Имидазолсодержащие пептиды, их структурные аналоги и производные гемина в качестве антиоксидантов и моделей пероксидаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

РГ6 од

Рожкова Клена Анатольевна

"ИМИДАЗОЛ СОДЕРЖАЩИЕ ПЕПТИДЫ, ИХ СТРУКТУРНЫЕ АНАЛОГИ И ПРОИЗВОДНЫЕ ГЕМИН А В КАЧЕСТВЕ АНТИОКСИДАНТОВ И МОДЕЛЕЙ

ПЕРОКСИДАЗ".

02. 00. 10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Апторефераг

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии тонких органических соединений Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: член-корреспондент Российской АН,

доктор химических наук, профессор Евстигнеева Р.П.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Жданов Р.И.,

кандидат химических наук Сидорова М.В.

Ведущая организация: Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

" 7О " часов на заседании дисертационн , , ; Московской

государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (117571, Москва, пр. Вернадского, д. 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии ( 119831, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1).

Защита диссертации состоится

1997 г. в

Автореферат разослан 0^4 ^_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, к. х. н., с. н. с.

Лютик А.И.

общая харатсгкрисгика работы

Актуальность проблемы. Процессы, связанные с токсическим воздействием кислорода на клетку и метаболизмом его активных форм, не перестают привлекать внимание ученых. Особую важность приобретают зги исследования в наши дни, ког да неблагоприятная экологическая обстановка (загрязнения солями тяжелых металлов, оксидами азота, радиационными отходами), прессовые ситуации провоцируют возникновение различных опасных клеточных патологий, связанных с понреждающим действием скободно-радикадьных форм кислорода. Среди эндогенных детоксицирующих факторов в настоящее время достаточно интенсивно изучаются ферментативные системы, представленные металлопротеинами супероксид-дисмутазой, каталазой и пероксидазами. С другой стороны, известны низкомолекулярные гидрофильные антиоксиданты пептидной природы ряда карнозина (Р-Ак-И-Пэ), интерес к которым постоянно растет, а биологическая роль этих соединений на сегодняшний день является предметом дискуссий. На протяжении многих лег считалось, что приоритетная роль в защите клетки 01 окисления принадлежит ферментативным системам, а "вюрая линия защиты" отводилась пизкомолскулярным соединениям. Однако уже сегодня можно сказать, что обе системы важны и представляют собой взаимодополняющие звенья общей схемы защиты организма. Кроме того, в основе работы активных центров ферментов кислородной детоксикашш и пептидных антиокеидантов ряда карнозина могут лежать сходные по механизму взаимодействия переходных металлов с злектроподонорными аминокислотными заместителями, а мегаллокомплексы пептидов и их производных из данного семейства представляют интерес в качестве моделей металлсодержащих кластеров негемовых металлопротеинов. Поэтому синтез молекулярных систем на основе имндазолсодержащих пептидов, их топохимичсских аналогов и производных, содержащих объемные заместители (мсталлопорфирины, жирные кислоты) с целыо моделирования природных процессов, связанных с метаболизмом свободно-радикальных форм кислорода, имеет большой научный и практический интерес.

Целью работы явилось получение новых топохимических аналогов ряда карнозина (в том числе декарбоксилированных, липофильных, содержащих различные гетероциклические заместители) для изучения взаимосвязи между структурой и функцией, исследование полученных соединений в модельных

системах свободно-радикального перекисного окисления - липидов и непосредственного взаимодействия с гидроперекисями, а также синтез пептидных производных на основе протогемина IX, изучение их физико-химических свойств и исследование полученных моделей в каталитических реакциях окисления органических субстратов гидроперекисями.

Научная новизна и практическая ценность. Осуществлен синтез ряда новых аналогов карнозина, модифицированных по Ы- и С- концам. Показана принципиальная возможность взаимодействия карнозина и карцинина с гидроперекисями полиненасыщенных жирных кислот. Выявлена антиоксидантная активность карцинина. В ряду производных карнозина и карцинина обнаружены новые более эффективные антиоксиданты. Показана взаимосвязь природы Ы-ацильного заместителя и антиоксидантных свойств в ряду карнозина, карцинина и их структурных аналогов.

Получены моно- и бис-С-аминоацильные производные протогемина IX, содержащие электронодонорные заместители в пептидной цепи. Современными физико-химическими методами проведены исследования строения координационного узла железопорфирин-гистидин и электронной конфигурации железа в комплексе. Показана пероксидазная активность полученных гем-пептидов и их солюбилизированных форм, а также их высокая устойчивость к воздействию гидроперекисей. Впервые показана пероксидазная активность Аг§-содержащих безгистидиновых геминпентидов и их селективность в отношении органических просгранственно затрудненных гидроперекисей. Методами молекулярной механики предсказаны наиболее стабильные конформации геминпептидных комплексов. Показано влияние природы аминокислотных спейсеров на информационную подвижность, физико-химические и каталитические свойства геминпептидов.

Подходы, использованные в настоящей работе для конструирования аналогов карнозина, могут быть использованы для создания новых

•I .

высокоэффективных антиоксидантов пептидной природа. Вещества, полученные в ходе исследования, перспективны в качестве потенциальных фармакологических препаратов.

Описанные в работе пептидные производные гемина представляют научный интерес в качестве моделей для выяснения тонкого влияния инвариантных аминокислотных последовательностей в активном центре гемовых белков на

ферментативную активность. Полученные соединения могут быть использованы в качестве высокоэффективных и селективных, катализаторов реакций окисления для нужд современной химической технологии, медицины, а также найти применение при создании биосенсоров.

Публикации. Результаты работы отражены в 8 статьях, 2 авторских заявках и 10 тезисах Международных и Всероссийских конференций.

Адробацшь Результаты работы докладывались на Международной конференции но биокоординационной химии, 1994 г., г. Иваново; на Международной конференции по химии и свойствам порфиринов. 1995 г., г. Санкт-Петербург; на Международной конференции "Peroxidase Biotechnology and Application", 1995, г. Пущино-на-Оке; на V Международной конференции по биологически активным пептидам "Conformation activity in peptides: relationships and interactions", 1996, Капри, Италия; на IV международной конференции "Plant peroxidases: Biotechnology and physiology", 1996, г. Вена,. Австрия; на III и IV международных конференциях "Наукоемкие химические технологии" в 1995 г. (г. Тверь) и 1996 г. (г. Волгоград); на Юбилейной научной сессии, посвященной 100-лешю проф. Н.А. Преображенского, 1996 г.. г. Москва, на Международной конференции Chemistry of metals in biological systems, 1997, г. Томар, Португалия, a также на Международной конференции "Peroxidase Biotechnology and Application", 1997г., Санкт-Петербург.

Содержание работы. Диссертация изложена на __стр. и состоит из

введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Диссертация содержит YB _рисунков и ^ таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. СИНТЕЗ ИМИДАЗОЛСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ, ИХ СТРУКТУРНЫХ АНАЛОГОВ И ПРОИЗВОДНЫХ ГТМИНА.

Карнозин (р-аланил-гисгидин) присутствует в значительных концентрациях в различных органах и тканях человека и животных. Антиоксидантные свойства являются одной из наиболее важных и универсальных функций карнозина и некоторых его аналогов, что, по-видимому, и определяет, разнообразные

фармакологические эффекты этого ряда. Вместе с тем, биологическая роль карнозина продолжает быть предметом дискуссий, а его функции на молекулярном уровне привлекают пристальное внимание.

В качестве объектов исследования в данной работе были выбраны карнозин (1), его природные аналоги карцинин - ß-аланил-гистамин (ß-Ala-HA) (II) и N-ацетил карнозин (III), ряд их N- и С- производных, а также триптамин- (-ТгрА)- и серотонин-(-5-НТ)- содержащие производные (X-XII). Кроме того, карнозин и его аналоги были использованы в качестве ковалентносвязанных лигандов при создании координационных комплексов на основе гемина.

Синтезированные пептиды и аналоги ряда карнозина.

Х,-Х2

Таблица 1.

№ X, Х2

соединения

1 H-ß-Ala- -HisOH

11 H-ß-Ala- -HA

Ш СНзСО- ß-Ala- -HisOH

IV СНз(СН2)<СО- -HisOMe

V СНз(СН2)юСО- -HisOMe

VI СНз(СШ)1бСО- -HisOMe

VII СНз(СН2)4СО- -HA

VIII CH,(CH2)ioCO- -HA

IX СНз(СН2)|«СО- -HA

X СНз(СН2)тСО- -TrpA

XI СН_,(С1Ь)юСО- -5-HT

XII СНз(СН2)юСО- -5-0(BzI)TrpA

XIII Boc-ß-Ala- -HisOMe

XIV Boc-Leu- -HisOMe

XV H-Leu- -HisOMe

1.1. Синтез гистидинсодержаших пептидов ряда карнозина.

- -К- настоящему- времени - -опубликовано—несколько- способов получения синтетического карнозина.

Среди них известны методы, основанные на М-ацилировании свободного гистидина в водно-органических средах в присутствии оснований активированными производными Ы-замещенного р-А1а. Существенным недостатком этих подходов является опасность рацемизации гистидинового остатка в водно-шелочной среде. Кроме этого, при выделении конечного продукта

возникают значительные трудности с отделением солей. Другая 1руппа синтезов включает способы, основанные на ацилировании метилового эфира гистидина" в органической среде М-замещенными производными Р-аланина, активированными по карбоксильной группе. Преимуществом ->тих способов является проведение реакции в органической среде, что облегчает образование пептидной связи и выделение продукта. В то же время подобные схемы отличаются многостадийностыо и невысокими выходами.

Схема 2.

Схема синтеза 1 и III.

Р-А1а

Вос-

Воо-Вос-

Вос—

2 ТЯА ЯР Н —

Ас—

■ОН

■ ОСОоЕ! О^и

Н-

-ОН

•он

-он - он -он

Нами был использован иной способ синтеза (схема 2), основанный на ацилировании свободного гистидина чрехкратным избытком М-оксисукцишшщцюго эфира Ы-трет.-бутилоксихарбонил-р-аланина в водно-органической среде. Существенным отличием данного подхода от известных методов являегея отсутствие основания, чго позволяет избежать возможность рацемизации и ацилирования имидазольного остатка гистидина. Применение в качестве альтернативного "ацилирующего агента смешанного ангидрида Вос-Р-аланина требовало 4-5 кратных избытков карбоксильной компоненты. Кроме того, неустойчивость смешанного ангидрида приводила к плохой воспроизводимости результатов.

Активированный Ы-оксисукцинимидный эфир Вос-р-аланина получали через смешанный ангидрид карбоксильного компонента в хлористом метилене в присутствии органического основания. В результате сравнения метилового, изобутилового и этилового эфиров хлоругольной кислоты предпочтение было

отдано этилхлорформиату, применение которого приводило к наиболее высоко!» выходу целевого продукта (93%) но сравнению с метилхлорформиатом (43%) изобутшгоюрформиатом (30%). Выбор N-оксисукцинимидного эфира бы обусловлен его устойчивостью к условиям ацилирования в водно-органическо среде и хорошей растворимостью в воде выделяющегося в процессе создани пептидной связи N-гидроксисукцинимида. Выделение свободного пептида из ег трифторацетата с одновременной очисткой проводилось в безводном этаноле изоэлектрической точке карнозина при рН 8.1 в присутствии органическог основания. Дополнительно карнозин был очищен переосаждением из вод! этиловым спиртом с выходом 66%.

Для получения N-ацетил-карнозина (111), который был впервые выделен и природных источников, ранее был описан метод, заключающийся i ацетилировании свободного карнозина уксусным ангидридом в уксусной кислоте < последующей очисткой ионообменной хроматографией с применением водноп пиридина и дальнейшим переосаждением из органических растворителей < выходом 38%. Однако авторами были приведены не все необходимые физико-химические характеристики этого соединения, в частности, отсутствовал!; значение угола оптического вращения, данные ИК- и ЯМР- спектроскопии.

В качестве реагента для введения ацетильной группы нами был выбран п-нитрофенилацетат (схема 2) - реагент, применяемый в химии белка. N-ацетил-карнозин был получен взаимодействием свободного карнозина с п-нитрофенилацетатом в водном диоксане с последующей очисткой целевого продукта флэш-хроматографией на силикагеле. п-Нитрофенол отделяли элюцией смесью хлороформ-метанол 8:2 до полного исчезновения окрашенных фракций, целевой продукт элюировали системой растворителей хлороформ- метанол- 25% водный аммиак 3:3:1. Выход (Ш) составил около 46%, считая на исходный карнозин, продукт был полностью охарактеризован физико-химическими методами.

По методикам, разработанным в нашей лаборатории, был синтезирован также декарбоксилированный аналог карнозина - карцинин (Н-(}-А1а-НА) (II). Выход и физико-химические характеристики соответствовали литературным.

Среди топохимических аналогов карнозина нами был получен метиловый эфир N-трет.-бутидоксикарбонил-р-аланил-гнстидина (XIII), представляющий собой карнозин с защищенными амино- и карбоксильной группами. Синтез

данного соединения осуществлялся путем ацилирования метилового эфира гистндина в диметилформамйде пентафторфениловым эфиром Вос-[5-А1а, полученным дициклогексилкарбодиимидным методом. Выход целевого продукта составил 50%.

Кроме того, нами были синтезированы лейщшеодержащие аналоги карнозина - Вос-Ьеи-ШвОМе (XIV) и Н-Ьеи-ШвОМс (XV), более гидрофобные по сравнению с Вос-р-А1а-ЬПЮМе и Н-р-А1а-Н1.чОН. Для синтеза (XIV; была использована известная методика, а для выделения соответствующего аналога со свободной аминогруппой (XV) применялся метод ионообменной хроматографии, ранее успешно использованный для выделения свободного основания (II) из соответствующей соли. С этой целью 2ТРА Ьеи-ЖэОМе, наносили на колонку с аиионитом АРА-8п в ОН -форме и элюировали 60% водным метанолом. Выход целевого продукта составил 45%.

1.2. Синтез производных, содержащих остатки жирных кис пот.

Известно, что пептиды и аминокислоты, модифицированные остатками жирных кислот, проявляют такие виды биологической активности, как противомикробная, ростспшулирующая, противовирусная. Их ошосят к экологически безопасным новерхносшо-аюивным соединениям. В последнее время значительный интерес исследователей проявляется к липоаминам - новому классу биорегуляторов. Кроме того, известно, что некоторые биогенные амины способны модулировать процесс перекисного окисления лппндов (ПОЛ). В ходе данной работы нами были синтезированы липофильные аналои карнозина и карцинина (1У-ХИ), представляющие собой Ы-ацильные производные метилового эфира гистидина или биогенных аминов (гисгамина, триптамина и серотонина). Длина остатка жирной пасышешгой кислоты варьировалась от С<, до Сщ.

Для активации карбоксильной группы жирной кислоты нами был использован хлорангидридный метод. Свободное основание метилового эфира гистидина или амина ацилировали хлораншдридом жирной кислоты в присутствии триэтиламииа в безводном диметилформамиде. Гндроксильиая функция серотонина была защищена бензильной группой, которая в дальнейшем отщеплялась гидрированием над палладием на угле. Выделение данных соединений осложнено их амфифильностью, что особенно характерно для

производных лауриновой кислоты (V, VIII, X-XIII). Для каждого конкретного соединения нами были подобраны свои условия выделения конечного продукта. Так, гексаноильные производные гистамина (VII) и метилового эфира гистидина (IV) удалось очистить переосаждением из ацетона при рН 9. Вследствие практически количественного протекания реакции по гистамину при получении (VII) очистка целевого вещества была упрощена и проводилась без применения колоночной хроматографии. Лауроилтриптамин (X) осаждали водным раствором бикарбоната натрия из диметилформамида. Во всех остальных случаях был использован метод колоночной хроматографии на силикагеле в хлороформ-метааольных системах растворителей. Выходы липофильных производных аминов и метилового эфира гистидина составили 56-98%.

Синтезированные соединения были охарактеризованы данными ТСХ, ИК-спектроскопии, масс-спектромеггрии, элементного анализа, 'Н-ЯМР (в том числе 'Н-ЯМР спектроскопии двойного резонанса).

исследований, проводимых на кафедре ХТТОС МИТХТ им. Ломоносова. Несмотря на то, что основные подходы при получении данных соединений к настоящему времени достаточно хорошо разработаны, препаративное получение геминпептидов, а также синтез ранее неописанных объектов до сих пор представляет значительную проблему.

В качестве объектов синтеза нами были выбраны как moho-, так и бис-С-аминоацильные производные гемина, содержащие короткие пептидные фрагменты

1.3. Синтез пептидных производных протогемина IX

Синтез пептидных производных протогемина IX является продолжением

(XVI-XIX).

Схема 3.

Строение синтезированных геминпептидов.

" (XVIII) R,=-ОН (-LeuHisOMe)

(XVI) R,--OH (-pAlaHisOMe)

R2= (-OH) -pAlaHisOMe (XVII) R-pRj» -pAlaHisOMe

R2= (-OH) -LeuHisOMe (XIX) R,=R2= -LeuHisOMe

В случае геминпептидов (ГП) (XVI) и (XVII) основный остаток гистидина был присоединен к иропионовокислым фрагментам порфирина через линейные атшиновые спейееры, тогда как в (XVIII) и (XIX) остаток р-А1а был заменен на более гидрофобный и короткий лейцин.

Таблица 2.

Аналитические данные для геминпептидов.

№ соединения Электронный спектр, (£ 10 ■*), UM* ИК-спектр, КВг, V, см-' масс-cncKjp. m/¿

vyi tлт (CiC. ОЧ yiui^ ITJi. yyo.uj, 503 (7.26), 535 (плечо), 575 (плечо), 625 (3.76) плечо), 1640 (амид I), 1550 (амид II) ГЛ Л1+ Oln

XVII 360 (плечо), 409.5 (98.9), 535 (8.73), 560 (плечо) 3260 (N14, ш.с.), 1738 (СО сл. эфир), 1650 (амид I). 1540 (амид 11) [M]+ 1060.2

XVIII 355 (плечо). 407.3 (125), 498 (7.81), 530 (плечо). 575 (3.72), 627 (4) 3200 (ЫН), 1750 (СО сл. эфир), 1650 (амид I). 1550 (амид II) [M]+ 881

XIX 360 (плечо), 409.5 (101), 495 (6.47), 533 (6.53), 560 (плечо), 525 (2.55) 3300 (N1-1, ш.с.), 5 730 (СО сл. эфир), 1640 (амид I), 1540 (амид П) [MJ+ 1145

* спектры соединений XVI, XVII peí нсгриропали в ДМСО, XVIII, XIX - в смеси хлороформ-меганол

Синтез С-аминоацильных производных протогемнна IX осуществлялся с применением классических методов пептидной химии в растворе (схема 4). Соединения (XVI) и (XVII) были синтезированы впервые. Активация карбоксильной труппы гемина осуществлялась путем превращения в N1-оксисукнинимидный эфир ОСС-методом. Для образования моно-6(7)-К1-оксисукцинимидных эфиров применяли концентрационное разбавление.

Поскольку задача моделирования требует однозначной корреляции между структурой и функцией модели, отработка препаративных методов получения химически индивидуальных веществ приобретает особое значение. Гак. ГП (XVIII), полученный но известным методикам, был очищен модифицированным способом, включающим препаративную ТСХ на Клевере! 60 в, что позволило полностью отделить целевой продукт от побочного и определить структуру последнего. С помощью масс-спектрометрии, электронной и ИК- спектроскопии, а также методом ТСХ на окиси алюминия, было показано, что побочный продукт

представляет собой бис- аналог (XIX), хроматографическая подвижность которого близка к таковой для соединения (XVIII) в описанных ранее хроматографических системах. Структура соединения (XIX) была также подтверждена направленным синтезом. Вышеупомянутые физико-химические методы были использованы для характеристики всех синтезированных геминпептидов (табл.2).

Схема 4.

Синтез гемин-пептидов.

XVIXVI»

-1!-А1а-НкОМе (XVI,XVII) -1.ои-Н«ОМе (XVIII. XIX)

СОЯ, СОЙ,

и. изучение лнтиоксидлнтных СВОЙСТВ КАРНОЗИНА,

карцинина и родственных соединений.

Предполагается, что разнообразные фармакологические эффекты карнозина связаны с его антиоксидантнымн свойствами. Перекисное окислеиис нолинеиасышениых жирных кислот являекя удобной моделью для изучения антиокислителыюй активности карнозина и родственных соединений.

В данной работе карнозин и аналоги были исследованы в модельной системе Ре2+-аскорбатзависимого окисления мицеллярного раствора линолевой кислоты, что позволяет определять прямой суммарный антиоксидантный эффект in vitro. Антиоксидантную активность определяли путем измерения уровня малонового диальдегида по реакции с тиобарбатуровой кислотой (ТБК). В таблице 3 приведены антиоксидантные эффекты исследуемых соединений как разность между уровнем ТБК-реактивных продуктов в присутствии исследуемого вещества и контрольной инкубацией. Впервые был показан ангиоксидантнмй эффект карцинина и выявлен ряд новых эффективных модуляторов ПОЛ в ряду аналогов карнозина (табл.3).

К настоящему времени достаточно хорошо изучена способность переходных металлов, входящих в активные центры металлопротеидов, к модуляции ПОЛ. Так, Fe-+-гемоглобин (НЬ) может образовывать с липидными гидроперекисями систему с обратной положительной связью, в результате чего генерируются гндрокенльные радикалы, разрушающие как белок, так и липид. Мы использовали систему гемоглобин/гидроперекись линолевой кислоты (НЬЛХЮП) в качестве модели для изучения способности карнозина и его аналогов выступать в качестве ловушки гидроксильных радикалов. Влияние карнозина, карцинина и родственных соединений на окисление липосом из фосфатидидхолина (ФХ), индуцированное Hb/LOOH, так же представлено в таб.3.

Среди механизмов антиоксидантного действия различают как свойства, направленные непосредственно на ингибирование окисления, так и способность к утилизации продуктов окисления. Карнозин и карцинин были исследованы в реакциях непосредственного взаимодействия с гидроперекисями жирных кислот и в свободном состоянии, и в составе модельных ФХ липосом. Гидроперекись

Таблица 3.

Влияние карнозина, карцинина и родственных соединений на перекисное окисление липидов, инициированное системами Ре2+-аскорбат и гидроперекись линолевой кислоты/гемоглобин (ЬООН/НЬ)."

Окисляемый субстрат № n/п, соединение, Ингибирование

концентрация ПОЛ,%

Линолевая кислота 1. ß-Ala-HA 25 мМ -47.0

(0.25 мг/мл)* 2. ß-Ala-His 25 мМ -59.0

3. имидазол 25 мМ -11.0

4. ß-Ala 25 мМ 0

5. HisOH 25 мМ +26.0

6. НА 25 мМ +32.0

7. ß-AIa 25 мМ+His 25 мМ +3.0

8. ß-Ala 25 мМ+НА 25 мМ + 15.0

9. N-Boc- ß-Ala-HisOMe 10 мМ -36.6

1 мМ -25.4

10. HisOMe 10 мМ -6.8

1 мМ -14.2

11. N-Hex-HA 10 мМ -32.8

1 мМ -24.6

12. N-Lau-HA 10 мМ -58.9

I мМ -52.5

I мкМ , -48.9

13. N-Lau-HisOMe 10 мМ -34.0

1 мМ -15.0

14. N-Lau-TrA 10 мМ -88.0

1 мМ -37.4

15. N45(OBzl)TA) 10 мМ -79.4

1 мМ -62.4

16. N-Lau-(5-HT) 10 мМ -67.4

1 мМ -48.2

ФХ липосомы 17. ß-Ala-HA 10 мМ -42.0

(1 ш/мл)» 18. НА 10 мМ +63.0

1 мкМ +45.0

19. ß-Ala-His 10 мМ -53.0

20. HisOH 10 мМ +48.0

ФХ липосомы 21. ß-Ala-HA 10 мМ -37.0

(1 мг/мл)* 22. ß-Ala-His 10 мМ -52.0

23. НАШмМ -03.0

24. His 10 мМ -09.0

в качестве инициатора ""f.миия использовали 'систему FV/аскорбиновая кислота, ♦♦гемоглобин/гидроперекись линолевой кислоты. Линолевую кислоту окисляли в течение 35-120 минут, липосомы - в течение 60 минут. Ингибирование отмечено знаком -, активация +.

СНз(СН2)4СО- = Hex-; СНз(СН2)юСО- = Lau-,

линолевой кислоты была получена ферментативным методом по известным методикам. Линолевую кислоту окисляли в токе кислорода препаратом липоксигеназы-9, выделенной из клубней картофеля методом фракционного

# Соединения №-№ 1 -X и 17-24 исследованы совместно с к.б.н. Бабижаевым М.А. (Институт глазных болезней им. Г.Гельмголъца, Москва).

высаливания. Целевую г идроперекись выделяли колоночной хроматографией на силикагеле. Методами иодометрического титрования, ТСХ, а также спектрофотометрически были получены новые данные об антиоксидантных свойствах карнозина и карцинина, связанных с 1гх способностью прямого взаимодействия как с водно-органическими растворами гидроперекисей жирных кислот, так и с гидроперекисями в составе липндного бислоя. Ипгибирование атиоксидантной активности карнозина и его аналогов сильным хелагируюшим агентом, например ЭДТА, а также литературные данные о строении и свойствах металлических комплексов имндазолсодержатцих коротких пептидов, позволяют предположить, что "псевдопероксидазная" активность карнозина, карцинина и их аналогов связана с их способностью образовывать хелаты с переходными металлами.

На основании изучения структурно-функциональных закономерностей в ряду аналогов карнозина можно заключить, что увеличение липофильности Ы-ацилыюго заместителя, а также элиминирование первичной аминофункции могут

быть использованы при конструировании имидазолсодсржащих антиоксидантоп с более высокой активностью. Несомненное преимущество мягких имидазолсодсржащих янтиоксидантов но сравнению с жирорастворимыми включается в проявлении ими протекторного действия прошв свободнорадикального окисления как в липидной фазе биомембран (фосфолипидных липосом), так и в водном растворе.

Ш. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ С МОДЕЛЬНЫМИ ГЕМИНПЕПТИДАМИ.

Коньюгаты металлопорфиринов с пептидами, способные мимикрировать свойства природных ферментативных систем, являются удобными объектами как

для изучения взаимосвязи между структурой и функцией в гемопрогендах, гак и для создания новых каталитических систем для современной химической технологии, медицины, цито- и иммунохимии.

В рамках данной работы было предложено исследовать ГП (ХУ1-ХХ! V) в качестве моделей активных центров гемовых пероксидаз.

(XVI) и-р -ОН (-р-МаШгЮМе)

(-0Н)-р-А1аН|50Мё

(XVII) -р-АШвОМе (XVII!) -ОН (-ГеиН|50Ме)

Я2= (-ОН)-1еиН|зОМе

(XIX) РЦ=Р!2= -(-СиН^ОМе

(XX) Я1--ОН(-ивиН15МНС10Н20СООМе)

("ОН) -|_еиН|$ШС10Н20СООМе

(XXI) -ОН (-А,А2АтдА4А5ОМе) Н2= ("ОН) -А1А2АгдА4А5ОМе

(XXII) -ОН (-АгдА2 7АгдА9А10ОМе) Я2= (-ОН) -АгдА2.7АгдАдА10ОМе

(XXIII) И-р -ОН (-|_еи1.е1Л/а1РЬеОМе) Яг= (-ОН) -|_еи1_е1Л/а1Р>1еОМе

(XXIV) Ир!^ -ОН

А1 алифатические аминокислоты

В качестве доноров электронов для восстановления гидроперекисей (трет.-бутилгидроперекись, перекись водорода) в реакциях, катализируемых ГП, были использованы восстановленные пиридшшуклеотиды (ЫАО-Н, ЫАЭР-Н). Относительная пероксидазная активность предложенных соединений оценивалась спектрофотомеггрически по начальной скорости окисления МАО(Р)-Н при Хтах = 339 им (рис. 1)."

Нами была выявлена пероксидазная активность соединений (XVI. XVIII, ХХ-ХХ11), представляющих собой пентакоординационные комплексы железа. Интересен факт проявления. пероксидазной активности соединением (XVII), представляющим собой бис-производное гемина, содержащее два остатка гистидина, способные к координации с железом. В отличие от него, соединение (XIX), в котором остатки Р-А1а были заменены на более гидрофобные и короткие лейциновые спейсеры. искомой активности не проявило. Впервые в качестве моделей активных центров гемовых пероксидаз были предложены безгистидиновые ГП (ХХ1-ХХП), в которых роль экстралиганда может выполнять основный остаток аргинина, выявлена их способность катализировать пероксидазные реакции. При этом А^-содержашие геминпептиды проявили селективность в отношении органической трет.-бутилгидроперекиси (ТБГ), тогда как в присутствии Н2О2 наблюдался только распад порфиринового макроцикла.

# Совместно с к.б.н. Лыско А.И. (Институт Фармакологии РАМН, Москва).

Пероксидазный цикл представляет собой ряд последовательных реакций.

При измерении зависимости скорости пероксидазной реакции от концентрации

н'минпешидов и от концентрации ГБГ при постоянной концентрации ЫАО-Н

оказалось, что начальная скорость реакции удовлетворяла уравнению:

(З^ЛО-ЬПо . ,

- --— = ОДП! ]о-[Т БГ ]о

Линейный характер зависимости скорости реакции от концешранип субстратов позволил определить константы скорости второго порядка к; для данных геминнен гидон (гиб т. 4).

Поглощение, отн. ед.

ни

Рисунок I. Спек фальные изменения, обусловленные протеканием пероксидазной реакции, катализируемой ГП (XVIII).

Реакция инициировалась подачей Г'П. Концентрации: N А ОН 10 1 \1. треч.-бутидгилроперекись 910 1 М. ГП 25-10».Среда: ДМС0 7-КИ М-кшин-фосфатный буфер 20мМ,рН 7.4, при 25°С.

В процессе пероксидазной реакции наблюдается разложение ГП вследствие атаки порфириниво; и матфоннтога птдрокенльнымн радикалами, образующимися и процессе гемолитического распада гидроперекиси. Относительная устойчивость ГП к воздействию гидроперекисей оценивалась спсктрофотометрически по снижению поглощения в области полосы Соре (рис.2).

Поглощений, отн-

Л, км

Рисунок 2. Спектральные изменения, обусловленные распадом гема под воздействием трет.-бутилгидроперекиси.

Концентрации: трет.-бугилгидроперекись 910 " М, ГП (XVIII) 25-10 '. Среда: ДМСО 7-102 М-калий-фосфатиый буфер 20 мМ. рН 7.4, при 25° С.

Таблица 4.

Константы скорости пероксидазной реакции (кг) и распада геминпептидов под воздействием трет.-бутилгидроперекиси (к[) для соединений (ХУ1-ХУ1П, XX-XXIV).

Соединение к2, М-'-сек-1 кь сек-'/КН

XVI 11.9+0.8 ].54±0.08

XVII 5.9+0.3 0.91+0.04

XVIII 17.3±1.7 0.90±0.02

XIX 0 0

XX 6.2±1.0 -

XXI 7.1 ±0.3 0.62±0.02

XXII 45.0±4.3 1.56±0.06

ххш 0 - - --0--

XXIV 0 26.03±1.78

При сравнительном изучении устойчивости ГП к действию ТБГ (табл. 4) удалось выяснить, что пептидный фрагмент способен защищать иорфириновый макроцикл от свободно-радикального разрушения. При этом протекторные свойства возрастают с увеличением липофильности аминокислот. Введение остатка жирной кислоты приводило к повышению устойчивости ГП при одновременном снижении его активности. Устойчивость предложенных ГП

превышает таковую для микропероксидазы 9 из цптохрома С приблизительно на 2 порядка при практически равной активности.

С целью получения водорастворимых форм геминпеитидов. а гак же для моделирования гидрофобного окружения гема нами была проведена их солюбилизация с применением полиэтилснгликоля (PEG). Полученные коныогаты так же проявили пероксидазнуго активностъ аналогичную таковой да я растворов геминпеитидов в смеси ДМСО-калий-фосфатный буфер при более высокой устойчивости в отношении гидроперекисей. Изменения в электронных спектрах солюбплтированпых гемттептидоп (?.ЦЫч 412 нм, полоса Соре) позволяют сделать предположение о том, что PEG может выступать в качестве макролигапда за счет взаимодействия его атомов кислорода с железом гема.

IV. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННОЙ КОНФИГУРАЦИИ АТОМА ЖЕЛЕЗА И СТРОЕНИЯ КООРДИНАЦИОННОГО УЗЛА ЖЕЛЕЗОПОРФИРИН-ЭЛЕКТРОНОДОНОРНЫЙ АМИНОКИСЛОТНЫЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬ.

Электронная конфигурация атома железа является одной из характеристик, отражающей взаимное влияние лигандов в природных мекгчлопорфиринах и их синтетических моделях. Эта характеристика непосредственно связана с природой лигандов. конформациен молекулы и определяет каталитические свойс/ва геминпептидов. С целью выяснения взаимосвязи между структурой и функцией модельные геминпептиды были изучены методами электронной и ЭПР спектроскопии (табл. 5). * Было установлено, что моно-С-аминоацилъные комплексы (XVI, XVIII ) преимущественно высокоспиновые, тогда как их бис-С-аминоацильные (XVII, XIX) аналоги находятся преимущественно в низкоспиновом состоянии. Arg-содержащий комплекс (XXI) - высокоспиновый.

Мы проведи анализ наиболее важных конформаций гистидинсодержащих комплексов (XVi-XIX) методом молекулярной механики на PC Penthium 100. Оптимизацию геометрии молекул проводили по Polak-Ribiere сопряженно-градиеитному алгоритму. Критерием остановки расчета был градиент энергии менее чем 0.01 ккал/моль. Результаты расчетов представлены в табл. 6. Минимум энергий для комплексов (XVI) и (XVI11) соответствует "куполообразной" (так называемой domain) конформацин, в которой порфириновый макроцикл выгнут основанием в

# Электронные и ЭПР спектры, а гакже комт.ю|срные расчеты выполнены k i.ii. Немыкиныч В.Н. (ИОНХ им. В.И. Вернадекою, Киев)

сторону выведенного из плоскости иона железа (рис. 3). Минимуму энергии дл комплексов (XVII) и (XIX) соответствует "рифленая" (ruffled) конформация, которой мезоатомы порфиринового макроцикла находятся попарно над и по, плоскостью, образованной пиррольными фрагментами. Интересно, что разниц энергий между "рифленой" и плоской конформациями в случае комплекса (XVII составляет лишь 3.68 ккал/моль, что позволяет предположить наличие равновеси между плоскими и "рифлеными" конформерами. Таким образом, длина пептидно цепи играет важную роль в стабилизации той или иной конформации. В наше; случае наличие р-аланинового фрагмента привело к удлинению пептидной цепи увеличению ее конформационной подвижности, что отражается в стабилизаци плоских или близких к плоским конформаций порфириновых циклов.

Таблица

Данные электронной и Э1 IP спектроскопии геминпептидных комплексов.

соединение Данные ЭСП Параметры ЭПР спектров*

Растворитель А., пш

XVI ДМСО 402, 503, 535 (плечо), 575 (плечо), 625 6, 2 (S=5/2) 4.2,2 (S=3/2)

XVII ДМСО 409.5, 535, 560 (плечо) 6, 2(S=5/2) 4.2, 2 (S=3/2) 2.92. 2.29. 1.55 (S=l/2)

XVIII ДМСО ДМСО/N-MeIm 407.3, 498, 530 (гигечо), 575,627 415, 536, 561 (плечо), 659 6, 2 (S=5/2) 4.2, 2 (S=3/2)

XIX ДМСО 409.5, 495, 533, 560 (плечо), 625 6, 2(S=5/2) 4.2, 2(S=3/2) 2.91, 2.3, 1.58 (S=l/2)

XXI ДМСО ДМСО/N-MeIm 405, 498, 535 (плечо), 611,621 414, 535, 563 (плечо) 5.57, 2.13 (s=5/2)

Замороженные растворы. 77К, N-Melm - N-метилимидазол.

Данные расчетов конформаций геминпептидов находятся в корреляции с их физико-химическими свойствами. Так, если в случае моно- и бис- производных (XVI) и (XVII), содержащих гибкий р - аланииовый спейсер, значения

коэффициентов экстинкции е Ю -1 (Лтах 402, 409.5 им, полоса Соре) практически равны, то в случае лейцинсодержащих геминпетидов нопощсние плоскою (XVIII) значительно превышает таковое для "рифленого" (XIX), табл.2. Данные наблюдения позволяют предположить, что неожиданная каталитическая активность соединения (XIX). содержащего два остатка гистидина. способных к координации с железом тема, связана со его значительной конформационной подвижностью. Вероятно, молекула способна принимать конформаиии, при которых возможно взаимодействие с 1 идроперскнсью.

Таблица 6.

Значения потенциальной энергии конформаций комплексов Х\'1-Х1Х, расчитаиныч методом молекулярной механики.

Комплекс Конформаиия* Энергия, ккал/моль

XVI р/к -16.26/-48.62

XVII р/пл -27.23/-23.55

XVIII р/к -18.4/-38.08

XIX р/пл -42.62/-25.01

* р - "рифленая", к - "куполообразная", пл - плоско-планарпая.

Рисунок 3. Геометрия, соответствующая минимуму энергии для геминпептндов XVIII (слева) и XIX (справа), оптимизированная методами молекулярной механики.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез ряда аналогов и производных карнозина и карцинина, в том числе' декарбоксилированных, липофильных, содержащих различные гетероциклические заместители.

2. Впервые показана антиоксидантная активность карцинина и возможность прямого взаимодействия карнозина и карцинина с липидными гидроперекисями.

3. Выявлены новые эффективные антиоксидантны в ряду синтезированных аналогов карнозина в Ре2+-зависимых системах окисления in vitro. На основе анализа взаимосвязи между структурой и функцией новых и ранее описанных аналогов карнозина определены элементы структуры и конформации, способствующие проявлению антиоксидантной активности в данном ряду.

4. Осуществлен синтез гистидинсодержащих геминпептидов. Подобраны условия их солюбилизации с применением PEG.

5. Изучена каталитическая активность геминпептидов в реакциях окисления NADH (NADFH) гидроперекисями. Впервые показана пероксидазная активность His- и Arg-содержащих геминпептидов.

6. Методами электронной и ЭПР спектроскопии показано, что моно-С аминоаципьные His- и Arg- содержащие производные протогемина IX преимущественно высокоспиновые системы, тогда как их бис- аналоги -низкоспиновые.

7. Методами молекулярной механики предсказаны наиболее стабильные конформации геминпептидных комплексов. Показана корреляция между коеформацией, физико-химическими свойствами и каталитической активностью геминпептидов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Евстигнеева Р.П., Жслтухина Г.А., Агеева Е.А., Бабижаев М.А.1/ Липопе-роксидазная активность карнозина и карцинина. - ДАН 1993.- Т. 333, №1.- С. 104106 [Doklady Biochemistry.- 1993.- V. 333. (Engl. Ed.)].

2. M.A. Babizhayev, M.-C. Seguin, J. Gueyne, R.P. Evstigneeva, E. A. Ageyeva (Rozhkova), G.A. Zheltukhina.// L-Carnosine (p-alanyl-L-histidine) and carcinine (P-alanylhistamine) act as natural antioxidants with hydroxyl-radical-scavenging and lipide-peroxidase activities.- Biochem. J.- 1994- V. 304.- P. 509-516.

3. Евстигнеева Р.П., Кубатиев A.A., Ткаченко С.Б., Рожкова Е.А., Желтухи-на Г.А.// Новыеимидазолсодержашие ннгнбигоры катепсин G-индунированной агрегации тромбоцитов,- ДАН,- 1995,- Т. 340, №2,- С. 260-262 [DokJady Biochemistry- 1995,- V. 340 (№ 1-3).- P. 7-9. (Engl. Ed.)].

4. Евстигнеева Р.П., Рожкова H.A., Желтухина Г. А., Лыско А.И.// Г'еминпептидм, проявляющие псроксидазную активность.- ДАН,- 1995,- Т. 342, №3,- С. 407-409 ¡Doklady Biochemistry.- 1995,- V. 342 (№ 1-6).- P. 69-7! (Engl. Ed.)].

5. Евстигнеева Р. П., Желтухина Г. А., Рожкова Е. А., Григорьев Д. Н.// Взаимосвязь природы Х-адилынмо заместителя, копформацни молекулы и ангмокси-дантных свойств в ряду карнозина, карцинина и их структурных аналогов. ДАН.-1996.- Т. 349, № 5,- С. 694-697.

6. R. А. Рожкова, С. А. Огрель, Д. Н. Григорьев, В. Е. Небольсин, Г. А. Желтухина, Р. 11. Евстигнеева.// Взаимосвязь между конформацией и антиоксида-нтными свойствами в ряду топохимических аналогов карнозина и карцинина с различными N-ацильными заместителями.- Биоорганическая химия.- 1996.- Т. 22, № 10-11,- С. 838-845 [Russian Journal of Bioorganic Chemistry.- 1996,- V. 22, .No 11,- P. 732-738 (Engl. Hd.)].

7. Babizhayev MA., Ycrmakova V.N., Sakina N.L., Evstigneeva R.P., Rozhkova E.A., Zheltukhina O.A.// N-Acetylcarnosine is a prodrug of L-carnosine in ophtalmir application as antioxidant.- Clinica Chimica Acta.- 1996.- V. 254.- P. 1-21.

8. Евстигнеева P.I I., Рожкова H.A., Немыкии B.H., Воронов O.A., Желтухина Г.А.// Ненланарные искажения порфиринового макроцикла С-аминоацильных производных прогогемина IX,- ДАН,- 1997,- Т. 356, № 5.

9. Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е., Огрель С.А., Рожкова Е.А.!! М-ацильиыс производные биогенных аминов - модуляторы перекисного окисления липидов и способ их получения,- Положительное решение от 24.01.96 г. по авт. заявке № 94033267 от 12.09.94 г.

10. Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Кубатиев A.A., Рожкова Е.А., Ткаченко С.Б.// Имидазолсодержашие ингибиторы катепсин G-индуцированной aiperaunn тромбоцитов. Положительное решение oi 11.11.96 г. по авт. заявке Хз 94037136 от 30. 09.94 г.

11. Лыско А.И., Рожкова Е.А., Желтухина ¡'.А., Евстигнеева Р.П.// Моно-С-аминоацильные производные протогемина IX, проявляющие пероксидазную активность.- Тезисы докладов I международной конференции по биокоординационной химии.- 20-22 декабря 1994 г.- Иваново, Россия.- С. 69.

12. Рожкова Е.А., Лыско А.И., Желтухина Г.А., Евстигнеева Р.П.// Модели гемовых пероксидаз на основе пептидных производных протогемина IX.- Тезисы

докладов VII международной конференции по химии порфиринов и их аналогов.-20-23 июня (995 г.- г. Санкт-Петербург, Россия,- С. 99.

13. Lysko А.1., Rozhkova Е.А., Zheltukhina G.A., Evstigneeva R.P.// Hemin-pe-ptide exibiting peroxidase-like activity.- International workshop on peroxidase biotechnology and application.- 26-30 June 1995.- Pushchino, Russia.- P. 68.

14. Желтухина Г.А., Небольсин B.E., Рожкова E.A., Кудрявцев И.А.. Евстигнеева Р.П.// Новые ингибиторы ферментов в каскаде арахидоновой кислоты,- III международной конференция "Наукоемкие химические технологии".- 11-15 сентября 1995 г.- г. Тверь, Россия,- С. 100.

15. Е. A. Rozhkova, S. A. Ogrel, D. N. Grigoriev, V. Е. Nebolsin. G. A. Zheltukhina, R. P. Evstigneeva.// Structure-functional relationships in the row of peptide and pseudopeptide carnosine-carcinine analogues.- 5th Naples workshop on bioactive peptides "Conformation activity in peptides:relationships and interactions".- May 1996. Capry, Italy.-Pi 124.

16. E.A. Rozhkova, A.I. Lysko, G.A. Zheltukchina, R.P. Evstigneeva.// Influence of aminoacid surrounding of heme on peroxidase models activity and stability.- IV International symposium "Plant peroxidases, biochemistry and physiology".- July 6-10 1996.-Vienna, Austria.- PA 9.

17. E.A. Рожкова, B.E. Небольсин, Д.Н. Григорьев, Г.А. Желтухина, Р. П. Евстигнеева.// Взаимосвязь между структурой и функцией в ряду антиоксидантов псевдопептидной природы.- Юбилейная научная сессия, посвященная 100-летию Н.А. Преображенского.- 21-22 октября 1996,- Москва. С. 61.

18. Е.А. Рожкова, С.А. Воронов, Г.А. Желтухина, Р.П. Евстигнеева.// Синтез модельных геминпептидов и изучение их физико-химических свойств.- Юбилейная научная сессия, посвященная 100-летию Н.А. Преображенского.- 21-22 октября 1996,- Москва. С. 64.

19. E.A. Rozhkova, V.N. Nemykin, G.A. Zheltukhina, R.P. Evstigneeva, S.V. Volkov.// Synthesis, electronic and ESR spectroscopy of protohemine IX C-aminoacyl derivatives as hemoproteins models.- European research conference "Chemistry of metals in biological systems".- May 7th-l 1th 1997.- Tomar, Portugal.- P.35

20. E.A. Rozhkova, Nemykin V.N., Voronov S.A., Zheltukhina, Evstigneeva R.P., Volkov S.V J/ Synthesis and properties of peroxidase active site models.- International Workshop "Peroxidase Biotechnology and Application".- June 25th-29th 1997,- St.-Petersburg, Russia.- P. 16.