Синтез O- и S-гликозилдиглицеридов и изучение их свойств в составе модельных мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ км. М.Б. Ломоносова

йпсйиализировагашП Совет Д 053.41.01

Нз правах рукописи

дубовская светлана игоизна

копта о- и' з-гжсчози'ию'жшрисов и изучиие их свойств

В СОСТАБЕ МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАН

02.00.10 - Бясорганичоская хкмая, хжия природных п Сияиологически ахтншшх веществ

диссертации на соискание ученой степени кандидата хиуических наук

Москва - 1994

Тобаа шшлнена на к>4влро хакш и техяолопти тсп-сих оргадачоск соеджопкй Московской Государстве;шой Академии 'Тонкой Хгажчеыи Технологии к,!. И.В. Ломоносова

Научный руководитель:

д.л.л., профессор СереОреннюедва Г.Л. Офшшалышо ояпонелти:

д.Х.н., вед.н.с. МолотковсгсА В.Г.

к.х.н., еэд.н.с. Проказоза К.Р.

В£<дур;гл организация: НЛЦ "Куробкос"

Зздта состоится [Л-ГЛуР7'11-^^ б /чесов но ззсздыши Сп?«;:а.,ц".с.ф01зшшого Соьтга Д 063.41.0) гг/1! МссксасиоК ГосудйрстпзшюЕ Акпдомл;: То»псоЛ Хл'.тлчэской Тех:<олоп:и ьм.М.Б.Ломоносоьл по адресу; г. !.!оскьа, пр. Вернадского, 86

С диссертация мочено ознакомиться в библиотеке 1.ГЛТГ км.М.З.Ломоносова (113031, г. Москва, ул. М. Шрогспская, 1) ' Автореферат разослан ._/ 1?Э4г.

Учений секретарь Специализированного Совета, калдидгт химических наук.

сирпий научный сотрудник д Лота« А.И.

)Т Л_

051Ш ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Глицэрогликолипияы являются осковнчми юююниптоми мембран растительных клеток и микроорганизмов, встречайся в тканях кквотаых. Эта соединения выполняют структурную роль, а ■апг.э участвуют в процессах иеиклаточного узиагзния. Однако исследо-:ания, направлению но изучение их мембранных свойств, начаты срэв-щтэльно недавно и в настоящее Ервчя отсутствует информация о взаи-юсвязи структуры этого класса молекул и выполняв мух ими в составе йгокэмбраи функций. Выявление этсй взаимосвязи предполагает деталь-гао изучение фпзичцских свойств как этих соединений, так и ряда их ¡налогов.

В настоящее время охарактеризовали лолгмср^кыс- свойстьа ьодных Г-;спврс;:й ряда дяэлкилмшх аналогов гликозкддиглицарпдоз и начаты ^следования дгзцпльпых соединений с полностью насыщенными уг.лэводо-зоднымя цепями. Било показано, что эта свойства определятся струк-гурнимя особенностями: ¡информацией плранозного кольца, длиной кир-юккслотных остатков, хиральностью глицеринового фрагмента, стерео-гликозидноЗ связи. Для более полного потманчя уникальности гтрухтуршг я дингшчосгап свойств молекул глицероглккогл'лидоз, оСо-зпэчквоэтяа гликозидзой связь», представлялось целесообразным ксс::а-дезать глнцероглкколЕПИдц с заменой 0- глихозидноЯ на S -глггкозидяуа :вязь. Такая зюгона позволяет, с одной стороны, изучить взаимосвязь зтруктура-фугащия в ряду х-ликозилдиглшорэдов, о другой стороны, подучить соединения с высокой гидролитической стабильностью и устойчивостью к дойстзив глякозидаз, что .может быть использовано, например.. ара создании модельных .фотосичтозирущих мембран и в состава липооом цля направленного переноса лекарственных средств к орг'зяам-миионям.

Данная работа шпзлизка в соответствии с гутном научных ■ исследований хафецры XTÍOG МГАТХТ им. М.В.Ломояосоза по теме Й23-865 "Вы-долепи а и синтез отдельных молекулярных mío в липидов, изучение их свойств в мембранах, использование длн создания физиологически ак-тишк лшмлных. препаратов и липосо:«шх форм" (номер государственной регистрации 0ГЭЛ0016432 ).

ЦЕЛЬ РДЕОТН. Синтез S- и 0-гликсзплдиглицеркдов, в том числе солержгдах дейтзриезио мотки, разработка метсдсз разделения диасте-реомерных сдасей S-гликозллдяглиперидоэ. Изучение особенностей поведения дейтержвчешх соэдкнений в составе м?делыш мембран.

¡ЦУЧЯАЯ КСВИЗНа. Пред/степ удобный подход к синтезу сероссдзр-жаздех р-глико:зиляиглж;еридсв из доступных синтсн з - ;яюгликозиллтк-Леоиноь. Пред --;:-?:: модпфкаирсвячкнй подход'к удаление ацетильных за-

- г -

вдшшх гру;ш с углеводной компоненты гилрас-;шоллзом. позволяющий по-ьисить выхода. Осуществлено разделение дааотвродмэрной скос;: ! ,2-ди-< пзлъматокл-Б- <2,3,4. б^зтраацэтил-р-В-гажстогараноэил) -3-тисглице-, рина методом рацгасличвской ВЭЖЗС. Впервые синтезированы 3- и 0-галзк-тозиддаглицорида, содержащие лэйтеривше метки по а-лолоааюш пвль-'■•' митоилышх остатков. Синтезированы и разделены методом' многократной кристаллизации дейтеромечешв диастореомора глидазалдиглицорида. ! Вшзрще прсьэдоио систематическою сравнительное исследование поведе-• к;:;! в состава модельных мембран дейтеромечишх' Б- и 0;; галактозилдиглицоридов, а также диастерооморов з-глшозилдиглпцзряда ' мэтодом гН-Я.!Р.

ПРД.КТИЧТОия :ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Предложи новый удобшй метод по-\ лучения оэросодоргшид* р-гликозкдляглацерадов. Разработан шдлфпцп-, . ровгшкй подход к удалении ацетилышх защитных групп с углеводной компонента гтерлзинодигом, позволяющий повысить выхода г.тшсозадш-•тллцеридов. Подобраны условия подучекся диастеросжерных форм соросо-держ!ших галзктоэилдаглипаридов и глдаозилдаглицерлдов штодауд ре-дщслвчоской-взкх-и киогократной красголлнзадги соответственно, йоду-

• танине коеш дскшэ о поведении Б- и О-гзлактозиддкглкцзридсв, а .,'< ;1й1®э диэстересморов Я-глюкозилдигмащврвдов в составе подальше ."ом-

• Срш могут .ойть использованы п мемораиолапм.

' Г • ДШ^РТОДЖШОЙ РАБОТОЙ З.ЦЦЭДАЭОТСЯ слздувдко основные молоке: / .яия:

, йобый люзод сивхеза 'серосодержащих р-гляхозющкгдшцвридов. моди-ФэдировшашЯ метод удаления ацетильных завдтщк групп с углеводной когыюконта, синтез дойтеромеченшс гдикозилдиглглцеридов;

> разделение диастереомерных смесей серосодержащих 'галактооилди-гляцерздов методом рециклической ВЗЯХ и глюкозилдиглицеридов ко ходом многократной кристаллизации;

исследования по сравнительному изучении динамического поведения в составо модольшпс мембран дейторомочошх серосадера&пда диазтерео-1 коров ¿--глвкоэкддаглицерида методом '"Н-Я!'Р;

исследования'По сравнительному изучеташ динамического поведения в составе модельных «емЗран дейтеромечегапс 3- и 0- гадактсзклдигли-■ царидоа, .

- Результата,'ивлоханше в диссертации, ялтрлхйъъ,

на Всесоюзной конференции "Опенка фармакологической активности тамм-•. ческах аоеданэний:.пркгщилк и подходи" (Купавна, ьоябрь, 1030). Рос-сийсяой конференции "Биолопгчески активные 'соединения, синтез -.1 использование" (Пенза, сентябрь, 1992).

ПУБЛИКАЦИИ: По материалам диссертации опубликованы I статья. 2 )зисов конференции, 3 статьи в печати.

ОБЪЕМ РАБОТЫ: Диссертационная работа изложена на страницах шгаописного текста, содеретт^рисукков.-З'таблиц, и состоит из '.едущих разделов: введение, литературный обзор, обсуждение резуль->тов, экспериментальная часть, спи-ок литературы, включаптай - "ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ К 1К ОБСУЖДЕНИЕ 1 . СИНТЕЗ СЕРО- И КМСЛОРОДСОДЕПШЩ ГЖК03И.Ш1ГЛИЦЕ{ЭД0В, Для проведения сравнительного изучения поведения гликозилдигли-|ридов и их серосодержащих аналогов к составе модельных мембран медом ?Н-ЯМР нам Сило необходимо синтезировать ряд соединений, з том :сле содержащих дейториевие метки. ОсноЕними проблемами в синтезе ро- и кислородсодержащих гликозилдаглкцеридов являются стересспо-фичность гликозилирования, выходы целевых соединений не стадиях ккозилирования к дезпцетилирования, а таккв возможность получения дивидуальнкх диастереомероз.

1.1. СИНТЕЗ 1,2-ЛЮТАЛКЧГ1'011Л-3-(2,Зр416-ТЕТРААШЛ'1М-р-П--ГЛЖ0ПИРАН03ИЛ) -3-Т1ГО ■-871 -ГЛИЦЕРИНОВ. Традиционный подход к синтезу серосодеркащк г.такозилдиглицори-з заключается в гликозилировании тетрапцетатов тиосахаров иодгвд-нают агликонов. Описанные в литературе соединения такого типа были лучены, исходя из рацемических аг^шконов, в виде смесей диастерео-ров. Для получения соединений с природной конфигурацией глицорино-го фрагмента ми использовали 1,2-изопрошиэден-яп-глицерин, кото-й переводили в тсзилоеый эфир и, после удаления изопропилидэновой дитной группы яолучгли 3-0-тозил-дп-глицерин (1)(схема 1). Послед-й ацилкровали пальмитоилхлеридом и проводили ¡замещение тозильной уппы на йод. Полученный 1,2-дш1эльмитокл-3-дэзокси-3-код--ап-глицэ-1(3) вводили'в реакцию с тетраацетом р-Б-тесгалактозы (4) или р-Б-зглюкозы С".), используя в кэ^стзе основания 1 ,8--диэзабицикло-,4,05-ундец-7-ек. Анализ продуктов реакции методом ВЭЖХ на колонке ЗПазэгЬ 600 с использованием подвижной фазы гептан-этилацетат 4:16) показал в обоих случаях присутствие более хр^матографически :шиишх а-анокерсв (15-20%). которые были отделены методом препа-г/.вней ВЗКХ. Основным недостатком данного метода является недоста-:ная стервоспецифачность иг,--за аткмеризацюг тиосахаров в условиях ждаи. В результате били получены 1,2-дтеалъттоил-3-(2,3,4,6-тет-

r- OCOR

an

AeO

Схема 1

r—OCOR

-Hf RCOO«~

«u —I

(3)

{4.8): R1kOAO, R2=H (5,7): R1=H. Rj-OAc R»(CHj)J4CH3

OAc

рйлц8тал--р';3--1'злгц:топираис50)"3-т110--аг1~гл11цер5ш (6) и ¡ ,2-дапальи!-тоил-S- (2,3,4,6-тотреацо'г»цг-^-1)-г.-!щош!р:)НйПйл) -З-тао-т-глкдарцн '(.7), используемые в качоотш стандартов при разделешш'дешетороомэрг ! пцк'смесей соотватствуюцкх S-гликозилдаглицёридоп.

(:1.2. СИНТЕЗ даСТИ'ЕСЩРЙШС ТИЭГМШ08>ОДда1ЩЕРИД0В.

. Ката пр'&локак новий подход к синтезу серосодвряазазс гликозил-диглкц»рвдоп, ааклвчаидайсп б предварительном получения порзцзтатов гдикози.тгцоглкцвршрв с гослбдуияшл шюдировашом к удалением аца-тилызкх зеаитвых груш .-(схема 2). Аякилирозазив гас-З-ткогдицвриив «--яцстоброигалактозой (В) проводлак в ерэдо ацетонитрида о присутствия трл&таламина. По данным Чг-Я?.1Р-спектроскогаги, а-аномор в продуктах рээкцяя отсутствовал. Синтезированный с внеозеим выходом, (около 803) 3-S- (2,3,4, б~тетраацетил-р-С-голактопираногил) -тио-гос-глздори.ч (9) 'является удобным синтоном для получении тяоаналогов гликозидда-глиц?рпдов с дефицитными аирнокислотными остатками. н&прпмэр; с дой-Tepo>.i;¡'-iftíH%3i оцильннми цопяма, так как- irx Еведозмэ осуществляется на предпоследний стадии синтеза.

Вашэй проблемой химик глэдерагликатпшидов : аьляегся цолучашо оторзотимически чистых соединения. .Напрэвлешшо' иштозн очот- елскш и но исключают частичной рацбмкаацеи на некоторых стадиях. Hmi раз , работая более простой способ получения тшглпкоаидшх аналогов га-лактогаддиглидвридов, вклвчащия синтез диаст&роогйрной см9ск и но-

слэдугщее разделение двух даастбреомзрных форм , отличающихся конфигурацией хирзлыюЛ) центра глицеринового фрагмента, методам роцикли-, ческой ВЭЖХ (схема 2). Лцилирсвание соединения (9) пальмитоилхлсри-дом в присутствии пиридина давало 1,2-дипальмитоил-Б-(2,3,4,в-тотра-ацегол-р-])-гэлачтотфанрзил)-3-таоглицерин в виде смеси диастерэгмо-роз (10э) п (103). Предварительную оптимизацию условий разделения проводили на ссрОонтах БПазогЬ 600. Селективность разделения (10а)

Схема 2

ЛгО

(10 а)

(10 в)

НМ2ПН2'Н2Э

I •

|ян2ннг-н2о

МО—1 но }-э ?

он (Ив)

I—1

н—•

,—осои юсов

Ц» (СН2)14СН3

- б -

и (100) при использовании в качестве подвижной фазы смесей гептана с различными полярными модификаторами (этилацетат., диэтиловый эфир, \диоксам .ацетон) была неудовлетворительной. Смеси метклеяхлоряд-эти.:ацетот давали увеличение селективности одновременно с ударением пиков. Для устранения этого аффекта мы использовали трехкомпонэнтную подвижную фазу гелтан-метиленхлорид-этилацетат. Подбор соотношения компонентов осуществляли на основании экспериментов со смешанными в различных соотношениях практически изоэлюэтропныда системами А (16% этилацетата в гептане, к 5,1) и В (5Ж этилацетата в Мйталенхлорида, к 5,4). Еыла выбрана подвижная фаза, представляющая собой смесь 25$ системы А и 75"» системы В, которая давала удовлетворительную форму пика при незначительном падении селективности разделения (а-И ,18) по сравнешто с системой В. С использованием выбранной таким образом подвижной фаза стереоиоомеры (10а) и (10<3) были разделены на колонке с 511азогЬ 600 в рациклическом роит а (рис. 1).

Рис. 1. Разделение смеси диастереомероз (10а) и (100). Цифрами 'обо- , значены направления потока: 1 - отбрасываемая фракция, 2 - рецлрку-. ляция, 3 - отбор соединения (10а), 4 - отбор соединения (1С<5), & -отбор смешанной фракция.

Оптическая чистота полученных (10а) к (106), по данным БЭЮС и 1Е-ЯМР, прявыияла 05". Для отнесения пиков на хроматогрзммах мы использовали синтезированный 1,2-дашалькитолГ1-3-(2,3,4,6-тетраацетил-р-В-галактотфанозилЬЗ-тао-йп-глицеран (6), который, по дашшм ЮН, соответствовал хроматографически менее подвижному стероомеру (Юз). С ПОМОЗЦ.Ю 1Н-Ш?-спвктроско1ши правильность этого отнесения была подтЕеркдека по сигналам СЗ глицериновых протонов, константы

1 ? з 2 э г з<. г дгзгэ^з

О 23 ¿0 Ю 80 мпк

которых наиболее различны для дкастероомерных пар. Параметры» полученные для стерооизомера (10а) (5Д=2,84 м.д., 8В=2,95 м.д., 1А"6,2 Гц' 1В~2,6 Гц' ^ча ц}-""'2»0 ^ Ь совпадали с еоответ-ствунднмн параметрами стандарта (6), слодовательно, соединение (Юа) обладает природной конфигурацией С2 хпральпого центра глицерина.

Следущзя проблема в синтезе 0- я 3-гликозилдиглицерндоз ззклю-чаетсл'в удалении заэдтшх ацетатных групп в присутствии сходашх по реакционной способности сложноэффных связей жирнокислоншх остатков. Общепринятый в нестоящее время метод-обработка гидразингидра-том а метаноле-но дает, как правило, хороша результатов.В связи с этим для стадии дезацетилировгния >т применили подход, описагамй о литературе для деблокирования аминогруппы в синтезе плазменилэтзнол-аминэ. В этом случае удаление фталоильной занятной групш проводили действием гидразингидрата н смеси хлороформ-мотанол-вода. Однако, в навен случае полярность блокированного ацетатными группами углеводного фрагмента недостаточна для образования мицелл тиоглихозилдигли-цорздамя в смесях мэтанол-водз. Для улучшения мицеллообразования мц вводил:! в решсцяокную смесь бромид триметилцетилачмсния, что обеспечивало образование мкцоллярных структур молекулой! исходного вещества и продукта реакции. Таким образом, сло«ноэфирная связь при С2 гдщерпнового Фрагмента находилась вблизи грагсои гидрофитыгаЯ и гидрофобной областей мицэлл и оказывалась менее доступной для гидразингидрата, что повиаало выход целевых соедгп-е'гай (54-72%). В ре. зультато били получены 1,2-дгаалыато'лл-3-(р-П-галзктолиранозил)-З-тно-от-глицерин (11а) и- 2,3-дипал^китоил-3-(р--3-галгктопиранозил)-1-тио-ап-глшерип (116).

Списанный метод был использован такг:а„для получения дяасторео-иерной смеси гаогалактозиддиглщеридов, содержащих дейтеркввие метки по а-положениям жирнокислоигых ц^пой (Схема 3). 1,2-Ди-(2~г'Н2)-поль-мятоил-3-(Р-0-галактопиранозил)-3- тяо-гас-глицерин (14) бил получен пцилироваккем соединения (9) дейторнротешым по а-полокенкю пзльми-тоилхлоридом (12) с образованием 1,2-ди-Г?-2Е,]-пэль?Я!Тоил-3-(2,3,4, 6-тотравце л1л-р-В-галактопиранозил)-3-тиогли1',орина (13)' и последующим гидрэзинолизом. По данным 1Н-ЯМР-сп>;ктр-:скоггш1 соотношение дла-стереомеров (т.о. антиподов по хирильному центру глицеринового остатка) (14) оказалось зкЕимолярным, поэтому кн обо1 гачили полученную смесь гас.

Дейтеромэченный пальмитоилхлорид (12) синтезировали из соответ-ствущей (2-2Нз]-пальмитиновой ки&лоты (15), которую получал! методом изотопного обмена из метилпальмитата и (гН)-метилового спирта в

- а -

Схеме Э

Схема 4

СН,(СН2)мСООСН, —--► СИа(СН4)„С«НаСООН -

, ' (15) , ■ •

■ (12) '

присутствие метилата натрия описалшм в литературе методом (Схема 4) Дейтериевьгй обмен в целях оптимального использования дейтерометано- . да проведали в дво стадии, так как степень обмена ограничивается на- . ст/плеьиек равновесия » реакционной смеси между дейтешровавным и недейтернрованным метилпелылитэтом с одной стороны и гН>-метанолом и мстанолом с другой стороны. Дейтерфованный мег-итальмитат омыля-ли Н01 в соответствувдую кислоту (16), ид которой действием тионил-хлорида получали хлорангидрид (12). Определение изотопной чистоты полученного метилового эфира 12—^Н^ 1 -пальмитиновой кислоты, а также продуктов дальнейших реакций проводили методом 1К-Я№- спектроскопии по интегральной интенсивности сстаточызс сигналов а-ыетаяеношх протонов (5 около 2 м.д.). Стэхтепь изотопного замещения полученных соединений превышала 90*. '■.■■;

1.0. СИНТЕЗ ДЕЙТЕРОМЕЧЕНЫХ ДОСТЕРЕ0М2Р0В ТИОГЛСКОЗИВДИГЛИПЕВДОВ.

Предложенный нами метод получения тиогалактозилдиглицеридов был., распространен на соединения с другой углеводной компонентой. Так,

гликозилпрованяем тиоглицэрияа а-ацетсбромглисозой (16) был получен сип тон (17) для синтеза тиоглюксэидных аналогов глгасозилдиглицери-доз, который затем ацилироваля хлората-идридом (2-гЫ2]-пальмитиновой кислоты (12) с образованием диастереомеряой пкеси 1,2-дя-£2-2Н21-польмятсил-5-(р-В-глхкоплранозил)-3-ТЕ0Глицври110в (18) (Схема 5).

Метод рещятаческой ВЭЖХ сказался ограниченным и исследования по возможности разделения диастереомеркых смесей Б-глхкозиддиглицэ-

Сгаиэ5

СзО

АвО-1

-011

-

—ем - —- Ад. \)

—зи Й£ОЧ-/

/ 1 / ОД«

Х (17)

—04

—он

1г.сго (12) '

2. г^гтзяяггжц» / \

У А

ДчО—1

■ Аг<

лго-

но—

ки1г;на-и2о

рОСОЯ ПСОО«Н—«н

О Ас

,2. Г$>»СТЕППЖ1Я?1Я

У

I— ОСОЙ М*4-«ССОД

(19«) «• С2..г(Сп2)пСНз

радов не привели к ожидаемому результату из-за меньших различий в хроматографеских подвикностях диастереомеров по сравнению с S-ra-»лактозилдаглицеридами в различных исследованных нами системах. После изучения различий в способности к кристаллизации в метаноле и других растворителях 1.г-дипальмитоил-Б-р-О-галактогапшранозил-З-тио-зп-глидерина (11а), 2.З-дипальмитоил-S-ii -D-галактопираноэил-1 -гио-зп-глицерина (116), в также их тетраацетатов (10а) и (100) ми предположили, что вти особенности будут сохраняться для диастереомерных пар о различными углеводными заместителями, в том числе и для тиознало-гов глхкозилдиглицеридов. В связи с этим смесь дейтеромеченых диа-стереомаров (18а) и (1.86) подвергали многократной кристаллизации из метанола. Контроль за разделением осуществляли с помощью 'н-ЯМР-спектроскопка по сигналам СЗ глицериновых протонов, используя для идентификации стереоизоыеров в качестве стандарта параметры, полученные для 1,2-дипальмитоил-3-(2,3,4,6-т9траацетил-р-В-гл1жопирано-зил)-3-тао-£тг-пшцерин (7) (8А=2,79 м.д., 8В=2,89 м.д., Jg ЗА®6,0 Гц, J2 зВ-7.2 Гц, J.^ зв=14,3 Гц). По дашшм 'н-ЯМР было установле-■ но, что полученный в результате кристаллизации осадок содержал 1. ?,-ди- f 3 -па льмитоил-S- (2,3,4,6-тетраацетил-р -Г>-глюкогшранозил) , -3-тио-зя-глицерин (18а) (сигналы даастереомора (186) отсутствовали)-, а обьеданйнный фильтрат состоял из смеси диастереомеров (18а) ¡и !П83) в соотношении 1:8. После удаления гидразинолизом ацетильных ¡запиимх групп с соединения (18а) получен 1 .г-ди-сг-^Ьпальмитонл-S-(р -Е-r лшопиранозил)-З-тио-зп-глицермн (19а), а после дезацегаяи-рования смеси (18а'Ги (186) шделена смесь диастереомеров (19а) и (196) в ооотпоиегаш 1:8. После многократной кристаллизации из метанола, контролируемой при помощи 1Н-ЯМР- спектроскопии по сигналам С1 глицериновых протонов (8A=2,7S м.д., 8В=2,94 м.д., Jg.u*6-6 Гц' J2 IB'4,4 Гц' J1A 1В°12»4 ^ • Удаюсь выделить 2,3-ди-[2-Н2)-паль-ш1тоил-3-(,'5-В-глюопиранозил)-3-тио-ап-глицерин (196 ).

1.4. СИНТЕЗ О-ГАЛАКТОЗШЩИГЛЩЕРИДОВ.

Для проведения сравнительных исследований мембранных свойств S-и 0-глй.коаилдиглицвридов нам необходимо было получить дэйтеромэченый ; 0-галактозилдаглицерид.

Для синтеза 1 .г-ди-гг-^З-палькитоил-З-О-кР-В-галактопирано-^ за''. )-гсс-глицерина (24) наш использован описанный в литературе'подход (Схема 6). Т'ликозилировакием аллилового спирта перацетатом галактозы в присутствии эфирата трехфтористого бора получали р-аллиловый эфир тетраацетилгалактозы (21) с примесью а-аномора (по

Схема 6

ЛеС —О ОАс

АсО

ОН

ВРз'В20

Ас< -ОО^,

ОАе

К№0.

ОАс

«СО

-ОН

-он

АсО

— ОСОЙ ОСОЯ

(12)

ОСОЯ —ОС 04

"¡Су —-

(23)

ОАс

й* СгН2(СН2)13СНз

¡шм ВЭ&Х). Полученную ано.черную смесь гидроксиляровали по двойной зи перманганатом калия в присутствии сульфата магния в водно-гоновой среде с образованием 3-0-(2,3,4,6-тетрзацетил-р-Э-галак-иранозил)-гос-глкцерина (22) (выход 30-35"), причем при хро-эграфяческой очистке полиостью отделялся в-аномер. Последующее лирование хлорангидридом [г-ТЦ ¡-пальмитиновой кислоты (12) при-11ЛО к образованию 1,2-ди-(2- Н^З-пальмитоил~3-0-(2,3,4,6-тотра-тл-р-В-галактспиранозилЬглицорина (23) в виде смеси диастерео-ов. После удаления ацетильных защитных групп гидразинолизом был учен 1,2-ди-(2-,"Нй)-паль?дггоил-0-(р-В-галзктоюфаноз;1л)-3-гас-цсряи (24) в. виде сг.:зси диастереокеров (т.е. антиподов по хираль-у центру глицеринового остатка) с соотношением, судя по ЯМР-спектрам, приблизительно 1:1, поэтому мы обозначили ого гас.

2. ИЕКБРЛНШЕ ИСатКЕОБАКИЯ ГЛ^ОЗШЦЩЩШУГОВ

2.1.МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ о

\ Метсд ~Н-Ш> спектроскопия является одним из информативных методов исследования модельных липидных мембран. Получение информации о локальном порядке и анизотропии движения в исследуемых липидных системах с помоадю этого метода предполагает использование синтетических селективдо дейтерированяых липздов. Тек как замена водороде па дейтерий минимальным образом сказывается на структуре изучаемых молекул, спектроскопии 2Н-ЯМ? относят "к числу так называемых, "не-ьозмущащих" методов исследования.

Форма ладш в спектрах "К-ЯМР чувствительна к полиморфному состоянию водных дисперсий липидов. На рис.2 (I) доказша ожидаемая 4орма 2К-ЯМР спектра для ламелляриогс кодадкристслличвского состоять (а), инззряфовашой гексагональной фазы (б) и агрегатов с изотропным двиганном липидных молекул (в).

б.

а.

20

-20 кГц

2С

-20 кГц

Рис. 2. Теоретический Я-ЯМР спектры дейторсмеченых липцдных мембран. (I) Изменение формы линия в ?. «жсимсстк от фазового состошлп мембраны: а) ламеллярного кадкскрлсталлического, б.: инвертированного гексагонального, в) изотропного. (II) а) Теоретический "порошковый" к 6) рассчитанный "ориентированный" спектры. • Ссогнолпгае лктеяспБ-ностей сигналов неэквивалентных дойтерсное еостазляст 1:2.

Лая лиявдов в ламяллярной жидкокристаллической фгзе величина рвадрупольного расщепления сигнала ыо таленовых групп углеводородных цэдей зависит от кх ориентации относительно плоскости лигащюго би-рлоя, а значение квадрупольного расщепления av-j пропорционально параметру порядка связи С-%, SCD: Avc» 3/4(e2qQ/h)SCD, где e2qQ/h-|рнстанта статического квадрупольного расщепления (для ар3 гибрпли-¡»овалшх связей она составляет - 170 кГц ). Параметр порядка, в свою «чередЬ, определяется кок: SCD«<3co3^e-t>/2, угловые скобки означают усреднение в диапазоне времен, более коротких по сравнзкип с юзадру-польным взаимодействием. Угол 0 - угол между нормалью к плоскости мембраны и направлением связ:1 С-^Н. Квадрупольное расщепление для дейтвронов. находящихся в а-пол линии жирных кислот, характеризует конформацют начальных участков ацильных цешй в области присоединения хглкцорино:>ому фрагменту.

Получить квфрмацию об "интенсивностях" (площадях) сигналов, соответствующих неэквивалентным дэйтерояам в молекулах липидов ип экспоримеитальных-Чтак называемых "порошковых") спектров можно рас-счетом "ориентированных" спектров (рис.2,11), т.е. спектров, получаемых в случае единственности ориентации связей С-2Н по отношению к направлению внеянегс магнитного поля. Такой расчет возможен, если дейтерированные фрагменты молекул совершают аксиально симметричные движения. При этом удобно рассчитывать спектры, соответствующие углу е»90° между осью симметрии движения.(длинная ось молекулы) и направлением прилсяенною магнитного поля. Удобство такого представления %-ЯМР спектров состоит в том, что компоненты рассчитанного спектра могут анализироваться методами, разработанными для спектроскопии ЯМР высокого разрешения.

2.2. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОМ 2Н-ЯЫР СВОЙСТВ МЕМБРАН, СФОРМИРОВАННЫХ ИЗ О- И S-ГАЛАКТОЗЮШИГЛИЦЕРИДОВ *

Введение ядер дейтерия в а-положение жирных кислот гликозилда-глицеридов представляется информативным как для изучения полиморфных

*) Список сокращения: ДП-о'-Гвл: 1,2-ди-[2-гН2]-палыяггоил-3-0-(р-В-галактопиранозил)-гас-глицерин (24), ДП-Б-Гал: 1,2-да-[2-И31-паль-ютозл-3-(р-В-галактопиранозил)-3-тио-гас-глицерин (14), 1,2-ДП-З-Глю: 1,2-ди-12-2Н2)-пальмитоил-3-(р-В-гл]ско1шранозил)-3-тио-зп-гли-церин (19а), 2,3-ДП-3-Глю: 2,3-ди-12-^]-пальмитсил-3-(р-Б--глюкопи-рансзил)-1-тио-эа-глицерин (196), гас-ДП-З-Глю: 1,2-ди-Е2-2Н2]-паль-китоил-S- (p-D-глккопиранозил )-3-тио-гас-глицерш.

г-

превращений их водных дисперсия, так и для определения конформаш начальных участков ацильных цепей в области присоединения к г лидер! »новому фрагменту. Целью данной части исследований явилось сравш тельное изучение эквимолярных смесей диастереомеров 0-$-галактозилдкглицеридов в составе водных дисперсий для определени взаимосвязи их полиморфных характеристик со структурными особенное тями молекул.

Последовательность полиморфных превращений мембран, сформиро вашшх из 0- и З-галактозилдиглицеридов не зависела от теоторатурны условий и сроков инкубации образцов, однако температуры пореходо изменялась и достигали своих постоянных значений при инкубации об разцэв мембран более 1 месяца при -5°С. Получении« при различны температурах 2К-ЯМ? спектры мембран, сформированных из ДП-Б-Гал 1 ДП-О-Гал в избытке вода, приведены на рис.3.

ДП-О-Гап

ДП-в-Гал

87°С

50

-5С " кГС

50

-50 кГц

Рис. 3. Экспериментальные ^Н-ЯМР спектры мембран ДП-О-Гал и ДП-Б-Гал при различных температурах. На спектрах ДП-О-Гал, снятых при температурах 73, 87°С показана анизотропная составлявдая с увеличенным по вертикали масштабом.

?

Из сравнения полученных и теоретически ожидаемых для различных пшидних фаз 'К-ЯМР спектров следует, что гликолштиды как с 0- гли-созидной, так и с тиоэфирной связями формируют агрогатн небислойных лруктур. Фазовое поведение исследованного 0- гликсзилдиглицерида !ыло следушим: гель (ниже 65°С), жидкокристаллический Си ело Л [65-70°С), совокупность ламеллярноЯ и кубической фаз (71 -73°С ), со-юкупкость инвертировакноЯ гексагональной и кубической фаз (выше Ю°С). Для мембран гликолипадсв с Б-глихозидной связью нзблвдалксь: 'елевая фзза (ниже 64°С), ламеллярная ¡¡¡идкокристзллическзя фаза и швертированная гексагональная фаза (вине 65°С).

Для экспериментальных 2Н-ШР спектров ламеллярного жидкокристаллического состояния мембран 0- и ЯП-З-Гал (температура С7°С) гроведен расчет "ориентированных" спектров ( Рис. 4. табл.1 ).

ДП-О-Гал

87°С

. 67°С №

-1-1--—!- --1-1-п-

20 0 -20 кГц 20 " 0 -20 кГц

Ч'с. 4. Рассчитанные "ориентпроцанше" спектры мембран ДП-О-Гал и ЦТ-Э-Гал щзи 67 и 87°С.

!а основания этого расчета мог.-ет бить сделано заключение о том, что (ля мембран ДП-З-Гал и ДП-О-Гзл т.ж"-о, как й для дизцилышх фосфоли-гидов, имеются различия з ориентации относительно плоскости мембраш ■ ой и 2- ей гзфпскислоткнх цепей молекул, Формирующих эти мембраны, '.к. "ориентированныег спектры мембран ДП-О-Гал и ДП-Э-Гал в состоя-пгя ламеллярного змдкокристаллического Оислоя представлены тремя

Таблица

Сравнакпо ''К-ЯМР спектров мембран ДП-О-Гол н ДП-Б-Гал ^ при температуре 6?°С

Состав к.омбраны Величина квад-руполыюго расщепления, (КГц) Ширина сигнала, (Гц) Нормированная интегральная интенсивность Время рвлак сации Т1, (мсек)

8,й* 1600 13 14.6 г 0,3

10,3* 1200 6 14,6 ± 0,3

ДП-Б-Гаг 18,5 ¿500 46 12,1 1 0,5

22,5 1900 44 12,2 * 0.5

26.4 2100 100 13,1 * 0,3

15,4 2100 43 11,8 ± 0,5

,£1»0-Гал 20,5 2600 54 12,0 1 0,5

26,9 2700 100 13,0 1 0.3

*- Сигналы, отвочвпше инвертированной гексагональной фаза

синглетами (рис.- 4, 07°С> с соотногсоялем интенсквностой (табл.1 Слизкому 1:1:2. Эти кокформациоютю отлячия неодинаковы для ДП-О-и ДЛ-Б-Гал (табл.1). Это обусловливает -то, что для мембран ДП-О-Г переход ламеллярнал/ гексагональная фяза проходит с образована изотроших структур, чего не наблвдается для мзмзрш ДЛ-Б-Гал.

На рис.4 такко приведены раисчмташте "орионтугроа.чнние" спек' ры, характерные для гексагональной ф«зы мел рач . и ДП-0-Г1 (37°С). Оба т та мембран в этой Сазо т-1хке имеют отличия. Снгчем квадрупольных расщэпльний сигналов несколько выше для мембран ДП-< Га л 1 чем для мекбрал ДП-Б-Гал (.б "ешсратурном диапазоне С4-87°С Таким образом, в гбксегональной для мимбран О- и ДП-5-Гал со: раняются разлития в копформашта цепей 1 к 2.

Для отнесешм сигналов дойлеронов I спектрах ^'Н-ШР лашллярш жадасохсристзллической' фааы мембран ДД-О-Гал, ДП-Е-Гал были пзмере! значения Ереглэм! Т^ тпкн-регабто'г.чой релаксации ¡табл.1). Было пою еано, что дойтерокы мэлекул Б- и ДП-О-Ггл давщ-е сигналы с разлет

[М ква~?упольнкм расщеплением характеризуйте л различился ^ялчэкячья!

(табл. 1). Таккэ, как и для дизцилышх фосфатидилходщта, эти от-гшя позволяют сделать заключение о том, что два сигнала с мояьсимя юченкями «ведрудольних растепления, имеющие близкие знатока вреда релаксации, принадлежат 2-ой яирнокислотной цэют, а сигнал двой->й интенсивности, имовдий др.угие релаксационные хар-чктористики' габл.1) обусловлен дзумя дейтеронпма 1-ой цени.

Таким образом, конфоркационвне отличи« о- и З-галактознлдагли-; рядов обусловливаю? отличия их полиморфных свойств. Мембрз:ш -глпнозалдиглщерида с пальиитонльными жираокислагаыки остатками, в гличие от 0-аналога, совершают переход бислой/гексагокальнал Саза зз образования структур с изотропным движением липвдов, что хзрак--5рно для списшпшх в литературе О-гзлактозилдягляцорздов с длиной ;:рнохкслотшх остатков болуа 16 атомов углерода.

2.3. ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДОМ 2К-ГО.Р СВОЙСТВ МЕЖРАН. ЭГСРЖРСВЛШШХ КЗ ' ДМСТЕРКОМЕРОВ з-глсхозадигжгеридов.

Настояла« часть исследований посвящено изуч'.-лт уетодсм II-ЯМР поЯств мембран, сфосмировашта из 5-глпкозилдкглицерлдоз. различаю--.

конфигурацией глицеринового фрагмента, я тзкгм прзготсвдеиноЗ з них эквимзляриоЗ смеси.

ИсследозакнкЛ на!.« термотропный полиморфизм водах дпспорста ,2-, 2,3-ДП-5-Глю и их диастереокеркой скэси в диапазоне температур 0-90°С, зависел от срока инкубация дисперсий с момента ее приготсв-«шя. Инкубации проводим яря комнатной температура С.22°С), и еиек-рп заютитали как е рэхкми нагревания, так и последумлего ох-тле.)-;; образцов черэз рашгло промезуткн времени.

Кипссродстветю после приготовления водные дисперсии ксследо-¡еяпих 3-гет«озилдиглицэридов и их смеси (гас-ДП-Э-Глю) обиарутапзли ходило аолпиорфные превращения как при нагрегоггил, так и при охлът-ктг.т образцов фкс.5 ). Прк повышении температуры наблюдались 'К-ШР спектры, типичнее для голевого состояния Х'вдерог.т.ясолгадов ;рис. 5, 52°С), для состояния ламеллнрного гэдкокристоллпческсго Си-¡лоя (рис. 5, в!°С), для инвертированной гексагональной фазы (рис. ¡1. б5°о. Пероход'бислой/гексагопаяьная фаза проходил в узком темпе->атурном пвторвьле 62-6Я°С.

Для жидкокристаллической и инвертированной гексагональной фавы .рс,»4.дуз ссионтирошшнх спектров. Отвечающие ламелдяряей

«дкокгл'ладг'.'чоскоя фпзе спектры характеризуются, такт как для 0.1 з-гэдоктсзилдаглвдзридов, наличием трех сигналов с распределение!«

65°С

м

61°С

V 52°С

-50 .'¿Г-ц

Рк<?.6. Характерные акспврименталыше ЛН-ЯМР спектры Б-глюкозилди-глидеридов пр I изменении то (.спер а тура (непосредственно после приготовления водных дисперсий ).

Параметры 2Н-ЯМР спектров Б-гликогилдиглицервдов в ламеллярной (51°С) и инвертированной гексагональной фазах.(75°С)

Таблица" 2

ЛУд, [кГц) (Т,, Гмсек])

Температура 1,2-ДП-Б-Глю г.г-дп-Б-глв йас-ДП-Б-Глю

19,0 (11,240,3* 17,6 (9,5*0,3) 13,0

51°С 22,0 (11,5*0,3) ¿1,0 (0,8*0,3) 21,5

25,9 (12,6±0,3) 25,9 (11,1*0.3} ¿5,9

75°С 9,3 т.в 8,1

•3.3 9,3 9,3

живности в соответствии с прспэрдаей 1:1:?., где - мити'сип--гь сигнала с максимальном значением квадруполького рсс&^плокия. зренные значения врзгдаи спин-решеточной рдхг.«:гг.да ¿\.~л -ДП-Б-Глю и 2,3-ДЛ-Б-Глп (табл.2) указывают на то. ч-.о дьз сигн'З-: меньшими значениями квадрулольных рзсяеплекй! принадлежат пп-; а сигнал деойной интенсивности - вп-1 »ирноккслотгой йога.

Небольшие различия в копформашпг начального участте цп-2 ц-?;;и Б-гликозилдитлицеридов, как следует из сравнения зпичжгя кг-зд-элышх расцеплений, приведенных в тaбJl.2. сохраняется и в ингур-эвакной гексагональной фазе. Полученные ~Н-Я.'.Р спектру, соотаит--гщио этому состоянии, кок показано расчетом ориен~ирог>;:;ш:;х егтек-з, являются суперпозициями двух сигналов (ссотяотекм. интенсив-гей сигналов близко к 4:3) с отличевдимигя значения?,?;; кв.тфуголь-расще::ленйй.

Полиморфное поведение изученных 8-гл»жозилдиглакор-.1Доь измэзд-!> с точением времени при инкубации образцов '.на протжетз'. 3 ме-зэ нри 22°С). Для обеих диастереомерннх образцов после 7 дней и;:-ацки набегались следующие превращения: при нагревании переход ьлэдкиЯ кристалл, завертаотмйся формированием гексагональной И'л-Яфозшюй Фазы (64°С). при охлаждений - гексагональная ивьерти-вяння фззз/лямеллярная жидкокристаллическая Фаза 'С1°С), лгжл-ная жидкокристаллическая фаза/голь (57°С). После такого ко срока убашм (7 дней) для образца гас-ДП-Б-Глю наблюдались следуиаио эдования фаз: гель/иидкий кристалл, завершающийся формированием езгоналыюй инвертированной фпсы (&7°С), инвертированная гексагс.--ьвая фаза/гель (67°С), т.е. отсутствовала ламеллярняи г'л.:ц-:окр::о-лзческая фаза. Такие зад превращения иаблхдаш:.съ и для -ДЯ-Б-Глю после 3-х месячного хранения при температуре 22°С. Для ззцэ З.З-ДП-Б-Глв после такого ке (о месяца) хранения не цзйжде-ь изменение последовательности пелиморфмх превращений, а прогс-ило увеличение температур перехода галь/инвортировиннач гепсаге-ькал фаза (70°С), инвертированная гексагональная Фдм/лзмеллррке,ч некристаллическая Фаза (69°С), лемеллярная кидкок-рнсталличеекая а/гель (63°С).

Таким обрчзом, полученные данные о помтагфазмз 1,2- п -ДЛ-З-Гла и г:х вквимолярной смеси свидетельствуют о формировании лнчшх кристаллических фаз, свойства которых зависят от темпера-ш!х условий и сроков инкубации. Различия в конфигуратуш минера -ого Фрагмента призе да а- :: значительным отличиям в полиморфном поении диэстересмзров, что объясняется образованием стабильных и

катастаоиъ^шг кристаллических фаз. Это характерно г для описагешз литературе t, 2 -дазцил-3- 0- 'р -11-глч-копираноэи.п) -s п -глицер;шоз, j .которчх происходит форюгроваккэ водородной сзязи кекду кислород карботглг.ной группы cn-2 цени и гидроксилом глмкозн во втором по.' кукии в стабильной гелезой Фазе. По-видимому, наблхшаемыо различи* юшетике Формирования гелевых фаз с различными свойствами объясняй ся рпзличнпмч ко[!формз^!ями глицеринового фрагмента для 1,2 2,3-ДЛ-5-Глю. Бнстрса форяфСЕанле стабильной кристаллической фа /ля экЕимслярной смеси диастереомеров ДЛ-Б-Глю свидетельствует есзможости мегаолекулярнсй ассоциации карбоксильной групш sn-2 н пи и гидроксильноЯ групш; пиранозного цикла.

ВЫВОДИ:

1. Разработан новый метод синтеза серосодержоти гликози вдет лнцер: дой.зэключовдийся в ашышровании салтонов, пслучснгах гликозилиров. ш:ем тиоглкцсрина ацетобромсахьрью; предложен ыодкфщдфованный mi тод удаления ацетильных задатных груш с углеводных фрагментов.

2. Проведено разделение дизстереоморных смесей серосодервадих п лактознлдаглщеридов методом рециклической ВЭНХ и глвкозилдиглицер: дов методом многократной кристаллизации.

3. Впервые поручены содержание ядра дейтерия d а-полскениях полые тоильных остатков 0- и з-гаяактоаилдиглицорнды, диастореоморц S-rns козилдигляцеридоь.

4. Методом ''К-ШР исследованы свойства водных дисперсий 0-S-галактозклдаглицеридов, Б-глшазгицой'Лицаридов. Показано, что во.' кие дисперсии изученных глихолилдаглицеридов с S-глпкогиднили ссязг, га, как и природные 0-гликоз:одкг лица ради, формируют нобислоШш структуры. Конформащш 1-ой и 2-ой ацальннх цепчй в области присос диненил к глицериновому фрагменту значительно отличаются между собо как у 0-, так и у S-глккогжлдиглиперкдов.

ь. установлено, что 1 .г-дипальгатаи-З-О-^-В-^алахтопиранозил) -гас-глицерин и его S-глпксзидний аналог проявляют отличия в темпе ратурном интервале пэрехода бпслой/гнксагональная фачг. Мембран Битачактозилдаглицерида, е отличие от u-аналога, созешгют этот пе ре ход оез образования изотропных липидша фаз. 6. Лродемонстрирована способность днастореомероэ Г-глгксзилдйгли цоридов, а такте их диастеросмеркой смеси при диспергировании з cow формировать различные кристаллические фаза, свойства которых завися,' от срока и условий температуркой инкубации.

I

., • i

, 1

j

основные результата диссертации спубликсваки в следухвдг работах:

1. Морозова Н.Г., Смирнова (Дубовская) С.П., Серебре:тихоза Г. А. Зингез ряда замещенных глхкозилглицериноз с потенциальной иммуно-адьювантяой активностью.// Тез. докл. Всесоюзной конф.: Сценка фпр--'/акологической активности химических соединений: принципы и подходы. - Купавна, 1989. - С.218.

2. Смирнова ( Дубовская ) С.И., Аяикин М.8., Серебренникова Г.Л. Синтез тиогликозвддотлицеридов.// Тез. докл. Российской конф.: Пио-лоппэски активные соединения, синтез я использование.-Пенза, 1ЭЭ2. -С.79.

3. Аникин Ы.В., Дубовская СИ., Чугкп В.В., Ссробрешгихова Г.А. Удобный подход к синтезу тиоглигазидних аналогов галактозилдиглице-ридов.// Епсорганическая .-1ЭЭЗ.-Т. 19.-С. 1102-1110.

4. Д/Ссескся С.::., Ашткин !,!.В., Чупот В.В., Соребрэнникова Г.А. Сйитез деГ.торсмечоных даастэреснгроз гдзгкозмдпгдицэрицоЕ.// Бпоор-гаютоскся хну','.я,-(в печати).

С. ДубсвсциЯ П.З.. Аникин 'i.D., Дуйовскгя С.К., Чупин 3.3., Ввсилен-г.о 'Л.Л., Сорзбр-лпг.пгсво Г.Д.// Срг-агстсльноа иоучапиз иэтодсм "Н-ЯМР ссо.1ста гэмбрси, с!ор:wpcso'sar. кз о- п З-гджомидэтдице- ридоп.// Биодопяэсюм maopusi. -(в шчста).

6. Chi:pl:i V., Smimcva S., В.се K:v; !,>'.// Synthoaie and. polymoi-phlcm of'ücutorlra chain labeled unsaturated '.'.cnogalactosyl dlgllceride аз studied by 2H ¡ГШ. // Ree.. Trav. Cliim. Ззу-?ая,- (l-ii ргезз).

Заказ 22 Тирах 80 Бесплатно

Ротапрпатная МИГ КГ ism.M. З.Ломоносова М.Кирсгоаскзя ул. д 1.