Синтез и физико-химические свойства дифильных сорбентов для жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.20 ВАК РФ

РГ6 од

•) г/ лпр 'аз

Государственный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт; химических реактивов и особо .чистых химических веществ

На правах рукописи БОГОСЛОВСКИЙ СТАНИСЛАВ ЮРЬЕВИЧ

.уда 541.183.02: 547.143 СИНТЕЗ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДИФИЛЬНЫХ СОРБЕНТОВ

для надкостной хроматографии ■ Специальность: 02.00.20 - Хроматография

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в Государственном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте химических реакт вов и особо чистых химических веществ (ИРЕА) и на химическом факультете Московского государственного университета (МГУ).

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Саксдыкский К. И. доктор химичешои наук, ведущий научный сотрудник Сердан А. А.

Официальное оппоненты: доктор химических наук, профессор Руденко К А. доктор химических наук Мчедлишвили Б.Е

• Ведущая организация: институт нефтехимического синтеза имени А.В. Годчкева РАЛ.

Защита состоится " 13." г--«а 1693 г. в "10 ч. на заседании специализированного совета К 138.04.02 по органической I физической химии, технологии продуктов тонкого органическогс синтеза и хроматографии Государственного научно-исследовательского института химических реактивов и особо чистых химическю веществ по адресу: 107258, г.Москва, Богородский вал д.3, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан: " £ "■ о-* р 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, К Авилина

кандидат химических наук

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Интенсивное развитие биотехьологии, медицины и фармакологии выдвигает новые требования к мотодам анализа биологических жидкостей. Такие анализы необходимы для изучения фармакокинетики и метаболизма лекарственных препаратов, а также для контроля за поддержанием терапевтической доэы у пациентов.

В настоящее время для этих целей используются дорогостояще, трудоемкие и продолжительные методы: радиоиымунологические, иммунологические, ферментативные и т. д. Применение более простых и универсальных хроматографических методов ограничено из-за отсутствия доступных сорбентов, позволяющих проводить анализ в режиме прямого ввода проб. Использование для подобных анализов обращенно - фазовых сорбентов сопряжено с необходимостью предва рительного удаления из пробы белковой фракции путем длительной и трудоемкой подготовки проб.

Эффзктивное решение этой проблемы возможно благодаря синтезу новых сорбентов, внутренняя поверхность которых аналогична широко используемым в настоящее время сорбентам, а внешняя, доступная для белковых компонентов пробы, экранирована специальным инертным покрытием, не затрудняющим диффузии малых молекул. Та кие сорбенты мы в дальнейшем будем называть дифильными (ДС).

Цель работы. Целью данной диссертационной работы являлось:

- Разработка методов синтеза стабильных в эксплуатации дн-фильных сорбентов.

- Исследование процесса экранирования внешней поверхности глобулярными белками.

- Исследование физико-химических и .хроматографических, характеристик синтезированных сорбентов в сравнении с традиционными обращенно-фазовыми сорбентами.

Научная новизна:

- Впервы? получены стабильные в эксплуатации дифмльные сср

бенты на основе немодифицироваиного кремнезема и кремнезема с привитыми ажилышми группами, экранированных сшитыми глобулами альбумина.

- Исследован и оптимизирован процесс формирования поверхности с. разными функциональными группами с использование« глобулярных белков: человеческого и бычьего сывороточного альбумина.

- Сопоставлены хроматографические свойства: дифильных сорбентов на основе немодифицировакного кремнезема и на основе кремнеземов с привитыми анкильными группа«« различной длины; дифильных сорбентов, полученных экранированием гексадецилкремкезе-ма человеческим и бычьим сывороточным альбуминами; а также свойства дифильных сорбентов на основе алкилкремнэзеыоз сс свойствами традиционных обращеннофазовых сорбентов с аналогичными алкидьными группами.

Практическая значимость. Установлены оптимальные параметр синтеза и синтезированы дифильные сорбенты с привитыми октшшны ми, гексадецильными и октадецильными группами на поверхност внутри пор. а также на основе ^модифицированного кремнезема позволяющие проводить анализ я режиме прямого ввода проб, и исс ледоваяы их физике- химические и хроматсграфические свойства.

Апробация работы. Отдельные части диссертации докладывалис и обсуждались на V Всесоюзном симпозиуме по молекулярной ад костной хроматографии (Рига, 1990), на IV Всесоюзной конференщ молодых ученых по прикладной хроматографии (Джубга, 1991), и ! 19-ом Международном симпозиуме по хроматографии (Франция, 1992.'

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит иэ вв дения, четырех ]лав, заключения, ¿ыводов, и списка литературы Она содержит 162 страницы, включая 12 таблиц и 22 рисунка Библиография 13^ ссылок.

Публикаций. Результаты работы изложены в 8 публикациях.

- 3 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Звэдешя)

Для хроматографического анализа смесей, содержащих нежелательные макромолекулы метолом жидкостной хроматографии , били предложены дифильные сорбенты с разными функциональными группами на поверхности (ДС). Узкие поры таких сорбентов недоступны для макромолекул, которые взаимодействуют лишь с их внешней поверхностью, образованной непориотыми участками и устьями пор. Эту часть поверхности модифицируют таким образом, чтобы она была инертна к макромолекулам ( т. е. не удерживала их). Благодаря такой обработке высокомолекулярные компоненты элюируются из хро-матографической колонки единым пиком еще до выхода любых низкомолекулярных компонентов пробы. Низкомолекулярные сорбаты легко проникают в недоступные для макромолекул поры сорбента, поверхности которых (т. в. внутренней поверхности) придаются сво" :? необходимые для их эффективного разделения.

Для формирования на внутренней и внешней поверхности сорбента различных модифицирующих слоев можно воспользоваться либо чисто химическими методами (например, проведение реакции за время меньшее, чем время диффузии реагента в поры), либо экранировать внешнюю поверхность химически активными микрочастицами больыего, чем поры, диаметра. Экранируя кремнезем с иммобилизованными ором- и аминопропильными группами модифицированным аэросилом, удается получить эффективные и долговечные сорбенты (см. табл 3 N0 11), однако, удерживание лекарственных препарате в на таких сорбентах и на традиционно используемых для медикобиологи-ческих исследований обращенно-фаэовых (ОФ) значительно отличается, что осложняет интерпретацию результатов. Поэтому нами б^а сделана попытка разработать способ адаптации обращенчо-фазовых сорбентов к режиму хроматографии с прямым вводом проб.

Так как поверхность таких сорбентов химически ине^тьа, то способ экранирования активными микрочастицам:! непригоден. Одним иэ решений в э.гом случае может быть использование для экраииро-

в&ния глобул альбумина. Однако, полученные до сих пор таким способом сорбенты обладали невысоксф.эффективность» и недостаточной стабильностью хромагографических свойств при эксплуатации.. Мы попытались усовершенствовать методику синтеза с тем, чтобы свести эти недостатки к минимуму.

Экспериментальная часть ~

Материалы

Для синтеза были испольэованы силикагели марок 51-300 производства фирмы "ЬасЬета" (Чехо-Словакия) и КСК-Г производства Горьковского опытного завода ВШИНП (Россия); алкилмодификаторы и 3- глицидоксипропилтриэтоксисилан (Россия); человеческий и бычий сывороточный альбумин, а также глутаровый диальдегид производства фирмы "Явапа1" (Венгрия). Характеристики исходных кремнеземов и сорбентов на их основе приведены в табл. 1: •

Таблица 1. "

Ивменение свойств сорбентов в процессе синтеза.

No До модифицирования После модифицирования поверхности

п/п %УД м/г средний dnopiHM привитые группы Х.0 по данным элементзого анализа групп на нкгпов-ти' число слоев средн. <WM

1 226 9,32 С 8 7,02 1,9 1,1 8,67

2 226 9,32 С 16 16,Об 2,10 1,2 8,28

3 206 10,03 С 18 16,11 2,0 1,0 8,26

Оборудовать

Порометрические измерения выполнены методом низкотемпературной адсорбции азота с использованием порометрической лаборатории фирмы "Carlo Erba instruments" (Италия).

Ультразвуковую обработку проводили на приборе УЗДН-1А (частота КБ кГц) в стеклянном реакторе с охлаждаемой протечной водоА

- б -

рубашкой.

Синтезированными сорбентам на установке фирмы "Нешсо" заполняли колонки из нержавеющей с.али ( 150*4,0 мы) и тестировали на хроматографе фирмы "Gilscn" с насосом "305", петлевым вводом фирмы "Rhoodyne" (20 ыкл), и детектором фирмы "Linear Instrumant.s Corporation" UV 106 при 254 нм.

Ciscrea есрЗсгггов

Рассмотрим наиболее важные моменты конструирования дифиль-ных сорбентов, экранированных человеческим и бычьим сывороточным альбугднюм (ДС-ЧСА и ДС-БСА соответственно). Строение частицы Tfiiçbro сорбента представлено на рие. 1.

Еыбор кремнеземных матриц и алкилмодификаторов. Наиболее подходящими для синтеза ДС являются кремнеземы со средним диаметром пор 6-10 нм. После прививки алкильных групп (С8, С16 или 018) поры таких кремнеземов сугаются, и белкоЕые компоненты проб не могут проникнуть в них.

Для модифицирования желательно использовать алкилмоцифика-тор с одним активным атомом в якорной группировке. В этом случае на поверхности образуется монослойное покрытие, что повышает воспроизводимость структурно-геометрических характеристик сорбентов. Уравнение соответствующей реакции приведено на рио. 1.

Условия проведения сорбции белка. Для лучшего ' растворения белка нужно проводить ультразвуковую обработку раствора белка а затем суспензии в течение 5-10 мин после предварительной дегазации раствора, которая значительно снижает кавитационную деструкцию белка. Концентрация белка в растворе не должна превышать 20 мг/мл, благодаря чему соревнование за место на поверхности невелико и внутреннего связывания сывороточных альбуминов достаточно для сохранения после абсорбции той же фермы глобулы, которую молекулы имели в растворе. Ионная сила раствора не долина превышать 0,1, иначе момет начаться агрегация белковых глобул. При I-0,05 форма глобул (с учетом величины рН) наиболее близка к сфе~

-он

СНд

+ «-¿1-(СН2)ррСН3

¿Ид

где п-7, 15, 17

СНс

-0-^1-(^^Нд + НС1 ¿Но

Внутрэшаа швэркшага

Ш

ЕйВЭПЯ 1Ю£ЭугЯ0С7&

СВИТЫЕ ГЛОБУЛЫ АЛЬБУМИНА на поверхности немодифицированного кремнезема

\

00 \

Ч

СНс

или

СШИТЫЕ ГЛОБУЛЫ АЛЬБУМИНА поверх привитых алкильных групп

МЭ-^1-ССН2) рг-СНз

сн3

где п-7, 15 иди 17 Рис. 1. Реакция модифицирования поверхности и схематичес изображение кремнеземной частицы дифильного сорбента для ана за биологических жидкостей

ричэской. Ереня проведения сорбции зависит от размера частиц носителя.

Условия предварительной свитки белка Предварительную сшивку проводили только при синтезе ДС на основе неыодифнцировашюго кремезема (ЛС-К). После растворения белка добавляли глутаровый альдегид до концентрации 0,5-1,07.. Время проведения реакции - 1 час при комнатной температуре.

Условия сдиски адсорбированного белка. Пооле завершения адсорбции ссрбэнт отфильтровывали на етекляном фильтре почти до-сука и рееуспендироЕали в растворе для ошавки. Сшивку приводили мутаровым диальдегилом. Известно, что он не искажает структуру макромолекул. Следует предположить, что наиболее проницаемо для малых молекул пробы покрытие из глобул сферической формы, ¡которую молекулы человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) принимают в растворе с 1-0,05 при рН-5,1 а молекулы бычьего сывороточного альбумина (БСА) при рН-4,8. Мы проводили сшивку а 0,1Н натрийфссфатнои буферном растворе с рН-5,0 при 12%-ой концентрации глутарового диальдегида. Образовавшиеся азометиновые связи восстанавливали боргидридом натрия при рН 7,0 и б°С.

Результата и обсуи»з;з:э

Экранирование внешней поверхности. Проведенные исследования показали, что инертность экранирующего покрытия зависит от следующих факторов: концентрации бедка в растворе для сорбции; ионной силы и рН раствора для сорбции; продолжительности сорбции белка; мощности, частоты, продолжительности и порядка ультразвукового водействия на суспензию частиц в растворе белка; ионной силы и рН раствора для сшивки адсорбированных на поверхности носителя глобул. Ряд прочих факторов имеющих, второстепенное значение, рассмотрен в диссертации.

Для оптимизации условий формирования внешней поверхности сорбента вначале была проведена оценка степени воздействия на процесс каждого из перечисленных параметров и приблизительно определены границы оптимальной области. Для контроля за качеством

поверхности на этом этапе использовались ссрбциошше измерения. Внутри оптимальной области были синтезированы и подвергнуты хро-матографическиы испытаниям 3 образца ДО. После подтверждения эффективности метода синтеза, была проведена серия экспериментов, уточнивших оптимальное сочетание факторов, влияющих на формирование внешней поверхности. При этом все образцы подвергали хро-матографическиы испытаниям.

Для определения оптимальной концентрации белка били построены изотермы адсорбции ЧСА на 0Ф-С16 и КС11-Г. (Участку "плато' соответствует концентрация растворов >8 иг/мл.) Биле установлено, что при увеличении концентрации вплоть до 12 иг/ил инерт ность ДС повышается. При дальнейшем увеличении конценураш; инертность ДО повышается незначительно.

Было установлено значительное влияние значения рН (рис. 2)

°ис. 2. Зависимость свойств ДС-С16 ЧСА от рН раствора для ции: процента регистрации белковой фракции (3), сорбции аль на (1) (сплошные кривые) и коэффициента емкости к'(пункт кривые) кофеина (2), теофиллина (4) и бензойной кислоты (5)

О

1234 5678 рН

ipn котором проводили сорбция альбумина на поверхности алкилои-тк?геля, па инертность сформированной внешней поверхности. Как зидко нэ рис. 2, при увеличении ^Н от 2 до 3. сорбция на поверхности готового сорбента ситзется с 2,3 мг/г до 1,1 мг/г, а процент регистрации белкоьой фракции возрастает до 98 X. При даль-гей ш'см увеличении рН до 7,0 сорбция ацьбумша на готовом ДО зоврастает вплоть до значения 6 мг/г, а процент регистрации бел-;овой фракции уменьшается до значения oQX при рН- Б,0 а затем вновь возрастает до 76% при plI-7,0.

Следовательно,.регистрация белковой фракции превыпает минимально допустимые 95% в интервале значений pli от 2, Б до 3,5. ( Необходимо учитывать, что после растворения альбумина рН повышается в среднем на 1-1¿5 единицы). Как следует из сходства величин к'на сорбентах, синтезированных при различных значениях рН (рис. 2 пунктирные кривые), в диапазоне значений рН растра для сорбции от 2 до 7 не происходит адсорбции белковых молекул на поверхности внутри пор. На рис. 3 приведены кривые сорбции белка на сорбентах Д0-С16 и ДО-К в динамических условиях. Видно, что наиболее инертны ДО, полученные при рН 2,0 и 3,0 (кривые 4 и 3). Дальнейшее увеличение рН раствора для сорбции приводит к снижению инертности внешней поверхности. На рис. 3 такде приведены результаты испытаний в динамических условиях колонки с ДС (рН раствора для сорбции 5,0) на основе немодифицированного кремнезема (кривая 1). Видно что сорбент характеризуется высокой инертностью.

Для минимизации времени сорбции нами были построены изотермы адсорбции сывороточного альбумина на КОК-Г и на ОФ-С 16 из 0,1 M фосфатного буферного раствора с рН-5,15 и 3,0 соответственно. ( Время выхода изотерм на участок "плато" составляет 18 и 12 ч). При завершении процесса адсорбции до выхода изотермы на "плато" инертность знешней поверхности получавшихся ДС недостаточна для хроматографического использования, а при продолжении процесса дольшэ 20 ч, инертность поверхности повышается незначительно, поэтому сорСцип проводили в течении 20 ч.

Рио. 3. Зависимость процента регистрации белковой фракции на колонке (150*4,0) с ДС от рН раствора, .использованного для сорбции белка.- 1-ДС-К ЧСА, остальные кривые - ДС на осьове кремнезема с привитыми гексадецильныыи группами, синтезированных при: 2 - рН-3,0 + конечная обработка; 3 - рН-3,0; 4 - рН-2,0; 5 - рН-5,15; б - рН-7,0.

Однородность и инертность внешней поверхности значительно повышаются, если проводить ультразвуковую обработку суспензии 03 в процессе сорбции. При этом интенсифицируются массообменные процессы и возрастает глубина проникновения суспензии, что особенно важно, т. к. поверхность ОФ гидрофобна. Результаты испытания образцов ДС-ЧСА, полученных без использования ультразвук (кривая 3), с ультразвуковой обработкой в процессе растворения белка (кривая 2) и с УЗ - обработкой как в процессе растворения, так и к .процессе сорбции (.1) приведены на рис. 4, данные элементного анализа б табл. 2.

Рис. 4. Зависимость процента регистрации белковой фракции от числа введенных проб альбумина. Колонки 150x4,Омм с сорбентами ДС-С18 ЧСА, полученными: 1-е УЗ-обработкой до и в процессе сорбции; 2-е УЗ-обработкой до сорбции; 3 - без УЗ-обработки.

Таблица 2.

Содержание углерода в % для ДС. полученных в различных режимах ультразвуковой обработки.

NN опыта % С В 0Ф-С19 Средний % С в ДС Наибольшая разница мевду X С в последовательных измерениях

1 одинаковый исходный 0Ф-С18 15,11 15,90 1,55

о й 14,92 0,20

3 14,98 0,39

. - 12 -

Для оценки влияния ультразвуковой обработки на поверхностный слой привитых алккльных групп мы провели элементный анализ образцов ОФ, подвергнутых ультразвуковой обработке ■ в течение различного времени. Обработка проводилась в 0,1 М фосфатном буферном растворе при рН-3,0 с добавкой 30% (объема.) иэспрапанолЕ для того, чтобы перевести весь ОФ в раствор. Уменьшение поверхностной концентрации алкильных групп га 30 мин составило всего 3 что свидетельствует о высокой устойчивости 0® сорбента. Следовательно^ время УЗ-обработки ограничивается устойчивостью глобул альбумина.

Во избешнии агрегации иди денатурации белковых глобул сум марная продолжительность всех ультразвуковых воздействий н< должна превышать 30 мин. Оптимальная продолжительность разового воздействия на суспензию около 6-7 мин при многократной и 10 35 мин при однократной обработке.

Время образования плотного слоя адсорбированного альбумин на внешней поверхности сравнимо со временем перехода частиц сор бента в раствор (для фракций о размером частиц 15+2, 10+2 6*1 мкм оно составляет 2, 8 г 15 ч для ОФ сорбента и 2,6 и 12 для немодифицироваяного кремнезема, соответственно).

При синтезе ДС на основе ОФ-сорбентов были сопоставлены де схемы синтеза: с промежуточной фиксацией формы адсорбированных глобул глутарОБЫм альдегидом (вар. 1), и без нее (вар. 2), пре? ставленные на рис. 5.

Было показано, что промежуточная фиксация не является необход! ►¿ой. При синтезе ДС-К использовали вариант 3. Предварительш фиксацчя формы глобул 0,5-1,0% раствором глутарового альдеги; предотвращает их разворачивание при адсорбции на сильно полярж поверхности кремнезема.

Конечная -обработка заключалась в восстановлении азометиков

связей раствором НаВН .

4

- 1Ь -

Коночная обработка не изменяет процента регистрации белко-пой франции, но уменьшает величину адсорбции белков на поверхности сорбента (рис.3 кривые 3 и 2). Кроме того она повышает стабильность экранирующего слоя белковых глобул на внешней поверхности ДО при использовании подв.чишх фаз с кислыми значениями рН.

ВАРИАНТ 1 ■

-I Фильтрация -

ВАРИАНТ 2. *

Подго- Сорбция Предвари- Промыв Сшив- Конеч-

товка -> альбу- -> тельная —> —> -> ная

реакти- мина на сшивка на ка ка обработ

вов пов-сти позер-сти ка

В А Р н АКТ 3

Предварительная сшивка альбумина в раот-ре Сорбция альбумина на поверхности

Рис. 5. Схемы, использованные для синтеза дифильных сорбентов. Варианты 1 и 2 - для синтеза ДС-С16 ЧСА и ДС-С16 ВСА; вариант 3 - для синтеза ДС-К.

Интересно было сравнить хроматографические свойства дифильных сорбентов на основе кремнезема с привитыми гексадецильчыми группами, для экранирования внешней поверхности которых был использован человеческий и бычий сывороточный альбумин (ДС-С16 ЧСА и ДС-С16 БСА), синтевированных при прочих одинаковых условия::. Соответствующие хроматограммы представлены на рис. 6 Ь и с. Видно, что регистрация белковой фракции и удерживание лекаре -

о сн3

ИХ II I

сн,

С

0 3 6

О 3

Время

6 (мин) 0 3

г1

а

а

í

Рис. 3. Хроматограммы лекарственных препаратов в плазме чехов; стой крови: а- традиционный 0Ф-С16, Ь- ДС-С16 ЧОА, с- ДМ БОА, с! - ДС-К ЧЗА. Колонки 150*4,Сш. Белки плазмы крови С бецэойная кислота (2), теофиллин (0) и кофеин (4). 0.02М нат; Ооофслный буферный раствор (рН 6,5) - ацетснитрил (90: К

твенных препаратов не изменимся при замене экранирующего слоя из человеческого сывороточного альбумина слоем ич бычьего сывороточного альбумина.

Норометрические испытания.

На рис. 7 а приведены результаты порометрических исследований исходного кремнезема (кривая 1), . 0Ф-С16 (кривая 2) и ДС-С16 ЧСА (кривая 3). Видно что эффективные диаметры пор при модифицировании гексадецилдиметилхлорсиланом уменьшаются на 1,04 им. Такой результат (с учетом ошибки измерений) более соответствует

20

10

О

I

15

6 15 0 б

Радиус пор, нм

Рис. 7. Распределение пор по размерам для а исходного кремнезема (1), кремнезема с привитыми гексадецильными группами СФ-С16 (2) и готового Д0-016 ЧСА на его основе (3); Ь: КС-К ЧСА.

модели жидкой пленки, выстилающей поры (рассчитанное по ней сужение пор долига составить 1,06 нм), чем модели щеночиой структуры (2,20 нм).

Экранирование внешней поверхности глобулами альбумина незначительно влияет на порометрические характеристики (кривая 3). Характеристики пор с с!<6 нм при этом остаются постоянными. Объем и распределение по размерам пор с б<й<8 нм изменяются незначительно. Наиболее существенно уменьшается объем пор с Ф10 нм. Мы объясняем 5Т0 приникноьением в них глобул альбумина. Труднее объяснить причину происходящего на этой стадии уменьшения среднего диаметра пор. Это могло произойти или из-за действительного еумения пор с Фбнм, за счет проникновения в них альбумина или нэ-бо. отклонения формы пор от цилиндрической. (При расчетах' использовалась модель цилиндрических пор). Отсутствие надежного метода для непосредственного наблюдений эа процессом формирования защитного слоя альбумина вынудило нас основывать свои выводы на косвенных наблюдениях. Выеокий процент обнаружения белковой фракции ка колонках, с дифильными сорбентами подтверждает, что внешняя поверхность и устья пор сорбента надежно экранированы альбумином от белков проб. С другой стороны, различие в содержании углерода в алкилкремнеземе и готовом ДС на его основе невозможно выявить с помощью элементного анализа, поэтому количество адсорбированного альбумина невелико. Следовательно, глобулы альбумина, вероятно, сортируются лишь на внешней поверхности и в устьях пор сорбента. При этом форма пор изменяется и больше не соответствует цилиндрической.

Этим также объясняется сходство хроматографических свойств внутренней поверхности ОФ и готового ДО-ЧСА на его основе. Восстановление евометиновых связей №аВ Н не изменяет структурные ха-

4

рактеристики сорбента.

На рис. 7 Ь приведены результаты яорометрических испытаний ДС нн основе немодифицированного кремнезема (ДС-К). Видно, что хе.-

рактеристики пор с с!<9 нм изменяются незначительно, следовательно, как и в случае кремнезема с привитыми алкильнуми группами, условия модифицирования внешней поверхности выбраны правильно.

Адсорбционные измерения.

Адсорбционная емкость сорбентов по человеческому сывороточному альбумину (ЧСА) приведена в табл. 3. Для сравнения приведены характеристики прототипа - ДС, синтезированного с использованием аэросила (N0 11) и емкость традиционного сорбента с инертной к белковым компонентам проб гидрофильной поверхностью (привитые дцольные группы) (N0 12): >

- -»• Таблица 3.

Адсорбционная емкость сорбентов по человеческому альбумину

No п/п Сорбент Адсорбционная емкость, мг/г No п/п Сорбент Адсорбционная емкость, мг/г

1 - 300 14.3 7 ДС С8 0,9

2 кск-г 13,3 8 ДС С16 0,8

3 4 Б 0Ф-С8 0Ф-С16 05-С18 25,6 24,5 25,1 9 10 11 ДС С18 "Сорбент Пинкертона" ХМК ДП 0,5 1.1 1.6

6 ДО-К 0,5 12 FCK-Г диол •1,1

Видно, что после экранирования внешней поверхности адсорбционная емкость сорбентов резко снижается и оказывается на уровне лучших иностранных ("сорбент Пинкертона") и отечественных (ХШ ДП) образцов. Оне таете близка к емкости традиционно используемого для анализа биополимеров гидрофильного сорбента с привитыми

( - ч

диоль.чыми группами.

Хроматографические испытания.

Оптимальным с точки зрения потребителя является совпадение характеристик удерживания низкомолекулярных компонентов проб на синтезированных ДО с удерживанием на традиционно используемых

сорбентах (в нашем случае ОФ) в пределах обычного диапазона значений рН, ионной силы и концентрации органического модификатора. Причина воэмогиьк различий - наличие экранирующего слоя ив сшитых глобул альбумина на внешней поверхности ДС-ЧСА. Хотя количество такого белка невелико, однако "а лриори" трудно оцепить степень его воздействия, поэтому мы подвергли синтезированные сорбенты хроматографич&ским испытаниям. Б качестве тестовых соединений были использованы лекарственные препараты с функциональными группами различной природы. Результаты исследований приведены на рис. 8 и 9.

В общем случае время удерживания могжт быть представлено как функция по крайней мере трех характеристик подвижной фазы: рН, ионной силы и концентрации органического растворителя. Варьирование рН подвидной фазы изменяет шлекулярную форму разделяемых соединений, а при хроматографии на ДС-ЧСА еще и ионообменные свойства сшитых глобул альбумина на внешней поверхности сорбента. Изменение ионной силы уменьшает или увеличивает ионообменные взаимодействия с молекулами пробы.

Как видно из приведенных на рис. 8 данных, зависимости удерживания от рН буферного раствора на ОФ и ДС-ЧСА подобны. Изменение рН в пределах от 7,5 до 3,0 не влияет на удерживание кофейка и теофиллпна. Удерживание кислых сорбатов при рН-5,0 резко увеличивается из-за перехода молекул в недиссоциированную форму. Интересно, что при значении рН<4 на ДС-ЧСА, в отличие от ОФ, наблюдается заметное поглощение кислых сорбатов. Это можно объяснить анионообменным взаимодействием провоцированных аминогрупп альбумина с молекулами ацетилсалициловой и бензойной кислот.

Известно, что увеличение или уменьшение концентрации орга-

ш

Рис. 8

Л7

Рис. 9

20 МеС и,'/.'

Рис. б. Зависимость времени удерживания косина (1), теофиллина (2), ацетилсалициловой (3), и бензойной (4) кислот от рН элюента на колонках (150x4,0 мм), заполненных сорбентами 0Ф-С18 (светлые символы) и ДС-018 ЧСА (темные символы). Элюент 0,02 М натрийфос-фатный буферный раствор - ацетонитрнл (95:5); 1 мл/мин; 254 нм.

Рис. 9. Зависимость времени удерживания кофеина (1) и теофиллина (2) от содержания ацетонитрила в элюенте. Колонки и условия элю-ирования те же, см. рис. 8.

г 20 -

ничеокого раствбрителя влияет на энергетику дисперсионных взаимодействий меаду молекулами пробы и привитыми гидрофобными группами, изменяя время удерживания.

Г1ак видно из рис. 9, соответствующие зависимости для ДС-ЧСА и традиционного обращенно-фазового сорбента сходны. Удерживание кофеина и теофиллина при снижении содержания ацетонитри-ла от 20 до 10% не изменяется, а при дальнейшем снижении до ЪХ значительно увеличивается, из-за усиливающегося взаимодействия этих молекул с гидрофобным покрытием на поверхности внутри пор.

Варьирование концентрации НаНдРОдВ буферном растворе от 0,02 до 0.20М не влияет на удерживание теофиллина и кофеина, следовательно, ионообменные взаимодействия этих тестовых веществ о поверхность» как ОФ. так и ДС-ЧСА сорбента незначительны.

Времена удерживания гидрофобных сорбатов на ДС-ЧСА меньше потому, что его внешняя поверхность экранирована альбумином. (Гидрофобность сшитых молекул альбумина меньше гидрофобности привитых алкильных групп). Меаду 0Ф-С18 и ДС-С18 ЧСА в сравнении с парой 05-016 и ДС-С16 ЧСА наблюдается большее расхождение характеристик удерживания, • что обусловлено несколько большим размером пор кремнезема, использованного для синтеза ДС-С18 ЧСА (средний с1 пор-10,06 нм против 9,32 ьм в случае 0Ф-С16). Больший раамер пор приводит к увеличению площади внешней поверхности ДО-С18ЧСА, экранированной альбумином.

На рис. 6, 10 и 11 приведены хроматограммы определения лекарственных препартоь в плазме человеческой крови. На рис. 6 а-на традиционном ОФ сорбенте, на рис. 6 Ь,с,с1 - на ДС сорбентах. Видно, что белки шшму не элюируются из колонки с ОФ сорбентом изеа адсорбции на его поверхности, но выходят единым ииком из колонок о ДС сорбентами. Бензойная кислота, теофиллин и кофеин детектируются отдельными, хорошо разделенными пиками, кроме случая Дг-к, разделение на котором неполное.

На рис. 10 приведен пример одновременного определения 5 лекарственных препарат в плазме человеческой крови. Видно что

1)

3&*

/ 4

Б 3 12 <5

время (мин)

1в 21

Рис. 10. Анализ лекарственных препаратов в плазме крови. Колонка с дифильным сорбентом ДС-С18 ЧСА (150x4,0 мм). Элюент 0,111 нат-рийацетатный буферный раствор. рН-6,85 - ацетонитрил (90:10); 1 мл/мин; УФ 254 нм. 1 - белки плазмы; 2 - кодеин; 3 - ацетилса лициловая к-та; 4 - фенацетин; 5 - кофеин; 6 - фенобарбитал.

Время мин)

Рис. 11. Анализ лекаре твенных препаратов в плазме крови. Колонки 150+4,Омм г дифильными сорбентами: ДС-С8 ЧОА (слева) и ДС-018 ЧСА (справа). Элюент: 0;02М натрийфосфатный буферный р р. , рН-б,50 - ацетонитрил (90:10); 1 мл/ мин, УФ 254 нм. 1- белки плазмы; 2- те офиллин; 3- кофеин.

белки плазмы .выходят единым пиком до выхода низкомолекулярных компонентов пробы, ацетилсалициловая кислота, фенацетин, кофеин и фенабарбитал детектируются отдельными, хорошо разделенными и симметричными пиками.

На ркс. 11 приведена хроматограмма разделения лекарственных препаратов на сорбентах ДС - CS ЧСА и ДС - С18 ЧСА.

Зыводы

1. Разработан способ синтеза гидрофильно -органофильных (ди-фильных) сорбентов (ДС), позволяющий проводить экранирование внешней поверхности ¡^модифицированного кремнезема и кремнезема с привитыми алкильными группами (dnop < Юнм), сшитыми глобулами альбумина

2. На основании данных низкотемпературной адсорбции азота, показано, что при экранировании внесшей поверхности предложенным способом объем пор с <1<8нм изменяется крайне незначительно, объем пор с 8<d<10 нм уменьшается на 10-75 %, объем пор с d>10 нм уменьшается на 90 %. Следовательно, глобулы экранирующего покрытия не проникают в поры с d<8 н < , образующие основную поверхность сорбента.

3. На основе адсорбционных и хроматографических исследований показаны идентичное?г ДС, полученных экранированием кремнезема с привитыми гексадецильными группами человеческим и бычьим сывороточным альбумином.

4. Адсорбционными и хроматографическими исследованиями покатана высокая инертность полученных сорбентов к белкам пробы (регистрация белкоюй фракции 98+32, адсорбционная емкость <1мг/г), что позвоияет проводить анализ лекарственных препаратов в биологических жидкостях в режиме прямого ввода проб.

5. Методом ВЭЖХ исследовано удерживание тэофиллина, кофеина, ацетилсалициловой и бензойной кислот ( при различных значениях рН, ионной силы и содержания ацетонитрила в подвижной фазе) на синтезированных ДС. и сделан вывод о подобии удерживания лекарственных препаратов на ДО и традиционных обращенно - фазовых (ОФ) сорбентах с аналогичными алкильными группами.

6. Показано, что применение синтезированных ДО вместо ОФ сорбентов позволяет избежать многостадийной подготовки проб и эа счет этого сократить время анализа, избежать возможных потерь определяемых веществ, и сократить объем крови, отбираемой у пациента для анализа с 1-5 мл до 50-100 мкл.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Сердан А. А., Ляшенко А. Г. , Богословский С. Ю. , Нестер,енко Е Н. Новый подход к хроматографическому определению низкомолекулярных лекарственных препаратов в биологических жидкЬс-тях.// Научно-технический информационный сборник статей

"Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения." Вып. 4, М., ВНИИСЭНТИ,

1990, с. 41-46,

2. Сердак А. А., Богословский 0. П., Нестеренко П. Е , Сакодкнский К И. Сорбент с дифильной поверхностью для медицинских л биологических исследований. В кн. -. Практика хроматографического анализа: Научн. тр. М.: ИРЕА, 1991г. с. 64-70.

3. Сердзн А. А. , Богословский С. О. , Нестеренко П. Н Зависимость удерживания некоторых лекарственных препаратов на дифильном сорбенте от рН и ионной силы эдюента. // журнал 1из. . Химии,

1991, т. 65,с. 2038-2643.

4. Сердан А. А., Богословский С. Ю. , Нестеренко П. Н. Зависимость удерживания некоторых лекарственных препаратов на дифилы-шх

сорбентах от рН и у~нной силы элюента В кн.: V Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. Рига 1990. с. 142.

П. Богословский С. IQ Сердан А. А., Нестеренко II К , Сакодынский R. И. Сорбенты для определения лекарственных препаратов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ с прямым еводом пробы. В кн.: IV Всесоюзная конференция молодых ученых по прикладной хроматографии. Джубга. 1991. с. 11.

Ь. Bogoslovski 1 S. U., Sakodynskii К. I., Serdan A. A. Diphil sorbents for direct sample Injeotion of drags in biological matrices // 19-th International symposium on chromatography, France. 1992. p. 163.

У. Bogoslovskii S.U. , Sakodynskii К. I. . Nesterenko P. N. , Serdan A. A. Chromatographic and poronetric investigations diphil sorb«nts for direct sample injeotion of drugs In biological matrices// 19-th international symposium on chromatography, Fraivje. 1992. p. 164.

u Сердан A. A. , Староверов С. M. , Богословский С. Ю. , Лисичкин Г. Е, Сакодынский К. И. Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей. Решение о выдаче Д. с. по заявке N 4936077/26 ( 028119) с правом публикации в открытой печати.