не фрактогеле СШ ТйК (НС03"~) в линейном градиенте ТЕАВ. Побочными продуктами при этом являлись соответствующие фосфомоноэфиры метил-а-Ц-маннопиранозида, что объяснялось частичным расщеплением гликозилфосфатной связи при дезацилировашш проиводных 29-31. Поиск более мягких условий дебензондирования показал, что понижение температуры, уменьшение времени обработки и концентрации МеОКа являются факторами, практически устраняющими или существенно замедляющими реакцию расщепления гликозилфосфатной связи. 1 Найденные оптимальные условия получения фосфодиэфиров 32 (0,1 М МсОЯа/МеОН, 2,5ч, 1°), 33 (0.1М Ме(Жа/МеОН, 22ч, 1°), 34 (0.05Н Ие'Ш/ЧеОН. 1,5ч, 20°) позволили ' выделить эти соединения с выходами 50 , 77 и 83%, соответственно. . ; '

Разработанные условия были успешно использованы при деблокировании (1-2)- и (1-4)-связанных маннозилфосфогалактозидов 26 и

27. Омыление - этих - соединения - проводили 0,05 М раствором - МеОЧа - в-----------------

МеОН с диоксаном при 1°С. Незащищенные фосфодиэфиры 35 и 36 выде ляли внионооб!,генной хроматст-рафией с внходвми В8 и 75^, соответственно.

Использование 0 беизоилированного производного манпозил Н -фоефоната позволило проводить одностадийное деблокирование защищенных фосфодиэфиров 26^ и 27, что представляется более привле-тсвталыгам по српвпегото с двухствдийиш получением ппзяцкщшлг?: ГФС 32-34 из соединений 23-25. Были разработаны мягкие условия дебензоилирования защищенных фосфодиэфиров, обеспечивающие высокие выходы целевых ГФС.

1.2. Использование 0-(З-бензоилггрогшоншадого) производного иакнозил-Н-фосфоната в синтеза гликозилфосфосахаров

Поскольку омыление ГФС 29-31 сопровождалось побочной реакцией частичного расщепления гликозилфосфатной связи, мы также исследовали применение 0 (3 бензоилпропионильного) производного Н-фосфоната 39 в реакции Н фосфонатной конденсации и тривнетятями 40 и 41_ (схема 4). Использование в синтезе 3 бензоилпропио пильных и ацетильных 0- защитных групп могло быть полезным для деблокирования защищенных ГФС в более мягких условиях. С другой стороны, использование З-бензоилнропионилышх групп обеспечиваю достаточно высокую гидрофобность Н-фосфоната 39 , что было существенно при выделении »того производного.

Исходным для синтеза Н-фюсфоната 39 служило соединении 37, полученное с невысоким выходом обработкой Р-маннозн З-бенэоил-пропионовой кислотой в пиридине в присутствии ЛЛГ-дициклогек-оидкароодиимиди и 4 дпметилпминопиридина. Геи лкмпнлирппплн диметилнминим в нцетонитриле с обрнзонннием I 011-ироиинодного 38 (общий выход КИ). которое превращали в согышгпно 39 по пстоццщ синтез:) Н-фосфопатов £ и 6 (см. 1.1.1). Кяндрнсвщш Н-фосфо'натд

чо-| ео-1 ЙО-п . «о-,

о. » кг о. н Ьг°; „ Ь-о.

(он но

еаг — .„«I—.«л„.

НОм-1 КсГ-" Ко-К0Н но4-0-&-0'

39

ЯО - .

37 38 39 Н

й«рьс0(сн2)2с0

42 Я^Ас

Н2=РЬСО(СН,)„СС

то * *

44 Я'-Я^-Н

НО-, ¿0-, ^ _

41

45 Я1.я2.н

а: 'РЬСО(Я^)2СО(Ш-1)СС-ШАР-Ру; Ъ: Ме^НН/МеСН; с: 1 )РС13-1тН-Е13Н-НеО).2)ТЕАВ; й: 1 )Р1уС1/Ру.2)12/Ру-Н20; в: МеОЫа/МеОН: I: Е^Н-НеОНЧ^О Сына 4

39 со сшртовыми компонентами 40 и 41 и последующее окисление, выполненные как описано выше (см. 1.1.3), приводили к фосфодиэфирам 42 и 43 с выходами 64 и 72%. соответственно. Дезвцилирование этих соединений было выполнено в более мягких, чем дебензоилирсвание (см.1.1.4) условиях: 0,02 М раствором МеОИа в МеОН с диоксанон при 1°С (для 44) и действием Е^М в йодном МеСН при 0°С_ (для 43). В' результате ГФС 44 и 45 были получены с выходами 82 к 71%, соответственно.

Таким образом, била продемонстрирована достаточно высокая реакционная способность О-(З-бензоилпропиовильного) производного Н-фогфоната 39, использование которого позволило проводить деблокирование защищенных ГФС в мягких условиях.

Строение синтезированных ГФС 32-36, 44, 45. подтверждалось

------ - ---------- ------ 91 — 1?— --------- ------------------------

данными спектроскопии Р-, Н и С-ЯМР. Сигналы в спектрах

Р-ЯМР лежали в области, характерной для полижений резонанса диэфиров фосфорной кислоты данной природы (Ор -0,9 -2,0). Тип фосфолиэфирной связи следовал из положений резонанса и повшсттой мультиплетности сигналов СГ, НГ, СХ и ИХ (Х--2 для 32 и 35, Х=3 для 33, Х-4 для 34, 36 и 44, Х^б для 45),связанной с дополнительным расщеплением этих сигналов на атоме Р (2JC р 5 - 6. 'Mjj р 7 - 9 Гц). вяля текже отиечгна ду.чгтттвг; форта снгшгов п;

* о

. которых соседних атомов углерода ( Jc р Б - 9 Гц) в спектрах 13С-ЯМР.

Таким образом, Н-фосфонатннй подход оказался эффективным методом получения ГФС, связанных через вторичные пдроксрлыше группы. Это позволило синтезировать ряд (1-2)-, (1-3,- и (1-4)-связанных фосфодиэфиров, которые являются иодельными ?оедщенрячи фрагментов прпрояных поля (гликозилфосфптов). Срагогсчи • рсзульп-п тов использования производных' Н-фосфонптов 4, 5 и ЗЭ с бензилышми, бензоильними и З-беняоилпропиоиильными •Кдаттнтш группами позволило еде пять вывод, что более иредпочп телышн с точки зрения удобства выделения и эффективности образования целевь'х ГФС является использование 0 бензоилыюги произвол! ого 5.

2. Сянтез дизфдрдых фрашэкгов каасульшх вг/шгенов бактерий Escherichia col1 К51 и Neisseria meningitidis X

Следукчпем этапом нашей работа явился синтез соединений 56 г 57 (схема 5) - диэфирных фрагментов капсульных антигенов бактерий Escherichia coli К51 и Neisseria meningitidis X, построенных из (1—3) — и <1 4) сшияггпих повторяющихся зпеньеп 2-япетамидо 2-лез окси и-1) 1 дшопир'люзилфои^пта. соответственно. Синтез бил выполнен конденсацией Н фопфг.пата 40 и частично бензоилиропяпных п-нитрофенилглпкозидо1! 52 и 53 с поглоиушинм окислением к удалением

йс --0-flc..-dj-{-

о"

Escherichia coll K5I

BzO-i )—О

46

/¡cVH

42

(он

6*0-, )—о

■ffcji —- fKL

BzO -(овг ВгО -

■НО

ЛОН/ О-Nalssaria meningitidis X 8*0-,

Яс«Н Н

4а.

ВгО

Вг0

НО

—О?*1«-

АсСН

53

4В + 62

НО

НО

W

о меь.

НО-. ЬгО-

)—о ofPK J VPh.

ЯсМ

49

Л O—i о М-

c>d >—о £

МП

50 R=H

51 R«8z

OVPh.

¿0«

w—{(/cr rov

AW

АгО

Лс«/ 52

54 R»Bz 56 Я=Н

c,d —0 R0 I—oqtJph,

55 ReBz 57 fi-H

АсУН сг

. а: ¿-Вц^//^/МеСН-ИеОН; Ь: I )РС13-1тН-Е13Н-МеСИ,2 )ТЕАВ; с: 1 )Р1уС1/ • Ру.ги-уРу-^О; а: МеОИа/ИеОН-даоксвн Сдана 6

защитных групп;

Исходным для получения Н-фосфонвта 48 служила 2-ацетамидо-3,4, в-три -О-бензоил-г-дезокси-а-ГЬглюкопираноза 47. полученная селективным дебензшлироваииеи по 01 тетрабеизоата 46 под

действием трет-бутиламина в ацетонитриле с метанолом. Нфосфонат 48 был синтезировав из аМ -ОН производного "47 аналогично"описап~~~ ным выше соединениям 4, 5, 39 и был выделен хроматографией ча S102 с выходом 98%. Использованные в качестве спиртовых компоиен тов моногидроксильные производные 52 и 53 получали из единого предшественника - п-нитрофеиилгликозида 49 . Превращение ого в 3 ацетат 50 через 4,6-0-оензилиденовое производное, последующее бензоилирование и 0-дезацетилирование действием НИ в МеОН с тетрагидрсфураном приводили к 3-011-производному 52 с .общим выходом 70% (считая на 50). Соединение 53, содержащее гидроксиль-ную группу при С4, получали частичным ацилированием гликозида 49 бензоилхлоридом в пиридине (2 экв., -40°) с выходом 32%.

Конденсация дибензоатов 52 и 53 с эквимолярным количеством Н-фосфоната 48 в присутствии PivCl и последующее окисление иодом приводили к защищенным фосфодиэфирен 54 и 55 с выходом около 70%. При использовании в реакции 4У+52 50%-ного избытка Н-фосфоната 40 выход производного 54 увеличивался до 93%. Дебензочлированяе фос фодиэфиров 54 и 55 проводили в найденных ранее условиях (см.1.1.4) действием 0,05 М раствора UeONa в МеОН с диоксеном при температуре 1°С. ГФС 55 и 57 были выделены ионообменной хроматографией с выходами 79 и 71%, соответственно.

Таким образом, использование Н-фосфонатного метода позволило осуществить первый синтез фрагментов бактериальных поли (глпкозил-фосфатов), связанных через вторичные гидроксилыше группы.

Я. Синтез олигомерного фрагмента основной цепи внеклеточного фосфоманнана дротаей Haneenula capsulata Y-1B42 Э.1. Выбор синтетического подхода Продолжением нашего исследования явился синтез олигомерних фрагментов поли(гликозилфосфатов) Н-фосфонзтнцм методом с использованием стратегии ступенчато!« наращивания цепи. В отличие от

олигонуклеотидного синтеза, где окисление всех атомов фосфора (III) проводят один раз в конце синтеза, нами была предложена иная схема ступенчатого наращивания, которая предполагает проведение окисления после каждой конденсации. Последнее было обусловлено возможностью расщепления гликозилфосфонатной связи при выделении и избирательном деблокировании продуктов конденсации - да-эфиров Н-фосфоновой кислоты типа (В) (см.1.). Реализация указанной схемы требовала в первую очередь выяснения возможности использования моногидроксильных производных, содержащих фосфатные диэфир-ные группировки, в качестве спиртовых компонентов при проведении Н-фосфонатных конденсаций. Решение поставленной задачи предпола-' галось выполнить в ходе синтеза олигомерного фрагмента основной цепи внеклеточного фосфоманнана дрожжей Hansenula capsulata Y-1842, состоящей; из остатков a-ü-маянопиранозилфосфата, соеди-. ненных фосфодиэфирными связями через С1 и CG.

3.2. Ступенчатый синтез линейного пентаманнозилтегрзфосфата В качестве ключевого синтопа, с помощью которого осуществляли- последовательное введение ианнозилфосфатных фрагментов, было выбрано производное -Н-фаоМпр 59 . , содержащее временную ищщитниси .

п.п'- диметокситритильнуюУ'группу 'при Об. Н-Фосфонат 59 получали из 1-ОН-производпого 58 аналогично соединениям 4, 5 (см. 1.1.1) с выделением продукта хроматографией на S102 (94Ж1. Упомянутый выше (см. 1.2) метил-2,3,4-три-О-ацетил-а-В-маннопиранозид <П использовали в качестве первого акцептора, терминирующего цепь с восстанавливающего конца.

Первой стадией синтеза (см. схему 6) была конденсация Н-фосфоната 59 с моногидроксильным производным 41 в присутствии 2,5 экв. PlvCl (15 .лин. 20°) в пиридине. Образующийся диэфир Н-фосфоновой кислоты без выделения из реакционной сме.си окисляли раствором иодв (2 экп.) в 95Ж-ШМ водном пиридине. Последующее детри-

ЯО-

'ОГ

5в я =н

Я=(ПеО)2Тг

¡^»(МвО^Тг Ь В1=НР(0)0Н.

Лс.0 ОНе 4 1

Я--О

1

ио

/

ИО ОМе

к

61 Я=(Меи)

2"

62 п»2

I —

а-с

Г

63 я=н, п*3

5

з, ь

64 Я=Вг, п=4

ом и

п = 2

а: Р1\'01/Ру; Ъ: ^/Ру-П^; о: )адР3С0С!УС^С1?; (3: МеОКа/КоиН

Схеяз в

тилирование !Ж-ной СРдСООН в СН2С1? (I мин.,0°) приводил«; к фос-фодиэфиру 60 (97%).

Следующая стадия, конденсация гликозил-Н-фосфоната 59 зкп.) с фосфодиэфирным блоком 60 явилась критической для оценки выбранной стратегии ступенчатого наращивания. Продукт стой реакции и последующего окисления, проведении в указанных выше уело виях, олигомер 61, был выделен с выходом 78Ж. Дпнние спектров 31Р- и 1Н-ЯМР подтвердили, что продукт содержит две фосфатные ди-зфир,ши группы (6р -й.еа, -2.92 /1:1/) и тру-ипниопиршознит зве-

на (в]М 4,68, б]

Ш '

41

, ,~5,80 м). Полученный результат свиде-

тельствовал о том,, что наличие а составе спиртового компоненте 60 диэфирной фосфатной группы не приводит а присутствии ?1¥С1 к сб-

и

разованию побочных продуктов ее взаимодействия с Н-фосфонатом 59. Таким образом, дальнейшее удлинение цепи с помощью описанной последовательности реакций представлялось возможным.

Моногидроксилъный трисахаршшый блок 62 был получен из соединения 61 в результате детритилирования с выходом 97%. Следующей стадией ступенчатого наращивания цепи был синтез линейного тетрамоннозилтрифосфатного производного, который включал в себя конденсацию соединений 59 (1,5 экв.) и 62 (1 экв.) с последующим окислением и детритилированием в приведенных выше условиях. Тет-расахаридный блок 63 был выделен также с высоким выходом (71 %). Заключительную стадию наращивания цепи выполняли с использованием описанного выше (см. 1.1.1) бензондированного маннозил-Н-фосфо-ната 5. 0-3ащищенное пентамшнюзное производное 64 получали из соединений 5 и 63 по стандартной методике конденсации и окисления с выходом 72%. Дезацилирование олигомера 64 проводили действием 0,1 М раствора МеОНа в ИеОН с диоксаном (1ч, 20°). Пентаманнозил-тетрвфосфат 65 выделяли ионообменной хроматографией с выходом В8% (С'Р -1.12).

Наличие (1-6)-фосфодиэфирных связей в пентамере 65 определялось значениями химических сдвигов и дублетной или уширенной формой сигнвлов атомов С1, С5 и С6 соответствующих маннопиранозных звеньев вследствие спин-спинового взаимодействия с атомом Р через С-О-Р и С-С-О-Р-связи (см. таблицу). а-Конфигурация маннозилфос-фвтпых фрагментов следовала из положений резонанса СЗ'-СЗ"" и С!)' -С5"", которые были близки к химическим сдвигам СЗ и С5 а 0 мвннопирвнозилфосфатя. Длина цени олигомера 65 подтверждалась сот ношениями суммарных интегральных интеисивностей СГ-С1"" и сг>-0б'" к интенсивностям С1 и С6'*" соответственно в спектре |,!С ПНР, равными 4:1;

Принципиальный реаультат данной части работы состоит в де- •

монстрации применения H фосфонатного- метоле для _эффективного они теза олиго(гликозилфосфата) с использованием стратегии стунеичв того наращивания иепи. Линейный пентаманнозилтетрафосфат §Ь бил синтезирован с общим выходим 30%, считая не акцептор Были но казана возможность использования в качестве спяртовы* компонентов шшгомерцых блоков, содержащих фосфатные диофирные группировки.

4. Синтез олигомерного фрагмента капеульного антигена бактараД Esherlchla coil К51 Заключительным этапом нашей работа было получение олш онер ного фрагмента капеульного антигена бактерий Escherichia coll K5I (структура - CM.2J с использованием разработанной стратегии ступенчатого наращивания цепи. В ходе синтеза в качества синто нов, с помощью которых должно было осуществляться последовательное введение гликозилфосфатных фрагментов, вами были исследованы два соединения - производные гликозил — H фосфонатсв ТЗ и 74. содержащие временные п,п'-диметокситритильную и п -метокеиоепзильиую защитные группы при 03, соответственно {см.схему *> ). Выбор дают-окситритилы-юй и метоксибензильной групп обусловливался ьоммож костью их избирательного удаления в присутствии бенвоильных, ни ляюшихся постоянными о-эащитаыми группами при наращивании цепи, lî качестве первого акцептора, терминирующего цепь с восстанавливаю шего кошт, было выбрано рассмотренное в разделе 2 производное п-нитрофенил-N яцетилглюкозашшида 52.

4.1. Синтез производных Н-фосфонатов Производные гликоэил-Н-фоофонатов синтезировали из общего предшественника трибеняоата Н-эцетилглькозамина SU. Последний был получен исходя из описанного в литературе 9 ацетата §§. Дебеиаилировоние (Н^/РсЬС) и последующее бензоидировмше оора.м вившегося триола приводили к соединению 67 (72*), которое далее селективно О-дезацетилировали действием НС1 в НеОН с обрел i-.tamtut

НО

НС

' АЫН 67 Н-Ас 6в й-н

ЪгР

ЛсЛМ 53 Ш

)вг

А

II

74

ЛсУН

и 12

66

69, 71, 73: Н=(Г\вО)2Тс

70, 72, 74: Я-ПвОС^С^

Схема 7

моногидроксильного производного 68 (60%). З-О-Диметокситритиловый эфир 69 получали с выходом 70% обработкой соединения §8 избытком п.п'-диметокситрйтилперхлората в присутствии 2,4,6-коллидина в СН2С12- 1-0-Дебензоилирование трибензоата 69 диметиламином в ацетонитриле приводило к а-производному 71, с выходом 62%. Глико-зил-Н-фосфонат 73 / был получен обработкой соединения 71_ триимида-золидофосфитом в ацетонитриле с последующим гидролизом. После хроматографии на Б102 выход продукта 73 составил 83%. Взаимодействие трибензоата 68 с п-метоксибензилтрихлорацетимида-том в присутствии 0,04 экв. трифторметансульфокислоты приводило к соединению ТО (56%), которое далее' селективно дебензоилировали обработкой Ме2Ш с образованием а-1-0Н-производного 72 (67%). И-Фосфонат 74 был получен из соединения 72 с выходом 96% в условиях синтезе соединения 73.

4.2. Попытка наращивания цепи с использованием 3-0-(п,п'-ди-мэтоксигритальиого) производного Н-фосфоната Первоначально была предприня?в попытка нарвшивания цепи с использованием 3-0-диметокситритильного производного Н-фосфонатэ 73. Конденсацию соединений 73 и 52 (см. схему 8), последующее окисление и дстритили[к)ваяие проводили в стандартных условиях (см.Л,2). Однако после онисвшшх операций ожидаемый фосфолиэфир 76 бил получен только с выходом 15%. Из реакционной емвеи были •

Схема 8

выделены также 3 фосфат 80 (9Ж) и симметричный пирофосфат 81 (11%). Исследование взаимодействия соединений 73 и 62 методом

от

спектроскопии Р-ЯМР показало, что конденсация эти* согяшнений гладко приводит к диастереомериым Н-фосфонодиэфирам 77 (Bp 7.33 и 9,06 /4:1/), и низкий выход защищенного фосфодиэфира 76 связан с протеканием побочных процессов на стадии окисления производного 77_. Вероятно, наличие объемной диметокситритлышй грутш при o;t' создает значительное стерическое напряжение, в результате чего понижается стабильность гликозилфосфатной связи в диофире Y7 и первичном продукте его окисления иодом в водном пиридине L иодин -

гидриде 78. При этом, наряду с образованием фосфодиэфира 75, преобладавшим становится процесс отщепления гликозильного заместителя в результате реакций гидролиза или сольволиза. Производное 79, получавшееся при трком расщеплении, может гидролизоваться до фосфомоноэфира 80 или превращаться в пирофосфат 81 по схеме 8. При этом следует учитывать влияние пиридина как нуклеофильного катализатора, которое, по-видимому, имеет место в ходе реакций иодпроизводных 78 и 79 в может приводить к образованию интермедиатов 78а и 79а.

Таким образом, использование временной 0-защитной диметокси-тритилыюй группы, весьма эффективной при получении (1-6Связанного олигомера 65, в данном случае оказалось невозможным.

4.3. Использование 3-0-п-кетокскбензильного производного Н-фосфоната

Альтернативным решением задачи синтеза нужного олигомера явилось использование производного Н-фосфоната 74, содержащего менее объемную п-метоксибензильную защитную группу при 03. Конденсацию соединений 74 и 62 выполняли в стандартных условиях в присутствии ИуС1, окисляя образующийся диэфир Н-фосфоновой кислоты иодом в 9556-вом водном пиридине. После хроматографии на 5Юр фосфодиэфир 82 (см.схему 9) был получен с выходом 74%. Последующее удаление метоксибензильной группы обработкой церий/Шаммо-пийпитрвтом в водном ацетонитриле приводило к моногидроксильному производному 76 с выходом 67%. Следующую стадию, конденсацию фос-фодиэфирного блока 76 с гликозил-Н-фосфонатом 74_ и последующее окисление проводили в условиях синтеза соединения §2. В результате тример 83 был получен с выходом 59«. Дебензилирование выполняли как описано вше, в результате чего мошладроксильпый трисаха-рилпый блок 84 был получен с выходом 73%. Заключительная стадия нпрящивпния цени включали конденсацию тригликозилдифосфпто 84 с

бгр

1—OQf!PL

ñdtu Я ФАс

74 R=P1eOC6H4CH2 5£

да

CtJphf'

fr'Ufíc

02 R«NeCC,H,CH,

--Q, 4 ¿

76 R=H, n*I

U

бз н-мвос6нлсн

n=2

Of/P h.

34. R»H, n=2

I S1

05 R = Bz ,

blHflC

a: PlvOJ/Py: b: L,/Py H20; c: Ce(NH4)2(N03)6/H«C!J !i,,0; d: МеОНа/М.ЮН-диоксан Cxcua 9

описанным вше (см.2.) О-бензоилировшшым Н-фосфонатом 48. После окисления продуктов реакции и хроматографического выделения выход защищенного тетрамера 85 составил 40%. Дебензоилирование тетрн-гликозилтрифосфата 65 проводили действием ü.tib м UeONa в МвОН с диоксаном при температуре 1°С. Тетрагликозилтрифосфат 66 выделяли ионообменной хроматографией с выходом 70% (Sp -0,69)=

Для олигомера 85 наличие фоефоднэфирных связей (13) тииа подтверждалось положениями и дублетной формой сигналов атомов 03-03". СГ-УГ", С2 С2*" в спектре ,3С-ЯМР (см.таблицу). a-Конфигурация гликозилфосфатных связей следовала из положений

1Ч

Даншв спектров С-ЯМР (Рг0) олиго(гликозилфосфатов) 65 и 86

65 86

Атом в,м.д,(^с>Р.Гц) Атом о.м.д.(Jp_p.ru)

С1 102,3 С1 99,8

С2 71,2 сг 56,1 уш

СЗ 71,8 СЗ 79.3 д (5.3)

С4 67,8 С4 70,6

С5 72,8 д (7,5) С5 77,4

Сб 66,3 д (4,9) С6 61,8

С1 '-С1'" 97,7 уш СГ.С1" 95,7 д (6,0)

сг'-сг*" 71,9 д (6,4) С2*.С2" 54,5 Д (6.8)

СЗ'-СЗ"' 71,3 СЗ'.СЗ" 77,4д(5,3),77,8д(5,3)

С4'~С4''' 67,3 С4',С4" 70,3

С5'-С5'" 74,0 д (6,5) С5\Сб'- 74,3

Сб'-Сб'" 66,0 уш Сб', Сб" 61,8

С1 " " 97.7 уи СГ" 95,7 Д (6,0)

сг * *" 71,9 Д (6,4) С2" 1 55.2 Д (7,1)

СЗ"" 71,3 СЗ"' 72,1 ■

С4 " " 67,8 С4" • 70,9

С5 " " 75.2 С5'" 74.1

Сб"" 62,2 Сб'" 61,8

резонанса С202 "' и С5*-С5'". характерных для 2-ацетамидо-г-дезокси-а-р-тлкжопиршюзилфосфата. Длина цени олигомера §5 подтверждалась соотношением суммарных интенсивностей сигналов

06 -Co''' и ОГ-СГ" к интенсивности С1, равным 4:3:1, "" -

Таким образом, использование гликозил-Н-фосфопатного метола позволило впервые синтезировать олигомерный фрагмент бактериального К-антигенного полимера, построенного из гликозилфосфатных звеньев. Предложенный' подход открывает возможности для направленного синтеза фрагментов поли(гликозилфосфатов) с заданной длиной цошт.

ВЫБОЛИ

1. Разработан водородфосфонатный метод синтеза гликозилфосфосаха-ров, связанных через вторичные гидроксильнке группы. Осуществлен синтез (1-2)-, (1-3)- и (1-4)~связ8нных маннозилфосфогексозидов, являющихся модельными соединениями фрагментов природных поли(гли-козилфосфатов),

2. Впервые осуществлен синтез (13)- и (1-4)-связанных фосфоди-зфиров '¿-апетамидо-й-дезокси-С- глюкозы - фосфодиофирных фрагмен тов квисулышх антигенов бактерий Escherichia, coli К51 и Neisseria meningitidis X, соответственно.

3. Разработана схема ступенчатого синтеза олиго(глнкоуилфо«|)нто») нодороцфосфонетним методом, которая предполагает использование в качестве спиртовых компонентов в реакции водородфосфонатной конденсации моногидроксильных соединений, содержащих фосфатные диэфирние группировки.

4. О помощью разработанных методов впервые осуществлен синтез олигоморного фрагмента основной цепи внеклеточного фосфоманнана дрожжей Hanaenula capsulata Y-1842, пентамшшозилтетрафосфага

НО -16Мап («) 1 -Р-),, - 6Мап (а )Ме.

б. Ъпервыь осуществлен синтез олишмерного Фрагмента килсульпор, антигена бактерий Escherichia coli К51, тетрагликозилтрифпсфата ГО- $UcHAc («Н-Р- 1Э кс tpjNPtu

Основнре содержание диссертации изложено в следующих публикациях;

1-. Николаев A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н., Кочетков Н.К. Использование водородфосфонатного подхода в синтезе (1-2)-, (1-3)- и (1-4¡-связанных гликозилфосфосахаров // Биоорган, химия. Т.15 (1989). N6. С.847-849.

2. Nlkolaev A.V., Ivanova I.A., Sliibaev V.N.. Kochetkov N.K. Hydrogcnphosphorate approach In (1-2)-, (1-3)- and (1-4)-lüiked glycosyl phosphosugar synthesis // Abstracts oi the Vth European Carbohydrate Symposium. Prague. 1989. P.A-9.

3. Николаев. A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н., Кочетков H.K. Фрагменты биополимеров, содержащие остатки гликозилфосфатов. 4.Синтез (1-2)-, (1-3)- и (1-4)-связанных гликозилфосфосахаров водородфос-фоватаым методом И Биооргвн. химия. Т.16 (1990). N5. С.674-684.

4. Николаев A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н., Кочетков H.H. Фрагменты биополимеров, содержащие остатки гликозилфосфатов. 5. Синтез бензил-2-O- и метил-4-0-а-В-мшшозилфосфо-р~1)-гал8ктози-дов и метил-4-0-а-С-маннозилфосфо-а-1)-гл»козида водородфосфо-натным методом // Биоорган.химия. Т.16 (1990). N8. С.1105-1117.

5'. iHkolaev A.V., Ivanova I.A., Bhibaev V.U., KochettoY N.K. Application of the hydrogenphosphonate approach In the synthesis оГ glycosyl phosphosugars llnKeü through secondary hyöroxyl groups // Carbohydr.Res. V.204 (1990). P.65-78.

6. Николаев A.B., Иванове И.А., Шибаев В.Н. Синтез фосфодиэфиров

2-8цетамидо-2-дезокси-1)-глюкозы - фрагментов полимеров капсул Escherichia coll К51 и NelBserla' meningitidis X // Биоорган, химия. Т.16 (1990). N12. С.1693-1695.

7. Николаев A.B., Иванова И.А., Шибаев В.Н. Ступенчатый синтез линейного пентаманнозилтетрафосфата с использованием гликозил-водородфосфонвтоп // Биооргян.химия. Т.16(1990). N12 0.1696-1699.