Синтез и структурно-функциональные исследования в ряду производных гемина, обладающих антимикробной активностью

Окороченков, Сергей Александрович

Синтез и структурно-функциональные исследования в ряду производных гемина, обладающих антимикробной активностью тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Окороченков, Сергей Александрович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез и структурно-функциональные исследования в ряду производных гемина, обладающих антимикробной активностью»

Автореферат диссертации на тему "Синтез и структурно-функциональные исследования в ряду производных гемина, обладающих антимикробной активностью"

005005609

ОКОРОЧЕНКОВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Синтез н структурно-функциональные исследования в ряду производных гемина, обладающих антимикробной активностью

02.00.10- Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

- 8 ДЕК 2011

Москва 2011

005005609

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Желтухина Галина Александровна доктор химических наук, профессор Степанов Александр Евгеньевич доктор биологических наук, профессор Борисевич Сергей Владимирович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства

здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 26 декабря 2011 г. в 13.00 ч на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.mon.gov.ru

Автореферат разослан 25 ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкое распространение инфекционных заболеваний и развитие резистентности к существующим антибиотикам определяет актуальность поиска новых антимикробных агентов среди различных классов соединений, в том числе среди синтетических производных природного метаплопорфирина - гемипа (ПГ).Несмотря на наличие некоторой антибактериальной активности, применение самого гемина ограничивается его токсичностью in vitro и in vivo, нерастворимостью в воде, недостаточной эффективностью и кратковременностью действия.

Одним из путей оптимизации свойств и повышения антимикробной активности гемина является ковалентное связывание его пропионовокислых остатков с аминокислотами и пептидами. Согласно литературным данным, такая модификация может повышать водорастворимость биологически активных веществ и снижать их токсичность.

В настоящее время антимикробные пептиды (АМП) рассматриваются как перспективный класс новых антибиотиков. Основными препятствиями к применению АМП в клинической практике является их сравнительно высокая стоимость, чуствительность к действию протеолитических ферментов, а также присущий многим АМП гемолитический эффект. Предпринятая в настоящей работе конъюгация двух антибактериальных агентов -гемина и антимикробных пептидов - могла бы привести к повышению антимикробной активности, водорастворимости и устойчивости к протеолизу, а также к снижению токсичности конъюгата.

Таким образом, является актуальным синтез аминокислотных и пептидных ПГ и исследование их антибактериальной активности против опасных для человека штаммов грамположительных, грамотрицательных бактерий и микроскопических грибов, в том числе резистентных, а также структурно-функциональные исследования в ряду ПГ.

Настоящая работа посвящена решению вышеназванных задач и является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС МИТХТ им М.В. Ломоносова по теме № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создания новых лекарственных препаратов» при финансовой и технической поддержке ООО «Фарминтерпрайсез» и АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» 2.1.1/2889.

Целью работы является создание новых антимикробных и противогрибковых агентов на основе конъюгатов гемина с пептидами, аминокислотами и их производными, выявление антимикробной активности и токсичности ПГ, изучение взаимосвязи между

\ \

структурой и активностью в ряду полученных соединений, исследование механизмов их действия.

Научная новизна. Осуществлен синтез ряда новых аминокислотных и пептидных производных гемина. Оптимизирована методика получения прекурсора ди-замещенных ПГ -ди-Ы-оксисукцинимидного эфира гемина. Разработан новый эффективный метод синтеза биологически активного пептида с аминокислотной последовательностью А^ИуДэр. Предложены оригинальные способы получения конъюгатов гемина со свободными аминокислотами и короткими разветвленными пептидами. Усовершенствованы способы конъюгации гемина с пептидами различной длины в растворе и на твердой фазе. Установлена низкая токсичность ряда синтезированных ПГ в отношении лейкоцитов и эритроцитов человека. Впервые продемонстрирована активность полученных соединений в отношении ряда патогенных микроскопических грибов, а также бактерий, в том числе резистентных. С помощью комплекса физико-химических и расчетных методов исследованы элементы механизма антибактериальной активности ПГ. Показано, что образование дефектов в липидной мембране является одним из важных элементов механизма действия ПГ.

Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения данной работы ПГ представляют практический интерес в качестве прототипов антибиотиков нового поколения. Ряд полученных ПГ обладает выраженным антимикробным действием, в том числе избирательным, против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Главное преимущество ПГ заключается в том, что они способны решить проблему резистентности к существующим противоинфекционным средствам. Для потенциального широкого применения ПГ в качестве лекарственных средств важной является простота структур ПГ и коммерческая доступность их прекурсоров. В этом отношении представляют особый интерес предложенные в данной работе препаративные способы получения ПГ и их синтонов. Предложен комплекс методов физико-химического скрининга ПГ, позволяющий выявлять наиболее активные вещества с оптимальным набором свойств. Полученные ПГ с противогрибковой и антибактериальной активностью могут быть использованы в научных исследованиях, медицине и сельском хозяйстве.

Положения, выносимые на защиту

1. Способы синтеза конъюгатов гемина с разветвленными пептидами и незащищенными аминокислотами.

2. Синтез аналогов антимикробных пептидов и их конъюгатов с гемином.

3. Усовершенствованные препаративные способы получения дп-]Ч-оксисукцинимидного эфира гемина и пептида 1ЮО.

4. Антимикробная активность ПГ, в том числе против резистентных патогенов, а также установление зависимости их биологической активности от структуры.

5. Комплекс расчетных и физико-химических методов для исследования механизма действия и прогнозирования водорастворимости и антимикробной активности ПГ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих российских научных журналах и 12 тезисов докладов на российских и международных конференциях и конгрессах. Получен 1 патент.

Апробация работы. Результаты диссертации были частично доложены на III Молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 2009), Международном симпозиуме Advanced Science in Organic Chemistry (Мисхор, Украина, 2010), V школе-конференции молодых ученых по биомедицинской химии (Регенсбург, Германия, 2010), X Международной конференции по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (Иваново, 2009), V и VII международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009 и 2011).

Структура ц объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 151 странице, содержит 29 рисунков, 1_3 схем и 12 таблиц. Список литературы включает 193 источника.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Синтез ПГ и исследования их антимикробной активности 1.1. Первоначальный скрининг антибактериальной активности ПГ

Ранее в нашей лаборатории были синтезированы многочисленные ди- и монозамещенные производные гемина (далее ПГ) (рис. 1) Отдельные представители аминокислотных ПГ продемонстрировали вирулицидное действие. Они оказались активными нуклеолитическими агентами, катализаторами окисления природных органических субстратов, а также проявили пероксидазную активность. Можно было прогнозировать, что перечисленные свойства могут обуславливать и антимикробное действие вышеуказанных соединений. С целью определения дальнейших направлений модификации, а также выявления структурных «мотивов», отвечающих за биологическую активность, нами проведено первоначальное исследование1 антибактериальной активности имеющихся в распоряжении известных ПГ с различными заместителями, в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

1 Антибактериальная активность ПГ была изучена в ИБХ РАН под руководством проф., д.б.н. A.B. Феофанова

Более выраженную антибактериальную активность против грамположительных бактерий по сравнению с немодифицированным гемином проявило большинство исследованных соединений, за исключением ПГ 3 и 6 (табл. 1). При этом наибольшую антибактериальную активность проявили дизамещенные производные гемина 1 и 2, содержащие остатки метиловых эфиров аргинина и серина, соответственно.

Ri(0)C (R2)

R,=R2= -ArgOMe R,=R2=-SerOMe R,=R2= -LeuHisOMe R,=R2= -ßAlaHA

R,= -OH, R2=-ArgArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH 5 R,= -OH, R2= -ArgTrpHisArgLeuLysGlu(OMe)OH 6

C(0)R2

(RO

Рисунок 1. Производные гемина, использованные для первоначального скрининга антибактериальной активности.

Исследования токсичности ПГ по отношению к компонентам крови, в частности лейкоцитам и эритроцитам, продемонстрировали, что все синтезированные ПГ обладают значительно меньшей токсичностью по сравнению с гемином, причем в большинстве случаев достигнуть ЭКШ не удалось.

Таблица 1. Антибактериальная активность соединений 1-6

Грамположительные бактерии

Грамотрицательные бактерии

Bacillus subtilis

Enterococcus Micrococcus Staphylococcus faecalis BKM B- luteus BKM Ac-aureus 209P 871 2230

Pseudomonas

МИК*, МБК**, МИК, МБК, МИК, МБК, МИК, МБК, МИК, МБК, МИК, МБК,

№ мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл

1 3,1 3,1 49,6 198,4 49,6 н/д* 1,6 6,2 н/д н/д 198,4 н/д

2 5,4 5,4 1,4 1,4 10,7 21,4 н/д 1,4 н/д н/д н/д н/д

3 н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д

4 46,2 92,3 92,3 н/д 184,6 н/д 5,8 23,1 н/д н/д н/д н/д

5 33,9 67,7 89,1 к/д 178,2 н/д 5,5 11,2 н/д н/д н/д н/д

6 71,5 141,2 Н/Д н/д н/д н/д 47,1 47,1 н/д н/д н/Д н/д

гемин 8,5 32,6 65,2 130,4 н/д н/д 8,2 16,3 Н/Д н/д н/д н/д

грамицидин D 4,3 4,3 23,5 94,1 0,8 11,9 0,8 0,8 Н/Д н/д н/Д н/д

*МИК, минимальная ингибирующая концентрация **МБК, минимальная бактерицидная концентрация ***н/д - МИК (МБК) не достигнута

Таким образом, первоначальное исследование антибактериальной

токсичности ПГ показало, что модификация гемина остатками производных их аналогов, а также пептидов является перспективной для дальнейшего качестве антимикробных агентов, так как позволяет получать соединения сравнимой и превосходящей таковую для известных антибиотиков.

активности и аминокислот и развития ПГ в с активностью

1.2. Синтез линейных б, 7-дизамещенных ПГ

1.2.1 Получение 6,7-ди-Ы-оксисукцинимидного эфира гемина - прекурсора дизамещенных ПГ

Первоочередными задачами настоящей работы явились выбор и оптимизация способа присоединения аминокомпонентов по двум пропионовокислым остаткам гемина. Согласно литературным данным, подобную конденсацию осуществляют с использованием карбодиимида, а также методов смешанных ангидридов или активированных эфиров. При этом последний оказался наиболее подходящим для получения ПГ, дизамещенных аминокислотами. В нашей лаборатории было показано, что оптимальным для получения 6,7-дизамещенных производных гемина является его 6,7-ди-Ы-оксисукцшшмидный эфир (Нет((Ж5и)2) (Схема 1).

Схема 1. Синтез 6,7-ди-1Ч-оксисукцин1Шидного эфира гемнна.

Однако, задача получения в препаративных количествах Нет(ОЫ8и)2, ие содержащего примесей моно-6(7)-Ы-оксисукцинимидного эфира, долгое время оставалась нерешенной. В настоящей работе проведен поиск оптимальных условий получения Неш(ОЫ8и)2. Оказалось, что при использовании в качестве растворителя смеси ОМИ с БМвО в соотношении 1:1, применении избытков ЭСС и НО.ЧБи, а также добавлении раствора ОСС в ОМЭО одной порцией при комнатной температуре, выход индивидуального Неш(ОЫ8и)2 составляет 90-95%.

1.2.2 Синтез производных гемина, замещенных по обоим пропионовокислым

остаткам.

Для изучения влияния состояния карбоксильной группы на антибактериальную активность нами с использованием Нет(ОЫ8и);> были синтезированы конъюгаты ПГ с производными аминокислот, в которых карбоксильная группа не была защищена или этерифицирована, или конвертирована в амидную функцию (Схема 2).

Основной задачей данного этапа исследования явилась разработка удобного способа получения дизамещенных производных гемина без хроматографического выделения получаемых продуктов.

С этой целью оказалось удачным использование 3-4-кратных избытков эфиров или амидов аминокомпонента, который вводился во взамодействие Нет(ОМ8и)1 в БМР Очистка нерастворимых в воде ПГ была успешно осуществлена без применения хроматографических методов, в то время, как водорастворимые ПГ очищались гель-фильтрацией на 5ерЬа(1ех Ш-20.

№ соединения 1

R № соединения R

ArgOMe 18 GlyOH

SerOMe 19 Glu(OH)OH

Arg(N02)0Me 20 SerOH

ArgNH2 21 p-AlaHisOH

HisOMe 22 HisOH

HA* 23 ArgOH

0-0 сГЧ

R о сг

"НА - остаток гмстамина **Е|31\1/вода или Triton В для соединений, содержащих свободную карбоксильную группу

NHCH2CH2OH

NHCH(CH2OH)2

NHCH(OH)CH2CH2OH

GlyOMe

GlyNH2

SerNH2

Схема 2. Синтез структурных аналогов соединений 1 и 2.

Основным препятствием при осуществлении присоединения незащищенных аминокислот к гемину является нерастворимость аминокислот в органических растворителях. Данную проблему нам удалось решить путем солюбилизации аминокислоты в диметилформамиде с применением катализатора межфазного переноса бензилтриметиламмония бромида (Схема 2). Однако при этом способе солюбилизации возникает проблема очистки целевого продукта от Тритона В, полное отделение которого возможно лишь с помощью колоночной хроматографии. Предпочтительным для получения ПГ такого строения оказалось применение триэтиламмониевых солей аминокислот, которые вводили во взаимодействие с 6,7-ди-М-оксисукцинимидным эфиром гемина, в среде РМИ, содержащего 7% воды. Для повышения выхода целевых продуктов нами применялись трехкратные избытки аминокислот. При этом реакции образования амидных связей протекали практически нацело в течение 20-30 мин. Полученные таким образом производные гемина (ПГ) 18-23 были выделены с высокими выходами.

Для изучения влияния гидроксильных групп на антибактериальную активность ПГ нами были синтезированы также разнообразные гидроксилсодержащие производные. В связи с этим следует отметить преимущество метода активированных эфиров перед другими методами активации для синтеза таких производных. Поскольку К-оксисукцинимидные эфиры обладают высокой селективностью в реакции ацилирования аминогруппы, а также сравнительно устойчивы к гидролизу и алкоголизу, в синтезе производных 2, 12, 13 и 14

оказалось возможным успешно применять аминокомпонепты с незащищенными гидроксильными группами.

1.2.3 Синтез ПГ с разветвленными пептидными заместителями

Одним из ключевых моментов в понимании взаимосвязи структуры и активности ПГ является количество и взаимное расположение одинаковых аминокислотных заместителей в молекуле ПГ. С этой целью представлялось целесообразным получение ПГ, модифицированных по пропионовокислым остаткам разветвленными пептидами (РПГ), содержащими по два остатка соответствующих аминокислот. В литературе в качестве аминокислот, удобных для создания «точек разветвления» приводится, в частности, глутаминовая кислота, которая и была использована нами.

Схема 3. Сннтез РПГ 26.

Поскольку при начальном скрининге наибольшую антимикробную активность проявили ПГ, содержащие аргинин, стратегия синтеза «разветвленного ПГ» была отработана нами на РПГ 26. Первая реализованная нами схема включала синтез защищенного разветвленного пептида, деблокирование его аминогруппы и присоединение к гемину (Схема 3). Наибольшая трудность при синтезе таким способом связана с отделением водорастворимого вещества 26 от непрореагировашего водорастворимого метилового эфира аргинина и низкий выход целевого продукта. В связи с этим нами была разработана новая схема получения РПГ. Удобным синтоном для получения конъюгатов гемина с разветвленными пептидами является ПГ 19, содержащее четыре карбоксильных группы, которые могут быть модифицированы остатками пептидов или аминокислот. По аналогии с Нет(0^и)2 был предпринят синтез тетра-М-оксисукцинимидного эфира 6,7-диглутамилгемина который мог бы быть удобным прекурсором для РПГ. Однако получить такой тетра-Ы-оксисукцинимидный эфир не удалось.

1. АгдОМе 2HCI,EtзN

АгдОМе МеОАгд

Более плодотворным оказалось присоединение метилового эфира аргинина к ПГ 19 в присутствии конденсирующего агента ТВТи (Схема 4). Как известно, при использовании ТВТи в качестве промежуточного соединения образуется М-оксибензотриазиловый эфир карбоксильного компонента.

№ соединения Я

CI- 26 АгдОМе

27 SerNH2

28 SerOMe

29 ArgNH2

оч 30 NHCH2CH2OH

Vr 31 GlyOMe

-> 32 GlyNH2

Схема 4. Синтез разветвленных производных гемина.

Подобные эфиры обладают высокой селективностью в отношении а-аминогруппы, что позволило использовать незащищенные по гидроксильным группам аминокомпоненты при синтезе соединений 27, 28 и 30.

Таким образом, нами были подобраны условия синтеза РПГ с использованием аминокислот с незащищенными боковыми функциями. Показана применимость конденсирующего агента TBTU для получения РПГ, при этом выходы целевых соединений 26-32 соединений составили 65%-78%.

1.2.4 Синтез конъюгатов гемина с незащищенными антимикробными пептидами различной длины

Ранее в нашей лаборатории было показано, что при синтезе монопептидных производных гемина его остаток в молекулу пептида удобно вводить действием о моно-6(7)-Ы-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира этого металлопорфирина (HemONb). Это соединение образуется при взаимодействии моно-6(7)-М-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида с гемином в присутствии DCC (Схема 5).

Для присоединения к гемину нами были выбраны следующие пептиды: коммерчески доступные пептидные антибиотики грамицидин S (далее GrS) и линейный пентадекапептид грамицидин D (далее GiD), антимикробный пептид [А1а5]-индолицидин, представляющий собой аналог природного АМП индолицидина; полученный на 2-хлортилхлоридном полимере пептид, соответствующий аминокислотной последовательности антимикробного пептид combi-1, а также трипептид Arg-Gly-Asp (RGD), аминокислотная последовательность

которого входит в состав антимикробных пептидов семейства цекропинов и фибронектина клеток млекопитающих.

Пептид [А1а5]-индолицидин был получен твердофазным методом по Ршос-стратегии на Ринк-амидном полимере и очищен с применением ВЭЖХ после отщепления от пептидилполимера действием ТРА с добавкой воды и триизопропилсилана в качестве скэвенджеров.

Схема 5. Синтез конъюгатов гемина с пептидами грамицидином S (34), [\\(л [пншлициппшм (36), грамицидином D (43) и combi-1 (46).

Конъюгаты [А1а5]-индолицидина и GrD были успешно получены действием HemONb на соответствующие пептиды в растворе. Синтезировать таким образом конъюгат гемина с GrS 34 не удалось, возможно, вследствие стерической затрудненности аминокомпонента. Соединение 34 удалось получить с применением активирующей системы ВосгО/пиридин.

Синтез конъюгата гемина с соответствующим аминокислотной последовательности combi-1 46 был осуществлен действием HemONb на синтезированный нами на 2-хлортритилхлоридном полимере пептид combi-1 с последующим отщеплением ПГ 46 20%-ным раствором TFA в дихлорметане.

Поскольку описанные методы получения пептида RGD являются довольно трудоёмкими, нами был предложен новый способ синтеза этого пептида (Схема 6), включающий наращивание пептидной цепи с N-конца и применение силильной защиты для глицина на стадии получения пептида ZArg(Z2)-GlyOH. По данной схеме RGD был получен с высоким выходом (71%) без применения хроматографических методов очистки. При синтезе

-VGAIAvVvWIXIWIW-NHCH2CH2OH, X=Val, Тгр или Туг

*GrS=cyclo(-Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro-)2

полистирольная матрица с 2-хлортритилхлоридной якорной группой

конъюгата RGD с гемином нами была применена новая стратегия синтеза моно-замещенных производных гемина.

Как известно, наличие триметилсилильной защиты на аминогруппе не препятствует ацилированию последней N-оксисукцинимидным эфиром карбоксильного компонента.

BSA

i) H-Gly-OH -TMS-Gly-OTMS

CH2CI2 27

1) этилхлорформиат, Et3N МеОН

Z-Arg(Z)2-OH-»- Z-Arg(Z)2-Gly-OTMS -— Z-Arg(Z)2-Gly-OH

2) TMS-Gly-OTMS „ ,„„„,,

38 (86%)

1) этилхлорформиат, Et3N

ii) Z-Arg(Z)2-Gly-OH ,„te4„fa-Z-Arg(Z)2-Gly-Asp(0'Bu)-0,Bu (98%)

2) H-AsplO'BuJ-O'Bu

1 ) 95% TFA

Hi) Z-ArgfZb-Gly-AspiO'BubO'Bu -H-Arg-Gly-Asp(OH)-OH (87%)

2) H2, Pd/C

BSA

¡V) H-Arg-Gly-Asp(OHbOH -TMS-Arg-Gly-Asp(OTMS)-OTMS

CH2CI2

1)Hem(ONSu)2

TMS-Arg-Gly-Asp(OTMS}-OTMS

2) MeOH

3) перераспределение между органической и водной фазой

Схема 6. Синтез пептида RGD и его конъюгата с гемином 41.

(54%)

СООН CO-Arg-Gly-Asp (-Arg-Gly-Asp) (-ОН)

Как известно, наличие триметилсилильной защиты на аминогруппе не препятствует ацилированию последней N-оксисукцинимидным эфиром карбоксильного компонента. Нами было сделано предположение о том, что если ввести в реакцию с Hem(ONSu)2 силилированный пептид 40, то вследствие высокой пространственной затрудненности силилированного аминокомпонента образование ПГ, дизамещенного остатком RGD, будет осложнено. Как следствие, можно ожидать, что основным продуктом реакции будет моно-замещенное ПГ 41. Это предположение подтвердилось экспериментально - в масс-спектре реакционной смеси стадии iv (Схема 6) не наблюдалось образования соответствующего дизамещенного производного гемина. Целевой продукт был выделен экстракцией 0.1 М раствором карбоната натрия.

Все синтезированные соединения охарактеризованы физико-химическими методами анализа, в частности, данными электронной и ИК-спектроскопии, а также масс-спектрометрии.

1.2.5 Исследование антимикробной активности ПГ и их токсичности в

отношении эритроцитов и лейкоцитов

В результате исследования антибактериальной активности ПГ in vitro против ряда резистентных штаммов оказалось, что наибольшим антибактериальным действием в отношении бактерий обладают ПГ, несущие суммарный положительный заряд2. Так, содержащие протонированный остаток гуанидина ПГ 9, 23, 26 и 29 подавляли рост резистентных штаммов в тех же концентрациях, что и антибиотик ванкомицин (табл. 2). При этом соединения 9, 26, и 29 проявили активность в отношении резистентных к ванкомицину штаммов грамположительных бактерий Ent. faecium 569 и грамотрицательных Е. coli 4300. Несодержащие ионизируемых групп ПГ 16 и 17 также проявили высокую антибактериальную активность. Кроме того, из табл. 2 видно, что токсичность и антибактериальная активность ПГ зависят от состояния С-концевой группы заместителя. ПГ, в которых карбоксильная группа амидирована, проявили в целом большую эффективность и широту действия, но и большую токсичность, нежели вещества, содержащие свободную или этерифицированную карбоксильную группу. В то же время, РПГ 29, содержащее 4 остатка амида аргинина, наряду с высокой антибактериальной активностью проявило умеренную гемолитическую активность и токсичность в отношении лейкоцитов. Кроме того, МПК большинства ПГ существенно ниже их токсических концентраций в отношении лейкоцитов и эритроцитов.

Интересной особенностью некоторых РПГ, не содержащих ионизируемых групп, является их избирательное действие в отношении ряда штаммов грамположительных бактерий. Так, соединение 27, не активное в отношении умеренно резистентных штаммов, ингибирует, хотя и в достаточно высоких концентрациях, ванкомицин-резистентный штамм Е. faecium 569. Соединение 30 в низких концентрациях ингибирует St. aureus 25923 и St. epidermis 533 и в более высоких E.faecalis 559, оставаясь неактивным в отношении St. aureus J00KC и Е. faecium 569. Поэтому разветвленные ПГ могут рассматриваться в качестве основы для дизайна избирательно действующих антибактериальных агентов.

Это важно в связи с тем, что в настоящее время рядом исследователей ведется поиск антимикробных агентов, селективных в отношении конкретных видов бактерий с целью избирательного уничтожения лишь патогенных бактерий, не затрагивающих нормальную бактериальную флору. Таким образом можно снизить риск дисбактериоза, представляющего собой побочный эффект большинства известных антибиотиков. Конъюгаты гемина с АМП и пептидом RGD продемонстрировали низкую активность в отношении резистентных штаммов (табл. 2).

" Антибактериальная активность ПГ в отношении резистентных штаммов была изучена НИИИНА под руководством в.н.с., д.м.н. Мирчинк Е.П.

Таблица 2. Антибактериальной активность и токсичности в отношении эритроцитов и лейкоцитов ПГ. Водорастворимые соединения отмечены знаком (*). Наиболее активные соединения выделены серым цветом

МПК , м кг/мл

ЭК|о", мкг/мл

St.

структура заместителя aureus aureus

St. epider

Ent. Ent. faecalis faecium E.coli

№ (соединения) 25923 loo кс m 533 559 569 4300 эритроциты лейкоциты

1 ArgOMe3'* 24,8 49,6 24,8 24,8 н/д н/д 64,0 н/д

2 SerOMe3 2 2 5,3 4,4 2,7 н/д н/д н/д н/д

8 Arg(NOi)OMe3 н/д" н/д н/д н/д н/д н/д 83,0 58,0

9 ÄrgNH23'» 1,0 2,4 0,4 1,2 2,9 39,1 58,0 53,0

10 HisOMe3 5,8 5,8 4,9 38,8 38,8 Н/Д н/д н/д

И НА34 н/д н/д н/д Н/Д н/д н/д н/д н/д

12 NHCH,CH,OH3 4,2 н/д 4,2 5,0 н/д н/д н/д н/д

13 nhch(ch2oh)23 н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д

14 NHCH(OH)(CH2)2OH3 н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д

15 GlyOMe3 19,5 Н/Д 19,5 Н/Д н/д н/д 78,6 н/д

16 gi>nh23 0,3 0,3 1,2 0,3 37,8 н/д 88,2 55,4

17 SerNH2s 0,7 0,4 1,3 21,0 21,0 н/д 56,8 37,6

18 Gl>OH3 2,1 10,0 5,0 н/д н/д н/д 98,0 41,0

19 Glu(OH)OH3 н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д 57,4

20 SeiOH3 10,5 4,4 2,6 н/д н/д н/д н/д 83,2

22 HisOH3 6,0 12,0 12,0 47,8 н/д н/д н/д н/д

23 ArgOH3'" 0,4 0,4 0,4 5,3 н/д н/д н/д 131,0

26 Glu(ArgOMe)ArgOMe3'* 1,2 2,3 1,2 1,2 9,4 н/д н/д н/д

27 Glu(SerNH2)SerNH23'* н/д н/д н/д н/д 70,6 н/д 149,0 н/д

28 Glu(SerOMe)SerOMev 71,6 71,6 71,6 71,6 н/д н/д н/д н/д

29 Glu(ArgNH2)ArgNH23'» 2,4 1Л 1,2 4,8 9,7 25,7 125,0 н/д

30 Glu(amet5)amet3 0,6 н/д 9,3 49,5 н/д н/д н/д н/д

31 Glu(GlyOMe)GlyOMe3 0,6 3,9 1,6 4,7 н/д н/д н/д н/д

32 Ghi(GlyNH2)GlyNH,3'* 17,5 17,5 17,5 17,5 н/д н/д 137,0 н/д

34 Hcm'(GrS )7 н/д Н/Д н/д н/д н/д н/д 66,0 н/д

GrS 0,5 2,0 0,5 8,0 8,2 н/д 11,2 7,5

36 Hem([5Ala]Ind)7 н/д Н/Д н/д Н/Д н/д н/д н/д н/д

[!Ala]Ind 11,1 8,1 2 2 29,1 14,3 н/д 18,1 25,4

40 ArgGlyAsp н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д

41 Hem(ArgGlyAsp)7 49,6 н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д

43 Hem(GrD)7 25,4 н/д н/д 10,7 8,4 н/д н/д 116,0

GrD 0,6 3,3 0,9 15,6 33,4 н/д 8,0 6,3

45 combi-1 н/д н/д - н/д н/д н/д н/д н/д Н/Д

46 Hem(combi-l)7 н/л н/д н/д н/д н/д н/д 138,0 121,0

Гемин Н/Д н/д Н/Д н/д н/д н/д 27 2 68,4

Ванкомицин 1,0 1,0 1,0 1,0 н/д н/д _9 -

'МПК, минимальная подавляющая концентрация; 2ЭКм, эффективная концентрация ПГ, при которой наблюдается лизис 10% эритроцитов (лейкоцитов); 3 заместитель в 6,7-дизамещеннном ПГ; 4ИА, остаток гистамина;

'ате1, остаток аминоэтанола;

6 Неш, остаток гемина;

7 структура 6(7)-монозамещенного ПГ

8 н/д, МПК (ЭКШ) не достигнута; 9-, исследование не проводилось

Заметная активность сохранилась лишь у ПГ 43, являющегося конъюгатом гемина с грамицидином D. При этом токсичность полученных конъюгатов оказалась существенно ниже, нежели у самих антимикробных пептидов. Полученные результаты, возможно, объясняются потерей последними в составе ПГ конформации, необходимой для проявления антимикробной активности.

Вместе с тем, частичное сохранение активности конъюгатом 43, наряду со снижением его токсичности в отношении клеток крови по сравнению с грамицидином D, позволяют предполагать, что модификация гемином АМП в ряде случаев может оказаться перспективной с точки зрения получения новых антимикробных агентов.

Нами была изучена антигрибковая активность производных гемина против патогенных для человека резистентных штаммов микроскопических грибов С. albicans, АТСС 14053, С. humicolus АТСС 9949, A. niger АТСС 16404, а также опасного для сельскохозяйственных растений гриба F. oxysporum VKM F-I40. Оказалось, что ПГ 1, 9 и 26 угнетали жизнедеятельность ряда штаммов с МПК 6,0-80 мкг/мл. Эти вещества обладают общей структурной особенностью, а именно, содержат положительно заряженные остатки аргинина, а также являются водорастворимыми. Обнаруженный эффект является основой для дальнейшего поиска высокоэффективных антигрибковых агентов среди катионных производных гемина.

2 Изучение механизма антимикробной активности ПГ 2.1. Исследование взаимодействия ПГ с модельными липосомами

Различия в составе липидной мембраны эукариотических клеток и бактерий в ряде случаев могут обуславливать селективность антимикробных агентов. Так, АМП, несущие, как правило, суммарный положительный заряд, имеют большее сродство к мембране бактерий, состоящих из отрицательно заряженных фосфолипидов, нежели к мембране эукариотических клеток, построенной из цвиттер-ионных липидов.

Нами было проведено исследование воздействия ПГ на мембраны липосом, состоящих из цвиттер-ионного липида DOPC, моделирующих мембрану эукариотических клеток и липосом, построенных из отрицательно заряженного фосфолипида DOPG , и моделирующих мембрану бактериальных клеток. Липосомы содержали во внутреннем объеме флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин (КФ) в концентрации самогашения флуоресценции (100 мМ).

По скорости вытекания и максимальной степени выхода КФ из липосом можно судить об относительном изменении проницаемости липидной мембраны под действием ПГ. Поскольку молекулы DOPG и DOPC содержат по две С=С-связи (по одной в каждой из ацильных цепей), существует принципиальная возможность их окисления ПГ. С помощью

масс-спектрометрии нами было показано, что в условиях опыта окисления липидов под действием ПГ не наблюдается. Из рис. 2.1 (А и В) видно, что содержащие протонированные остатки гуанидина ПГ 1,23 и 26 высокоактивны в отношении липосом обоих типов. 1

10 15 20 25 lime, min

lime, min

Рисунок 2. Кинетика выхода КФ (а - степень выхода КФ из внутреннего объема липосом) под действием гуанидин-содержащих ПГ 1,8,23, и 26, а также ПГ 19 (1), имидазол-содержащих ПГ 10,11, 22 и гемина (2), ПГ 2, 12, 13, 14 и 15, несодержащих ионизируемых групп (3) из липосом, состоящих из цвиттер-ионного фосфолипида DOPC (А), а также из отрицательно заряженного фосфолипида DOPG (В). Концентрация производных гемииа 5-Ю"6 М. Концентрация липида 5-Ю"5 М. Буфер 10 мМ MES, 10 мМ Tris, 100 мМ KCI.

Отрицательно заряженное ПГ 19 и ПГ 8, содержащее остатки аргинина с блокированными гуанидиновыми группами оказали незначительное воздействие на липосомы, состоящие как из DOPC, так и из DOPG. Таким образом, для проявления

активности в отношении мембран липосом обоих типов гуанидин-содержащим ПГ необходим положительный заряд. При этом не наблюдалось селективности действия положительно заряженных ПГ в зависимости от заряда липосом. Так соединения 1, 23 и 26 нарушают целостность как цвиттер-ионных, так и отрицательно заряженных мембран примерно в равной мере, но с различной скоростью.

Имидазолсодержащие ПГ проявили заметно меньшую активность в отношении липосом по сравнению с аргинин-содержащими ПГ, по-видимому, вследствие меньшего эффективного положительного заряда. В то же время, величина заряда ПГ, начиная с некоторой пороговой величины практически не оказывает влияния на кинетические характеристики его взаимодействия с мембраной: ПГ 23 и 26, содержащие 2 и 4 остатка гуанидина соответственно, нарушают целостность мембран липосом практически в одинаковой мере.

Неионогенные ПГ (НИГ ПГ) также проявили высокую активность в отношении липосом обоих типов. При этом ПГ 12 и 13 оказались несколько активнее в отношении DOPG-липосом, что однако, не коррелирует с их антибактериальной активностью.

Таким образом, все ПГ, обладающие антибактериальной активностью, эффективно усиливают проницаемость мембран липосом обоих типов, что позволяет использовать липосомальную модель для прогнозирования антибактериальной активности ПГ. Вместе с тем, очевидно, что заряд мембран не является фактором селективности ПГ.

2.2. Исследование механизма антибактериальной активности ПГ 2 методом

конфокальной микроскопии

Конфокальная микроскопия является мощным инструментом биологических исследований. Этот метод, основанный на регистрации флуоресценции молекул внутри клетки, позволяет, в частности, визуализировать процесс нарушения липидной мембраны бактерии. Так, при действии на бактерии, содержащие во внутреннем объеме флуоресцентный краситель, агентом, вызывающим пермеабилизацию их мембран, наблюдается, снижение интенсивности флуоресценции внутри бактерий.

Нами была изучена способность3 соединения 2 пермеабилизовать мембраны бактерий. Исследование проводили на штамме грам-положительных бактерий Staphylococcus aureus. Ранее было обнаружено, что данное соединение проявляет высокую активность в отношении S.aureus 209Р. Для установления временного интервала активности соединения 2 была исследована кинетика его бактерицидного действия. Для этого бактерии инкубировали с ПГ 2 в течение 30 мин - 6 ч, а загем высевали на агар. Было обнаружено, что уже через 30 мин инкубации бактерий с 2.75 мкг/мл ПГ 2 на агаре не вырастает ни одной колонии.

3 Эксперименты по конфокальной микроскопии были проведены в ИБХ РАН под руководством проф., д.б.н. А.В. Феофанова

Наличие дефектов в цитоплазматической мембране определяли по вытеканию из цитоплазмы флуоресцентного красителя BCECF AM и одновременному затеканию пропидий иодида (PI). В качестве положительного контроля в тех же условиях вместо ПГ 2 добавляли детергент Тритон Х-100 и через 20 мин. регистрировали вытекание BCECF AM и одновременное затекание PI. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что при бактерицидной концентрации соединение 2 вызывает пермеабилизацию мембраны бактерий S. aureus. Вместе с тем, вытекание BCECF AM при действии ПГ 2 на бактерии наблюдается в значительно меньшей степени по сравнению с положительным контролем. По-видимому, пермеабилизация мембраны бактерии является частью механизма антибактериальной активности соединения 2 и гибель бактерий, скорее всего, происходит с участием и других механизмов.

3 Подходы к прогнозированию физико-химических свойств и биологической

активности ПГ

3.1. Исследование зависимости растворимости ПГ от строения заместителей

Синтезированные ПГ, как уже упоминалось выше, имеют различную растворимость в воде. Наиболее логичным объяснением этого факта являются отличия в гидрофобности их заместителей по пропионовокислым остаткам гемина. Как известно, наиболее универсальной характеристикой гидрофобности органических веществ является логарифм коэффициента распределения октанол/вода (logP). Как правило, используют значения logP, полученные различными расчетными методами.

Нами было показано, что значения ClogP для ПГ, вычисленные помощью различных компьютерных программ, имеют разброс в 2-3 единицы, что совершенно неудовлетворительно для оценки логарифмической величины. Вместе с тем, расчет значений ClogP для заместителей ПГ с помощью разных компьютерных программ продемонстрировал удовлетворительную сходимость. По-видимому, трудности вызывает расчет ClogP для порфириновой части молекул ПГ. Поскольку ClogP является аддитивной величиной, можно предположить, что ClogP гемина является некоторой постоянной. Если исходить из этого допущения, то для сравнения гидрофобностей ПГ будет достаточно вычислить ClogP для их заместителей.

При расчете ClogP ПГ нами были приняты следующие допущения: гуанидиновая группа аргинина является протонированой вследствие высокой основности гуанидина; имидазольная группа считается непротонированой по причине низкой основности имидазола; а-аминогруппа принимается непротонированной, поскольку она ацилирована пропионовокислым остатком гемина и её основность подавлена; поскольку ClogP является

аддитивной величиной, формальный С^Р дизамещенных ПГ характеризуется как удвоенный С1о§Р заместителей по пропионовокислым группам.

Сопоставление расчетных значений С^Р и их растворимости в воде позволило установить, что водорастворимыми являются те ПГ, для которых С^Р<-4,0. Особо следует отметить малорастворимые в воде соединения 17,30 и 31, имеющие С^Р<-4,0.

Таким образом, нами предложен методический подход к расчету С^Р производных гемина, а также найден формальный признак водорастворимости ПГ, позволяющий направленно получать водорастворимые производные гемина.

3.2. Исследование взаимосвязи физико-химических свойств и биологической активности водных растворов производных гемина Недавно было показано, что биологический эффект БАВ зависит от физико-химических параметров их водных растворов. Для ПГ 1 и 2 были получены концентрационные зависимости размера частиц, электропроводности, ¡¡-потенциала и поверхностного натяжения (о) в интервале концентраций 1О'10-1О"3 М (рис. З)4. Как и ожидалось,

|дС (М)

1дС(М)

Рисунок 3. Изменение поверхностного натяжения а (а), размеров частиц О (Ь), электропроводности х (с), С

-потенциала (с!) водных растворов веществ

-1 -«-2

в зависимости от концентрации (С), 25°С

размер, заряд ассоциатов и другие физико-химические свойства растворов ПГ нелинейно и немонотонно изменяются с изменением концентрации, что особенно выражено в области проявления антимикробного эффекта ПГ 1 и 2, а именно при концентрации 10"6-10"5 м.

4 Концентрационные зависимости физико-химических параметров растворов ПГ были получены в ИОФХ им.

Арбузова КазНЦ РАН под руководством д.х.н. Рыжкиной И.С.

Зависимость поверхностного натяжения растворов 1 от концентрации свидетельствует о том, что это соединение, в отличие от ПГ 2, обладает признаками катионного ПАВ. Концентрационные зависимости коэффициентов экстинкции в воде ПГ 1 и 2 также нелинейны и указывают на различные степени их агрегированное™, которые максимальны в области 10"6-10"5 М. В этом же интервале концентраций наблюдается тенденция к минимизации размера частиц D (рис. 3) и увеличению абсолютной величины зарядов частиц.

ВЫВОДЫ

1. Впервые синтезированы конъюгаты гемина с разветвленными пептидами и незащищенными аминокислотами. Показана возможность наращивания цепи разветвленного пептида в составе конъюгата с гемином с применением метода урониевых солей.

2. Предложены удобные препаративные способы получения индивидуального ди-N-оксисукцинимидного эфира гемина и пептида RGD.

3. С применением Fmoc-стратегии осуществлен твердофазный синтез аналогов антимикробных пептидов. Получены конъюгаты антимикробных пептидов с гемином как в растворе, так и на твердой фазе.

4. Выявлены элементы структуры ПГ, способствующие повышению и расширению антибактериальной активности, главными из которых являются наличие остатков основных или гидроксилсодержащих аминокислот и С-концевой амидной группы.

5. С применением флуоресцентной спектроскопии липосом, нагруженных карбоксифлуоресцеином, показана способность ПГ усиливать проницаемость липидной мембраны, являющаяся частью механизма антимикробного действия.

6. С помощью конфокальной микроскопии продемонстрировано образование дефектов в липидной мембране бактерий под действием ПГ, замещенного остатками метилового эфира серина.

7. В ряду синтезированных соединений выявлены перспективные для дальнейшего продвижения ПГ, обладающие водорастворимостью, низкой токсичностью и высокой антибактериальной активностью, в том числе избирательной, против резистентных бактерий in vitro.

8. Впервые обнаружена противогрибковая активность ПГ, в том числе против резистентных и опасных для человека микроскопических грибов. Выявлена взаимосвязь этой активности со структурой ПГ.

9. Исследованы концентрационные завсимости физико-химических параметров и биологической активности водных растворов ПГ.

Список публикаций по теме диссертации

1. Okorochenkov S.A., Zheltukhina G.A., Nebolsin V.E.. / Antimicrobial peptides: mechanisms of action and prospects for their practical application // Biochemistry (Moscow) Supplement Series В (Biomedical Chemistry), 2011, V. 5, № 2, P. 95-102

2. Рыжкина И. С., Киселева Ю. В., Желтухина Г. А., Окороченков С. А., Муртазина Л. И., Тимошева А. П., Небольсин В. Е., академик Коновалов А. И. / Взаимосвязь самоорганизации, физико-химических свойств и биологической активности водных растворов производных гемина//ДАН, 2011, том 440, № 1, С. 59-63

3. Окороченков С.А., Быстрова Е.А., Павлова Е.М., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. / Синтез и биологические свойства конъюгатов гемина с незащищенными пептидами // Вестник МИТХТ, 2010, т. 5, № 5 с. 71-81

4. Окороченков С.А., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. / Синтетические производные гемина: изучение биологической активности и механизма действия // Тезисы III Молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии» Москва, 2009, С. 45

5. Желтухина Г.А., Окороченков С.А., Феофанов А.В., Небольсин В.Е. / Производные гемина - эффективные и нетоксичные антимикробные агенты // Тезисы XVII Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2010, С.615

6. Окороченков С.А., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. / Исследование взаимодействия производных гемина с лнпидными мембранами с целью создания подходов к конструированию новых биоцидных агентов // Тезисы VI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии», Севастополь, 2010, С. 296-298

7. Окороченков С.А., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. / Синтез монозамещенных пептидных производных гемина с антимикробной активностью // Тезисы Международного симпозиума Advanced Science in Organic Chemistry, Мисхор, 2010, p. C-163

8. Okorochenkov S.A., Zheltukhina G.A., Nebolsin, V.E., Mirchink, E.P. / Hemine amino acids and peptide derivatives as antibacterial agents // Тезисы 5th Summer School Medicinal Chemistry, Regensburg, 2010, P. 223

9. Zheltukhina G.A., Okorochenkov S.A., Nebolsin V.E., Ryzhkina I.S., Murtazina L.I., Kiseleva Yu.V., Konovalov A.I. / Supramolecular systems based on hemin derivatives: correlation between biologic activity and physicochemical properties of their aqueous solutions // Тезисы 3rd International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology", Lviv, 2010, P. 181.

10. Окороченков СЛ., Желтухина Г.А., Носик H.H., Желтухин C.J1., Небольсин В.Е. / Исследование механизмов вирулицидной активности аминокислотных и пептидных производных гемина. // Тезисы Пятого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009, С. 184-185

11. Желтухина Г.А., Окороченков С.А., Небольсин В.Е. / Модифицированные производные гемина как катализаторы окисления природных органических субстратов и перспективы их биомедицинского применения. // Тезисы научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый Свет, 2009, С. 195

12. Желтухина Г.А., Окороченков С.А., Небольсин В.Е., Носик H.H. / Синтез, биоцидные свойства и механизмы действия конъюгатов гемина с пептидами и пептидоаминами. // Тезисы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 2009, С. 194

13. Окороченков С.А., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. / Физико-химические исследования гемин-пептидов в тестовых модельных системах с целью прогнозировния их биологической активности // Тезисы X Международной конференции по физической и координационной химии и их аналогов (ICPC-10), Иваново, 2009, С. 150-151

14. Желтухина Г.А., Окороченков С.А., Тренин A.C., Галатенко O.A., Небольсин В.Е. / Исследование противогрибковой активности синтетических производных гемина // Тезисы XVIII Российского национального конгресса "Человек и Лекарство", Москва, 2011, С. 503

15. Окороченков С.А., Желтухина Г.А., Мирчинк Е.П., Феофанов A.B., Небольсин В.Е. / Исследование механизмов антибактериальной активности конъюгатов гемина с аминокислотами, пептидами и их производными. // Тезисы VII Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии», Украина, Севастополь, 2011, С. 323

Патенты

1. Патент RU 2415868. Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение / Небольсин В. Е., Желтухина Г. А., Окороченков С. А. Опубл. 10.04.2011 Бюл. № 10

Подписано в печать 23.11Л1 Заказ № 40 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,86 (495) 936-88-35 (494) 434-83-55

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Окороченков, Сергей Александрович

1. Литературный обзор.

1.1. Введение.

1.2. Применение гемина как индуктора гем-оксигеназы.

1.3. Производные гемина в биоорганической и биомедицинской химии.

2. Полученные результаты и их обсуждение.

2.1. Первоначальный скрининг антибактериальной активности ПГ.

2.2. Синтез 6,7-дизамещенных аминокислотных ПГ.

2.3. Синтез ПГ с разветвленными пептидными заместителями.

2.4. Синтез конъюгатов гемина с незащищенными антимикробными пептидами различной длины.

2.5. Исследование биологической активности ПГ.

2.6. Исследование зависимости растворимости ПГ от строения заместителей.

2.7. Изучение механизма антимикробной активности ПГ.

2.8. Антигрибковая активность ПГ.

Введение диссертация по химии, на тему "Синтез и структурно-функциональные исследования в ряду производных гемина, обладающих антимикробной активностью"

Актуальность проблемы. Широкое распространение инфекционных заболеваний и развитие резистентности к существующим антибиотикам определяет актуальность поиска новых антимикробных агентов среди различных классов соединений, в том числе среди синтетических производных природного металлопорфирина - гемина (ПГ). Несмотря на наличие некоторой антибактериальной активности, применение самого гемина ограничивается его токсичностью in vitro и in vivo, нерастворимостью в воде, недостаточной эффективностью и кратковременностью действия.

Научная новизна. Осуществлен синтез ряда новых аминокислотных и пептидных производных гемина. Оптимизирована методика получения прекурсора ди-замещенкых ПГ -ди-Ы-оксисукцинимидного эфира гемина. Разработан новый эффективный метод синтеза биологически активного пептида с аминокислотной последовательностью А^01уАБр. Предложены оригинальные способы получения конъюгатов гемина со свободными аминокислотами и короткими разветвленными пептидами. Усовершенствованы способы конъюгации гемина с пептидами различной длины в растворе и на твердой фазе. Установлена низкая токсичность ряда синтезированных ПГ в отношении лейкоцитов и эритроцитов человека. Впервые продемонстрирована активность полученных соединений в отношении ряда патогенных микроскопических грибов, а также бактерий, в том числе резистентных. С помощью комплекса физико-химических и расчетных методов исследованы элементы механизма антибактериальной активности ПГ. Показано, что образование дефектов в липидной мембране является одним из важных элементов механизма действия ПГ.

1. Литературный обзор

1.1. Введение

Одной из основных целей, стоящих перед современной биоорганической химией и фармакологией, является получение эффективных и безопасных лекарственных препаратов для лечения различных заболеваний, в том числе инфекционных.

Модификация природных соединений по-прежнему остается важным инструментом поиска новых антибиотиков и антисептиков. Преимуществами препаратов, в том числе биоцидных, на основе природных соединений является их прогнозируемая низкая токсичность и биодеградируемость. Особый интерес в качестве основы для перспективных биоцидных агентов представляют природные порфирины, в частности гемин.

Гем-содержащие белки являются биологическими катализаторами целого ряда реакций. В зависимости от белкового окружения гема каталитические центры осуществляют такие процессы, как обратимое связывание кислорода, перенос электронов, окисление органических субстратов, катализ восстановления и диспропорционирования гидроперекисей. Разнообразие функций этих белков в основном определяется строением их активного центра, а именно ближайшим аминокислотным окружением гемовой группы. Это окружение часто имеет значительное сходство, что, по-видимому, определяет в ряде случаев полифункциональность одного и того же белка. Так, миоглобин способен разрушать перекись водорода и липидные гидроперекиси, проявляя таким образом псевдопероксидазные свойства [1].

Многогранную биологическую активность демонстрируют и низкомолекулярные

Л I производные гемина. В восстановленном состоянии иона железа (Ре ) в составе гема такие соединения катализировали гидроксилирование холестерина кислородом воздуха, имитируя таким образом свойства Су1.Р-450 [2]. Отдельные аминокислотные и пептидные производные гемина ингибировали протеиназу ВИЧ, оказывая вследствие этого и *противовирусное анти-ВИЧ действие при низкой токсичности по отношению к неинфицированным клеткам [3]. Недавно было показано, что пептидные производные гемина способны катализировать окислительное расщепление таких важных природных макромолекул, как нуклеиновые кислоты [4]. Все эти механизмы могут лежать в основе антимикробного и противовирусного действия производных гемина.

Известна способность гемина значительно катализировать цепное окисление (ЦО) полинасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и усиливать перекисное окисление в липосомах и липидных мембранах [5]. Эти свойства определяют, главным образом, токсическое действие гемина в отношении нормальных клеток, органов и тканей при его свободной циркуляции в организме, вызывая, в частности, гемолиз эритроцитов.

Гемин является простетической группой для широкого круга белков, которые играют важную роль в доставке кислорода, функционировании митохондрий, сигнальной трансдукции, антиоксидантной защите. Различные производные гемина, такие как гематин и другие альтернативные внутривенные производные (например, пангематин) в настоящее время доступны и применяются в клинике с 1970 годов для успешного лечения острой порфирии [6], контроля отторжения аллотрансплантата печени как следствие рецидива эритропоэтической порфирии, а также у пациентов с талассемией [7]. Гемин является признанным агентом для индукции НО-1 на некоторых протестированных культурах клеток и in vivo [8,9].

В первой части настоящего обзора рассмотрены различные биомедицинские направления исследования гемина, в частности как важного индуктора НО-1 при лечении острой порфирии, острого панкреатита, различных заболеваний почек и печени, геморрагического шока. Рассматриваются антимикробное и антидиабетическое действия гемина. Во второй части проанализированы аспекты исследования и применения, в том числе немедицинского различных производных гемина, полученных как химической модификацией, так и с помощью других подходов.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

3. Выводы

2. Предложены модифицированные препаративные способы получения индивидуального ди-Ы-оксисукцинимидного эфира гемина и пептида RGD.

3. С применением Fmoc-стратегии осуществлен твердофазный синтез,,, аналогов антимикробных пептидов. Получены конъюгаты антимикробных пептидов с гемином как в растворе, так и на твердой фазе.

7. В ряду синтезированных соединений выявлены перспективные для дальнейшего развития ПГ, обладающие водорастворимостью, низкой токсичностью и высокой антибактериальной активностью, в том числе избирательной, против резистентных бактерий in vitro.

4. Экспериментальная часть

В работе использовались аминокислоты и их производные L-ряда фирмы «Bachem» (Германия). DIC, HOBt, DCC, 9-флуоренилметилсуцинимидоилкарбонат, Et3N, триизопропилсилан, К,0-бис(триметилсилил)ацетамид, грамицидин D, CF фирмы Fluka (Швейцария), TFE (Merck, Германия), В0С2О, этилхлорформиат (Aldrich), гемин (ч) «Биолар» (Олайнский завод химреактивов), дигидрохлорид грамицидина

S («Красфарма»), DOPG

Avanti Polar Lipids, США). Все растворители безводные, за исключением тех, которые использовались для экстракции из водных растворов.

В качестве полимерного носителя в синтезе пептидов использовали 4-(2',4'-диметоксифенил-флуоренилметоксикарбонил-аминометил)-феноксиметильный (Ринкамидный) полистирольный полимер, сшитый дивинилбензолом (1%) (Iris Biotech, Германия), а также содержащий 0,1 ммоль/г активных аминогрупп полистирольный полимер, сшитый дивинилбензолом (1%) модифицированный 2-хлортритилхлоридной якорной группой с содержанием хлора 1.43 ммоль/г (Bachem, Швейцария).

Индивидуальность полученных соединений проверяли методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) в системах: хлороформ - метанол (9:1) (1), хлороформ -метанол 4:1 (2), хлороформ - метанол - вода - уксусная кислота 5:4:0,1:0,1 (3), хлороформ -метанол - вода - уксусная кислота 5:4:0,2:0,2 (4), хлороформ - метанол - вода - уксусная кислота 5:4:0,5:0,5 (5). Хроматограммы проявляли хлор-бензидиновым реактивом или УФ-светом.

Аналитическую ВЭЖХ пептида 35 осуществляли на хроматографе Gilson 305 (Gilson, Франция) в условиях: колонка (4.6 х 250 мм), обращенная фаза С5, средний диаметр пор сорбента 5 микрон (Phenomenex, США) в градиенте ацетонитрила в 0.1% раствора TFA в воде от 30 до 50%, 1%/мин, скорость потока 0.5 мл/мин, детекция при 220 нм (8). Препаративную ВЭЖХ 35 осуществляли в условиях: колонка (25 х 250 мм), обращенная фаза С5, средний диаметр пор сорбента 10 микрон (Phenomenex, США) в градиенте ацетонитрила в 0.1% растворе TFA в воде от 30 до 50%, 1%/мин, скорость потока 8 мл/мин, детекция при 254 нм (6).

Аналитическую ВЭЖХ пептида 45 проводили на хроматографе Gilson 305 (Gilson, Франция) в условиях: колонка (2 х 150 мм), обращенная фаза С18, средний диаметр пор сорбента 5 микрон (Phenomenex, США) в градиенте 80% водного ацетонитрила в 0.05% растворе TFA от 0 до 100%, детекция при 220 нм . Препаративную ВЭЖХ 45 осуществляли в условиях: колонка (19 х 250 мм), обращенная фаза С18, средний диаметр пор сорбента 5 микрон (Phenomenex, США) в градиенте 80% водного ацетонитрила в 0.15% TFA в воде от 0 до 60 %, детекция при 280 нм. (7).

Колоночную хроматографию проводили на сефадексе LH-20 (Pharmacia, Швеция) или на силикагеле Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия).

Масс-спектры высокого разрешения получали на время-пролетном масс-спектрометре «Ultraflex» (Bruker, Германия) методом матриксной лазерно-десорбционной ионизации (TOF MALDI), в качестве матрицы использовалась 2,5-дигидроксибензойная кислота. Электронные спектры регистрировали на спектрофотометре Helios Delta (Thermo Electron, США) и на спектрофотометре Jasco UV/VS 7800 (Jasco, Япония). Спектрй1 'Н-ЯМР регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре Bruker DPX 300 (Bruker, Германия). Температуру плавления определяли на приборе Nagema (Nagema, Германия). ИК-спектры регистрировали на Фурье-спектрометре Magna 750 (Nicolet, США). Динамику вытекания КФ из липосом изучали с помощью спектрофлуориметра Varían Сагу Eclipse (США). Поверхностное натяжение растворов измеряли на высокоточном тензиометре Sigma 720ЕТ (KSV Instruments, Финляндия). Удельную электропроводность растворов изучали с помощью кондуктометра inoLab Cond Level 1 (WTW, Германия) Диэлектрическую проницаемость растворов определяли при 298 К на установке, которая состояла из работающего по методу биений прибора El2-1 (Advanced Packaging, США) и измерительной ячейки, которая представляет собой термостатируемый конденсатор. t

4.1. Синтез производных гемина, замещенных по двум пропионовокислым остаткам

4.1.1. 6,7-ди-Ы-оксисукцинимидный эфир протогемина IX (7) К раствору 0.5 г (0.77 ммоль) протогемина IX (2) в 10 мл смеси DMF-DMSO (1:1 v/v) прибавляли 0.444 г (3.85 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 0.79 г (3.85 ммоль) DCC. Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 0°С, затем 16 ч при комнатной температуре. При этом продукт частично выпадал в осадок. Осадок, содержащий продукт и DCU отделяли фильтрованием, продукт экстрагировали из осадка 8 мл DMSO. Фильтрат и экстракт объединяли и концентрировали в вакууме до объема 5 мл, выпавший осадок DCU отделяли фильтрованием, после чего продукт осаждали 40 мл диэтилового эфира. Осадок Отделяли центрифугированием и промывали диэтиловымэфиром 3x40 мл, после чего высушивали в

Ч 4 эксикаторе. Выход 0.614 г (95%). Rf 0.6 (1). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВп: 1735 (СО сл.эф.). Масс-спектр, m/z: [М-СГ]+ 810.4. Электронный спектр, Xmax, нм, DMSO, (е-10"3): 401.5 (99.3), 472.2 (10.8), 601.0 (5.8)

4.1.2. Общая методика получения соединений 2 и 8-17 К суспензии 0.30 ммоль аминокомпонента в 1.5 мл DMF прибавляли 0.033 мл (0.266 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 3 мин. К полученному раствору прибавляли раствор 0.100 г (0.118 ммоль) 6,7-бис-М-оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 5 мл DMF, и перемешивали 30 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (3). Реакционную смесь концентрировали в вакууме до объёма 1 мл. Для нерастворимых в воде соединений 2, 8 и 1017 к сконцентрированной реакционной массе добавляли 10 мл водного 0.01 М раствора соляной кислоты, осадок отделяли и промывали водой до нейтральной реакции. Осадок сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток. Для водорастворимого соединения 9 к сконцентрированной реакционной массе добавляли 2.55 М раствор соляной кислоты в метаноле до достижения нейтральной реакции, затем добавляли 10 мл 0.01 М раствора соляной кислоты водном растворе NaCl насыщенного. Осадок отделяли и сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток, затем растворяли в 1 мл безводного метанола и отфильтровывали нераств^рившийся NaCl, после чего очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20 х 2 см, заполненной Sephadex LH20, элюируя метанолом. Содержащие целевой продукт фракции объединяли, растворитель удаляли в вакууме. Целевой продукт сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток.

4.1.2.1. 6,7-бис-(метиловый эфир Иа-серил)-протогемин (IX) (2)

Выход 0.087 г (87 %), Rf 0.31 (2). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1738 (СО сл.эф.), 1645 (амид I), 1527 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М-СГ]+ 818.5. Электронный спектр, ?w нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 401.0 (119.1), 481.2 (9.5), 598.0 (6.9).

4.1.2.2. 6,7-бис-(метиловый эфир-Ыа-(№-питро)аргинил)-протогемин (IX) (8) Выход 0.106 г (79 %), Rf 0.26 (2). ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВс 1737 (СО сл.эф.), 1648 (амид I), 1539 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M-N02-C1"]+ 1001.2 [M-2N02-C1']+ 956.8 Электронный спектр, DMSO, нм, (є-10"3): 404 (1.163), 500.2 (0.986), 623.4 (0.540).

4.1.2.3. 6,7-бис-(амид Na- аргинил)-протогемин (IX) (9)

Вещество очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20 х 2 см, заполненной Sephadex LH-20, элюируя метанолом. Выход 0.100 г (82%), Rf 0.26 (4). ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВг: 1656 (амид I), 1534 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 926.2 Электронный спектр, DMSO, ^ах, нм, (є-10"3): 403.8 (92.60), 499.2 (6.36), 623.6 (1.55).

4.1.2.4. 6,7-бис-(метиловый эфир Ыа-гистидил)-протогемин (IX) (10)

Выход 0.091 г (87 %), Rf 0.31 (1). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1742 (СО сл.эф.), 1647 (амид I), 1524 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 918.8. Электронный спектр, DMSO, нм (є-10"3): 402.0 (109.4), 481.2 (8.8), 598.0 (5.9)V

4.1.2.5. 6,7-бис-гистаминил-протогемип (IX) (11)

Выход 0.076 г (76 %), Rf 0.25 (1). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1644 (амид I), 1543 (амид И). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 802.7. Электронный

СПеКТр, Afliax, HM,

ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 388 (49.1), 508 (4.18), 640 (1.76).

4.1.2.6. 6,7-бис-Ы-(2-гидроксиэтил)амид протогемина (IX) (12)

Выход 0.072 г (83 %), Rf 0.45 (2). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1632 (амид I), 1549 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 702.5. Электронный спектр1, Хтах, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 400 (183.0), 508 (5.23), 640 (2.08).

4.1.2.7. 6,7-6uc-N-(l ,3-дигидроксипропан-2-ил)амид протогемина (IX) (13) Выход 0.081 г (86 %), Rf 0.35 (2). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1629 (амид

I), 1550 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 762.7. Электронный спектр, А™ах, им, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 400 (40.5), 508 (2.68), 640 (1.02).

4.1.2.8. 6,7-6uc-N-(l ,2-дигидроксипропан-3-ил)амид протогемина (IX) (14) Выход 0.084 г (89 %), Rf 0.35 (2). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1634 (амид

I), 1565 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 762.7.Электронный спектр, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 396-400 (24.2), 488 (2.14), 600 (1.40).

4.1.2.9. 6,7~бис-(Метиловый эфир Ыа-глицил)-протогемин (IX) (15) и і

Выход 0.072 г (77 %), Rf 0.56 (1). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1737 (СО сл.эф.), 1648 (амид I), 1539 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [M-Cl"]+ 758.6. Электронный спектр, Кгх, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 400 (115.9), 508 (9.38), 640 (3.81).

4.1.2.10. 6,7-бис-(амид Иа-глицил)-протогемин (IX) (16)

Выход 0.077 г (86%), Rf 0.56 (3). ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВг: 1654 (амид I), 1536 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 728.6. Электронный спектр, DMSO, Хтах, нм, (є-10"3): 402.0 (101.2), 504.2 (7.417), 628.6 (4.201).

4.1.2.11. 6,7-бис-(амид Ыа-серил)-протогемии (IX) (17)

Выход 0.080 г (82%), Rf 0.34 (3). ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВг: 165Цамид I), 1530 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+788.3. Электронный спектр, DMSO, >чпах, нм, (є-10"3): 404.8 (207.1), 499.2 (6.54), 623.4 (3.60).

4.1.3. Общая методика получения соединений 18-23 К раствору или суспензии аминокислоты (0.945 ммоль) в 0.5 мл воды добавляли 0.130 мл (для серина и глицина) или 0.260 мл (для глутаминовой кислоты и дигидрохлоридов аргинина и гистидина) триэтиламина. Полученный раствор вносили к 6,7-6hc-N-оксисукцинимидного эфира гемина (100 мг, 0.118 ммоль) в 6 мл диметилформамида и перемешивали 30 мин. Реакционную массу концентрировали в вакууме до объёма 1 мл. Нерастворимые в воде соединения 18-21 и водорастворимые вещества 22-23 выделяли как описано в методике 4.1.3 для веществ с соответствующей растворимостью.

4.1.3.1. 6,7-бис-Ма-глицил-протогемин (IX) (18)

Выход 0.078 г (86%), Rf 0.62 (3). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 3294 (NH), 1724 (СООН), 1656 (С=0 амид I), 1543 (С=0 амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-С1"]+ 730.1. Электронный спектр, DMSO, нм, (є-10"3): 404 (126), 498 (8.02), 622 (4.48).

4.1.3.2. 6,7-бис-Ыа-глутамил-протогемин (IX) (19)

Выход 0.088 г (82%), Rf 0.30 (3). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка KBr^3286 (NH), 172 (СООН), 1644 (С=0 амид I), 1544 (С=0 амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-С1"]+ 874.7. Электронный спектр, DMSO, W нм, (є-10"3): 404 (76.7), 496 (8.79), 615 (6.02).

4.1.3.3. 6,7-бис- Иа-серил-протогемин (IX) (20)

Выход 0.085 г (87%), Rf 0.50 (3). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1727 (СООН), 1656 (С=0 амид I), 1530 (С=0 амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [M-Cl"]+ 790.6. Электронный спектр, DMSO, Х^х, нм, (є-10"3): 403(188), 497 (8.51), 622 (4.49).

4.1.3.4. 6,7-бuc-(ß-aлaнuлгucmuдuл)-npomoгeмlш (IX) (21)

Выход 0.084 г (67%), Rf 0.43 (3). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1623 (амид I), 1542 (амид И), 1722 (СООН). Масс-спектр (MALDI): [М-СГ]+ 1032.9. Электронный спектр, Xmax, НМ, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 396 (61.6), 512 (5.17), 640 (2.08).

4.1.3.5. 6,7-бис- Иа-гистидил-протогемин (IX) (22)

Вещество очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20x2 см, заполненной Sephadex LH-20, элюируя метанолом. Выход 0.078 мг (71%), Rf 0.51 (4). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 3393 (NH), 1730 (СООН), 1652 (С=0 амид I), 1544 (С=0 амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 890.7. Электронный спектр, DMSO, Хтах, нм, (є-10"3): 403 (108), 503 6.53), 626 (3.17).

4.1.3.6. 6,7-бис Ыа-аргинил-протогемин (IX) (23)

Вещество очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20 х 2 см, заполненной Sephadex LH-20, элюируя метанолом. Выход 0.091 мг (74%), Rf 0.35 (4). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 3377 (NH), 1729 (СООН), 1649 (С=0 амид I), 1536 (С=0 амид її). Масс-спектр (MALDI), m/z: [M-Cl"]+ 928.9. Электронный спектр, DMSO, Хт^, нм, (q-JO"3): 403 (146), 503 (7.75), 626 (3.89).

4.1.4. Ди-пентафторфепиловый эфир Вос-Ь-глутамиповой кислоты (24) К раствору 1.500 г (6.073 ммоль) Вос-Х-глутаминовой кислоты в 9 мл ацетонитрила добавляли 2.235 г (12.145 ммоль) пентафторфенола. Реакционную смесь охлаждали до - 10 °С и прибавляли по каплям в течение 10 мин. 2.505 г (12.145 ммоль) DCC в 4 мл ацетонитрила. Реакционную смесь перемешивали 20 мин. при 0 °С и выдерживали 24 часа при 4-5 °С. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (10). Осадок DCU отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Маслообразный остаток дважды кристаллизовали из этилацетата гексаном. Твердый осадок сушили в вакууме над безводным СаС12. Выход 3.410 г (84 %), Rf 0.70 (2). Т. пл. 127-131°С. Найдено, %: С 45.61; Н 2.61; N 2.42. C22Hi5N06Fio. Вычислено, %: С 45.60; Н 2.59; N 2.42. ИК-спектр Фурье, v, см"1, таблетка КВг: 1737 (СО сл.эф.), 1697 (OCONH), 991, 1113 (C-F), 1521(ароматика). Лит.[195]: Rf 0.65. Т.пл. 128-132.

4.1.5. Ди-(метиловый эфир Ыа-аргинил)-Вос-Ь-глутаминовой кислоты (25)

К суспензии 0.069 г (0.266 ммоль) H-ArgOMe-2HCl в 2 мл DMF прибавляли 0.074 мл (0.531 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 5 мин. К полученному раствору прибавляли 0.077 г (0.133 ммоль) ди-пентафторфенилового эфира Вое-глутаминовой кислоты, полученного ранее, и перемешивали 4 часа при '.комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в условиях (5). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Маслообразный осадок отделяли от растворителя декантированием, остатки растворителя удаляли в вакууме. Вещество очищали колоночной хроматографией на силикагеле Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) (23x1 см), элюировали смесью метанол - уксусная кислота - вода 4:0.5:0.5. Фракции, содержащие вещество с Rf 0.67 (4) собирали. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.073 г (77 %), Rf 0.67 (4). [a]D25 - 8.53° (С 0.38; МеОН). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1735 (СО сл.эф.), 1653 (амид I), 1542 (амид II). Масс-спектр (MALDI): [М]+587.7

4.1.6. 6,7-бис-[(Ди-метиловый эфир На-Ь-аргинил)-Ь-глутамил]-прот^огемина

• i t

IX (26)

К 0.073 г (0.0946 ммоль) ди-(метилового эфира №-аргинил)-№-Вос-Ь-глутаминовой кислоты (VII) приливали 6 мл ~3 н НС1/МеОН. Полученную суспензию перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Контроль процесса осуществляли ТСХ в условиях (6). После достижения полного отщепления Вос-защиты соединения растворитель удаляли в вакууме при 30 °С. Маслообразный остаток кристаллизовали под безводным диэтиловым эфиром, растворитель отделяли декантацией.

К суспензии полученного H-Glu(ArgOMe)2-3HCl в 1.5 мл DMF прибавляли 0.047 мл (0.335 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 2 мин. Наблюдали выпадение осадка Et3N-HCl. К полученной суспензии прибавляли раствор 0.047 г (0.0558 ммоль) 6,7-бис-М-оксисукцинимидного эфира протогемина IX (I) в 2 мй1 DMF и перемешивали 22 часа при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли ТСХ в условиях (6). Раствор концентрировали в вакууме до 1 мл и прибавляли 10 мл диэтилового эфира. Для введения противоиона СГ остаток растворяли в 4 мл МеОН и прибавляли 0.150 мл ~3 н НС1/МеОН до достижения рН 4. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Вещество очищали колоночной хроматографией на сефадексе LH-20 (13x1 см), элюировали МеОН. Фракции, содержащие вещество с Rf 0.1 (6) объединяли. Растворитель удаляли в вакууме. Выход 0.034 г (40 %), Rf 0.4 (5). ИК-Фурье споктр, v, см"1, таблетка КВг: 1737 (СО сл.эф.), 1649 (амид 1), 1528 (амид II). Масс-спектр (MALDI): [М-С1"]+ 1554.9. Электронный спектр, ?w, нм, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 400 (92.2), 508 (6.31), 636 (2.39).

4.1.7. Методика синтеза ПГ 26-32 К 0.070 г (0.077 ммоль) 6,7-бис-№-глутамил-протогемина (IX) в 5 мл ДМФА добавляли 0.148 г (0.462 ммоль) TBTU и 0.086 мл (0.462 ммоль) Et3>J. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин. К суспензии 0.462 ммоль хлоргидрата аминокомпонента в 1.5 мл DMF прибавляли 0.086 мл (0.462 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 3 мин, после чего полученный раствор добавляли к раствору преактивированного 6,7-бис-№-глутамил-протогемина (IX). Реакционною массу перемешивали в течение суток, после чего концентрировали в вакууме до объёма 1 мл. Нерастворимые в воде соединения 30 и 31 и водорастворимые вещества 26-29 и 32 выделяли как описано в методике 4.1.3 для веществ с соответствующей растворимостью.

4.1.7.1. 6,7-бис-[(Ди-метиловый эфир Ыа-Ь-аргинил)-Ь-глутамил]-протогемина IX (28)

Выход 0.096 г (72 %), Rf 0.4 (5). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1737 (СО сл.эф.), 1649 (амид I), 1528 (амид II). Масс-спектр (MALDI): [М-С1"]+ 1554.9 Электронный спектр, HM, ХЛФ:МеОН (8:2), (є-10"3): 400 (92.2), 508 (6.31), 636 (2.39).

4.1.7.2. 6,7-бис-[(Ди-амид Ыа-Ь-серил)-Ь-глутамил]-протогемина IX (27) Выход 0.073 г (76 %), Rf 0.4 (3). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1651 (амид I),

1537 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ] 1219. Электронный спектр, UMSO, Xmax нм, (є-10"3): 398.6 (89.4), 497.4 (4.16), 619.4 (2.12).

4.1.7.3. 6,7-бис-[(Ди-метиловый эфир Ыа-Ь-серил)-Ь-глутамил]-протогемина IX (28)

Вещество очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20 х 2 см, заполненной Sephadex LH-20, элюируя метанолом. Выход 0.076 г (75 %), Rf 0.62 (3). ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВг: 1747 (СО сл.эф.), 1646 (амид I), 1542 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [M-Cl']+ 1278. Электронный спектр, DMSO, Х™« нм, (є-10"3): 404.6 (124), 500 (7.43), 622.2 (4.03)

4.1.7.4. 6,7-бис-[(Ди-амид №-Ь-аргинил)-Ь-глутамил]-протогемина IX (29)

Вещество очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20 х 2 см, заполненной і

Sephadex LH-20, элюируя метанолом. Выход 0.087 г (67 %), Rf 0.32 (5). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1658 (амид I), 1541 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-С1"]+ 1495.2 Электронный спектр, DMSO, A«,« нм, (s-10'3): 396.8 (137), 505.6 (13.4), 623.2 (6.41).

4.1.7.5. б,7-бис-[(Ди-2-гидроксиэтил)-Ь-глутамил]-протогемина IX (30) Выход 0.062 г (74 %), Rf 0.52 (3). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1654 (амид

I), 1547 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 1047. Электронный спектр, DMSO, Атах нм, (е-Ю-3): 403.2 (107), 502.3 (9.04), 635.2 (6.59). v I

4.1.7.6. 6,7-бис-[(Ди-метиловый эфир Ыа-Ь-глицил)-Ь-глутамил]-протогемина IX (31)

Выход 0.072 г (78 %), Rf 0.70 (3). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1738 (СО сл.эф.), 1652 (амид I), 1535 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 1159. Электронный спектр, DMSO, Хпмх нм, (8-10"3): 404.4 (88.0), 497.8 (5.18), 621.8 (2.73).

4.1.7.7. 6,7-бис-[(Ди-амид Ыа-Ь-глицил)-Ь-глутамил]-протогемина IX (32) Вещество очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20 х 2 см, заполненной

Sephadex LH-20, элюируя метанолом. Выход 0.076 г (87%), Rf 0.28 (3). ИК-Фурье спектр, v, см*1, таблетка КВг: 1652 (амид I), 1539 (амид И). Масс-спектр (MALDI), m/z: [М-СГ]+ 1099. Электронный спектр, DMSO, W нм (s-10"3): 402 (82.0), 498 (5.48), 623.5 (2.56).

4.2. Синтез конъюгатов гемина с антимикробными пептидами \lt

4.2.1. Синтез 6(7)-моно-Ы-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (33) К раствору 0.35 г (0.54 ммоль) протогемина IX в 4.5 мл DMF прибавляли 0.1 г (0.54 ммоль) ]М-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида. К раствору при охлаждении до и перемешивании прибавляли по каплям в течение 6 ч раствор 0.11 г (0.54 ммоль) DCC в 2 мл DMF. Реакционную смесь оставляли на 16 ч при 0°С, затем перемешивали 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок DCU отделяли фильтрованием. Продукт

ПрОМЫВаЛИ ДИЭТИЛОВЫМ Эфиром X 3. В ОСаДКе ПОЛучаЛИ СМеСЬ СОеДИНеНИЙ С R/(och, моно-ONb эфир протогемина IX) 0.3, R/(минор, протогемин IX) 0.1, R/(следов., бис- ONb эфир протогемина IX) 0.65 (1).

4.2.2. N5-[6(7)-(Протогемин 1Х)-ил]-цикло-(От-Ьеи-0-Рке-Рго-Уа^ (34) К раствору 50 мг (0.077 ммоль) гемина в 0.5 мл сухого DMF прибавляли 1 мл пиридина и 25,3 мг (0.116 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната и перемешивали 15 мин. при комнатной температуре. Одновременно к суспензии 93.5 мг (0.077 ммоль) дигидрохлорида грамицидина S в 0.5 мл DMF прибавляли 22 мкл (0,154 ммоль) триэтиламина и перемешивали 2 мин.

К полученному преактивированному гемину прибавляли раствор грамицидина S и перемешивали 3 ч. К реакционной смеси приливали 5 мл раствора HCl с pH 4, экстрагировали хлороформом и промывали водой до нейтральной реакции. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 30°С. Остаток растворяли в хлороформе и очищали на колонке (30x2 см) с силикагелем, элюировали смесью ХЛФ-МеОН 12:1. Выход 0.038 мг (27 %), Rf 0.48 (2). ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВг: 1738 (СООН), 1636 (амид I), 1540 (амид II). R/ 0.6 (2). Масс-спектр, m/z: [М-СГ] 1739.8. Электронный Спектр, X^naxj HM, ХЛФ:МеОН (8:2), (s-10'3): 400.0 (92.2), 492.0 (1.06), 600.0 (0.60).

4.2.3. Твердофазный синтез [Alas]Ind (35) Синтез осуществляли, исходя из 0.25 г Ринк-амидного полимера с содержанием 0.1 ммоль/г аминогрупп.

2.9. Заключение

Из рассмотрения данных по антибактериальной активности и токсичности ПГ в отношении лейкоцитов, видно, что наиболее активными против микроорганизмов, но в то же время и наиболее токсичными веществами явяляются конъюгаты гемина с амидами аминокислот аргинина, серина и глицина (рис. 29.а, Ь). ПГ, в которых пропионовокислые остатки гемина замещены аминокислотами со свободным карбоксилом, по антимикробной активности и токсичности в отношении лейкоцитов занимают промежуточное мёсто между

6 Антигрибковая активность ПГ изучена в НИИИНА им. Гаузе под руководством в.н.с., к.б.н. Тренина А.С. соответствующими метиловыми эфирами и амидами аминокислот. Эта зависимость хорошо коррелирует со значениями формальных коэффициентов распределения ПГ в системе 1 а) Бї аигеиБ 25923 ■■ Ет Гаесаііз 559 аигеив 100 КС І I ЕШаесшт 569 І Б« ерісіегт 533 Ні Е.соїі 4300 * *** **** *

1 І І І і

Ь) с)

МН2 СООН разе ОСН3 разе МН2 номер соединения

ЫН2 СООН разв ОСНз развЛ номер соединения

N142 СООН разв ОСН3 разв ЫНг номер соединения ЭК. эритроциты ■■ ЭК,0 лейкоциты

ЫН2 СООН разв ОСН3 разе ЫНг номер соединения

ЫНг СООН разв. ОСН, разв.ЫН, номер соединения мн2 СООН разв ОСН, разв .ЫН2 номер соединения

Гм

Рисунок 29. Сопоставление антимикробной активности отношении резистентных штаммов бактерий (а), токсичности в отношении лейкоцитов (Ь) и коэффициента распределения октанол-вода (с) аминокислотных и разветвленных пептидных конъюгатов гемина с производными аргинина (1), глицина (2) и серина (3) (*МПК(ЭК|0) не достигнута). октанол-вода (рис. 29.с). Для разветвленных ПГ антимикробная активность в отношении исследованных штаммов и токсичность, за исключением аргининсодержащих РПГ, ниже, чем у соответствующих линейных аналогов. Выраженно гидрофильные, хорошо растворимые в воде РПГ 23 и 29, содержащие по четыре остатка метилового эфира и амида аргинина соответственно, сохраняют антибактериальную активность, по-видимому, вследствие высокого суммарного положительного заряда (рис. 29.а). В то же время, эти соединения характеризуются низкой токсичностью в отношении как лейкоцитов, так и эритроцитов. При этом антибактериальная активность и токсичность других гидрофильных РПГ 27-28 и 31-32, (содержащих по 4 остатка производных серина и глицина соответственно) существенно ниже. Таким образом, можно утверждать, что одним из факторов, определяющих профиль антибактериальной активности и токсичности ПГ, является полярность их заместителей по пропионовокислым остаткам. По-видимому, существуют некоторые оптимальные уровни полярности заместителей, при которых ПГ проявляют антимикробную активность, оставаясь нетоксичными в отношении эукариотических клеток. Можно прогнозировать полезность предложенного подхода к расчету С^Р для ПГ в комплексе с другими методами для предсказания водорастворимости, антибактериальной активности и токсичности соединений данного ряда.

Наряду с расчетными методами прогнозирования водорастворимости ПГ пригодными для этой цели оказались также физико-химические методы и модельные системы. Так, исследование взаимодействия ПГ с модельными липосомами позволило установить, что проявление ПГ антибактериального действия, как правило, сопровождается наличием выраженной способности усиливать проницаемость липидной мембраны. И хотя четкой корреляции между кинетическими параметрами пермеабилизации мембраны и биологической активностью ПГ не наблюдается, такое исследование позволяет выявить потенциально наиболее активные соединения и отсеять заведомо малоактивные ПГ.

Г~1 Зіаигеиз 25923 І I Етіаесаіів 559 Зіаигеив 100 КС ■■ ЕпШесіит 569 В віерісіеті 533

Номер соединения

Рисунок 30. Специфичность РПГ 27-32 в отношении отдельных грамположительных бактерий (*-МПК не достигнута)

Интересной особенностью некоторых РПГ, не содержащих ионизируемых групп, является их селективное действие в отношении ряда штаммов грамположительных бактерий. Так, соединение 27, не действующее на умеренно резистентные штаммы, ингибирует, хотя и в достаточно высоких концентрациях, ванкомицин-резистентный штамм Е. faechim 569. Соединение 30 в низких концентрациях ингибирует St. aureus 25923 и St. epidermis 533 и в более высоких Е. faecalis 559, оставаясь неактивным в отношении St. aureus 25923 и Е. faecium 569. В настоящее время рядом исследователей ведется поиск антимикробных агентов, изберательно действующих на конкретные виды бактерий [194] с целью уничтожения лишь патогенные бактерий, не затрагивая нормальную бактериальную флору. Таким образом можно снизить риск дисбактериоза, представляющего собой побочный эффект большинства известных антибиотиков. Следовательно, разветвленные ПГ могут рассматриваться в качестве основы для дизайна селективных антибактериальных агентов.

Итак, в ходе данной работы была показана высокая антибактериальная активность ряда ПГ, обладающих низкой токсичностью в отношении эукариотических клеток. МПК ряда ПГ близок к таковым для весьма эффективного антибиотика - ванкомицина, причем ПГ 9 и 29 продемонстрировала более высокую активность и более широкий спектр антимикробного действия, нежели этот антибиотик. Полученные результаты указывают на возможность практического применения наиболее активных ПГ в качестве антимикробных агентов. РПГ 29, содержащее 4 остатка амида аргинина, обладает оптимальным набором свойств, а именно водорастворимостью, наибольшей активностью в ряду синтезированных соединений, оставаясь при этом малотоксичным для лейкоцитов и эритроцитов. Кроме того, это соединение активно в отношении резистентного штамма E.coli 4300, что указывает на возможность создания на основе ПГ агентов, эффективных против не только грамположительных, но и грамотрицательных бактерий. Таким образом, это соединение может рассматриваться в качестве кандидата для дальнейшего развития как нового антибиотика. В ряде случаев, однако, от антимикробного агента требуемся низкая

И ь растворимость в воде, например, при применении в качестве активного начала в составе фармацевтических композиций для наружного применения. Наиболее активными малорастворимыми в воде ПГ являются дизамещенные ПГ 16 и 17, содержащие остатки амидов серина и глицина соответственно. Несмотря на то, что эти соединения обладают сравительно более высокой токсичностью в отношении эукариотических клеток, они могут найти применение в качестве антисептиков и компонентов антибактериальных средств для наружного применения.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Окороченков, Сергей Александрович, Москва

1. Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А.,Лыско А.И. , Лукьянова Л.Д. Геминпептиды, проявляющие пероксидазную активность. // ДАН 1995 - Т.342(3) - р.407-409

2. Евстигнееева Р.П., Лукашова Е.А., Соловьева А.Б, Желтухина Г.А., Лубсандоржиева Л.К. Каталитическая активность гемин-пептидов в реакции гидроксилирования холестерина. // Журн. физ. химии 1995 - Т.96 - р.1972-1974 1

3. Евстигнеева Р.П., Зарубина Т.В., Небольсин В.Е., Носик Д.Н., Носик Н.Н. Производные гемина и их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, применение и фармацевтическая композиция. Патент РФ 2238959,2004

4. Stocker R., Ames B.N. Potential role of conjugated bilirubin and copper in the metabolism of lipid peroxides in bile. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987 - Vol.84 - p.8130-8134

5. Kanakiriya S.K.R., Croatt A.J., Haggard J.J., Ingelfinger J.R., Tang S.-S., Alam J. and Nath K.A. Heme: a novel inducer of MCP-1 through HO-dependent and HO-independent mechanisms. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2003 - Vol.284 - p.546-554

6. Alam J., Killeen E., Gong P., Naquin R., Ни В., Stewart D., Ingelfinger J.R4 Nath K.A. Heme activates the heme oxygenase-1 gene in renal epithelial cells by stabilizing Nrf2. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2003 - Vol.284 - p.743-752

7. Maines M.D. The heme oxygenase system and its functions in the brain. // Cell. Mol. Biol. -2000 Vol.46 - p.573-585

8. Otterbein L.E., Soares M.P., Yamashita K., Bach F.N. Heme oxygenase-1: unleashing the protective properties of heme. // Trends Immunol. 2003 - Vol.24 - p.449-455

9. Clark J.E., Foresti R., Sarathchandra P., Kaur H., Green C. J., Motterlini R. Heme oxygenase-1-derived bilirubin ameliorates postischemic myocardial dysfunction. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000 - Vol.278 - p.643-651

10. Suematsu M., Ishimura Y. The heme oxygenase-СО system as a regulator of hepatobiliary function. // Hepatology 2000 - Vol.31 - p.3-6

11. Ryter S.W., Tyrrell R.M. The heme synthesis and degradation pathways: role in oxidant sensitivity. Heme oxygenase has both pro- and antioxidant properties. // Free Radical Biol. Med. 2000 - Vol.28(2) - p.289-309

12. Poss K.D., Tonegawa S. Reduced stress defense in heme oxygenase-1 deficient cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997 - Vol.94(20) - p. 10925-10930

13. Gonzales S., Erario M.A., Tomaro M.L. Heme oxygenase-1 induction and dependent increase in ferritin. A protective antioxidant stratagem in hemin-treated rat brain. // Dev. Neurosci. 2002 - Vol.24 - p. 161-168

14. Choi A.M., Alam J. Heme oxygenase-1: function, regulation, and implication of a novel stress-inducible protein in oxidant-induced lung injury. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. -1996 Vol.l5(l) - p.9-19

15. Immenschuh S., Ramadori G. Gene regulation of heme oxygenase-1 as a therapeutic target. // Biochem. Pharmacol. 2000 - Vol.60(8) - p.l 121-1128

16. Anderson K.E., Bloomer J.R., Bonkovsky H.L. Recommendations for the diagnosis and treatment of the acute porphyries. // Ann. Intern. Med. 2005 - Vol.142 - p.439-4^0

17. Anderson K.E., Collins S. Open-label study of hemin for acute porphyria: clinical practice implication. // Am. J. Med. 2006 - Vol.l 19(9) - p. 19-24

18. Bonkowsky H.L., Tschudy D.P., Collins A. Repression of the overproduction of porphyrin precursors in acute intermittent porphyria by intravenous infusions of hematin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1991 Vol.68 - p.2725-2729

19. Lamon J.M., Frykholm B.C., Hess R.A., Tschudy D.P. Hematin therapy for acute porphyria. // Medicine (Baltimore) 1979 - Vol.58(3) - p.252-269

20. Kostrzewska E., Gregor A., Tarczynska-Nosal S. Heme arginate (Normosang) in the treatment of attacks of acute hepatic porphyries. // Mater. Med. Pol. 1991 - Vol.23 - p.259-262• V t

21. Смирнов И.В., Левина A.A., Кузнецов И.В., Цибульская М.М., Гладун В.В., Минина Л.Т., Бовенко В.Н., Пивник А.В. Аргинат гемина как корректор порфиринового обмена. // Химико-фармацевтический журнал 2000 - Т.5 - р.3-5

22. Nakamichi I., Habtezion A., Zhong B., Contag C. H., Butcher E. C., Omary M. B. Hemin-activated macrophages home to the pancreas and protect from acute pancreatitis via heme c oxygenase-1 induction. // J. Clin. Invest. 2005 - Vol.115(11) - p.3007-3014 *

23. Fu K., Sarras M.P., Jr. De Lisle R.C., Andrews G.K. Expression of oxidative stress-responsive genes and cytokine genes during caerulein-induced acute pancreatitis. // Am. J. Physiol. 1997 - Vol.273 - p.696-705

24. Sato H., Siow R.M.C., Bartlett S et al. Expression of stress proteins heme oxygenase-1 in acute pancreatitis and pancreatic islet TC3 and acinar AR42J cells. // FEBS Letters 1997 -Vol.405-p.219-223

25. Algul H., Tando Y., Schneider G. . Acute experimental pancreatitis and NF-kappaB/Rel activation. // Pancreatology 2002 - Vol.2 - p.503-509

26. Graca-Souza A.V., Arruda M.A., de Freitas M.S., Baija-Fidalgo C., Oliveira P.L. Neutrophil activation by heme: implications for inflammatory processes. // Blood 2002 -Vol.99-p.4160-4165

27. Maschi E., Mariani A., Curioni S., Testoni P.A. Risk factors for pancreatitis following endoscopic retrograde cholangiopancreatography: a meta-analysis. // Endoscopy 2003 -Vol.35 - p.830-834

28. Silva J.L., Zand B.A., Yang L.M., et al. Heme oxygenase isoform-specific expression and distribution in the rat kidney. // Kidney Int. 2001 - Vol.59 - p.1448-1457

29. Nath K.A., Vercellotti G.M.,Grande J.P. Heme protein-induced chronic renal inflammation: suppressive effect of induced heme oxygenase-1. // Kidney Int. 2001 - Vol.59 - p.106-117

30. Morimoto K., Ohta K., Yachie A. Cytoprotective role of heme oxygenase (HO)-l in human kidney with various renal diseases. // Kidney Int. 2001 - Vol.60 - p. 1858-1866 «n

31. Agarwal A., Nick H.S. Renal response to tissue injury: lessons from heme oxygenase-1 gene ablation and expression. // J. Am. Soc. Nephrol. 2000 - Vol.11 - p.965-973

32. Jarmi T., Agarwal A. Heme oxygenase and renal disease. // Vascular Mech. 2009 - Vol.11- p.56-62

33. Nath K.A., Balla G., Vercellotti G.M. MCP-1 is upregulated in unstressed and stressed HO-1 knockout mice: pathophysiologic correlates. // J. Clin. Invest. 1992 - Vol.90 - p.267-270

34. Nakao A., Neto J.S., Kanno S. Protection against ischemia/reperfusion injury in cardiac and renal transplantation with carbon monoxide, biliverdin and both. // Am. J. Transplant. 2005- Vol.5-p.282-291

35. Goodman A.I., Olszanecki R., Yang L.M. . Heme oxygenase-1 protects' against radiocontrast-induced acute kidney injury by regulating anti-apoptotic proteins'.,// Kidney Int. 2007 - Vol.72 - p.945-953

36. Rezzani R., Rodella L., Buffoli B. Change in renal heme oxygenase expression in cyclosporine A-induced injury. // J. Histochem. Cytochem 2005 - Vol.53 - p. 105-112

37. Shiraishi F., Truong L. Heme oxygenase-1 gene ablation or expression modulates cisplatin-induced renal tubular apoptosis. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2000 - Vol.278 - p.726-736

38. Tayem Y., Johnson T.R., Mann B.E. Protection against cisplatin-induced nephrotoxicity by a carbon monoxidereleasing molecule. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2006 s-1 Vol.290 -p.789-794

39. Ollinger R., Kogler P., Biebl M. Protein levels of heme oxygenase-1 during reperfusion in human kidney transplants with delayed graft function. // Clin. Transplant. 2008 - Vol.22 -p.418—423

40. Martins P.N., Kessler H., Jurisch A. Induction of heme oxygenase-1 in the donor reduces graft immunogenicity. // Transplant Proc. 2005 - Vol.37 - p.384-386

41. Stec D.E., Vera T., McLemore G.R. Heme oxygenase-1 induction does not improve vascular relaxation in angiotensin II hypertensive mice. // Am. J. Hypertens. 2008 - Vol.21 -p. 189-193

42. Vera T., Kelsen S., Stec D.E. Kidney-specific induction of heme oxygenase-1 prevents angiotensin II hypertension. // Hypertension 2008 - Vol.52 - p.660-665

43. Wu C.C., Lu K.C., Chen J.S. HO-1 induction ameliorates experimental murine membranous nephropathy: antioxidative, anti-apoptotic and immunomodulatory effects. // Nephrol. Dial. Transplant. 2008 - Vol.23 - p.3082-3090

44. Kim J.H., Yang J.I., Jung M.H. Heme oxygenase-1 protects rat kidney from ureteral obstruction via an antiapoptotic pathway. // J. Am. Soc. Nephrol. 2006 - Vol.17 - p.1373-1381

45. Ndisang J.F., Jadhav A. Heme oxygenase system enhances insulin sensitivity and glucose metabolism in streptozocin-induced diabetes. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab, 2009 -Vol.296-p.829-841

46. Desrois M., Sidell R.J., Gauguier D., King L.M., Radda G.K., Clarke K. Initial steps of insulin signaling and glucose transport are defective in the type 2 diabetic rat heart. // Cardiovasc. Res. 2004 - Vol.61 - p.288-296

47. Rensing H., Bauer I., Zhang J.X., Paxian M., Pannen B.H., Yokoyama Y., Clemens M.G., Bauer M. Endothelin-1 and heme oxygenase-1 as modulators of sinusoidal tone in the stress-exposed rat liver. // Hepatology 2002 - Vol.36 - p.1453-1465c

48. Yasui Y., Nakamura M., Onda T., Uehara T., Murata S., Matsui N., Fukuishi N., Akagi R.,*

49. Suematsu M., Akagi M. Heme oxygenase-1 inhibits cytokine production by activated mast cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007 - Vol.354 - p.485-490

50. Y. Nitzan, H. Ladan, S. Gozansky, Z. Malik. Characterization of hemin antibacterial action on Staphylococcus aureus. // FEMS Microbiol. Lett. 1987 - Vol.48(3) - p.401-406

51. Chen J., Zhao L., Bai H., Shi G. Electrochemical detection of dioxygen and hydrogen peroxide by hemin immobilized on chemically converted graphene. // J. Electroanal. Chem. o- 2011 Vol.657(l-2) - p.34-38 1

52. Komori K., Takada K., Tatsuma T. Peroxidase model electrodes: Self-mediation of heme peptide multilayer-modified electrodes and its application to biosensing with adjustable dynamic range. // J. Electroanal. Chem. 2005 - Vol.585 - p.89-96

53. Рожкова Е.А., Кулешов К.В., Евстигнеева Р.П. Синтез и антиоксидантная активность азольных производных гемина. // Биоорг. хим. 2000 - Т.26(6) - р.466-470

54. Everse J. Encyclopedia of Biological Chemistry, Volume 2. London: Elsevier Jnc., 2004.4 Ip. 354-361

55. A. Lombardi et al. Pavone Peptide Based Hemoprotein Model. // Chem Rev. 2001 -Vol.101 -p.3165-3189

56. E.S. Ryabova, A.E. Hesslein, M.J. Bjerrum, S. Ciurli, and E. Nordlander Preparation and reactivity studies of synthetic microperoxidases containing b-type heme. // J Biol Inorg Chem. 2004 - Vol.9(4) - p.385-395

57. Dallacosta C., Casella L., Monzani E. . Modified microperoxidases exhibit different reactivity towards phenolic substrates. // ChemBioChem 2004 - Vol.5 - p. 1692-1699

58. Roncone R., Monzani E., Labö S., Sanangelantoni A.M. and Casella L. Catalytic, activity, stability, unfolding, and degradation pathways of engineered and reconstituted myoglobins. // J. Biol. Inorg. Chem. 2005 - Vol.10 - p.l 1-24.

59. Yang W., Zheng H., Yuan W.-T. and Xu J.-G. Silica-hemin Composite Nanoparticles as New Biocatalyst to Highly Sensitive Determination of Glucose in Human Serum. // Anal. Sei. 2004 - Vol.20 - p.1265-1270

60. Lee W.A., Yuan L.C., Bruice T.C. Oxygen transfer from percarboxylic acids and alkyl hydroperoxides to (meso-tetraphenylporphinato)iron(III) and -chromium(III). // J. Am. Chem. Soc. 1988 - Vol.110 - p.4277-4283

61. L. Casella, M. Gullotti, L. De Gioia, E. Monzani, F. Chillemi, . Synthesis, ligand binding and biomimetic oxidations of deuterohaemin modified with an undecapeptide residue. // J. Chem. Soc., Dalton Trans. -1991 Vol.101 - p. 2945-2953

62. Ryabova E.S., Dikiy A., Hesslein A.E., Bjerrum M.J., Ciurli S., and Nordlande E. Preparation and reactivity studies of synthetic microperoxidases containing b-type heme. // J. Biol. Inorg. Chem. 2004 - Vol.9(4) - p.385-395

63. Traylor T.G., Popovitz-Biro R.J. Hydrogen bonding to the proximal imidazole in heme protein model compounds: effects upon oxygen binding and peroxidase activity. // J. Am. Chem. Soc. 1988 - Vol.110(1) - p.239-243

64. Casella L., De Gioia L., Bartesaghi R., Chillemi F. Haem-peptide complexes. Synthesis and stereoselective oxidations by deuterohaemin-L-phenylalanyl-poly-L-alanine complexes. // J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1993 - Vol. - p.2233-2239

65. Traylor T.G., Campbell D., Sharma V., Geibel J. Kinetics and mechanisms of carbon monoxide dissociation from chelated heme-carbon monoxide complexes. Models for hemoprotein reactions. // J. Am. Chem.Soc. 1979 - Vol.l01(18) - p.5376-5383

66. Dallacosta C., Monzani E., Casella L. Reactivity study on microperoxidase-8. // J. Biol. Inorg. Chem. 2003 - Vol.8(7) - p.770-776

67. Nicolis S., Casella L., Roncone R., Dallacosta C., Monzani E. Heme-peptide complexes as peroxidase models. // C. R. Chimie 2007 - Vol.10 - p.380-391

68. Dallacosta C., Casella L. Modified Microperoxidases Exhibit Different Reactivity Towards Phenolic Substrates. // ChemBioChem. 2004 - Vol.5(12) - p.1692-1699

69. Baldwin D.A., Marques H.M., Pratt J.M. Hemes and hemeproteins: 2:The pH-dependent equilibria of microperoxidase-8 and characterization of the coordination sphere of Fe(III). // J. Inorg. Biochem. 1986 - Vol.27(4) - p.245-254

70. Marcus R.A., Sutin N. Electron Transfers in Chemistry and Biology. // Biochim. Biophys. Acta Rev. Bioenerg. - 1985 - Vol.811(3) - p.265-322

71. Rodriguez-Lopez J.N., Smith A.T., Thorneley R.N.F. Role of Arginine 38 in Horseradish Peroxidase: A critical residue for substrate binding and catalysis. // J. Biol.Chem. 1996 -Vol.271 - p.4023-4030

72. Itoh T., Y.K., Yano K., Kajino T., Inada Y., Fukushima Y. Phytol-Modified Heme in Mesoporous Silica: Conjugates as Models of Hemoproteins. // Biotechnol. Bioeng. 2006 -Vol.93(3) - p.476-484

73. Murata S., Kuroda K. Effective Inclusion of Chloro-phyllous pigments into mesoporous silica modified with a,ra-diols. // Chem. Mater. 2001 - Vol.13 - p.2722-2729

74. Yiu H.H.P., Botting N.P. Enzyme immobilisation using SBA-15 mesoporous molecular sieves with functionalised surfaces. // J. Mol. Catal. B: Enzym 2001. - Vol.l5"V,p.81-92.

75. Itoh T., Yano K., Inada Y., Fukushima Y. Photostabilized chlorophyll ain mesoporous silica: Adsorption properties and photoreduction activity of chlorophyll a. // J. Am. Chem. Soc. 2002 - Vol.124 - p. 13437-13441

76. Wang Q., Yang Z., Zhang X. , Xiao X., Chang C.K., and Xu B. A Supramolecular-Hydrogel-Encapsulated Hemin as an Artificial Enzyme to Mimic Peroxidase. // Angew. Chem. Int. Ed. 2007 - Vol.46 - p.4285 -4289

77. Silva G.A., Czeisler C., Niece K.L., Beniash E., Harrington D.A., Kessler J.A. and Stupp S.I. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. // Science 2004 - Vol.303 - p.1352-1355

78. Kiyonaka S., Yoshimura I., Shinkai S., Kato N., Hamachi I. Semi-wet peptide/protein arrayi iusing supramolecular hydrogel. // Nat. Mater. 2004 - Vol.3 - p.58 - 64

79. Schnepp Z.A.C., Gonzalez-McQuire R., Gonzalez-McQuire R. and Mann S. Hybrid Biocomposites Based on Calcium Phosphate Mineralization of Self-Assembled Supramolecular Hydrogels. // Adv. Mater. 2006 - Vol.l8(14) - p.1869-1872

80. J. Silver, B.L. Mossbauer studies on protoporphyrin IX iron(II) solutions. // Inorg. Chim. Acta 1983-Vol.80-p.109-113

81. Chen Z., Hua Z., Wang J., Guan Y., Zhao M., Li Y. Molecularly imprinted soluble nanogels as a peroxidase-like catalyst in the oxidation reaction of homovanillic acid under aqueous conditions. // Appl. Cat. A 2007 - Vol.328 - p.252-258

82. Santos W., Lima P.,Tarley C.,Hoehr N., Kubota L. Synthesis and application of a peroxidase-like molecularly imprinted polymer based on hemin for selective determination of serotonin in blood serum. // Anal. Chim. Acta 2009 - Vol.631 - p. 170-176i t

83. Huang Y., Ma W., Li J., Cheng M., and Zhao J. A Novel p-CD Hemin Complex Photocatalyst for Efficient Degradation of Organic Pollutants at Neutral pHs under Visible Irradiation. // J. Phys. Chem. B 2003 - Vol.107 - p.9409-9414

84. Nicolis S., Pennati A., Perani E., Monzani E., Sanangelantoni A.M., Casella L. Easy Oxidation and Nitration of Human Myoglobin by Nitrite and Hydrogen Peroxide. // Chem. Eur. J. 2006 - Vol. 12(3) - p.749-757,

85. Pironti V., Nicolis S., Monzani E., Colonna S., Casella L. Nitrite increases the enantioselectivity of sulfoxidation catalyzed by myoglobin derivatives in the presence of hydrogen peroxide. // Tetrahedron 2004 - Vol.60(37) - p.8153-8160

86. Y. Watanabe. Construction of heme enzymes: four approaches. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002 - Vol.6(2) - p.208-216

87. Casella L., Monzani E., Fantucci P., Gullotti M., De Gioia L., Strini A. Axial Imidazole Distortion Effects on the Catalytic and Binding Properties of Chelated Deuterohemin Complexes. // Inorg. Chem. 1996 - Vol.35(2) - p.439-444

88. Watanabe Y., Construction of heme enzymes: four approaches. // Curr. Opin. Chem. -Biol. 2002 - Vol.6(2) - p.208-216

89. Monzani E., Alzuet G., Casella L., Redaelli C., Bassani C. et. al. Properties and -Reactivity of Myoglobin Reconstituted with Chemically Modified Protohemin Complexes. // Biochemistry 2000 - Vol.39(31) - p.9571-9582

90. Hayashi T., Hitomi Y., Ando T., Mizutani T., Hisaeda Y. et. al. Peroxidase Activity of Myoglobin Is Enhanced by Chemical Mutation of Heme-Propionates. // J.\^m. Chem. Soc. 1999 - Vol.121 - p.7747-7750.

91. Hayashi T., Hisaeda Y. New Functionalization of Myoglobin by Chemical Modification of Heme-Propionates. // Acc. Chem. Res. 2002 - Vol.35 - p.35-43

92. Redaelli C., Monzani E., Santagostini L., Casella L., Sanangelantoni A.M., Pierattelli R., Banci L. Characterization and Peroxidase Activity of a Myoglobin Mutant Containing a Distal Arginine. // ChemBioChem 2002 - Vol.3(2-3) - p.223-233

93. Roncone R., Monzani E., Nicolis S., Casella L. . Engineering and Prosthetic-Group Modification of Myoglobin: Peroxidase Activity, Chemical Stability and Unfolding Properties. // Eur. J. Inorg. Chem. 2004 - Vol. - p.2203-2213

94. Roncone R., Murtas M., Battaini G., Sanangelantoni A.M. et al. Engineering peroxidase activity in myoglobin: the haem cavity structure and peroxide activation in the

95. T67R/S92D mutant and its derivative reconstituted with protohaemin-L-histidine. // Biochem. J. 2004 - Vol.377 - p.717-724.

96. Ricoux R., Raffy Q., Mahy J.-P. New biocatalysts mimicking oxidative hemoproteins: Hemoabzymes. // C. R. Chimie 2007 - Vol.10 - p.684-702

97. Cunningham I.D., Bachelor J.L., Pratt J.M. Kinetic study of the H202 oxidation of phenols, naphthols and anilines catalysed by the haem octapeptide microperoxidase-8. // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 -1991 Vol.561 - p. 1839-1843

98. Ricoux R., Sauriat-Dorizon H., Girgenti E., Blanchard D., Mahy J.-P. Hemoabzymes: towards new biocatalysts for selective oxidations. // J. Immunol. Methods -2002 Vol.269(l-2) - p.39-57

99. Lang F., Gulbins E., Lerche H. Eryptosis, a window to systemic disease. // Cell Physiol. Biochem. 2008 - Vol.22 - p.373-380

100. Langmuir A.D., Ingraham H.S., Brandt A.D., Lester W., Loosli C.G., Parkins J.E. , et al. Air Sanitation (Progress in the Control of Air-Borne Infections). // Am. J. Public Health Nations. Health 1950 - Vol.40(5 Pt 2) - p.82-88.

101. A. Giuliani, G. Pirri, S. F. Nicoletto. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics. // Central European Journal of Biology 2007 - Vol.2(l) -p.1-33

102. Melo M.N., Dugourd D., Castanho M.A. Omiganan Pentahydrochloride in the Front Line of Clinical Applications of Antimicrobial Peptides. // Recent Patents Anti-Infect Drug Disc. 2006 - Vol. 1(2) - p.201-207

103. Jenssen H., Hamill P., Hancock R. E. W. Peptide Antimicrobial Agents. // Clin. Microbiol. Rev. 2006 - Vol. 19(3) - p.491-511

104. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. // Pharmacol. Rev. 2003 - Vol.55(l) - p.27-55

105. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance. // Pharmacol. Rev. 2003 - Vol.55(l) - p.27-55

106. Bastian A. and Schafer H. Human alpha-defensin 1 (HNP-1) inhibits adenoviral infection in vitro. // Regul. Pept. 2001 - Vol.101 - p.157-161

107. De Lucca A.J. and T. J. Walsh. Antifungal peptides: novel therapeutic compounds against emerging pathogens. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999 - Vol.43 - p. 1-11

108. Alberola J., Rodriguez A., Francino O., et al. Safety and efficacy of antimicrobial peptides against naturally acquired leishmaniasis. // Antimicrob. Agents Chemother. 2004 -Vol.48-p.641-643

109. C.H. Rammelkamp and L. Weinstein. Toxic Effects of Tyrothricin, Gramicidin, and Tyrocidine. // Jour. Infect. Dis. 1942 - Vol.71(2) - p. 166-173

110. Grotenbreg G.M., Witte M.D., van Hooft P.A.V., et al. . Synthesis and biological evaluation of gramicidin S dimers/. // Org. Biomol. Chem. 2005 - Vol.3 - p.233-238

111. Евстигнеева Р.П., Зарубина T.B., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е., Калиберда Е.Н., Румш Л.Д. Тведофазный синтез конъюгатов гемина с олигопептиЧшми и их действие на протеиназу ВИЧ-1. // ДАН 2001 - Т.381(5) - р.630-633

112. Zheltukhina G.A., Nossik N.N., Zheltukhin S.L., Nebolsin V.E. Synthetic hemine-derivatives as virulecide agents and a base for their rational designing. // J. Porphyrins Phthalocyanines 2008 - Vol.12 - p.793

113. Roginsky V., Zheltukhina G. A., and Nebolsin V.E. Efficacy of Metmyoglobin and Hemin as a Catalyst of Lipid Peroxidation Determined by Using a New Testing System. // J. Agric. Food Chem. 2007 - Vol.55(16) - p.6798-6806

114. Kluytmans J., van Belkum A., Verbrugh H. Nasal carriage of Staphylococcus aureus:Vepidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. // Clin. Microbiol. Rev. 1997 -Vol.10(3)-p.505-520 С

115. Seifert H., Kaltheuner M., Perdreau-Remington F. Micrococcus luteus endocarditis: case report and review of the literature. // Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis. 1995 - Vol.282(4) - p.431-435

116. Сидоренко C.B., Грудинина С.А., Резван С.П., Стерхова Г.А. Госпитальныеинфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое

117. Hernandes R.T., Elias W.P., Vieira М.А., Gomes Т.A. An overview of atypical enteropathogenic Escherichia coli. // FEMS Microbiol Lett. 2009 - Vol.297(2) - p.137-149

118. Gause G.F., B.M.G., Brazhnikova M.G. Gramicidin S and its use in the Treatment of Infected Wounds. //Nature 1944 - Vol.154 (3918) - p.703-703

119. Burkhart B.M., Gassman R.M., Langs D.A., Pangborn W.A., Duax W.L.^ Pletnev V. Gramicidin D conformation, dynamics and membrane ion transport. // Biopolymers. 1999 -Vol.51(2) - p.129-144

120. Ушакова И.П., Серебренникова Г.А., Никанорова E.A., Евстигнеева Р.П. Получение липосомных форм гидрофобных производных гемина. // Биоорг. хим. -1989 -Т.15(8)-р.1128-1132

121. Cheng X., Liu X., Bing Т., Cao Z., Shangguan D. General Peroxidase Activity of G-Quadruplex-Hemin Complexes and Its Application in Ligand Screening. // Biophemistry -2009 Vol.48 (33) - p.7817-7823

122. Evstigneeva R.P., Zarubina T.V., Zheltukhina G.A., Nebol'sin V.E. and Kaliberda E.N. Solid-State Synthesis of Oligopeptide Conjugates with Hemin and their Effect on HIV-1 Proteinase. // Dokl. Chem. 2001 - Vol.381(4-6) - p.349-352

123. Гросс Э., Майенхофер И. Основные методы образования пептидных связей -М: Мир, 1983.-р.253-255

124. Crespo L., Sanclimens G., Pons M., Giralt E., Royo M., and Albericio F. Peptide and Amide Bond-Containing Dendrimers. // Chem. Rev. 2005 - Vol. 105(5) - p. 1663-1682

125. Pettit G.R. and Taylor S.R. Synthesis of the Marine Sponge Cycloheptapeptide Stylopeptide 1. // J. Org. Chem. 1996 - Vol. 61 - p.2322-2325

126. Кокряков B.H. Биология антибиотиков животного происхождения. С-Петербург: Наука, 1999. - p. С.146

127. Jenssen Н., Hamill P. and Hancock R. Е. W. Peptide Antimicrobial Agents. // Clin. Microbiol. Rev. 2006 - Vol.l9(3) - p.491-511

128. Bodsworth N.J., Crooks R.J., Borelli S., Vejlsgaard G., Paavonen J., et al. Valaciclovir Versus Aciclovir in Patient Initiated Treatment of Recurrent Genital Herpes: A Randomised, Double Blind Clinical Trial. //J. Urol. 1998 - Vol.l59(4) - p.1420-1421

129. Машковский М.Д. М: Новая волна, 2002. - с. 852

130. Kastin A. J. Handbook of biologically active peptides. London: Elsevier, Academic Press, 2006. - p. 576

131. Naito N., Ohara N., Matsumoto S., Yamada T. The novel fibronectin binding motif and key residues of micobacteria. // J. Biol. Chem. 1998 - Vol.273 - p.2905-2909 ^

132. Grotenbreg G.M., Witte M.D., van Hooft R.M. et al. Synthesis and biological evaluation of gramicidin S dimers. // Org. Biomol. Chem. 2005 - Vol.3 - p.233^238

133. Semraua S., Monster M.W.L., van der Knaap M., Florea B.I., Schmidt Tr, Overhand M. Membrane lysis by gramicidin S visualized in red blood cells and giant vesicles. // Biochem. Biophys. Acta Biomembranes - 2010 - Vol.l798(l 1) - p.2033-2039

134. Окороченков С.А., Быстрова E.A., Павлова E.M., Желтухина Г.А., Небольсин В.Е. Синтез и биологические свойства конъюгатов гемина с незащищенными пептидами. // Вестник МИТХТ 2010 - Т.5(5) - р.71-81

135. Позднев В.Ф. Активация карбоновых кислот пирокарбонатами. Диалкилпирокарбонаты как конденсирующие реагенты в синтезе амидов защищенных аминокислот и пептидов. // Биоорг. хим. 1996 - Т.22(4) - р.280-286

136. Chow Н. and Aldrich J.V. Comparison of methods for the Fmoc solid-phase synthesis and cleavage of a peptide containing both tryptophan and arginine. // Int. J. Peptide Protein. Res. 1993 - Vol.42 - p.58-63

137. Papareddy P, Rydengard V, Pasupuleti M, Walse B, Morgelin M, Chalupka A, Malmsten M, Schmidtchen A. Proteolysis of human thrombin generates novel host defense peptides. // PLoS Pathog. 2010 - Vol.22(4) - p.el000857.

138. Brunetti В., Prada M. Tripeptides with pharmacological properties. Патент GB2207922A 1987

139. Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов -Москва Мир 1965. с.586

140. Abo-Ghalia M, El-Rahman S., El-Kafrawy A. and Kalomuch A. Optimized conventional synthesis of "RGD" and "RGDS" peptides and their sarcosine mimics as integrin GP Ilb/IIIa antagonists. // Amino Acids. 2003 - Vol.24 - p.405^411

141. Birkofer L., Ritter A., Neuhausen P. Di-und Tripeptide und ihre Verwendung zu Peptidsynthesen. // Liebigs Ann.Chem. 1962 - Vol.659 - p. 190-199

142. Крысин Е.П., Карельский B.H., Антонов А.А., Глинка Э.Д. Применение реакции силилирования в синтезе пептидов на основе а-лизина. // Хим. природ, соед. -1978 Т.4 - р.482-485

143. Herrelland W. Е., Heilman D. Experimental and Clinical Studies on Gramicidin. // J. Clin. Invest. -1941 Vol.20 - p.583-591

144. Urry D.W. The gramicidin A transmembrane channel: a proposed рі(ЦіЗ) helix. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1971 Vol.68(3 ) - p.672-676

145. Bourinbaiar A.S., Coleman C.F. The effect of gramicidin, a topical contraceptive and antimicrobial agent with anti-HIV activity, against herpes simplex viruses type 1 and 2 in vitro. // Arch Virol 1997 - Vol.142 - p.2225-2235

146. Гершкович А.А., Кибирев B.K. Синтез пептидов: реагенты и методы. Киев: Наукова Думка, 1992. - р. 358

147. Takemoto Т., Ariyoshi I., Noda I. Method of removing Formyl groups from N-formyl-amino acid and N-formyl-peptide esters. Патент US4021448, 1997

148. Blondlle S.E., Houghten R.A. Novel Antimicrobial compounds identified using synthetic combinatorial library technology. // Trends in Biotech 1996 - Vol.l4^p.60-65

149. Jing W., Hunter H.N., Vogel H.J. The structure of the antimicrobial peptide Ac-RRWWRF-NH2 bound to micelles and its interactions with phospholipids bilayers. // J. Pept. Res. 2003 - Vol.61 - p.219-229

150. Rezansoff A.J., Hunter H.N., Jing W., Park I.Y., Kim S.C., Vogel H.J. Interaction of the antimicrobial peptide Ac-FRWWHR-NH2 with model membrane systems and bacterial cells. // J. Pep. Res. 2005 - Vol.65(5) - p.491-501

151. Kang J.H., Lee M.K., Kim K.L., Hahm K. Structure- biological activity relationships of 11-residue highly basic peptide segment of bovine lactoferrin. // Int. J. Pept. Res. 1996 -Vol.48 - p.357-363

152. Rink H., Sieber P., Raschdorf F. Conversion of NG-urethane protected»arginine to ornithine in peptide solid phase synthesis. // Tetrahedron Lett. 1984 - Vol.25 - p.621-632

153. Рубина А.Ю., Беспалова Ж.Д., Бушуев B.H. Твердофазный синтез пептидов, содержащих аргинин с незащищенной гуанидиновой группой. // Биоорг. хим. 2000 -Т.26(4) - р.263-272

154. Wahlstrom К., Unden A. A new protecting group for tryptophan in solid-phase peptide synthesis which protects against acid-catalyzed side reactions and facilitates purification by HPLC. // Tetrahedron Lett. 2009 - Vol.50 - p.2976-2978

155. Strandberg E., Tiltak D., Ieronimo M., Kanithasen N., Wadhwani P. andXJlrich A.S. Influence of C-terminal amidation on the antimicrobial and hemolytic activities of cationic a-helical peptides. // Pure Appl. Chem. 2007 - Vol.79(4) - p.717-728

156. Okorochenkov S.A., Zheltukhina G.A., and Nebol'sin V.E. Antimicrobial Peptides: the Mode of Action and Perspectives of Practical Application. // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry 2011 - Vol.5 (2) - p.95-102

157. Baldridge A., Amador A., Tolbert L.M. Fluorescence Turn On by Cholate Aggregates. // Langmuir 2011 - Vol. - p.501-506

158. Zhu H., Sedykh A., Chakravarti S.K. and Klopman G. A New Group Contribution Approach to the Calculation of LogP. // Curr. Comp.-Aid. Drug Design 2005 - Vol.1 - p.3-9

159. Bennett E.R., Clausen J., Linkov E., Linkov I. Predicting physical properties of emerging compounds with limited physical and chemical data: QSAR model uncertainty and applicability to military munitions. // Chemosphere 2009 - Vol.77(10) - p.1412-1418

160. Chongsiriwatana N.P., Barron A.E. Comparing bacterial membrane interactions of antimicrobial peptides and their mimics. // Methods Mol. Biol. 2010 - Vol.618 - p.171-182

161. Schmitt Т. H., Schreier S. Hemin-Induced Lipid Membrane Disorder and Increased Permeability: A Molecular Model for the Mechanism of Cell Lysis. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993 - Vol.307(l) - p.96-103

162. Schiller J., Fuchs В., Muller M., Zschornig O., Arnold K. MALDI-TOF MS in lipidomics. // Front. Biosci. 2007 - Vol.12 - p.2568-2579

163. Spickett C.M., Winter H., Zambonin L., Landi L., Jerlich A., Schaur RJ.1, Pitt A.R. Detection of phospholipid oxidation in oxidatively stressed cells by liquid chromatography-mass spectrometry. // Biochem. J. 2001 - Vol.355 - p.449-457

164. Stoilova T.B. , Kovalchuk S.I., Egorova N.S., Surovoy A.Y., Ivanov V.T. Gramicidin A-based peptide vector for intracellular protein delivery. // BBA -Biomembranes 2008 - Vol. 1778(10) - p.2026-2031

165. Феофанов А.В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях. // Усп. биол. хим. 2007 - Т.47 - р.371-410

166. Carballeira N.M, Sanabria D., Cruz С., Parang К., Wan В., Franzbláu S. 2,6-hexadecadiynoic acid and 2,6-nonadecadiynoic acid: Novel synthesized acetylenic fatty acids as potent antifungal agents. // Lipids 2006 - Vol.41 (5) - p.507-511

167. Araujo R., Pina-Vaz C., Rodrigues A. Susceptibility of environmental versus clinical strains of pathogenic Aspergillus. // Int. J. Antimicrob. Ag. 2007 - Vol.29(l) - p. 108-111

168. Michielse C.B. and Rep M. Pathogen profile update: Fusarium oxysporum. // Mol. Plant Patol. 2009 - Vol. 10(3) - p.311-324 С

169. Eckert R., Qi F., Yarbrough D.K., He J., Anderson M.H., and Shi Wenyuan. Adding Selectivity to Antimicrobial Peptides: Rational Design of a Multidomain Peptide against Pseudomonas spp. // Antimicrob. Agents Chemother. 2006 - Vol.50(4) - p.1480-1488

170. Хрущев А.Ю., Клименко JI.B., Митин Ю.В. Разветвленные антимикробные пептиды. // Биоорг. хим. 2007 - Т.33(6) - р.588-5921. Благодарности1. Выражаю благодарность

171. ООО «Фарминтерпрайсез» и лично генеральному директору к.х.н. Небольсину Владимиру Евгеньевичу за оказанную материальную и техническую поддержку в выполнении настоящей работы;

172. В.н.с., д.м.н. Мирчинк Елене Павловне за изучение активности ПГ в'отношении резистентных штаммов бактерий;

173. В.н.с., к.б.н. Тренину Алексею Сергеевичу за исследование активности ПГ против микроскопических грибов;

174. В.н.с., д.х.н. Рыжкиной Ирине Сергеевне за изучение концентрационных зависимостей физико-химических характеристик растворов ПГ;

175. Моей маме, Окороченковой Елене Владимировне за заботу и моральную поддержку, без которых эта работа никогда не стала бы реальностью.11