Синтез новых фосфорорганических аналогов карнозина и ингибиторов карнозин синтетазы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

иогкгжскіт op/(гнл іруломго кглсти« лиьщт

ІІИ* UU ' Í гочкпп ХИШПГГКОЯ ТІ'УНОЧОМГИ ии. К. ік Л0Мї>ИПГОМ\

( я «’ п i<n « і» ,мм':'п v M,sí¡ и 1 ґ'і- * • * ' ’ ' 1 т - - - - - .

if л ¡1 рчп-5 • ; Ï *- ' •: i-í- '

V û»K STM5líS<f?.^V|

• ХСМУТОП Гчциййм'і

СИНТЕЗ lionwx ФОСФОГШТАНИЧР.СКИХ АНАЛОГОВ КАРІШИНА И ИНГИКЯТОГОП КЛРНОЗИН СИНТЕТЛ1Н.

Гприия лмісе т ? О7 U0 ! о ,

Пмопргопччр« кдч хики-4, хмния Прмрс»Л1*ИЧ Н ФМГІМС'ІОІ И *Г»г И( nKlHPHUX В«>*<»СТР

Автореферат

їїи( і ортнцим мп гои'к<м»и<? у о'мсії і HU ИД ИДИ ? ч УММН'»<'(■>/« у Hl у V

Мосирп \*)9а

H ••• ш.гч

iUrri хчіг'Ді.иния дяггніпсзх р і •' і .-т!”?Г!(1исиичіт9іі:?

-,ІІ7 І ггіч-і.-і IV'H.îb,,'

t if,r, Uj (ÿ-ç ^ '"'Г!І I яу

I I ■ w ' 4(X- KVM <Ч‘МР<$ИЦ'И 4‘4'tJnH 'rt.'S'HIl ÎXfliN ;wr-*i,'TiiKcifc rc и -'i t оі!л:'^ч- ?iïnr i íVí''?«1' ;t

■ (3 i І И 'IM® ’3'riïT

• м і,;. і-іпрін.Ьчц f .'і (in T4Mtirn 1 |Д) (! : .(ое'ІЬп 'М( -q-yrmi

IVІ1П1 il 'г/.см хи'г'ямти'- і'Фчмір "і’гппк і уі>чЛі,( '■»мччіче'лиііі

"І! ‘ !()' H- ('Off lî «jг*я>..і I- ’■•■Iiripq."l!'fiii v.'nîi;4' і ийіШ'Гі’орг teil її" '«і,

^ Ч • 1 pjj.ç-WiTO' ■ )£.• *:ИЧ'Ч '<-) ItllllRl 1>-гмії Ç.1

■ r >14 -'Jltí il '■’If ' !¡ и НИ »

í і ,1 ' ¡'t ■' vi ' ' ■ t ' ¡’ ! ;■> I. І НИ'! .У-'btlf'W^ • KUtl гг ПИН »> liliO'W Kv \1П

4 l.frmtf О 1 г V 'I'f - rjt"'f|U

‘ V M\ Î1Ï t 'tr' *4' ІІГІ'ї'Г

ЦС'( 14li,v:l1 !l ' ’~n M'■ і '.'.міші» !• t-> it /иіпінчіііл ñi- utii'ii i i'

ІІК.М'П.' 4 ’’ ' t ' ' ! I -11' ~ !r r '(I. -t ! ИИ ЛПn ■!/,( |;'Н|І,Л'|1

' f/.|| (l.'iF4;i)rf -IV \I “ ї>. ■ И 4 . ' г-'’l II ■' >"t I'Mn'.tv І і ' I 1 r..,

ИМ I 1 ’ : Ґ : »'■: ft : И',! V T7 ■ ! -■'■Г'Г '1 r-,:- ['-'-.V'U • f I’- 1

Актуальность проблемы. Карнозин (0-аланил-1.-гистидин ), о-ьфт^и

В.С.Гулевичем в начале века, присутствует ь значительных количествах в различных органах и тканях позвоночных. Карнозин необходим для поддержания работоспособности мышц, играет важную роль в процессах распознавания запахов, недостаток карнозина является одной из причин нарушения обмена меди в организме, гомокарноэин 1г-аыи-нобутирил-Ь-гистидин) существенней для нормального Функционировл ния центральной нервной системы. Вместе с ген, иетаболиэ^карноэи на, его регуляция и функции дипептида на молекулярном уропне иэу чени недостаточно. Одним из перспективных подходов к вияснрнип этих вопросов является избирательное воздеяс' зие на ферменты метаболизма карнозина, карнозин синтетаэу и карнозиназу, а таклг использование его аналогов з карнозин зависимых преараьтшиях.

Создание регуляторов метаболизма карнозина, а такт* тлшк новых активных веществ в этом ряду представляются перспективными и в связи с присущим каркозину комплексом полосных свопстп, ч”? позволяет рассчитывать на практическое применение веществ эти: о семейства.

Целью работы явилось получение неизвестных ранее фос^онис I ы:< и фосфоновых аналогов гистидина и карнозина, синтез новых избирательных ингибиторов карнозин синтетазы, а. также исследование полученных соединения в карнозин синтетазноп реакции и в свободно радикальных'реакциях перекисного окисления.

Научная новизна. Синтезирован иеиииестнып п.чноо сго-‘и I .1 аналог гистидина и рассмотрена реакция оксичов >: ’осф'.>р:! < и. ем

кислотой. Наяден но'яый метод презраисми.1 э.*::-'.пфос *он.ь: I и к . л П соответствующие фосфонатн Я Осущесте •••*)! : опат №С¡И1 ! I

фосфонозого аналогов карнозина. Показан), т. о -уо!. рочн«:к,1 .. < -• нозина,подобно самому дипептиду торшкмг р^-лкни¡т овпбпкии кального окисления ненасыщенных .»ирных к .»г. и Я’ дел:»"-'-и , .и зина.

Синтезирован набор неописанных ранее стабильных аналога» щи межуточных соединений каршюин- еингенгл о» и ал ,”!• ■'.< <•

взаимодействие с ферментом из грудных ¿иш ¡"шл;«-; М:*30!-ч^ а ■ •

рательные ингибиторы карнозин сингетазы, в том числе н -аг ¡ш Зиновия Эфир а-кето-у-аыинопропанфоефоновой кислоты, ирннаплал'

«ni к новому типу аналогов аыиноациладенилатов. Независимым образом подтвержден аденилатныя путь активации 0-аланина ферментом из грудных мышц цыплят.

V/ '

Практическая ценность работы. Подходы, использованные в нас-•гояшйй работе'для конструирования ингибиторов карнозин синтетаэы, мог у г оказаться полезными для получения ингибиторов других АТР-пависимых синтетаз. Описанные в настоящей работе ингибиторы биосинтеза карнозина могут оказаться полезным инструментом в изучении функция дипептида. Вещества, подобные ингибиторам биосинтеза карнозина, а также его фосфоанопогам, могут, представлять практический интерес для расширения возможностей, карнозинотерапии. Ранее неизвестные фосфонистые и фосфоновые аналоги гистидина и кар-нолкна представляют интерес как вещества ингибирующие реакции свободно-радикального окисления.

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на VIII Конференции молодых ученых "Синтез и исследование биологи-чески-активны"' соединений" (Рига, 1984 гЛ, VIII Симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" (Рига, 1985 г.), V Всесоюзном биохимическом Съезде (Киев, 1986 г.). "

Защищаемые положения.

- Структура ингибиторов карнозин синтетазы как аналогов 0-аланил-аденилата и 0-аланилфосфата, синтез, взаимодействие с ферментом.

- Метод синтеза неизвестных ранее фосфонистого и фосфонового аналогов Р-аланил-1.-гистидина (карнозина), а также получение 1-ами-но-2-имидазолилфосфонистой и 1-аыино-2~имидаэолилфосфоновой кислот.

- Фосфоаналоги карнозина как ингибиторы реакций свободно-радикального окисления 2’-дезоксигуанозина, линолевой кислоты и фраг-иэнтов саркоплазматического ретикулума.

Публикации. По.материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем диссертации. Диссертация изложена на ________ стр. машино-

тисного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован ______ таблицами и ____ рисунками. Список

цитированной литературы включает _________ наименований.

Карнозин возникает в результате синтетаэноя реакции, а ході; которой происходит активация карбоксильной группы fl-аланина с участием АТР и-последующим взаимодействием с гистидином <Kaiy«n _kaг G. & Meister A., 1959):

Предполагается, что промежуточный соединение« в этой реакции является 0-аланиладенилат, в пользу чего спидетельствует зависи-

мая от ß-'алаішна р-ция пирс фосфатного обмена АТР «и~» pp. + ATI1.

Вместе с тем, нельзя полностью исключить активации S-аланпча рез образование ß-аланилфосфата. Обе эти возможности следовало учитывать при конструировании ингибиторов карноэин синтетаэы.

Для ингибирования ATP-зависимых ферментативных процессов ак тивации карбоксильной группы, протекающих через промежуточное <>о разование ацилфосфатов или ациладенилатов, в'настоящее время признается целесобразныы использование стабильных аналогов этих не устойчивых соединения. Основой такого подхода является допудани.»

о комплементарности активного центра фермента структурам, i-ou г ветствуюшим промежуточным состояниям ферментативной реакцн <. мы подразумевает более высокое сродство их к ферменту по сравнение с субстратами или продуктами. Соответственно этому соедит нт структурно близкие переходным состояниям, аогут прочно сзяунык, ся с ферментом и обладать свойствами избирательных ингибиторов.

Известно несколько типов аналогов аминоациладенилатоэ, им гибиторов соответствующих ферментов: аминоалкиловые уфирн w-

(Casslo D., et.al., 1967!, 5*-аленоэиловые эфиры г-оыино-р-кето-алкилфосфоновых кислот (Gorin? С. a Ci-а me г F., I97J), а г»>.?.е

аминофосфониладенилаты (BlryuKov A.Z.. et.al., ¡976). fmm мн > также торможение ацетил-СоА-синтетазы 5'-аденозиловым эфиром ил1-тофосфоновой кислоты (Гуляев H.H. и пр., 1971). В качестве ат/и-гов ацилфосфатов '"‘¿ли получены построенные сходным of<pa:>c>M j+hlu фосфорной кислоты и эамещ :ut фосронап*.

Е

Е

Е

ß-Ala

Г)

Уместно отметить, что в качестве ингибиторов карнозин синтетазы испытывались многочисленные гомологи, производные и аналоги

лучший ингибитор, г-аминопропилсульфонат, действовал в концентрации порядка IO"2 М (Seely J.E. ь Marshall F.D.’, 1982).

Таким образом, для ингибирования карнозин синтетазы наиболее перспективными представлялись аналоги ß-аланиладенилата и В-ала-ниифосфата (I, R в Ado, Н). Соответственно, одной из задач настоящей работы явился синтез, неизвестных ранее стабильных аналогов промежуточгчх соединений карнозин синтетазной реакции общей формулы (II):

Одну группу составляли вещества, в которых был сохранен карбонильный фрагмент В-аланиладенилата (В-аланилфосфата), но ангидридный кислород отсутствовал или был заменен на метиленовое звено - аденозиновые эфиры В-кето- и а-кето-фосфоновых кислот, а также и собственно В-кето- и а-кетофосфоновые кислоты (III) и (IV), соответственно:

субстратов карнозин синтетазы. Однако активность их была низкой и

Н2Н-СН2СН2

о о

он

о-в

<1>

<и>

о

«Н2

Y * -СН2-;°-0-R * Н, Ado

НО ОН

О О

О О

ОН

ІІІІ8І R а Н (III6) R » Ado

• ОН 1IVa) R = Н

(IVÖJ R - Ado

В качестве аналогов лабильного продукта присоединения нуклео фила по карбонильной группе структур (I) были использованы устойчивые соединения, содержащие в соответствующем фрагменте тетрагональный углерод (Ya-Ув) или фосфор * VI»: I ,

«. X О о о 1

Н2 НСН2 СН2 -СН-Y-J-0-П H2HCH2CH2-J-0-l-0-H

ОН Ьи 1)11

(Ya) X ■ Н, Y * О, В - Ado , „, R „ ft(j0 1

IYO) X ■ ОН, Y » СН2, И ■ Н

(Vb) X * ОН. Y * СН2, В * Ado

Хотя механизм карнозин синтетаэной реакции на стадии образования пептидной связи не исследовался, нельзя исключить вероят*' ность прямого взаимодействия аминогруппы гистидина с проыежуточ-. ныи смешанный ангидридом (II, Этой стадии ферме ¡тативной реакции будут соответствовать вещества, включающие основные элементы структур субстратов реакции, одним из которых является соединение (VII), в котором аыинопропильный остаток может связываться с уча-• ’ ' • , *

. • 0 ' ■' ’ ■ H2HCH2CH2-C-CH2-^-0-Ado 1

J 'он ,VJI‘

!>-

CII2-CH2-CH2

irtl2

стком активного центра, ответственным за фиксирование имиаазояъ-ного фрагмента гистидина. .

ИСХОДНЫМ соединением В СИНТЄЗО 0-КЄТОфОСфоновой кислоты (ІЇІ8) был N-Cbz-0-Ala, который превращался в иодквтон и вводило» в реакцию Арбузова, что приводило к диэтиловому эфиру 1- К~СЪ2-\} ‘ оксо-бутан—і-фосфоновой кислоты, кислотный гидролиз которого ян-вал кислоту lilla). Аденоэиновыя эфир tille) был получен кон; ir сацией N-Cbz-(IIIa) с этоксиметиленаденоэином под действием три-изопропилбенэолсуль'охлорида (ТР*<). ' '■ 11

о о II I ОС.

НС1/Н20

1. Cbz-Cl

2. 2 ’,3'-этоксииетилен-Айо/Ру/ТРЗ

—■* anal

* IIIIÖ)

3. Ас0Н/Н20 ■4.. Н2/РЙ

В ряду отличающихся своей неустойчивостью, а-оксофосфонатов соединения, содержащие аминогруппы, не были описаны. Для получения (IVa) хл„рангидрид N-Tfa-ß-Ala вводился в реакцию с трибен-зилфос^итом и далее проводилось ступенчатое удаление защитных групп. Соединение сIVaI было получено из N-Tfa-(IVa) и этоксиме-тиленаденсзина с использованием ТРЗ в качестве конденсирующего агента, тогда как применение дициклогексйлкарбодиимида (DCC) приводило к разложению а-кетофосфонатов:

О

ТГа-1ШСН2СН2

О О

1. Nal

1. 2',3'-этоксиметилен-Ado/Py/TPS

(IVöl

2. Ас0Н/Н2О

3. nh4oh

Синтез 3-аминопропклового Эфира АМР IVa) был осушествле, аденилированием З-М-СЬг-аминопропанола смешанным ангидридом дифе-

нилфосфата и АМР с последующим удалением защитной грунт*.

0-Оксифосфонат IVÖJ и его аденозиновыя Эфир 1Ув) были получек восстановлением соответствующих М-СЪ2-ПРОИ5ВОДНЫХ веюнств ЦП«) и ИШ1 борогидридоы натрия с последующим снятием зашиты.

Соединение (VI), представляющее собой смешанный ангидрид ANW и цилиатина ’12-аыиноэтилфОСфоновая _ кислота), природного аналсн а

ß-аланина, обладает реакционноспособноя ангидридной "связы? ;г со---------------

ответствует по структуре аденилату (I) а его переходном corui'-i нии. Сегодня известно несколько способов, приводящих К ангидридам аминофосфонатов и нуклеотидов и требуюших использования групп, однако соединение i VI» было получено взаимодействие)! ■ во бодных цилиатина и АМР а водном пиридине в присутствии 1)СС.

Аналог мультисубстратного комплекса (VII), являшциисм oi-.ги иои 1Ш9) и 1-аииноокси-З-аминопропана, оказалось возможным получить в обычных условиях образования оксяыов.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ИНГИБИТОРОВ С К \РН03ИН CHtfli. i ASUI)

ИЗ ГРУДНЫХ МЫШЦ ЦЫПЛЯТ

Влияние соединения Ulla. Шб, IVO,. Va, Yb и VI) на активность частично очищенной карнозин синтетазы исследовалось на ферменте из грудных мышц цыплят, выделенном, согласно (Meiste!' А, •«

Kaly&nkar G.D., 1971) с некоторыми изменениями. Определение «<

> ! А

тивности фермента проводилось с использованием Н~ или С-гно i дина-с последующим разделением радиоактивных гистилнна и к.п.'»г зина ионообменной хроматографией по модифицированной мчг^днм-(HorinlsM H., et.al., 1976). Полученные величины для зим

на, АТР и L-гистидина 1с использованием 3 Л-0--аланина) срстзрляш 1.5.10~^ М, 5.7.10-4 Ци 4.Ö.106 М, соотнетсгвенно.

В стандартных условиях определения активности из нс?х чснь

тайных веществ сильнее всего действовал 5 '-.гдепозиновь’й :ц4(.

Г-аыино-а-кетопропанфосфоновой кислоты tlYd), который оказала.

-*s

конкурентным обратимым ингибитором с Kj 9,3.10 М. Следует пт катить, что до сих пор не были известны 1--кетофосфп)1ятц»е анал.ти аминоаииладенилатов, что 11Vö > был первым примером подобного вши ингибиторов и что лучший из известных ингибиторов кариоэии С ’.М». тазы, r-аминопропилфое-фонат имел Kf i.o.io'*1 М.

. Активность д{ тих синтезиг >ванных анало! tu г •> л а’ •« и«-. «•»»•.< п * " --с

('оставляла величины Kj порядка 10~3—10 4 М, причем во всех случаях горможение было конкурентным и обратимым. Следует отметить, что карнозин синтетаэа оказалась мало чувствительна к изменениям к строении vex фрагментов ингибиторов, которые моделировали <рос-Ф.ангидридную часть 8-алаииладенилата или фосфата. Сходная картина и с теми же уровнями ¿.ктивности была описана ранее для различных аналогов ацетиладенилата и ацетил-СоА-синтетазы.

Найденные константы ингибирования для аналогов сопоставимы с относительно низким сродством самого аденилата: ферментативный синтез карноэина из L-гистидина и р-аланиладенилата протекает с

-3

заметной скорость» при концентрации последнего 10 М, т.е. сравнимы с величинами Км 0-аланина и АТР. Активность аналогов амино-ациладенилатов в случае аминоацил-тРНК-синтетаз коррелировалась с высоким сродством промежуточных аденилатов, но активность разных еидов аналогов также находилась в интервале величин двух порядков концентраций. Таким образом, во всех этих случаях, включая карно-зин синтетазу, аналоги аденилатов скорее следовало рассматривать как мультисубстратные ингибиторы, аналоги промежуточных Соединении, но не как модели переходных состояний. Соответственно этому, аналоги 3-аланилфосфата значительно слабее тормозили активность карнозин синтетазы, чем аналоги 6-аланиладенилата, что также свидетельствовало и в пользу агенилатного пути биосинтеза карноэина.

Избирательность действия новых ингибиторов карнозин синтетазы была показана в экспериментах на аспарагин синтетазе из E.coll, для которой установлено промежуточное образование р-ас-партиладенилата в процессе активации аспартата. Аналоги р-аланил-аденилатов оказались на три порядка менее активны, чем соответствующие аналоги аспартиладенилата, которые отличались наличием дополнительной В-карбоксильной группы (Жуков Ю.Н. и др., 19881.

Таким образом, в ходе настоящей работы получены первые избирательные ингибиторы карнозин синтетазы и подтвержден аденилатный механизм активации 0-аланина ферментом из грудных мышц цыплят.

рассмотренные выше аналоги й-аланиладенилата и 8-аланилфос-4>ата химически принадлежат к замещенным аминоалкилфосфонатам, а входящий в состав соединения ^Vl) 13-аминоэтилфосфонат (цилиатин) является прямым фосфоаналогом ¡5-аланина. Использование соединении со связью С-P позволило решить задачу получения стабильных анало-

ГОВ неустойчивых промежуточных соединения, возникающих пр.< *(■() ментативном синтезе карнозина. Кроме того, таким образом удаугс* сохранить основные фрагменты молекулы субстрата, придавая аналогам одновременно устойчивость в метаболических превращениях. По этому казалось естественный использовать этот же подход в случае гистидина и карнозина и получить их фосфорорганические ана/.оп*. что и обсуждается-в следувиих_разделах.

СИНТЕЗ ФОСФОНИСТЫХ И ФОСФОНОВЫХ АНАЛОГОВ ГИСТИДИНА И КАРН03И:)А

Этот раздел посвяшен новым аналогам питидина и карнозина, для которых характерным является наличие кислотных фосфонисгого и фосфонового фрагментов вместо карбоксильной группы. .

О О

: II

Интерес к фосфорорганическим аналогам аминокислот и пептидов

значит, не являются чуждыми для жиных сисіем структурами), і., являсь прямыми аналогами амииокарбомовмх кислот, они облилиы комплексом сходных с последними свойств, часто «вляптся .?$фем. рами ферментов ме.аболизма аминокислот и служат ис, .'чин* <>м ,і<

О Н-Р-011

н

І-Ашшо-2-имидазолил-этилфосфонмстая кислота 1Н1в-Рн)

К

На~( р-Аланил )-1-амино-2-ииидазоли/1-зтилфосфонистая кислота (Саг-Рц)

О

О

Н0Л

н

1~Аммно-2-иммдазолил-зтмлфосфоноваа кислота (НІБ-Р)

На*( р-Аланил )-1-амино-2-мймлааолил-зтилфосфоновая кислота І Саг -Iі)

Н

вызван тем, что некоторые из этих соединения найдены в прирспе (и

икстй с разнообразной физиологической активностью.

По аналогии, для фосфоаналогов гистидина можно было ожидать определенного сродства к соответствующим ферментам, устойчивости

з гистидин декарбоксилазной реакции, сохранения реакционноспособ-нссти аминогруппы (способность участвовать в ферментативных превращениях, характерных для аминогруппы гистидина, например, образование пептидной связи с 0-аланином) и возможности влияния фос-фофрагмента на ферментативные превращения в радикале аналога.

В фосфоанадогах карнозина сохранялись элементы структуры последнего, 'пределяющие его индивидуальность и биологическую активность, за исключением фосфофрагмента, который отличается сте-рическиии параметрами от НООС-группы и в случае Саг-Р является двухосновным. При этом существенным представлялась ожидаемая устойчивость аналогов к действию карноэиназы, гистидин-специфичес-кой металл-эависимой карбоксилептидазы, аналогично тому, что наблюдалось в случае карбоксилептидазы А и других пептидов с С-кон-цевоя фосфонатной функцией.

К настоящему времени разработаны методы синтеза аминофосфо-натов и соответствующих пептидов, которые позволили получить многочисленные аналоги аминокислот, в том числе белковых и природных, а такжо фосфопептиды самого разнообразного состава, строения и биологической активности. Тем не менее, до последнего времени фосфоновыя аналог гистидина оставался неизвестен, существующие методы оказались непригодными для его получения и лишь недавно, когда настоящая работа в своей основе была, завершена, был опубли-

ТИ

кован 14— стадийный синтез с суммарным выходом 3,4* ¡МеггеЬ 7,.У. еЬ.а!., 1988). Таким образом, з задачу настоящего исследования

входило не только получение неизвестного Н1з-Рн, но и разработка нового синтеза Н1в-Р, который сделал бы это вещество практически доступным. Это являлось необходимым условием реализации второй задачи - получение также неизвестных фосфоаналогов карнозина (Саг-Рн и Саг-Р). '

Синтезу аминофосфонистых кислот и их производных посвящено всего несколько работ. До конца 70^ годов единственной а-аминофос Фонистоя .;ислотой со свободной, аминогруппой являлся аналог глицина, полученный аминированием хлорметилфосфонистой кислоты. Одна ко, палая доступность других а-галоидалкилфосфонистых кислот ог

раничмвала возможности этого способа.

Известные сегодня общие методы получения а-аминофосфонистых кислот исходят из карбонильных соединений, которые дгумя разными путями превращаются в искомые вещества. По одному из них альдегид превращает в основание Шиффа с бензгидриламином, которое после взаимодействия_с фосфорноватистой кислотой и удалением ^-зашиты дает фосфонистый аналог аминокислоты (Вау Иг Е.К., е^а1т ,1984): -

О + о

Ж” -Ü-.

\ ОН \ он

нн нн„

>С=Н-СН(С6Н5»2 ♦ н3Р0/ Uc6H5>2

Во втором синтезе полученный из альдегида оксим в одну стадию превращается и аминофосфонистую кислоту в результате взаимодействия с фосфорноватистой кислотой (Хомутов P.M. л Осипова Т.И., 1976):

>С"НОИ HjP02

Одностаді/якості., мягкие условия проведения реакции, исключении операций уг.алення зашиты (и притом в жестких условиях) определили гшбор оксимного варианта получения фосфонистого аналога гистидина. Одновременно предполагалось получить информации об исобенностях и возможностях этой )всем не изученной реакции.

Исходным соединением в синтезе HiS-PH ДОЛЖЕН быть имидазо-*чл/*сусныа альдегид, однпхо удалось обнаружить единственную ра-'OTV . о 11 ; - ияающуо получение аналитических количеств гидразона имидазолилэтаналя ( Каре lier-Ad 1er R., &. FlsLcùer H., 1959}; ни сам альдегид, ни его оксим описаны не были.

оксим имидазолилуксусного альдегида удалось получить окисле-гк‘ргч г.'.дирода ь іірнсутс'івии ьолъгрпчата мат-г' ..•>. , ’, ¡ірохпдііла достаточно гладко, причем и ми да. дьнсс яд-

>С-

нн,

н

ок

о

5.

ро, чувствительное к перекисям, в этих условиях не затрагивалось. Одностадийность процесса и доступность исходного гистамина позволили получить оксии в препаративных количествах:

н2н-сн2-си2-

н

WbW ,

40 X

нон»сн-сн

н

Гп

Hiy-W-H

н

Реакция альдоксимов с фос$орноватистоя кислотой проводилась в разных условиях несколькими авторами и приводила к различным продуктам: .

Соотношение реагентов < оксмм/к-та)

Условия

H-CH-i'

I ОН НОНН

R-CH-!

Продукты

sOH

Ссылки

(А»

(В)

t

10

Кипящий спирт,

1 час.

Кмаяший спирт, •

1 час.

Без растворителя, 20°С, 24 <1С.

Без растворителя. 20°С, 24 час.

Kreutztamp N., et.al., 1969

Румянцева В.В. и др.. ¡969.

Хомутов P.M. 4 Осипова Т.Н., 1976

US Patent, 1984

Во всех случаях реакция подробно не изучалась, надежно установлено строение только аминофосфонистых кислот (В), тогда как ч случае кислот (А) отсутствовали какие-либо данные, подтверждающие предлагаемуг авторами структуру.

В настоящей работе получение Н1в~Рн проводилось нагреванием смеси оксима и кислоты (1:2) в спирте. Основным продуктом был Н1з-Рн, выделены также имидазолилацетонитрил, Н1в-Р и показано

образование фосфористой кислоты.

10 хГ

(— 20 *)

(~ 3-5 «)

Образование нитрилов характерно для альдоксимов в условиях реакции Бекмаиг., что в данном случае являлось побочным процессом, снижающим выхси продукта. Возникновение С-Р-связи происходило, вероятно, присоед>н«нием Н^РО^ по >ОИ'СВЯзи оксима, что соответствовало известным случаям присоединения Н}РС>2 по С=С-связям, карбонильной группе, иминам и гидразонам.

НчР09

В-СН=НОН -------“—*-

Й-С?н

Ч-я

Ч

о

-сн-^Н | ОН нн„

,н и

ч-

о

II 011 Й-СН-Р'

он

Промежуточным соединением при . этом являлась гидрокец^шино-кислота (А), восстановление которой до Нів-Рн 1В> могло проходить через эфир (Б), претерпевавший затем перегруппировку аналогично описанному (Мартынов И.В. и др., 19?в) восстановлению оксимов ди-алкилхлорфосфитами:

Другая возможность, прямое восстановление >Ы-0-группы фосфонова-тистой кислотой, по-видимому, протекает с большим трудом, поскольку О-замещенные оксимы превращались в аминофосфонистые кислоты лишь при длительном нагревании с Н3Р02. '

В соединении (А> фрагмент NH0H в кислых условиях выполняет окислительные функции (превращая, например. Н3Р02 в Н3Р03), а Р-Н фрагмент способен окисляться,’ что предполагало неустойчивость (А). Следовательно, для 1А> оказывалось возможным как превращение в (В», так и конкурентная трансформация в фосфонат * Г J, образование которого было трудно объяснить окислением (В) кислородом воздуха (реакция проводилась в атмосфере инертного газа). Можно было также представить возникновение (Г) как результат реакции Н3Р03 и оксима и затем превращение f Д) —-> * Г). однако Н3Р03 не реагировала с оксимами в различных условиях (в пользу такого объяснения возникновения фосфонтов свидетельствует и следовые их количества при реакции О-алкилоксимов с HjPOj). .

Создание препаративных ме.одов синтеза а-аминофосфонистых кислот (Хомутов P.M. & (Зсипова Т.И., 1978, Baylls Е.К., et.al., 1901) привело•к тому что, в 'яде случаев оправданным стало получение а-аминофосфонатов посредством окисления соответствующих а-аминофосфонитов: . ■

О

н3с

В

й ■ Н3С-; С2Н50-

Обычно используемые для этих целей окислители: Вг2 В КИСЛОЙ среде, НаС12, а также ^ в водной иодистоводородной кислоте приводили в случае Н1е-Рц к сложной смеси продуктов, в том числе и замешанных в имидазольном ядре, и низким выходам целевого Н1в-Р. Удобным методом получения последнего оказалось протекающее с практически количественным выходом окисление Н18-Рн действием 302С12 в ледяной уксусной кислоте: -------------------

о о

и НО и ..

Этот метод окисления может иметь общее значение для превращения а-аминофосфонистых кислот в а-амкнофосфоновые, что подтверждено синтезами Уа1-Р, В-А1а-А1а-Р и &-А1а-Н1в-Р.

Синтезы дипептидов с С-концевыми фосфоаналогами различных

НО

н

н

о и2нсн

о

I

1. А1 а,- Р||

ч 1. А1а-Р

2. НВг/АсОН

1.. НВг/АсОН

аминокислот подробно описаны в литературе, и показано, что в этом случае удовлетворительно работает большинство классических методов пептидной химии, причем зашита гидроксильных группы в фосфорной функции не всегда обязательна tKatarskl P., et.al., 1965). Конденсация Ь-оксисукцинимидного эфира N-Cbz-&-Ala с Н1б-Рн с по следующим удалением Cbz-группы действием НВг в ледяной уксусной кислоте приводит к целевому Саг-Рн с выходом 58*. Car-Р получен аналоги но Саг-Рн из His-P и Н-оксисукцинимидного эфира N-Cbz-р-А1а, а также встречным синтезом - окислением Car-Р 302С12 в уксусной кислоте подобно синтезу Hlfi-р из Н1б-Рн. В-А1а-А1а-Рн .и fl-Ala-Ala-Р получены по схеме, описанной для Саг-Рн и Саг-Р.

АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ФОСФОАНАЛОГОВ КАРНОЗИНА И ГИСТИДИНА

Одной из вахных и достаточно универсальных функций карнози-на является его способность выступать в качестве ловушки свободных радикалов и препятствовать тем самым перекисному окислению липидов или повреждении ДНК IKohen R. et.al., 19вв). Перекисное окисление жирных кислот является удобной моделью, позволяющей изучать антиоксидантные свойства карнозина и его производных In vitro.

В даннной работе фосфоаналоги гистидина и карнозина были исследованы в 2,2-аэобисиэобутиронитрил-зависимом окислении линоле-вой кислоты. Было найдено, что, подобно карнозину, Саг-Р^ и Саг-Р способны ингибировать перекисное окисление линолевой кислоты. Напротив, 0-А1а-А1а-Р также, как А1а-Рн и З-Ala-Ala-P^, практически не тормозят окисления линолевой кислоты в аналогичных условиях, что свидетельствует о незначительном вкладе Р-Н фрагмента в антиоксидантную активность фосфонист"* аналогов гистидина и карнозина, действие которых обусловлено, в основном, наличием имидаэоль-ного Фрагмента; - •

Фосфоаналоги карнозина были также исследованы ив модельной реакции Си+2-аскорбатзависимого окисления 2*-дезоксигуанозина в условиях, аналогичных описанным для карнозина. Оказалось, что Саг-Р и Car-Pfj действует подобно самому карнозину и полностью подавляют образование 2'-дезокси-6-оксигуаноэина при соотношении Си+^ - -осфоак-лог “ 1:10. Для. карнозина подобный эффект объяснялся образованием с ионами меди прочного комплекса, который в

Рис.1. ВЭЯСХ разделение продуктов медь-аскорбат зависимого окисления 2'-деэоксигуанозина. А - 1 иМ раствор 2'-дезоксигуанозина в воде; Б - 1 шМ раствор 2'-дезоксигуанозина в воде, содержащий аскорбиновую кислоту іконц. 1 иМ) и сульфат меди (конц. 0,1 шМ); В - то же в присутствии карнозина (конц. 1 тМ); Г - то же в присутствии Саг-Рн (конц. 1 шМ).

отличие от свобсдных ионов меди был неактивен в качестве инициатора перекисного окисления, фосфоаналоги Саг-Рн и Car-Р действовали подобно природному дипептиду, что свидетельствовало в пользу значительной устойчивости соответствующих комплексов.

+2

Fe -Аскорбат-зависимое окисление фрагментов саркоплаэмати-чеекого ретикулума является моделью, на которой защитные свойства карнозина такжз исследованы достаточно подробно (Дупин А.М., 19861. Фосфоанэ.логи карнозина и гистидина были активны и в этой системе’1. Эффективность действия "аг-Р и Саг-Р^ была несколько 'ниже, чем у карнозина, а отличия межау фосфоновым и фосфонистым аналогами hr были высажены (Рис.2А). Аналогичные соотношения в активностях наблюдались и в ряду His - Hls-P - Hls-P^ <Рис.2Б). Таким образом, замена карбоксильной группы карнозина и гистидина на фосфор-содержашй фрагмент существенно не сказывается на его способности тормозить перекисное окисление липидов во фрагментах саркоплчзматического ретикулума кро^.'ка.

’ 'ссрмсстно г к.О.н. А.М.Нулиным, Кафедра Биохимии Биофака МГУ.

Рис .2. Ингибирование Ре -аскорбат зависимого перекисиого окисления фрагментов саркоплазматического ретикулума кролика. 1-окисление суспензии мембран саркоплазматического ретикулума (контроль); 2-то же в присутствии Саг-Рн; 3-то жв в присутствии Саг-Р;

4-то же в присутствии карнозина; 5-то же в присутствии Нів-Р^; б-

то же в присутствии гистидина; 7-то же в присутствии Ніа-Р; в-то же в присутствии гистамина. Все соединения в концентрации 20 тМ.

Фотохимические повреждения нуклеиновых кислот, в том числе и протекавшие через триплетное возбужденное состояние (время жизни

Рис.3. Фотохимическое восстановление ур&цила і 10 (10 М). А - УФ~облучение урацила (10 * М) в воде;

-3

М) №Н2Р02 то ^ в

-1

присутствии ЮМ №Н2Р02; В - то же в присутствии 10 М НаН2Р02

и ЗЛО'2 М 1-карноэина.

Б

* —.Л ’

10-10 сек.) пиримидиновых оснований, также как и свободнорадикальные, могут приводить к комплексу нежелательных для организма последствий. Однако, карноэин никогда не раса .тривался в качестве ингибитора подобных фотохимических превращений. Недавно нани била обнаружена новая реакция фотохимического восстановления 2,4--дикетопиримидинов солями фосфорноватистой кислоты^ которая проходит в водных растворах через триплетное возбужденное состояние (Яковлев Д.Ю. и др., 1991). Оказалось, что карноэин в концентрации 5.10“2 М ингибирует восстановление С5-С6 двойной связ. , но не влияет на конкурирующую реакцию фотогидратации урацила, проходящую через синглетное возбужденное состояние (Рис.З)'1.

“'совместно с к.х.к. Д.Ю.Яковлевым, ИМБ им.В.А.Энгельгардта, РАН.

. ВЫВОДЫ

1. Синтезирован набор неописанных ранее аналогов В-аланиладени-лата и 0-аланилфосфата, в том числе и 5'-аденоэиновыя эфир а-ке-то-7-аминопрогмлфосфоновоя кислоты - новый тип аналогов амино-аииладенилатоЕ.

2. Показано, -¡то новые аналоги промежуточных соединений избирательно тормозят карноэин синтетаэу, превосходя по активности известные ингибиторы фермента. Ингибитор>ый анализ синтетаэной реакции позволил получить информацию з пользу аденилатного пути активации В-аланина.

3. Осуществлен синтез 2-имидазолил-1-аминоэтилфосфонистой кислоты, неизвестного ранее аналога гистидина и показана близость ряда

его сгойств природной аминокислоте.

4. Найден способ превращения аминофосфонистых кислот в аминофос-фоновые, что впервые позволило получить 1-амино-2-ииидазолилэтил-фосфоновую кислоту в препаративных количестввах.

3. Рассмотрены возможные пути превращения оксимов в реакции с фосфорноватистой кислотой.

6. Получены неизвестные ранее фосфоновые и фосфонистые аналоги карнозииа, способные, подобно природному дипептиду, тормозить реакции свободно-радикального окисления 2'-дезоксигуанозина, линоле-воя кислоты и фрагментов саркоплазматического ретикулума кролика.

Оснаднре содержание Eftgaxtj атваязна 6. СЛедущвд публикациях;

1. А.Р.Хомутов. Ингибирование карнозин синтетазы из грудных мышц цыплят аналогами промежуточных соединений. // Тезисы докладов VIII Конференции молодых ученых "Синтез и исследование биоло-гически-активных соединения“. Рига. 1984. С. 101.

2. А.Р.Хомутов, С.Е,Северин. Ингибирование карнозин синтета-эы аналогами промежуточных соединений. // Тезисы докладов VIII Симпозиума биохимических обществ СССР и ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии". Рига-. 1983. С. 148.V

3. А.Р.Хомутов, С.Е.Северин. Новые ингибиторы карнозин син-

тетазы. // Тезисы докладов V Всесоюзного биохимического съезда. Киев. 1986. Т. 2. С. 68-6$. '

4. А.Р.Хомутов. Новые ингибиторы карнозин синтетазы ка основе аналогов В-аланиладенилата и р-аланилфосфата. // Биоорганичес-кая химия. 1989. Т.13. No 3. С. 827-633.

3. А.Р.Хомутов. Синтез фосфонистых и фосфоновых аналогов гистидина и карнозина. // Биоорганическая химия. 1990. Т.18. No 9

С. 1290-1293.