Синтез и спектральные свойства флуоресцентных фенилэтинилпиреновых и бис(фенилэтилен)антраценовых псевдонуклеозидов и меченных ими олигонуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ВЛИЯНИЕ ФЕНИЛЬНЫХ И ФЕНИЛЭТИНИЛЬНЫХ

ЗАМЕСТИТЕЛЕЙ НА ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА ОРГАНИЧЕСКИХ ФЛУОРОФОРОВ (обзор литературы)

1Л Флуоресценция - общие принципы g

1.2 Флуоресцентные красители ^

1.3 Полициклические ароматические углеводороды с этинильными

ГЛАВА П. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ АМИДОФОСФИТНЫЕ РЕАГЕНТЫ НА ОСНОВЕ 1-ФЕНИЛЭТИНИЛПИРЕНА И 9,10-БИС(ФЕНИЛЭТИНИЛ)- 75 АНТРАЦЕНА: СИНТЕЗ, ВВЕДЕНИЕ В СОСТАВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННЫХ КОНЪЮГАТОВ результаты и обсуждение)

II. 1 Синтез пиренового и антраценового псевдонуклеозидов (XII) и (XIX), 76 содержащих фенилэтинильные группы

Н.1.1 4-(4-(1-Пиренилэтинил)фенил)-1,3-бутандиол (XII)

II. 1.2 4-{4-[Ю-(Фенилэтинил)антрацен-9-илэтинил]фенил}-1,3-бутандиол и фенилэтинильными заместителями

1.4 Влияние растворителя и другие факторы

И. 1.3 Спектральные свойства флуоресцентных псевдонуклеозидов

П.2 Синтез модифицирующих реагентов (амидофосфитов и твердофазных носителей) на основе 4-[4-(1-пиренилэтинил)фенил]-1,3-бутандиола

ХП) и 4~{4-[10-(фенилэтинил)антрацен-9-илэтинил]фенил}-1,3-бутандиола (XIX)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ах - арил bpy - бипиридил

DMAP - 4-(/*/,Лг-диметиламино)пиридин

DMF - диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

DMT - 4,4'-диметокситритил (4,4'-диметокситрифенилметил)

Et - этил

FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции

LCAA-CPG - аминоалкилированное стекло с определенным размером пор

Me - метил

Ph - фенил

Рг' - изопропил

Ру - пиридин

THF - тетрагидрофуран

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ПНР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолетовый

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

В последние годы в химических и биологических исследованиях все шире используются нерадиоактивные люминесцентные метки. Для них характерны практически неограниченный срок хранения, высокая чувствительность, сравнимая с чувствительностью радиоактивных меток и даже превосходящая ее, возможность автоматизации процедур модификации и детекции, возможность одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорами, а также меньшее отрицательное воздействие на окружающую среду и человека.

Довольно хорошо разработаны методы мечения нуклеозидов, олиго- и полинуклеотидов люминесцентными красителями [1, 2-5]. Эти конъюгаты находят широкое применение для исследования различных биомолекул, особенно нуклеиновых кислот. Так, нуклеозид-5'-трифосфаты и олигонуклеотиды, содержащие ковалентно присоединенные флуоресцентные красители, используются для секвенирования ДНК [68]. Флуоресцентно меченные олигонуклеотиды широко используются в качестве ДНК-зондов [9-14], праймеров для ПЦР, антисмысловых и антигенных ингибиторов экспрессии генов [15-21].

Однако в настоящее время флуоресцентные метки в составе конъюгатов с нуклеиновыми кислотами в большинстве случаев используются лишь для детекции олиго-или полинуклеотидной части конъюгатов и намного реже для исследования структурных изменений в процессе различных взаимодействий: гибридизации нуклеиновых кислот с образованием дуплексов или триплексов, их взаимодействий с белками, пептидами и смешанными биополимерами. Это вызвано тем, что детекция процессов взаимодействия биомолекул на основе спектров флуоресценции связана с решением ряда проблем: подбор флуоресцентного красителя, разработка синтеза его функционализированного производного, а также нуклеозидных и олигонуклеотидных конъюгатов и исследование спектральных свойств полученных конъюгатов. Несмотря на определенные трудности, флуоресцентные метки могут служить эффективным инструментом изучения динамики нуклеиновых кислот. Очень перспективным представляется использование флуоресцентных меток для изучения динамики фолдинга и функционирования РНК -молекул, представления о которых за последние полтора-два десятилетия претерпели, пожалуй, наиболее значительные изменения по сравнению с другими биополимерами, прежде всего в связи с обнаружением у них самостоятельной ферментативной активности.

Целый ряд сведений о динамике нуклеиновых кислот получен на основе регистрации и анализа изменений флуоресценции у единственного флуорофора, присоединенного к субстрату [22-24]. Вместе с тем, для повышения чувствительности эмиссионного спектра зонда к микроокружению возможно использование двух флуорофоров в качестве донора и акцептора энергии в качестве составного флуорофора. У этих флуорофоров спектр возбуждения акцептора должен перекрываться со спектром эмиссии донора. При этом возбуждение системы при длине волны, характерной для донора, сопровождается не отвечающей ему эмиссией, а безызлучательным резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET, fluorescence resonance energy transfer) на другой флуорофор и эмиссией, соответствующей акцепторному флуорофору. Для такой пары эффективность безызлучательного переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между красителями. Это означает, что использование такой пары должно быть крайне чувствительно к расстоянию между обоими флуорофорами [25-27].

В связи с этим весьма эффективно использование такого подхода для изучения биополимеров [28-38], например для изучения разнообразных конформационных изменений в РНК, что делает возможным выяснение общих принципов, управляющих динамикой этих биомолекул. С помощью FRET был зарегистрирован процесс гибридизации в живой клетке [40] (возможность такой регистрации предсказывалась ранее [25]). Весьма плодотворным оказалось использование резонансного переноса энергии для детекции различных вторичных структур нуклеиновых кислот [41-43], определения хиральности (направления закручивания) ДНК-спирали [35], определения расстояний между отдельными участками ДНК [44], детекции ДЦК-ДНК-гибридизации [45-54], исследования кинетики ферментативного расщепления нуклеиновых кислот [55, 56]. Перенос энергии оказался удобным методом для мониторинга деградации олигонуклеотидов in vivo [57, 58] и секвенирования ДНК [59-63]. Данный подход был использован также для изучения транспорта белка через плазматическую мембрану [39].

Следует отметить, что не только люминесцентные красители помогают изучать нуклеиновые кислоты, но и с помощью нуклеиновых кислот могут быть исследованы свойства красителей. Так. на основе ДНК разработан биосенсор, позволяющий детектировать способные к интеркаляции производные флуоресцентных полициклических ароматических углеводородов [64], а олигонуклеотидный дуплекс использован для стабилизации и регистрации флуоресценции эксимеров /w/^анс-стильбена [65, 66].

Весьма перспективными люминесцентными красителями для создания высокочувствительных зондов являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они химически устойчивы, обычно имеют высокие коэффициенты экстинкции и высокие квантовые выходы люминесценции, способны к нековалентным взаимодействиям с ДНК (интеркаляция, стэкинг). Очень интересным свойством ПАУ является их способность к образованию эксимеров (сокращение от excited dimers -возбужденные димеры) [67-71] Кроме того ПАУ относительно легко модифицировать с расширением системы тг-сопряжения, что может приводить к соединениям, по люминесцентным свойствам существенно отличающимся от исходных ПАУ, то есть к новым красителям. Среди различных группировок по характеру влияния на спектральные свойства ПАУ интересны арилэтинильные заместители. Введение таких заместителей приводит к существенному длинноволновому сдвигу максимума поглощения и эмиссии ПАУ и, как правило, к значительному увеличению квантового выхода флуоресценции [72-75]. Известно также, что введение фенилэтинильных групп в ПАУ приводит к соединениям, которые являются эффективными акцепторами энергии хемилюминесцентных реакций.

На основании приведенных данных в качестве красителей нами были выбраны флуорофоры на основе ароматических полициклических углеводородов, сопряженных через тройную связь с фенилэтинильными группами, которые устойчивы в условиях автоматизированного твердофазного олигонуклеотидного синтеза. При введении модифицированных подобным образом нуклеозидов и псевдонуклеозидов в олигонуклеотид флуоресценция красителя может дополнительно измениться в результате взаимодействия с нуклеиновыми основаниями. Гибридизация меченного таким образом олигомера с комплементарной нуклеотидной последовательностью может сопровождаться дальнейшими изменениями в спектре флуоресценции метки.

Целью данной работы явилась разработка и синтез новых флуоресцентных меток на основе фенилэтинилпирена и бис(фенилэтинил)антрацена, создание реагентов. введения этих меток в состав олигонуклеотидов в автоматическом синтезаторе ДНК, синтез и изучение свойств полученных конъюгатов.

Настоящая работа выполнена в лаборатории механизмов генной экспрессии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) п

выводы

1. Разработаны методы синтеза ацетиленовых производных двух флуоресцентных красителей - 4-(4-(1-пиренилэтинил)фенил)-1,3-бутандиола (ХП) и 4-{4-[10-(фенилэтинил)антрацен-9-илэтинил]фенил}-1,3-бутандиола (XIX) и на их основе синтезированы реагенты (амидофосфиты и модифицированные носители) для введения этих флуорофоров в олигонуклеотиды.

2. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения флуоресцентных" меток в состав олигонуклеотидов. . Синтезирован ряд олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 1-(фенилэтинил)пирена и 9,10-бис(фенилэтинил)антрацена в заданных положениях.

3. Показана возможность использования синтезированных олигонуклеотидов в качестве ДНК-зондов для детекции гибридизации ДНК в растворе и структурно-функционального исследования ДНК.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает сердечную благодарность В.А. Коршуну и Ю.А. Берлину за руководство диссертационной работой; своим коллегам из Лаборатории механизмов генной экспрессии за постоянную поддержку; сотрудникам ИБХ РАН Ю.Г. Молотковскому за великодушную инструментальную поддержку, И.И. Михалеву и И.В. Гречишниковой за регистрацию спектров флуоресценции; Ю.П. Козьмину и A.B. Сулиме за регистрацию масс-спектров; Т.А. Балашовой, Э.В. Бочарову, А.П. Голованову, Д.В. Дементьевой, В.Ю. Орехову и B.C. Пашкову за регистрацию 'Н-ЯМР-спектров. Автор признателен коллегам из других институтов: Э.И. Лажко (Институт по изысканию новых антибиотиков РАМН, Москва) за регистрацию 31Р-ЯМР спектров, А.Г. Витухновскому и О.П. Варнавскому (ФИАН им. Н.П. Лебедева, Москва) за содействие в измерении спектров флуоресценции.

1. Kessler С., Ed.; Nonradioactive labeling and detection of biomolecules,: Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 1992.

2. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjugate Chem., 1 (3), 165-187 (1990).

3. Beaucage S.L., Iyer R.P. The functionalization of oligonucleotides via phosphoramidite derivatives. Tetrahedron, 49 (10), 1925-1963 (1993).

4. Коршун В.А., Берлин Ю.А. Введение нерадиоактивных репортерных групп в синтетические олигонуклеотиды и их детекция. Биоорган, химия, 20 (6), 565-616 (1994).

5. Normally В.К., Не Н., Li L.C., Tucker S.A. McGown L.B. Characterization of visible dyes for four-decay fluorescence detection in DNA sequencing. Anal Chem., 69 (13), 2392-2397 (1997).

6. Prober J.hi., Trainor.G.L, Dam R.J., Hobbs F.W., Robertson C.W., Zagursky R.J., Cocuzza A. J., Jensen M.A., Baumeister K. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science, 238 (4825), 336-341 (1987).

7. Краев А.С. Технологии секвенирования ДНК и их автоматизация. Мол. биол., 25, 1447-1482 (1991).

8. Herrlein М.К., Konrad R.E., Engels J.W., Holletsz Т., Cech D. З'-Amino-modified nucleotides useful as potent chain terminators for current DNA sequencing methods. Helv. Chim. Acta, 77 (2), 586-596 (1994).

9. WetmurJ.G. DNA probes: application of the principles of nucleic acid hybridization. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26, 227-259 (1991).

10. Кнорре Д.Г. ДНК и РНК-зонды как альтернатива и дополнение иммунохимического анализа. ЖВХО, 34, 52-60 (1989).

11. Бадашкеева А.Г., Кнорре Д.Г. Олиго- и полинуклеотидные зонды. Методмолекулярной гибридизации. Мол. биол., 25 ( 2), 309-324 (1991).

12. Tyagi S., Bratu D.P., Kramer F.R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nature Biotechnology, 16 (1), 49-53 (1998).

13. ХЪ.Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. Москва:Наука, 1987.

14. UhlmanE, РеутапА. Antisense oligonucleotides: a new terapeutic principle. Chem. Rev., 90 (4), 543-584 (1990).

15. Helene C., Toulme J.J. Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigene nucleic acids. Biuchimica Biophysicu Acta, 1049, 99-125 (1990).

16. De Mesmcieker A., Haner R., Martin P., Moser H.E. Antisense oligonucleotides. Acc. Chem. Res., 28 (9), 366—374 (1995).

17. Crooke S.T., Benuett C.F. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annii. Rev. Pharmacol. Toxicol., 36, 107-129 (1996).

18. Crooke S. T. Progress in antisense terapeutics. Med. Res. Rev., 16, 319-344 (1996).

19. Matteucci M. Structural modification toward improved antisense oligonucleotides. Perspect. Drug Discovery, 4 (1), 1-16 (1996).

20. Verma S., Eckstein F. Modified oligonucleotides: synthesis and strategy for users. Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134(1998).

21. Cook P.D. Making drugs out of oligonucleotides: a brief review and perspective. Nucleosides & Nucleotides. 18 (6&7). 1141-1162 (1999).

22. Brauns E.В., Madaras M.L., Coleman R.S., Murphy C.J., Berg M.A. Measurement of local DNA reorganization on the picosecond and nanosecond time scales. J. Am. Chem. Soc. 121 (50), 11644-116449 (1999).

23. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., WolfD.E. Detection of nucleic acid by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (23), 8790-8794 (1988).

24. Clegg R.M., Murchie A.I.H., Zechel A., Lilley D.M.J. Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad.

25. Sci. USA, 90 (7) 2994-2998 (1993).

26. Tuschl Т., Gohlke C., Jovin T.M., Westhof E., Eckstein F. A three-dimensional model for the hammerhead ribozyme based on fluorescence measurements. Science, 266 (5186), 785-7891994).

27. Векишн Н.Л. Перенос возбуждения в макромолекулах. Итоги науки и техники. Сер. Радиационная химия. Фотохимия, 7, 3-176 (1989).

28. Clegg R.M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Meth. Enzymol., 211, 353-388 (1992).

29. Selvin P.R. Fluorescence resonance energy transfer. Meth. Enzymol., 246, 300-334 (1995).

30. Wu P., Brand L. Resonance energy transfer: methods and applications. Anal. Biochem., 218 (1), 1-13 (1994).

31. Clegg R.M. Fluorescence resonance energy transfer (FRET). In: Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy, Wang X.F., Herman В., Eds.\ New York: Wiley, 1996, 179-252.

32. Glazer A.N., Mathies R.A. Energy-transfer fluorescent reagents for DNA analyses. Curr.

33. О put. Biotechnol., 8 (!). 94-102 (1997).

34. De Silva A.P., Gunaratne H.Q.N., Gunnlaugsson Т., Huxley A.J.M., McCoy C.P., Rademacher J.Т., Rice Т.Е. Signaling recognition events with fluorescent sensors and switches. Chem. Rev., 97 (5), 1515-1566 (1997).

35. Jares-Erijman E.A., Jovin T.M. Determination of DNA helical handedness by fluorescence resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 257 (3), 597-617 (1996).

36. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E. Haaima G., Christensen L, Nielsen P.E., Nor den B. Hybridization of peptide nucleic acid. Biochemistry. 37 (35), 12331-12342 (1998).

37. Toth K., Sauermann V., Langowski J. DNA curvature in solution measured by fluorscence resonance energy transfer. Biochemistry, 37 (22), 8173-8179 (1998).

38. Mergny J.-L. Fluorescence energy transfer as a probe for tetraplex formation: the I-motif. Biochemistry, 38 (5), 1573-1581 (1999).

39. Majoul I. V., Bastiaens P.I.H., Soling H.-D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: Studies with choleratoxin in Vero cells. J. Cell. Biol., 133 (4), 777-789 (1996).

40. Sixou S., Szoka F.C., Jr., Green G.A., Guisti B., Zon G., Chin D.J. Intracellular oligonucleotide hybridization detected by fluorescence resonance energy transfer (FRET).

41. Nucí Acids Res., 22 (4), 662-668 (1994).

42. Cooper J. P., Hagerman P.J. Analysis of fluorescence energy transfer in duplex and branched DNA molecules. Biochemistry, 29 (3v>, 9261-9268 (1990).

43. Gohlke C., Murchie A.I.H., Lilley D.M.J., Clegg R.M. Kinking of DNA and RNA helices by bulged nucleotides observed by fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (24), 11660-11664 (1994).

44. Ozaki H., McLaughlin L.W. The estimation of distances between specific backbone-labeled sites in DNA using fluorescence r-j;onànce energy transfer. Nucl. Acids Res., 20 (19), 5205-5214 (1992).

45. AS. Morrison L.E., Haider T.C., Stols L.M. Solution-phase detection of polynucleotides using interacting fluorescent labels and competitive hybridization. Anal. Biochem., 183 (2), 231-244 (1989).

46. Morrison I.E., Stols L.M. Sensitive fluorescence-based thermodynamic and kinetic measurements of DNA hybridization in solution. Biochemistry, 32 (12), 3095-3104 (1993).

47. Yang M., Ghosh S.S., Millar D.P. Direct measurement of thermodynamic and kinetic parameters of DNA triple helix formation by fluorescence spectroscopy. Biochemistry, 33 (51), 15329-15337 (1994).

48. Selvin P.R., Rana T.M., Hearst J.E. Luminescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 116 (13), 6029-6030 (1994).

49. Selvin P.R., Hearst J.E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91 (21), 10024-10028 (1994).

50. Parkhurst K.M., Parkhurst L.J. Kinetic studies by fluorescence resonance energy transfer employing a double-labeled oligonucleotide: hybridization to the oligonucleotide complement and to single-stranded DNA. Biochemistry, 34 (1), 285-292 (1995).

51. Parkhurst K.M. Parkhurst. L.J. Donor-acceptor distance distributions in a double-labeled fluorescent oligonucleotide both as a single strand and in duplexes. Biochemistry, 34 (1), 293-300 (1995).

52. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature

53. Biotechnol., 14 (3), 303-308 (1996).

54. Tyagi S., Landegren U., Tazi M, Lizardi P.M., Kramer F.R. Extremely sensitive, background-free gene detection using binary probes and Qj3 replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (11), 5395-5400 (1996).

55. Bjornson K.P., Amaratunga M., Moore K.J.M., Lohman T.M. Single-turnover kinetics of helicase-catalyzed DNA unwinding monitored continuously by fluorescence energy transfer.

56. Biochemistry, 33 (47), 14306-14316 (1994).

57. Ghosh S.S., Eis P.S., Bhimeyer K., Fear on K, Millar D.P. Real time kinetics of restriction endonuclease cleavage monitored by fluorescence resonance energy transfer. Nucl. Acids Res., 22 (15), 3155-3 159 (1994).

58. Lee S.P., Censullo M.L., Kim H.G., Knutson J.R., Han M.K Characterization of endonucleolytic activity of HIV-1 integrase using a fluorogenic substrate. Anal. Biochem., 227 (2), 295-301 (1995).

59. Uchiyama H., Hircmo K, Kashiwasake-Jibu M., Taira K. Detection of undegraded oligonucleotides in vivo by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem., 271 (1), 380-384 (1996).

60. Ju J., Ruan C., Fuller C.W., Glazer A.N., Mathies R.A. Fluorescence energy transfer dye-labeled primers for DNA sequencing and analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 (10), 4347-4351 (1995).

61. Ju J., Kheterpal I., Scherer J.R., Ruan C, Fuller C.W., Glazer A.N., Mathies R.A. Design and synthesis of fluorescence energy transfer dye-labeled primers and their application for

62. DNA sequencing and analysis. Anal. Biochem., 231 (1), 131-140 (1995).

63. Hung S.-C., Ju J., Mathies R.A., Glazer A.N. Energy transfer primers with 5- or 6-carboxyrhodamine-6G as acceptor chromophores. Anal. Biochem., 238 (2), 165-170 (1996).

64. Hung S.-C., Ju J. Mathias R.A., Glazer A.N. Cyanine dyes with high absorption cross-section as donor chromophores in energy transfer primers. Anal. Biochem., 243 (1), 15-27 (1996).

65. Ju J., Glazer A.N., Mathies R.A. Energy transfer primers a new fluorescence labeling paradigm for DNA sequencing and analysis. Nature Med., 2 (2), 246-249 (1996).

66. Pandey P.C., Wee tall H.H. Evanescent fluorobiosensor for the detection of polyaromatic hydrocarbon based on DNA intercalation. Appl. Biochem. Biotechnol. 55 (2), 87-94 (1995).

67. Letsinger R.L., Wu T. Use of a stilbenedicarboxamide bridge in stabilizing, monitoring, and photochemically altering folded conformations of oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc., 117 (28), 7323-7328 (1995).

68. Lewis F.D., Wu Т., Burch E.L., Bassani D.M., Yang J.-S., Schneider S., Jäger W., Letsinger R.L. Hybrid oligonucleotides containing stilbene units. Excimer fluorescence and photodimerization. J. Am. Chem. Soc., 117 (34), 8785-8792 (1995).

69. Stevens В., Hutton E. Radiative life-time of the pyrene dimer and the possible role of excited dimers in energy transfer processes. Nature, 186 (4730), 1045 (1960).

70. De Schryver F.C., Collart P., Vandendriessche J., Goedeweeck R., Swinnen A., van der Airweraer M. Intramolecular excimer formation in bichromophoric molecules linked by a short flexible chain. Acc. Chem. Res., 20 (5), 159-166 (1987).

71. Барашков H.H., Сахно Т.В., Нурмухаметов Р.Н., Хахелъ O.A. Эксимеры органических молекул. Усп. химии, 62 (6), 579-593 (1993).

72. Dietrich В., Vi out Р., Lehn J.-M. Macrocyclic chemistry. Aspects of organic and inorganic supramoiecular chemistry. VCH: Weinheim, New York, Basel, Cambrige, 1993, 19-21.

73. Shimadzu A., Ohtani H., Ohuchi S., Sode K., Masuko M. Perylene excimer formation by excimer-forming two-probe nucleic acid hybridization method. Nucl. Acids Symp. Ser. № 39, 45-46 (1998).

74. Hanhela P. J., Paul D.B. Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. I. The phenylethynylation of antraquinone. Aust. J. Chem., 34 (8) 1669-1685 (1981).

75. Hanhela P. J., Paul D.В. Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. II. Violet and blue emitters. Aust. J. Chem., 34 (8) 16871700 (1981).

76. Hanhela P.J., Paul D.B. Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. III. Yellow and red fluorescent emitters. Aust. J. Chem., 34 (8) 1701-1717 (1981).

77. Hanhela P.J., Paul D.B. Evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. IV. Fluorescence quantum yields of some phenyl and phenylethynyl aromatic compounds. Aust. J. Chem., 37 (3), 553-559 (1984).

78. Nakatsuji S., Matsuda K., Uesugi K, Nakashima K., Akiyama S., Fabian W. Synthtesis and absorbtion/emission spectroscopic properties of bis(phenylethynyl)benzenes and 9,10-bis(phenylethynyl)anthracenes. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1992 (7), 775-758.

79. Базылъ O.K., Майер Г.В., Копылова Т.Н., Данилова В.И., Чайковский В.К. Теоретическое и экспериментальное исследование генерации фенилэтинильных замещенных нафталина Ж. пршсг. спектроск., 35 (2), 261-267 (1981).

80. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986.

81. Марч Дж. Органическая химия. М.: Мир, 1987, т. 1, с. 310.

82. Chandross Е.А. A new chemiluminescent system. Tetrahedron Lett., 1963 (12), 761-765.

83. Rauhut M.M., Roberts B.G., Semsel A.M. A study of chemiluminescence from reactions of oxalyl chloride, hydrogen peroxide, and fluorescent compounds. J. Am. Chem. Soc., 88 (15), 3604-3617 (1966).

84. Bollyky L.J., Whitman R.H., Roberts B.G., Rauhut M.M. Chemiluminescence from reactionsof oxalic anhydrides with hydrogen peroxide in the presence of fluorescent compounds. J. Am. Chem. Soc., 89 (25), 6523-6526 (1967).

85. Moulding D.R., Clarke R.A., Roberts B.G., Rauhut M.M. Chemiluminescence from reactions of electrophilic oxamides with hydrogen peroxide and fluorescent compounds. J. Org. Chem., 33 (1),250-254(1967).

86. Orosz G., Torkos K., Borossay J. Investigations of peroxyoxalate chemiluminescence in aprotic media. Acta Chim. Hung, 128 (6), 911-917 (1991).

87. Takalo H., Mukkala V.-M., Mikola H., Liitti P., Hemmila. I. Synthesis of europium (III) chelates suitable for labeling of bioactive molecules. Bioconjugate Chem., 5 (3) 278-282 (1994).

88. Sanechika K., Yamamoto Т., Yamamoto A. Palladium catalyzed C-C coupling for synthesis of л-conjugated polymers composed of arylene and ethynylene units. Bull. Chem. Soc. Japan, 57 (3), 752-755 (1984).

89. Ri'eel W., Dormer W. Schlegelmilch W. Mono- und Dianlagerungen von monosubstituierten Acetylenderivaten an unsubstituiertes und substituiertes Anthrachinon. Chem. Ber. 94 (4), 1051-1058 (1961).

90. Джемилев У.М., Сараев P.А., Вырыпаев E.M., Ибрагимов А.Г. Кросс-сочетание диацетиленидов магния с органическими галогенидами, катализируемое комплексами переходных металлов. Изв. АН СССР, Сер. хим., 1987 (9), 2037-2041.

91. Пискунов А.В., Мороз А.А., Шварцберг М.С. Синтез 9,10-диацетиленилантраценов. Изв. АН СССР, Сер. хим., 1990 (6), 1441-1443.

92. Грузинский В.В., Дегтяренко К.М., Копылова Т.Н., Павлова В. Т. Генерация излучения в парах цепочечных соединений. Изв. высш. уч. зав., 28 (1), 101-103 (1985).

93. Stiegman A.E., Miskouski V.M., Perry J.W., Coulter D.R. A series of donor-acceptor molecules of the form NH2(C6H4)(C=C)n(C6H4)N02. Unusual effects of varying n. J. Am. Chem. Soc., 109 (19), 5884-5886 (1987).

94. Graham EM., Miskowski V.M., Perry J.W., Coulter D.R, Stigman A.E., Schaefer

95. W.P.Marsh R.E. Unusual structural distortions induced by charge-transfer interactions through conjugated molecules: crystal structures of NT^CeHjsCeFUNC^ (n=0-4). J. Am. Chem. Soc., Ill (24), 8771-8779 (1991).

96. Wong M.S., Nicoud J.-F. Synthesis and computational studies of hyperpolarizable zig-zag chromophores. Tetrahedron Lett. 35 (33), 6113-6116 (1994).

97. Grubbs R.H., Kratz D. Highly unsaturated oligomeric hydrocarbons: 'alpha'-(Phenylethynyl)-'omega'-phenylpoly 1,2-phenylene(2,1 -ethynediyl). Chem. Ber., 126, 149-157(1993).

98. Nakasuji K, Akiyama S., Nakagawa M. Linear conjugated systems bearing aromatic terminal groups. Vlll. Synthesis and electronis spectra of bis(4-biphenylyl)- and 2,2'-difluorenylpolyynes. Bull. Chem. Soc. Japan., 47 (3), 883-891 (1972).

99. Joshi H.S., Jamshidi R, Tor Y. Conjugated 1,10-phenanthrolines as tunable fluorophores. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 38 (18), 2722-2725 (1999).

100. Ley K.D., Li Y., Johnson J.V., Powell D.H., Schanze KS. Synthesis and characterization of it-conjugated oligomers that contain metal-to-ligand charge transfer chromophores. Chem. Commun., 1999 (17), 1749-1750.

101. El-ghayoury A., Harriman A., Ziessel R. Developing osmium(II) tris(2,2'-bipyridyl) derivatives as reagents for luminogenic assays. Chem. Commun., 1999 (20), 2027-2028.

102. Harriman A., Hissler M., Khatyr A., Ziessel R. A ruthenium(II) tris(2,2'-bipyridine) derivative possessing a triplet lifetime of 42 pis. Chem. Commun., 1999 (8), 735-736.

103. Kawase Т., Darabi H.R., Oda M. Cyclic 6.- and [8]paraphenylacetylenes. Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 35 (22), 2664-2666 (1996).

104. Горшкова H.Г. Чупарава M.A., Касаточкин В.И., Сладкое A.M., Ухин Л.Ю. Спектры поглощения ароматических азоэтинильных соединений. Ж. физ. хим., XL, (2), 411-416 (1966).

105. Клар Э. Полициклические углеводороды. Москва: Химия., 1971, тт. 1, 2.

106. ПО. Wong M.S., Nicoud J.-F. Synthesis of novel non-centrosymmetric crystalline materials for quadratic non-linear optic./. Chem.Soc., Chem. Commun., 1994 (3), 249-250.

107. Rao В. V. V.S.N.P., Mathur S. C., Dube D.C., Tewari D.P., Banerjee M. Theoretical study on naphthylphenylacetylenes for second-order nonlinear optical applications. Can. J. Chem., 75, (8), 1041 — 1046 (1997).

108. Davey A.P., Elliot S., O'Connor O., Blau W. New rigid backbone conjugated organic polymers with large fluorescense quantum yields./. Chem.Soc., Chem. Commun., 1995 (14), 1433-1434.

109. Swager T.M., Gil C.J., Wrighton M.S. Fluorescence studies of poly(p-phenyleneethynylene)s: the effect of anthracene. J. Phys. Chem., 99 (14), 4886-4893 (1995).

110. Kciwabata S., Yamazaki /., Nishimura Y. Synthesis and photochemical properties of anthracene-polyyne-porphyrin assemblies. Bull. Chem. Soc. Japan, 70 (5), 1125-1133 (1997).

111. Taylor P.N., Wylie A.P., Huuskonen ./., Anderson H.L. Enhanced electronic conjugation in anthracene-linked porphyrins. Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 31 (7), 986-989 (1998).

112. Moulding D.R., Roberts B.G. Electronic absorption and fluorescence of phenylethynyl-substituted acenes. J. Org. Chem., 34 (6), 1734-1736 (1969).

113. Kondo K., Yasuda S., Sakaguchi Т., Miya M. The third-order optical non-linearity of the phenylethynyl-substituted benzene system. J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1995 (1), 55-56.

114. Grosshenny V., Hcirriman A., Ziessel R. Towards the development of molecular wires: electron localization, exchange, and transfer in alkyne-bridged multinuclear complexes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34 (23/24), 2705-2708 (1995).

115. Васильева О.А., Гореленко С.В., Давыдов С.В., Калоша И.И., Толкачев В.А. Генерация излучения растворами арилацетиленовых производных при лазерной и ламповой накачках. Ж прикл. спектроскопии. 46 (4), 642-645 (1987).

116. Клочков В.П., Богданов В.Л. Спектрально-люминесцентные свойства сложных молекул в высоких электронных состояниях. Изв. АН СССР, Сер. физ. 54 (3), 386-390 (1990).

117. Devadoss C., Bharathi P., Moore J.S. Energy transfer in dendritic macromolecules: molecular size effects and the role of an energy gradient.J. Am. Chem. Soc. 118 (40), 9635— 9644 (1996).

118. Ни O-S., Pugh V., SabatM., Pit L. Structurally rigid and optically active dendrimers./. Org. Chem. 64 (20), 7528-7536 (1999).

119. Passerini R. The near-ultra-violet absorption cpectra of some heterocyclic compounds. Part I. Benzoxazoles. J. Chem. Soc., 1954 (7), 2256-2261.

120. Reiser A., Leyshon L.J., Saunders D., Mijovic M.V., Bright A. and Bogie J. Fluorescence of aromatic benzoxazole derivatives. J. Am. Chem. Soc. 94 (7), 2414-2421 (1972).

121. So Y.-H., Zaleski J.M., Миг lick С. and Ellaboudy A. Synthesis and photophysical propeties of some benzoxazole and benzothiazole compounds. Macromolecules,.29 (8), 2783-2795 (1996).

122. Пушкина Л.Н., Ткачев В.В. О люминесцентных и сцинтиляционных свойствах некоторых 2-замещенных бензоксазолов. Ж. прикл. спектроскопии, 1 (3), 275-279 (1964).

123. Kosower ЕМ., Ben-Shoshan М. Biman acetylenes and diacetylenes. Bimanes. ЪЪ (???). J.

124. Org. Chem., 61 (17), 5871-5884 (1996).

125. Takalo H., Hemmila., Sutela Т., Latva M. 71.Synthesis and luminescence of novel Еиш complexing agents and labels with 4-(phenylethynyl)pyridine subunits. Helv. Chim. Acta, 79 (3), 789-802 (1996).

126. Starck J.-F., Nakatani Y, Ourisson G. Synthesis of two new phospholipidic fluorescent probes for membrane studies. Tetrahedron, 51 (9), 2629-2638 (1995).

127. Starck .J.-F., Nakatani Y, Ourisson G., Cowley D.J., Duportail G. Fluorene derivatives as membrane probes. Steady-state and time-resolved fluorescence studies in DMPC vesicles. New J. Chem. 20 (12), 1293-1299 (1996).

128. Yamana K., Gokota Т., Ozaki H., Nakano H., Sangen 0., Shimidzu T. Enhanced fluorescence in the binding of oligonucleotides with a pyrene group in the sugar fragment tocomplementary polynucleotides. Nucleosides Nucleotides, 11 (2/4), 383-390 (1992).

129. Staab H.A., Riegler N. Diederich F., Krieger C., Schweitzer D. 3.3.- and [4.4](2,7)pyrenophanes as excimer models: synthesis, molecular structure, and spectroscopic properties. Chem. Ber., 117 (1), 246-259 (1984).

130. Inouye M., Fuji тою К., Funisyo M., Nakazumi H. Molecular recognition abilites of a new class of water-soluble cyclophanes capable of encompassing a neutral cavity. J. Am. Chem. Soc. 121 (7), 1452-1458 (1999).

131. Ebata К.,Masuko M, Ohtani H., Kashiwasake-Jibu M. Nucleic acid hybridization accompanied with excimer formation from two pyren-labeled probes. Photochem. Photobiol, 62 (5), 836-839 (1995).

132. Totig G., Law I or J.M., Tregear G.W., Haralambidis J. Oligonucleotide-polyamide hybrid molecules containing multiple pyrene residues exhibit significant excimer fluorescence. J. Am. Chem. Soc., 117(49), 12151-12158 (1995).

133. Frazer J.D., Horner S.M., Woski S.A. Synthesis of a pyrene-containing nucleoside and its incorporation into oligonucleotides. Tetrahedron Lett., 39 (11), 1279-1282 (1998).

134. Clegg R.M., Murchie A.I.H., Zechel A., Lilley D.M.J. Observing the helical geometry of double-stranded DNA in solution by fluorescence resonance energy transfer. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 90, 2994-2998 (1993).

135. Chen X., Zehnbauer В., Gnirke A., Kwok P.-Y. Fluorescence energy transfer detection as homogeneous DNA diagnostic method. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 94 (20), 10756-10761 (1997).

136. Martin C.S., Butler L. Bronstein I Quantitation of PCR products with chemiluminescence. Biotechniques, 18 (5), 908-913 (1995).

137. Schubert F., Möller U., Cech D. Methylene blue-oligonucleotide conjugates: synthesis and application in DNA analysis. Collect. Czech. Chem. Commun., 61, S140-S141 (1996).

138. Karoda N., Hosoki S. Nakci.shima K., Akiyama S., Givens R. Photographic detection of fluorescent-labelled oligodeoxynucleotide in the blotting format by peroxyoxalate chemiluminescence. J. Biolumin. Chemilumin., 13 (1), 101-105 (1998).

139. Bodendorf К., Kloss P. Acetylen-Derivate durch Fragmentierung. Angew. Chem., 75 (2), 139 (1963).

140. Bodendorf К., Mayer R. Uber die Darstellung und Fragmentierung von ß-Chlor-acroleinen. Chem. Ber., 98 (11), 3554-3560 (1965).

141. Lötzbeyer J., Bodendorf K. Darstellung von Aryl-buten-inen und Phenyl-hexadien-in. Chem. Ber., 100 (8), 2620-2624 (1967).

142. Синтезы органических препаратов. Сборник 1, 189-190, Москва:ИЛ, 1949.

143. Органикум. Москва: Мир, 1992, т. 2, стр. 264-268.

144. Olah G.A., Ed., Friedel-Crafts and Related Reactions. New York: Willey Interscience,1963, vols. 1, 3.

145. Органикум. Москва: Мир, 1992, т. 1, стр. 454-458.

146. Mayer R, Wehl J. Thioamide aus Enaminen und Schwefel bei Raumtemperatur. Andew. Chem., 16 (20), 861 (1964).

147. Plati J.T., Strain W.H., Warren S.L. lodinated organic compounds as contrast media for radiographic diagnoses II. Ethyl esters of iodinated straight and branched chain phenyl fatty acids. J. Am. Chem. Soc., 65 (7), 1273-1276 (1941).

148. Oikawa Y, Sugano K., Yonemitsu 0. Meldrum's acid in organic synthesis. 2. A general and versatile synthesis ofß-keto esters. J. Org. Chem., 43 (10), 2087-2088 (1978).

149. Capozzi G., Roe lens S., To/ami S. A. Protocol for the efficient synthesis of enantiopure ß-substituted ß-lactones. J. Org .Chem., 58 (27), 7932-7936 (1993).

150. Soai K, Oyamada H. A Chemoselective one-step reduction of ß-ketoesters to 1,3-diols.

151. Synthesis, 1984 (7), 605-607.

152. Korshun V.A.; Prokhorenko I.A.; Gontarev S.V.; Skorobogatyi M.V.; Balakin K.V.; Manasova E.V.; Malakhov A.D.; Berlin YA. New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 16 (7-9), 1461-1464 (1997).

153. Sonogashira K. Tohda Y, Hctgihara N. A convinient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkenes, iodoarenes and bromopyridines. Tetrahedron Lett., 1975 (50), 4467-4470.

154. Rossi R, Carpita A., Bellina F. Paliadium-and/or copper-mediated cross-coupling reaction between 1-alkynes and vinyl, aryl, 1-alkynyl, 1,2 propadienyl, propargyl and allylic halides or related compounds. Org. Prep. Proc. Int. 27 (2), 127-160 (1995).

155. Коршун В.А., Манасова E.B., Берлин Ю.А. Алкинилированные нуклеозиды и их аналоги. I. Методы синтеза. Биоорг. химия, 23 (5), 324-387 (1997).

156. Acevedo O.L., Angrews RS., Dunkel М., Dan Cook P. Synthesis of C-4 substituted pyrimidinnucleoside analogs. Preparation of several 4-(2-oxoalkylidene)-2(l//)-pyrimidinone ribonucleosides./. Heterocycl. Chem., 31 (4), 989-995 (1994).

157. Gan L.-S.L., Lu J.-Y.L., Hershkowitz D.M., Ahvorth W.L. Effect of acetylenic and olefinic pyrenes upon cytochrom P-450 dependent benzoa.pyrene hydroxylase activity in liver microsomes. Biochem. Biophys. Res. Commitn., 129, 591-596 (1985).

158. Caruthers M.H., Barone A.D., Beaucage S.L., Dodds D.R., Fisher E.F., McBride L.J., Matteucci M., Stabinsky Z., Tang J.-Y. Chemial synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Meth. Enzymol. 154, 287-313 (1987).

159. Atkinson Т., Smith M. Solid-phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides by the phosphite-triester method. In: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach. Gait M.H., Ed., Oxford: IRL Press, 1984, 35-81.

160. Damha M.J., Giannciris P.A., Zabarylo S. V. An improved procedure for derivatization of controlled-pore glass beads for solid-phase oligonucleotide synthesis. Nucl. Acids Res., 18 (13), 3813-3821 (1990).

161. Шпаковский Г.В., Лебеденко Е.Н. Первый представитель нового семейства эукариоточеских факторов транскрипции, обнаруженный с помощью межвидовой комплементации. Биоорган, химия, 23 (3), 234-237 (1997).

162. Grechishnikova /.Г., Johansson L.H.-A., Molotkovsky J.G. Synthesis of new bifluorophoric probes adapted to studies of donor-donor electronic energy transfer in lipid system. Chem. Phys. Lipids, 18 (I). 87-98 (1996).

163. Letsinger R.L.,Wu T. Control of excimer emission and photochemistry of stilbene units by oligonucleotide hybridization. J. Am. Chem. Soc., 116 (2), 811-812 (1994).

164. FOrsster T. Intramolecular energy migration and fluorescence. Ann. Phys., 2, 55-75 (1948).

165. FOrsster T. Transfer mechanism of electronicexcitation Discus. Faraday Soc., 27. 7-17 (1959).

166. FCrster T. Delocalized excitation and excitation transfer. In: Modern Quantum Chemistry, Sinanoglu O., Ed., New York,: Academic Press, Part 3, pp. 93-137 (1966).

167. Lankiewicz L. Malika ,/., Wiczk W. Fluorescence resonance energy transfer in studies of interchromophoric distances in biomolecules. Acta Biochim. Polonica, 44 (3), 477-489 (1997)

168. Ren R.X.-F., Chaudhuri N.C., Paris P.L, Rumney I.S., Kool E.T. Naphthalene,phenanthrene, and pyrene as DNA base analogues: synthesis and fluorescence in DNA. ./ Am. Chem. Soc., 118 (33), 7671-7678 (1996).

169. Guckian K.M., Schweitzer B.A., Ren R.X.-F., Sheils C.J., Paris P.L., Tahmassebi D.C., Kool E. T. Experimental measurements of aromatic stacking affinities in the context of duplex DNA./. Am. Chem. Soc., 118 (34), 8182-8183 (1996).

170. Coulson D.R. Tetrakis(triphenylphosphine)palladium (0). Inorg. Synth., 13, 121-124 (1972).

171. Nielsen ./., Dahl 0. Improved synthesis of (Pr'2N)2POCH2CH2CN. Nucl. Acids Res., 15 (8), 362b (1987).

172. Bannwarth W., Trzeciak A. A simple and effective chemical phosphorylation procedure for biomolecules. Hetv. Chim. Acta, 70 (1), 175-186 (1987).

173. Davidson D. Bernhard SJhe structure of Meldrum's supposed /?-lactonic acid. ./. Am. Chem. Soc.70 (10), 3426-328 (1948).