Экспресс-определение загрязнителей окружающей среды с помощью ферментативных колориметрических тестов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

МИНИСТЕРСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ОБЩЕМУ И ПРОФЕССИОНАЛЬНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 543.9 + 577.15.087.4

!

СТОЙКОВА Екатерина ЕвгёньевнаО

ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕЦЫ С ПОМОЩЬЮ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ ТЕСТОВ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

КАЗАН Ь

1997

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химическо: факультета Казанского государственного университета.

Научные руководители: доктор химических наук, член-корр.РАЕН

профессор Будников Г.К., кандидат химических наук, доцент Евпогин Г.А.

Официальные оппоненты: доктор х^4ич§Йжх наук, профессор

Винтер В.Г.

кандидат химических наук, доцент Евгеньев М.Л

Ведущая организация: ГНПО "Химаналит", г.Санкт-Петербург

Защита состоится "щ " Р^Ли^А^ 1997 г. в

К часов на заседай«

Специализированного ученого совета К 053.29.02. при Казанско государственном университете по адресу. 420008, г.Казань, ул. Кремлевская 18, Казанский государственный университет, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Специализированного совета К 1)53,29.02, п

кандидат химических наук а*! -¿-¿¿V' Г Федотова Н.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время растущее внимание уделяется вопросам контроля объектов окружающей среды на содержание остаточных количеств загрязняющих веществ, особенно таких приоритетных токсикантов, как химические средства защиты растений. Используемые в настоящее время физико-химические методы трудоемки и малопригодны для осуществления оперативного контроля особенно в отрыве от лабораторной базы. В этой связи актуальной является задача разработки упрощенных тестовых методов определения загрязнителей окружающей среды, предназначенных для обнаружения и полуколичественной оценки содержания токсикантов. Практическое внедрение таких экспресс-тестов требует решения задач стабилизации ферментных препаратов, а также интерпретации отклика в многокомпонентных системах, в том числе реальных объектах окружающей среды. Решение этих задач позволит за счет упрощения пробоподготовки, сокращения продолжительности анализа и повышения чувствительности существенно расширить сферу экоаналитического контроля, а отсюда возможно снизить риск загрязнения биосферы и токсического действия загрязнителей на человека.

Диссертация выполнена в рамках проводимых кафедрой аналитической химии и Лабораторией экологического контроля Казанского государственного университета совместных исследований и разработок новых экспресс-методов контроля загрязнения окружающей среды при поддержке гранта ГНТГТ Миннауки РФ "Новые принципы и методы получения химических веществ и материалов. Проект 08.01.13. Теоретические и практические основы изменения избирательности биоспецифических методов анализа для решения конкретных аналитических задач" и программы "Университеты России. Экология. Проект 230-6-2. Разработка теоретических и практических основ биохимических методов экспресс-диагностики состояния водных экосистем".

Целью настоящего исследования явилось создание и практическая апробация новых ферментных тестов для контроля содержания ингибиторов гидролитических ферментов различного механизма действия с использованием стабилизированных в водорастворимых полимерных пленках фермент-

ных препаратов и колориметрических способов детектирования, а также выявление факторов, влияющих на чувствительность и селективность отклика системы на ингибиторы в многокомпонентных срелах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• разработать способы стабилизации препаратов гидролитических ферментов путем их включения в водорастворимые пленки на основе полимерных материалов, установить оптимальный состав полученных пленок и условия их хранения и использования;

• установить аналитические характеристики определения ингибиторов различного механизма действия, в том числе фосфорорганических инсектицидов, ионов тяжелых металлов, а-аминофосфонатов и гидразониевых сшей диакиддитиофосфатов в различных экспериментальных условиях;

• выявить экспериментальные факторы, определяющие чувствительность и селективность определения ингибиторов, в том числе при их совместт"*»« присутствии в растворе;

• изучить влияние макрокомпонентов матрицы на аналитические характеристики определения ингибиторов в объектах окружающей среды и разработать на этой основе упрощенные способы полуколичественного определения остаточных количеств пестицидов в растительных и почвенных вытяжках.

Научная новизна и практическая значимость работы заключается в том, . что она углубляет представления о закономерностях применения стабилизированных водорастворимых препаратов ферментов для определения ингибиторов методами полумикроанализа. Впервые проведено комплексное сравнительное исследование влияния экспериментальных факторов (стабилизатор фермента, условия проведения ферментативной реакции, присутствие в анализируемом растворе эффекторов ферментов) на аналитические характеристики определения ингибиторов различного механизма действия и на этой основе сформулированы подходы к направленному изменению чувствительности и селективности определения соединений с несколькими ингибирующими центрами, а также смесей ингибиторов различного механизма действия. Разработаны новые упрощенные способы полуколичественного определения остаточных количеств

фосфорорганических пестицидов в растительных экстрактах и почвенных вытяжках, проведена экспериментальная проверка возможности применения разработанных ферментных тестовых методов для обобщенной характеристики загрязнения осадков сточных вод и почв загрязнителями антропогенного происхождения.

Часть экспериментальных результатов и выводы на их основе использованы в учебном процессе Казанского государственного университета при чтении общего курса "Экологический мониторинг" и спецкурса "Методы биологического мониторинга и биоиндикашш".

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на Международной научной конференции "Сенсор-Техно-93" (Санкт-Петербург, 1993 г.), IV Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа ЭМА-94 (Москва, 1994 г.), на 5 Международном симпозиуме по кинетическим методам анализа (Москва, 1995 г.), Всероссийской конференции с международным участием "Химотеское разоружение-96. Экология и технология. СНЕМОЕТ-96" (Ижевск, 1996 г.), на Международном симпозиуме "Применение биосенсоров для прямого определения загрязнителей окружающей среды в полевых условиях" (Смоленице, Словакия, 1997 г.), Молодежном симпозиуме по химии фосфорорганических соединений "Петербургские встречи-97" (С-Петербург, 1997 г.), на научной конференции Казанского государственного университета в 1993 г.

Основные результаты изложены в 3 статьях и 6 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах машинописного текста, включает 23 рисунка и 25 таблиц и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы (161 источник).

Во Введении обоснована актуальность работы, ее новизна и практическая значимость, сформулированы цель исследования и основные задачи. Первая глава посвящена обзору литературы по определению загрязнителей окружающей среды с помощью ферментативных методов анализа, а также особенностей определения ингибиторов холинэстераэ и карбоксилэстераз. Основный результаты экспериментальных исследований и их обсуждение приведено в главах 3-5.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе были использованы препараты ферментов бутирилхолинэстеразы из сыворотки крови лошади (БуХЭ, АО'Ъиомед", Пермь), микробиальной карбоксилэстеразы (КЭ, АО"Биотехнология", Москва) и щелочной фосфатазы, стабилизированные путем включения в водорастворимые полимерные пленки на основе Г^-фта-лилхитазана, р-декстрана и полиглюкина. Скорость ферментативной реакции измеряли по времени достижения 30-50% превращения хромогенного субстрата (времени перехода окраски) с помощью колориметрического анализатора АКИ-Ц-01. Опенка чувствительности тестов к ингибиторам производилась по модельным водным растворам и экстрактам из растительного материала и почв, содержащим различные ингибиторы -фосфорорганические пестициды, фториды, соли тяжелых металлов, пшразониевые соли диалкиддитиофосфатов и а-аминофосфонаты (табл.1).

Включение ферментов в пленки водорастворимых полимеров значительно повышает их устойчивость при хранении. Ферментативная активность остается практически постоянной в течение полугода при использовании полиглюкина и декстрана и более года для фталилхитазана (рис.1).

Время хранения, месяцев Рис.1. Зависимость времени (I) перехода окраски от продолжительности хранения теста. БуХЭ в присутствии 0.008% полиглюкина (1), Ы-фга-лилхитазана (2) и р-декстрана (3). Субстрат индофенилацетат 1.7-10"4 моль/л, рН 6.5.

Таблица 1. Химическое строение изученных гидразониевых солей дналкил-дитиофосфатов (А-1 - А-8) и «-аминофосфонатов (Б-1 - Б-20)_

Шифр

Химическая формула

А-1 А-2 А-3 А-4 А-5 А-6 А-7 А-8

[о-Ы02С6Н4СН=Ы^(СНз)2] ИСНэО)гРНО] [о-ас6Н-,сн=м-ы(сн3)21 [(СН30)2РН0] [т-Н02С6ШСН=Ы-1^ ЩСЛШ+ [82Р(ОС2Н5:ь] -1т-Ы02С6Н4СН=М^Н(СНз)2]+(82Р<0СзН7)2Г 1т-ЫО,С6Н4СН=М^Н(СН3)2]+[32Р(ОС3Н7-1.Ы-(о-Ы02С(,Н4СН-СНСН=Ы-ЫН(СН3)2!+ [52Р(ОС2Н5)21' 1о-ЫО,С6Н,СН=СНСН=Ы-НН(СНз)2]+[52Р{ОСзН7)2] 1о^'02С6Н4СН=-СНСН=Ы-КН(СН3)214 [52Р(ОС3Н7-!)2]

Б-1 Б-2 Б-3

Б-4

Б-5

Б-6

Б-7 Б-8 Б-9 Б-10 Б-11 Б-12

РЬСН2ШС<СНз)2Р(0)(ОС2Н5)2 рьснгшснгрюхосгнуг

РИСН(СН ¡)ЫНС(СН})2Р(0)(ОС5Н{ I )2

РИСИ^Н—Р(0)(0С5Н) Ог

и

РИСНКН-^С—-Р(0)(0С5НИ)2

Г 1

Р!,СН2^Н—,С—Р(0)(0С5И,1)2

о

(СН3ЬСНЫНС(СН3)2Р(0)(0С2Н5)2

С6Н,:^НС(СН3ЬР(ОХОСН2СН(С2Н5)С,Н9)2

С6Н,3КНСН(С4Н9)Р(0){0СН2СН(С2Н5)С4Н9)2

C6H1зNHCHPhP(0)(0CH2CH(C2H5)C4H9)2

РЬСН3КНС(СН3)2Р(0)(0СН2СН(С2Н5)С4Н,)2

РЬСНгМН-рС—Р(0)(0СН2СН(С2Н$)С4Щ)2

о

Б-13

Б-14

РЬСН^Н^С~Р(0)(0СН2СН(С2Н5)С4Н9)2 PhCH(CHз)NHC(CHз)2P(0) (ОСН2СН(С2Н5)С,Н9)2

Продолжение табл.1

Б-17

Б-19

о>

ск

Р(0)(0С2Н5)2 .Р<0)(0С3Н5)1

нн

СНз

О]

сн?

СзН,

С3Н7

Б-18

Б-20

ИОХСзНЛ СН2ч ,СНАН5

сн;

^^ин—сн2

4

2

2

В качестве субстратов использовали бугирилхолин иодид (БХИ), ин-дофенилацетат (ИФА) для БуХЭ, ИФА и фенилацетат (ФА) - для КЭ. Присутствие стабилизатора не влияет на скорость ферментативного гидролиза субстрата. С увеличением буферной емкости время перехода окраски увеличивается, а ошибка его измерения уменьшается.

Определение фосфороргапических пестицидов с помощью стабилизированных препаратов БуХЭ и КЭ. Для повышения чувствительности определения тионовые фосфорорганические пестициды предварительно "активировали" путем электролиза в присутствии хлорида натрия. Образующийся хлор окисляет пестицид до более токсичного фосфорильного аналога. В доказательство механизма "активации" было изучено ингибирую-щее действие метафоса и его кислородного аналога параоксона. Соответствующие градуировочные зависимости практически совпадают. Метафос: Сг106 = (0.04±0.02) + (0.62±0.08)1п(^До), Сь моль/л, п=8, г=0.9544 Параоксон: Сг106=(0.09+0.05) + (0.69+0.06)1п(г^1о), С,,моль/л,п=8, г=0.9755

Аналитических характеристики определения пестицидов приведены в табл.2,3.

Таблша 2. Аналитические характеристики определения пестицидов с помо-

щью БуХЭ и КЭ (0.008% >)-фталилхитазана, рН 7.9, инкубирование 10 мин)

С,107 = а + Мп^/О, С„ моль/л

Пестицид а ъ 1 а 1 ь I г

Холинэстераза

Бутирилхолин иодид Индофенилацетат

Диазинон -0.24Ю.07 1.40±0.07 0.9912 -0.03+0.01 0.51+0.01 0.9980

Фозалон -0.40Ю.01 0.62±0.01 0.9965 -0.03+0.01 0.84+0.02 0.9972

Карбофос -0.06+0.01 1.76±0.01 0.9844 -0.53+0.05 1.09±0.04 0.9890

Корал -0.07±0.02 2.66+0.10 0.9681 -0.54+0.10 1.36±0.11 0.9901

ДДВФ -1.50+0.13 18.8±0.1 0.9912 -5.20±0.48 107±6 0.9849

Метафос 0.43+0.06 6.20+0.12 0.9544 -1.44+0.48 6.6210.60 0.9677

Карбоксилэстераза

Фенилаиетат Индофенилацетат

Диазинон -0.2б±0.04 19.8±3.3 0.9889 -0.29±0.05 11.1+0.2 0.9912

Фозалон -1.40±0.10 11.8+0.8 0.9933 -0.50±0.07 13.6+1.1 0.9955

Карбофос -58.8+3.7 146±29 0.9629 -2.40+0.10 26.3±2.1 0.9974

Корал 0.27±0.03 4.35±0.08 0.9957 -0.13+0.01 7.60+0.10 0.9638

ДДВФ -0.11±0.01 4.30±0.20 0.9910 -0.16±0.01 4.47±0.2 0.9920

Метафос -1.46±0.66 9.12±1.00 0.9441

Разработанные ферментные тесты позволяют детектировать присутствие фосфорорганических пестицидов на уровне ПДК для природных вод. Исключение составляет ДЦВФ, для которого предел обнаружения равен 2.5 ПДК. Совместное использование КЭ и БуХЭ может позволить идентифицировать отдельные пестициды- Так, КЭ малочувствительна к карбофосу и более чувствительна к ДДВФ по сравнению с БуХЭ. Для других ингибиторов аналитические характеристики определения с помощью КЭ несколько хуже.

Определение пестицидов в растительном материале и почвах.

Предварительно было установлено, что присутствие этанола или ацетона в концентрации до 20% не влияет на чувствительность тестов к пестицидам. Это позволило разработать упрошенный способ контроля остаточных количеств фосфорорганических пестицидов в растительности и почвах без выпаривания органического экстракта (табл.4). Наименьшая чувствительность определения достигается для культур с наименьшим содержанием масла - ячменя и овса. Это позволяет предположить, что наблюдаемые вариации аналитических характеристик определения обусловлены различной экстрагируемостью пестицидов ирастительного материала.

Таблица 3. Пределы обнаружения (ПО) и диапазоны определяемых концен-

Пестицид Субстрат ПО, моль/л Диапазон определяемых

концентраций, моль/л

Холинэстераза

Диазинон БХИ 2.М0-8 3.4-10-8 - 2.010-'

ИФА 7.7-10-9 8.410"9 - 3.3 Ю-«

Фозалон БХИ 9.4- Ю-9 1.5 10-« . 6.8-10-7

ИФА 1.3-10-8 3.2-10-8 - 3.410"7

Карбофос БХИ 2.7-10-8 5.010-8 - 3.010-«

ИФА 1.6 Ю-8 2.2-10-5 - 7.610-8

Корал БХИ 4.0-10-8 5.0-10-8 - 2.8-Ю-7

ИФА 2.0-Ю-8 4.0-20-8 - 1.4-10"7

ДДВФ БХИ 4.0-Ю-7 5.5-10 7 - 4.5 10'6

ИФА 1.610-« 3.0-10-« - 4.5 10 6

Метафос БХИ 9.310-8 2.0-10-' - 7.6-Ю-5

ИФА 9.910-8 2.0-10"7 - 7.6-10-7

Карбохсилэстераза

Диазинон ФА 3.0-10-7 5.0-10-7 - 7.5-10"7

ИФА 1.7- Ю"7 2.5-10"7 - 7.5-10"7

Фозалон ФА 2.1-10"7 3.5-10-7 - 6.8 Ю-7

ИФА 2.0-10'7 3.5-Ю-7 - 3.3-10-«

Карбофос ФА 2.210-« 3.810-«- 1.5Ю-5

ИФА 4.0-10-7 5.5-10"7 - 6.1-10-«

Корал ФА 7.1-10-7 1.0-10-6 . 2.8-10-5

ИФА 1.5-10-8 3.5-10-8 - 5.5-10-7

ДДВФ ФА 3.6-10-« 5.5-10-« - 8.5-10"5

ИФА 6.7-Ю-7 8.5-10"7 - 2.3-Ю-5

Метафос ИФА 1.4-10"7 2.5-Ю-7 - 1.1-10-6

Таблица 4. Аналитические характеристики определения пестицидов в растительном материале с помощью БуХЭ (фосфатный буферный раствор)

Ингибитор

Зерно

С; = а + Ь 1п ру^), Сь мг/кг

Ь

Диазинон

Гречиха Ячмень Овес

Пшеница

Рожь

Сорго

0.001+0.002 -0.006±0.(Ю2 -0.002+0.002 -0.001 ±0.004 -0.002±0.006 -0.009+0.004

0.05+0.005 0.07±0.005 0.06+0.008 0.03+0.002 0.03Ю.005 0.04±0.005

0.9809 0.9859 0.9819 0.9927 0.9764 0.9463

Фозалон

Гречиха Овес

-0.003+0.004 0.003+0.006

0.03+0.004 0.03±0.002

0.9598 0.9871

Метафос Гречиха

0.005±0.002

0.12+0.01

0.9859

а

г

При определении пестицидов в почвах степень их экстракции [стоном не превышает 60%, но и в этом случае ингибирование имеет чисто :обратимьш характер, те. соли металлов, присутствующие в почвах, на -(гибирующее действие пестицидов не влияют.

Влияние солей металлов на определение пестицидов. При определении ггэточных количеств пестицидов в реальных объектах окружающей среды юбходимо учитывать возможное влияние ионов металлов. С этой целью 1ми были изучено действие солей тяжелых металлов, являющихся ¡ратимыми ингибиторами БуХЭ (табл.5).

Таблица 5 Аналитические характеристики определения ионов металлов и [гор идо в с помощью БуХЭ (трис-буферный раствор, ИФА 1.7-10"4 моль/л)

Ингибитор

РН

Сг101 = а + Ь-(1Л)> С(, моль/л

Ь

Диапазон определяемых концентраций, моль/я

Си2+ Н82+

РЬ2+ А1Э+ Ре2+ Р-

В отсутствие N -фталилхитазана

6.5 5.5 6.5 6.5 5.5 4.0 4.0

-5.04±0.12 -1.54±0.04 -8.83±0.19 -4.7±0.17 -0.14±0.01 -3.69±0.08 0.66+0.15

4.13+0.10 1.28±0.05 9.01±0.18 6.13±0.14 0.25±0.01 3.58±0.09 0.68+0.08

0.9823 0.9824 0.9976 0.9861 0.9993 0.9836 0.9944

2-10"4 - 2-Ю"3 МО"5 - 5-10-3 5-10-3 . з.ю-2 310-4- 510-3 5-10'3 - 3.5-Ю-4 2-МИ - 1.610-3 МО"4 - МО"3

Си2+ С(12+ НВ2+

РЬ2+

А13+

В присутствии >}-фталилхатизана

6.5

6.5 5.5

6.5

5.5

-16.67±1.2 -22.2±1.2 -0.70+0.02 29.1±1.15 -5.61±0.07 -1.73±0.01 -0.63±0.01 0.21±0.07

16.67±1.0 18.5Ю.7 0.57±0.01 14.28±1.4 6.6±0.04 1.79+0.07 0.71+0.01 0.07+0.01

0.9925 0.9873 0.9818 0.9622 0.9967 0.9986 0.9884 0.9982

1.25-Ю-3 - 3-Ю"3 5-Ю-3 - 310-2 МО-5 - 5-10"4 5-НН - 5-10-3 310"4- 2-Ю-3 2.Ю-3-4.10-3 510-5- 310-4 310"4 - 510"4

При совместном присутствии ионов металлов и пестицидов необрати-эе ингибирующее действие последних снижается в силу "защитного эф-екта", который зависит от природы металла, условий определения и 1Стично подавляется стабилизатором, в наибольшей степени Ы-фталилхи-13аном (табл.6).

Таблица 6. Аналитические характеристики определения метафоса в присутствии солей металлов с помощью БуХЭ (трис-буферный раствор, субстрат ИФА 1.7-10"* моль/л)_

Эффектор СЮ3, моль/л Сг10й = а + b ln(tj/t0), С), моль/л

В отсутствие N-фталилхитазана В присутствии 0.008% N-фталилхитазана

aíb|r albir

0 0.0б±0.02 0.56±0.0б 0.9872 0.02±0.003 0.34+0.01 0.9837

Си2+, 0.5 0.09+0.01 0.78+0.03 0.9903 0.004+0.001 0.19±0.001 0.9903 рН 6.5 0.75 0.16+0.01 0.97+0.03 0.9544 0.07+0.008 0.26±0.01 0.9757 1.0 0.19±0.01 1.15+0.02 0.9922 0.16Ю.01 0.27±0.01 0.9734 1.5 0.15Ю.01 1.08+0.06 0.9938 0.12Ю.009 0.29±0.01 0.9668

Cd2+,pH 6.5 10 0.06±0.01 0.84+0.07 0.9913 0.02±0.01 0.34±0.02 0.9973

Определение комбинированных ингибиторов. Азотсодержащие фосфорорганические соединения способны в зависимости от строени: проявлять и обратимое, и необратимое ингибирующее действие за сче наличия аминогруппы и фосфорорганического фрагмента. Нами изучень два класса таких соединений - гидраэониевые соли диалкилдитиофосфатов I а-аминофосфонаты (табл.1). Как оказалось, изученные соединена соединения либо не проявляют ингибирующего действия (А-3 - А-8, Б-20) либо демонстрируют лишь слабое обратимое ингибируюшее действие (А-1 А-2 - ПО 2-Ю"5 моль/л, а-аминофосфонаты - ПО ()-н})10 5 моль/л.). Можнс предположить, что низкая активность изученных соединений обусловлен; взаимным связыванием (ионного характера или за счет водородных связей; азот- и фосфорсодержащих фрагментов молекулы. Электрохимическа5 "активация" ингибиторов значительно повысила чувствительность ш определения, причем и гидразоны, и фосфонаты стали демонстрирован необратимое ингибирующее действие на ферменты (табл.7-9). Для гвдразо ниевых солей ингибирование определяется строением фосфатного аниона Для а-аминофосфонатов наибольшее влияние на ингибирующее дейстаи: оказывают радикалы при атоме фосфора, непосредственно соседствующие с аминогруппой. При использовании КЭ ингибирующее действие все) указанных соединений усиливается в кислой среде с максимумом при рИ 3.5-4.0. Достигнутые в этих рабочих условиях пределы обнаружения более чем на порядок ниже полученных при использовании БуХЭ.

аблица 7. Аналитические характеристики определения гидразониевых со-гй диалкилдитиофосфатов (трис-буферный раствор, рН 4.0, субстрат ИФА 7-10"4 моль/л, инкубация 10 мин.)_

-Тнги- 1 Диапазон определяемых ПО, с,= а + Ып(1.Д0),

эитор ! концентраций, мкмоль/л мкмоль/л С 7, МКМОЛЬ/Л

а . 1 ь 1 г

Бутирилхолинэстераза

А-1 1.65-6.70 1.40 0.63+0.28 7.67+0.65 0.9928

А-2 1.70-6.84 1.36 0.87±0.56 4.90+0.86 0.9593

А-3 0.9-1.6 0.7 0.0±0.17 5.44Ю.32 0.9518

А-4 0.5-1.3 0.4 -0.12+0.07 4.17+0.34 0.9958

А-5 0.4-1.5 0.35 0.04+0.06 2.03±0.12 0.9933

А-6 1.0-2.5 0.4 1.9+0.09 2.54+0.18 0.9922

А-7 0.2-2.5 0.2 0.13+0.46 4.49+1.24 0.9869

А-8 0.3-2.5 0.2 -0.23+0.19 2.67±0.27 0.9743

Карбоксил эстераза

А-1 0.13-3.4 0.04 0.01+0.02 0.33+0.03 0.9851

А-2 0.10-3.4 0.05 0.005+0.022 0.43+0.04 0.9861

А-3 0.13-3.7 0.09 0.07±0.02 0.25+0.04 0.9613

А-4 012-2.9 0.09 0.06+0.02 0.29+0.003 0.9784

А-5 0.18-0.49 0.11 0.08±0.02 0.31±0.03 0.9850

А-6 0.16-0.24 0.11 0.15+0.01 0.09±0.02 0.9637

А-7 0.25-1.2 0.23 0.31+0.05 0.78±0.07 0.9766

А-8 0.08-0.3 0.07 0.05+0.01 0.22+0.02 0.9921

Вероятно, протонироваяие аминогруппы высвобождает фосфориль-ый ингкб игорный центр. Кроме того, КЭ малочувствительна к действию жных эффекторов, поэтому в отличие от БуХЭ не проявляется "защитный [>фект" гидразониевого и аммонийного катионов.

Фосфорилированные каликсарены Б-15 - Б-19 демонстрируют тактически совпадающие храдуировочные графики, поэтому, возможно, их ягибирующее действие связано с процессами связывания субстрата в жплексы "гость-хозяин". В отношении щелочной фосфатазы фосфорили-звапные каликсарены демонстрируют слабое активирующее (5-10-7-2.210"6 оль/л) и иншбирующее (2.5- 10 б - 4-10'6 моль/л) действие.

Достигнутые пределы обнаружения позволяет применять ферментные сты для контроля вроцессов с участием мембранных переносчиков, в ¡хнологическом контроле синтеза фосфорорганических комплексонов, в 1енке чистоты антипиренов и фармацевтических препаратов.

Таблица 8. Аналитические характеристики определения а-аминофосфонатов с помощью БуХЭ (трис-буферный раствор, рН 7.9, субстрат ИФА 1.7-10 4 моль/л. инкубация 10 мин.) __

Ингибитор Диапазон определяемых концентраций, мкмоль/л ПО, мкмоль/л Сг = а 4- Ып^Го), С], мкмоль/л

а Ь г

Б-1 2.7-7.1 1.4 0.72+0.15 6.44+0.22 0.9831

Б-2 8.1-38.8 3.9 3.0±0.87 51.±9 0.9900

Б-3 0.4-1.3 0.3 0.20±0.02 1.50±0.06 0.9919

Б-4 0.4-2.0 0.25 0.10±0.04 1.75±0.07 0.9894

Б-5 0.3-2.5 0.2 -0.05±0.04 2.05±0.06 0.9864

Б-6 1.3-7.4 0.8 0.52±0.14 8.2±0.3 0.9745

Б-7 26.8-84.4 19.1 9.55+0.48 115.5±1.0 0.9989

Б-8 0.7-2.3 0.5 0.3±0,03 1.6Ш.04 0.9898

Б-9 0.3-2.2 0.2 0.01+0.003 1.76+0.01 0.9974

Б-10 0.2-1.2 0.1 0.14+0.02 0.85±0.02 0.9947

Б-11 1.1-6.1 0.7 -0.06Ю.07 7,79+0.14 0.9894

Б-12 0.6-4.1 0.2 0.13+0.09 4.70Ю.19 0.9560

Б-13 0.3-3.1 0.2 0.14+0.02 1.4б±0.02 0.9964

Б-14 0.2-1.1 0.1 0.02±0.07 0.89*0.11 0.9767

Б-15 0.08-0.8 0.07 -0.03i0.05 0.41Ю.07 0.9552

Б-16 0.05-0.7 0.02 -0.03±0.02 0.42±0.02 0.9792

Б-17 0.08-0.5 0.03 0.04±0.01 0.25±0.01 0.9764

Б-18 0.07-0.7 0.02 -0.03±0.02 0.32+0.02 0.9941

Б-19 0.1-0.9 0.05 0.09+0.01 0.36±0.01 0.9787

Оценка общей за1рязненности осадков сточных вод тяжелыми металлами. Присутствие подвижных форм тяжелых металлов ограничивает возможности утилизации осадков сточных вод в а гро про и з иодстве. Нами изучена возможность оценки общей загрязненности осадков по их ингибирующему действию на БуХЭ. Как выяснилось при моделировании загрязнения осадков известными количествами солей металлов, последующая кислотная и солевая вытяжки не позволяют полностью извлечь вносимое количество солей. По сравнению с водными растворами солей металлов снижается чувствительность определения, в 2-10 раз увеличивается нижняя граница определяемых содержаний, причем снижение чувствительности наиболее значительно для осадков с небольшим сроком хранения, богатых органическими соединениями, способными удерживать металлы в нетоксичных комплексах.

Таблица 9. Аналитические характеристики определения а-аминофосфонатов : помощью КЭ (трис-буферный раствор, рН 4.0. субстрат ИФА 1.7-10"4 моль/л, инкубация 10 мин.) __

Ингибитор Диапазон определяемых концентраций, С[-107 , С], моль/л ПОЮ7, моль/л Сг107 = а + Ып^), С], моль/л

а 1 ь 1 Г

Б-1 0.7-3.5 0.4 0.05+0.6 4.07+0.11 0.9873

Б-2 82.6-310 48.1 3.83±5.6 443.5±И 0.9800

Б-3 2.8-13.8 1.5 0.86±0.09 6.87+0.09 0.9955

Б-4 0.8-12.7 0.5 -2.34±0.2 9.46±0.21 0.9939

Б-5 2.5-25.0 1.8 0.6+0.13 16.0±0.17 0.9982

Б-6 1.2-8.6 0.7 1.16+0.08 5.72±0.12 0.9876

Б-7 19.6-295 8.0 -15.3±3 233.5±5 0.9896

Б-8 1.2-11.3 0.9 -0.24±0.06 11.13+0.11 0.9983

Б-9 0.5-4.3 0.2 -0.01Ю.04 2.48+0.04 0.9957

Б-10 0.4-2.1 0.3 0.15+0.033 1.17+0.034 0.9948

Б-11 4.0-11.0 2.1 -0.97+0.32 11.31±0.04 0.9804

Б-12 0.4-2.0 0.2 0.26Ю.03 1.29±0.34 0.9762

Б-13 0.4-0.8 0.2 0.15±0.02 0.71+0.03 0.9654

Б-14 3.6-21.4 2.1 0.9±2.85 18.6+4.07 0.9630

Б-15 1.4-8.2 0.9 0.66±0.11 4.09±0.1 0.9785

Б-16 1.5-4.9 1.0 0.67+0.14 4.32+0.23 0.9619

Б-17 0.6-2.0 0.3 -0.36+0.03 6.19±0.12 0.9929

Б-18 1.4-10.2 0.8 -0.12±0.21 10.13+0.35 0.9645

Б-19 0.9-4.6 0.3 -0.74+0.1 7.12+0.26 0.9555

Б-20 38.6-386 21.7 -66±9 585±18 0.9867

Наблюдаемое в некоторых случаях активирующее действие водных (ытяжек связано, вероятно, с соэкстракцией компонентов поглощающего :омплекса и изменения буферных свойств рабочего раствора. Ацетоновые мтяжки из этих осадков проявляют обратимое ингибирующее действие, годавляемое электрохимической обработкой.

ВЫВОДЫ

. Разработаны колориметрические ферментные тесты на основе препаратов БуХЭ из сыворотки крови лошади и микробиальной КЭ, стабилизированных путем включения в твердые растворы на основе 14-фгалилхитазана, полиглюкина или р-декстрана, предназначенные для

определения ингибиторов ферментов в водных системах. Предел! обнаружения фосфорорганических пестицидов составляют п (10'8^10 9 молъ/л, что позволяет детектировать присутствие загрязнителей объектах окружающей среды на уровне ПДК. Аналитические харакгери стеки определения обратимых и необратимых ингибиторов ферменто зависят от природы стабилизатора, субстрата и буферного раствора.

2. Электролиз в присутствии хлорида натрия позволяет повысить чувстви тельность определения тионовых фосфорорганических соединений 1 аминофосфонатов. Показано, что механизм "активации" состоит в окис лении тиофосфатов и фосфонатов электрохимически генерированньн хлором до более активных ингибиторов.

3. Присутствие обратимых ингибиторов (фториды, ионы тяжелых металлов снижает чувствительность определения пестицидов. Подбор рабочи условий определения (состав буферных растворов, добавки N фталилхитазана) позволяют подавить защитное действие эффекторов.

4. Установлено, что гидразоны диалкидцитиофосфатов и а-аминофосфо наты являются слабыми ингибиторами ферментов вследствие взаимного связывания аминогруппы и фосфата (фосфоната). Электролиз, разру тающий связывание, приводит к необратимому ннгибирующему дейст вию с максимумом при рН 3.5-4.0. Применение КЭ, устойчивой к дейст вию ионных эффекторов, понижает пределы обнаружения до п (10'7-г10 8 моль/л.

5. Разработан упрощенный способ экспресс-определения остаточки количеств фосфорорганических пестицидов в зерне и почвах без удалс ния органического растворителя из экстракта с пределом обнару;;:ен;с пестицидов п^Ю-'ч-Ю"2) мг/кг с учетом влияния компонентов раститель ной матрицы на его аналитические характеристики.

6. Показана возможность использования холинэстеразного теста д;и оценки общей загрязненности осадков сточных вод тяжелым! металлами. Наблюдаемая активация БуХЭ обусловлена изменение» буферных свойств и кислотности вытяжек в процессе экстракции Ацетоновые вытяжки из этих осадков проявляют обратимо! ингибирующее действие, подавляемое электрохимической обработкой.

Of ^ное содержание работы изложено в следующих публикациях:

Никольская Е.Б., Евтюгин ГЛ., Искандеров P.P., Герасимова (Стойкова) .Е., Латыпова В.З. Определение присутствия фосфорорганических пести-идов в растительных продуктах с помощью сенсорных устройств на основе >линэстеразы. / Тез. докл. Межд. конф. "Сенсор-Техно-93. Сенсорные сис-:мы и компоненты." С.-Петербург, I993.-C.278. Евтюгин Г.А., Стойкова Е.Е. Повышение чувствительности ферментатив->т определения фосфорорганических пестицидов путем электрохимиче-сой активации пробы. / Тез. докл. IV конф. по электрохимическим методам »апиза "ЭМА-94" Москва, 1994.-C.19I.

Evtugyn G.A., Stoikova Е.Е., Budnikov Н.С., Nikolskaya E.B. Determenation ' P,N-contaiiiing organik compounds based on carboxylesterase from mold fungi. ¡lh Int. Symp.of Kinetics in Analytical Chemistry "KAC-95". Moscow, 1995. P.45. Евтюгин Г.А., Стойкова E.E., Искандеров P.P., Никольская Е.Б., Будни->в Г.К. Электрохимическая пробоподготовка в ферментативном о и редел с-ш ингибиторов холинэстеразы.//Журн.анал.химии.-1997.-Т.52.-№1.-С.6-10. Евтюгин Г.А., Стойкова Е.Е., Никольская Е.Б., Будников Г.К. Влияние >нов металлов на колориметрическое определение необратимых ингибито->в холинэстеразы. // Журн. анал. химии.- 1997.-Т.52.-№2.-С.188-192. Будников Г.К., Евтюгин Г.А., Никольская Е.Б., Стойкова Е.Е. Влияние жрокомпонентов на контроль следовых количеств фосфорорганических кепкантоп в объектах окружающей среды. / Тез. докл. Всерос. конф. с ме-1ународным участием "Химическое разоружение-96. Экология и техноло-я". Ижевск, 1996,- С.20-21.

Стойкова Е.Е., Стоиков И.И. Ферментативное определение гидразонов алкилдитиофосфорных кислот и а-аминофосфонатов в водной и водно-танической средах. / Тез. докл. Молодеж. симп. По химии фосфороргани-ских соединений "Петербургские встречи-97". С.-Петербург, 1997.- С.20. G.A.Evtugyn, E.P.Riiaeva, E.E.Stoikova, V.Z.Latipova, H.C.Budnikov The plication of inhibitor biosensors in local programmes of environmentral rmitoring./ Proc. Of NATO Advanced Research Workshop on Biosensors for the reel Monitoring of Environmental Pollutants in Field. Smolenice, Slovakia, ay 3-9, 1997,- 1997,- P.49.

G.A.Evtugyn, E.P.Rizaeva, E.E.Stoikova, V.Z.Latipova, H.C.Budnikov The plication of Cholinesterase biosensor for preliminary screening of the toxicity of ste waters.// Electroanalysis.- 1997,- V.9.- N 14.

Соискатель