Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур

Устинов, Алексей Викторович

Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Устинов, Алексей Викторович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур»

Автореферат диссертации на тему "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

УСТИНОВ Алексей Викторович

СИНТЕЗ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ

С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИИ [3+2]-ДИПОЛЯРНОГО ЦИКЛОПРИСОЕДИНЕНИЯ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КОНСТРУИРОВАНИИ ДНК-НАНОСТРУКТУР

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

у ">

< о ; . ,

Москва 2009

003465034

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель

кандидат химических наук В.А. Коршун

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Т.С. Орецкая

доктор химических наук, профессор Н.В. Бовин

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится 25 марта 2009 г. в 10.00 на заседании

Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 24 февраля 2009 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор физ.-мат. наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие химии олигонуклеотидных конъюгатов оказало колоссальное влияние на прогресс в молекулярной биологии. Секвенирование ДНК, ПЦР в режиме реального времени, флуоресцентная детекция точечных мутаций, гибридизационно-иммуноферментный анализ, флуоресцентная in .«'¿¡/-гибридизация - это лишь несколько примеров молекулярно-биологических методов, невозможных без использования модифицированных олигонуклеотидов.

Существует ряд способов получения модифицированных олигонуклеотидов. Постсинтетические методы, связанные с введением реакционноспособной группы на стадии твердофазного олигонуклеотидного синтеза и ее последующей модификацией, предпочтительны для синтеза олигонуклеотидных конъюгатов с фрагментами, недостаточно стабильными в условиях олигонуклеотидного синтеза (ОНС) и деблокирования. Такими фрагментами являются некоторые флуоресцентные красители. Помимо этого, постсинтетические методы принципиально позволяют синтезировать конъюгаты, содержащие несколько олигонуклеотидных цепей, пептидно-олигонуклеотидные конъюгаты, а также решать задачу иммобилизации олигонуклеотидов на твердых подложках.

В настоящее время основной реакцией, используемой для постсинтетической конъюгации, является реакция аминов с активированными эфирами (сукцинимидными, сульфосукцинимидными и некоторыми другими). При всей простоте, недостатками ее является неустойчивость активированных эфиров в водной среде, зависимость хода реакции от рН и растворимости активированного эфира, а также плохая масштабируемость. Активированные эфиры реагируют с аминогруппами природных биомолекул, что во многих случаях является нежелательным.

Поэтому представляется весьма актуальной разработка метода синтеза олигонуклеотидных конъюгатов на основе альтернативной реакции, призванной устранить перечисленные недостатки. Такой реакцией стала получившая широкое распространение Си(1)-катализируемая реакция [3+2]-диполярного циклоприсоединения азидов к терминальным ацетиленам ("click chemistry").

Благодаря специфичности реакции и высокой стабильности исходных компонентов, оказался возможным синтез разветвленных олигонуклеотидных конъюгатов - ранее весьма труднодоступных блоков, представляющих большой интерес для сборки ДНК-наноструктур. ДНК-наноструктуры являются сравнительно малоизученными и весьма интересными объектами, которые, возможно, в ближайшем будущем найдут применение в медицинской диагностике и технологии изготовления электронных устройств. Исследованию самосборки разветвленных олигонуклеотидных конъюгатов с образованием наноструктур посвящена часть настоящей работы.

Цель работы. Диссертация посвящена синтезу компонентов для реакции диполярного циклоприсоединения (ацетилен-модифицированных олигонуклеотидов, органических азидов, содержащих флуорофоры), отработке условий конъюгации, синтезу органических полиазидов и конъюгатов на их основе, содержащих несколько олигонуклеотидных цепей, а также изучению самосборки таких конъюгатов с образованием ДНК-наноструктур.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы был синтезирован ряд реагентов для введения ацетиленовой группы в олигонуклеотиды; из этих олигонуклеотидов посредством реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения были получены конъюгаты с различными органическими азидами. Продемонстрирована высокая эффективность этой реакции для синтеза флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (в том числе зондов для ПЦР в режиме реального времени), играющих большую роль в молекулярно-биологических исследованиях и медицинской диагностике. С помощью данного метода были с высокими выходами получены ранее труднодоступные конъюгаты, содержащие две и три олигонуклеотидные цепи, и была изучена гибридизация этих конъюгатов с образованием не описанных ранее дискретных и полимерных ДНК-наноструктур.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005, 2006, 2008), «Nucleic Acid Chemical Biology (NACB) PhD Summer School» (University of Southern Denmark, Odense, Denmark, 2007), международной конференции "Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2006), международном симпозиуме «17-й Круглый стол по нуклеозидам, нуклеотидам и нуклеиновым кислотам» (IRT-XVII; Берн, 2006), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей в реферируемых журналах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (136 ссылок). Работа изложена на 122 страницах, содержит рис., jсхем и Lj табл.

1. Синтез реагентов для модификации олигонуклеотидов

В Си(1)-катализируемой реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения принимают участие терминальные ацетилены 1 и органические азиды 2 (схема 1). Поскольку азидогруппа не совместима со стандартным фосфорамидитным олигонуклеотидным синтезом, для введения в олигонуклеотиды нами были выбрана ацетиленовая группа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

R1,

Н20, комн. т.

кат. Cu(l)

С целью сравнения поведения алкил- и арилацетиленов в условиях конъюгации, были синтезированы реагенты для введения как алкилэтинильной, так и арилэтинильной группы.

Реагент 5 (содержащий алкилацетиленовую группу) был получен посредством раскрытия коммерчески доступного энантиомерно чистого 2-гидроксибутиролактона 3 пропаргиламином, диметокситритилирования промежуточного продукта, и последующего фосфитилирования предшественника 4. Последнее соединение было также иммобилизовано на стекле контролируемой пористости для получения твердофазного носителя 6, на котором синтезировались олигонуклеотиды, содержащие 3'-ацетиленовую модификацию.

О"

ОН 3

DmtO

86%

4, R = H

5, R = ^r,

H ^

N 'Pr2

93%

6, R =

tT^O

CPG

Схема 2

Реагенты и условия: i, Пропаргиламин, МеОН, 60°С, 48 ч; DmtCl, Ру, 48 ч; 2-цианэтоксибис(диизопропиламино)фосфин, тетразолид диизопропиламмония, СН2С1г, 12 ч; ш, сукциноиламинопропил-CPG (60 мкмоль/г), диизопропилкарбодиимид, DMAP, Py/DMF, 150 ч.

Для введения арилацетиленовой модификации был синтезирован терминирующий фосфамидитный реагент 11 (схема 3).

со2н

Me3Si

59%

СО,Н

81%

Me-sSi

99%

89%

Схема 3

N{/-Pr)2

Реагенты и условия: триметилсилилацетилен, Pd(PPh3)4, Cul, F.t3N, DMF, 12 ч; HCl; ii, трис(пирролидин-1-ил)бенотриазол-1-илоксифосфоний гексафторфосфат, этилдиизопропиламин, 20 мин; транс-4-гидроксициклогексиламмоний хлорид, этилдиизопропиламин, 4 ч; ш, фторид тетрабутиламмония, THF, 10 мин; /V, 2-цианэтоксибис(диизопропиламино)фосфин, тетразолид диизопропиламмония, СНгСЬ, 12 ч.

С использованием носителя 6 и фосфамидитов 5 и 11 был синтезирован ряд олигонуклеотидов. Для этого был применен стандартный фосфамидитный протокол олигонуклеотидного синтеза. Последовательности синтезированных олигонуклеотидов

представлены в табл. 1. Структура олигонуклеотидов подтверждена масс-спектрами МА1Л31-ТОР (данные не приведены).

Таблица 1. Синтезированные модифицированные олигонуклеотиды.

Шифр Последовательность (5'—>-3') Остаток X

0N1 XCA-TTA-CAT-CCA-GAC HCS 0

ON2 XGT-CTG-GAT-GTA-ATG °V6 Н Х "Ч

ON3 GTC-TGG-ATG-TAA-TGX 0=Р > 0 ¿н н 4

ON4 ON5 XCA-TTA-CAT-CCA-GAC XTC-TGG-ATG-TAA-TGG - Lo

Для очистки олигонуклеотидов использовался как денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле, так и ВЭЖХ. Во втором случае 5'-концевая диметокситритильная группа по окончании ОНС не удалялась, благодаря чему время удерживания целевого олигонуклеотида на колонке с обращенной фазой существенно увеличивалось по сравнению с нетритилированными укороченными олигонуклеотидами, образующимися на промежуточных стадиях синтеза.

Оказалось, что нетритилированные олигонуклеотиды ON1-ON3, модифицированные реагентом 5 по 5 '-концу, неустойчивы в условиях аммонолиза (используемого для удаления защитных групп с синтезированного олигонуклеотида). В смеси, образующейся при аммонолизе олигонуклеотида на подложке, можно обнаружить (помимо укороченных цепей) два продукта, частично разделяющихся электрофорезом. Согласно MALDI-TOF, один из них представляет собой целевой олигонуклеотид ON1, а второй - соответствующий незамещенный амид. Очевидно, к потере остатка пропаргиламина приводит процесс, включающий в себя образование 2-гидрокси-у-бутиролактона (схема 4). Незамещенный амид образуется при раскрытии лактона аммиаком.

НО.

Олигонуклеотид'

NH3

Олигонуклеотид'

йо

О О

NH,

НО.

Олигонуклеотид'

NH,

В то же время было показано, что диметокситритилированные олигонуклеотиды устойчивы к аммонолизу и могут быть превращены в целевой продукт после очистки ВЭЖХ и удаления защитной группы водной уксусной кислотой.

2. Отработка реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения на модельном азиде Для отработки условий реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения был синтезирован флуоресцентный азид 18. Выбор структуры модельного азида обусловлен присутствием флуоресцентной группы (позволяющей легко визуально обнаруживать конъюгат на гель-электрофорезе), а также гидрофобностью молекулы (что дает возможность легко детектировать конъюгат на обращенно-фазовой ВЭЖХ).

Реагенты и условия: /,7реш-бутоксикарбонилметилентрифенилфосфоран, ЕЮАс, 4 ч, Д; й, Н2, Р<1/С, ЕЮАс, 2 сут; Ш, 1ЛАЩ4, ЕьО/ТНР; ¡V, 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон, РЬМе, 100°С, 30 мин; v РЬзСОН, (СР3С02)0, СР3С02И, А, 12 ч; и, СН3802С1, Е13Ы, СН2С12, 1 ч; NaNз, ОМР, 12 ч.

Исходным соединением в синтезе флуоресцентного азида служил 3-формилперилен 12 (схема 5). Соединение 13 было получено по реакции Виттига. Гидрирование двойной связи в нем привело к частичному восстановлению ароматической системы (соединение 14). Восстановление сложного эфира 14 дает спирт 15. Дегидрирование гексагидропериленового производного 15 оказалось сложной задачей: действие БРС} дает периленовый спирт 17 с выходом лишь 9%, а основной продукт был идентицицирован как ненасыщенный альдегид 16. Ароматизация с помощью тритил-катиона оказалась более удобной, но и тут удалось добиться выхода только 16%.

Полученный спирт 17 был переведен в целевой азид посредством мезилирования и последующего нуклеофильного замещения под действием азид-иона.

Реакцию конъюгации проводили в водном DMSO или водном ацетонитриле в присуствии соединений Cu(I), генерируемых in situ действием аскорбат-иона или трис(2-карбоксиэтил)фосфина на Си'\ Было показано, что природа восстановителя не влияет на выход конъюгата. Однако, избыток трис(2-карбоксиэтил)фосфина может приводить к восстановлению азидогрупп, поэтому применение аскорбат-иона предпочтительно.

Оказалось, что для успешного протекания конъюгации обязательно проводить ее в инертной атмосфере. Проведение реакции на воздухе отрицательно сказывается на выходах конъюгатов вследствие катализируемого Cu(I) процесса окислительной деградации олигонуклеотидов, сопровождающегося расщеплением их цепей.

Было показано, что реакция одинаково эффективно протекает при значениях рН от 4 до 10. Оптимальная концентрация Cu(I) была найдена равной 0.5-1 шМ. С использованием оптимизированных условий был получен ряд модельных конъюгатов (табл. 2). Реакция протекала наполовину за 3 ч при комнатной температуре. Полное превращение заняло 12 ч. При соотношении азида к ацетилену, равном 10:1, по окончании реакции методом ВЭЖХ не детектировалось следов исходного ацетилена. Оценивая эффективность этого процесса, следует отметить, что крайне низкая растворимость модельного азида в реакционной смеси не мешает протеканию реакции.

Таблица 2. Выходы полученных конъюгатов с 3-(3-азидопропил)периленом и результаты MALDI-TOF анализа.

MALDI-TOF,

Исходный олигонуклеотид Выход

найдено/вычислено

ON1 4745.34/4743.93 52%

ON3 4832.77/4830.99 57%

ON4 4833.07/4829.98 68%

ON5 4973.98/4971.98 71%

Неколичественный выход продукта в модельных реакциях был связан, по-видимому, с окислительной деградацией олигонуклеотидов под действием следов Ог, имеющей большое значение при малом масштабе реакции (4 нмоль олигонуклеотида). Было показано, что выход конъюгатов можно увеличить до практически количественного посредством использования лиганда ТВТА, стабилизирующего медь в степени окисления +1 и препятствующего таким образом каталитической окислительной деградации.

f—N N N'

--N

TBTA

Для синтеза флуоресцентных олигонуклеотидных конъюгатов посредством реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения нами были предприняты синтезы азидопроизводных некоторых флуоресцентных красителей.

3. Синтез флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов по реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения

Из смеси изомеров карбоксифлуоресцеина 19 были получены изомерно чистые азидопроизводные 5-карбоксифлуоресцеина 22 и 6-карбоксифлуоресцеина 23 (схема 6). Разделение изомеров производилось на защищенных производных пентафторфениловых эфиров карбоксифлуоресцеина 20 и 21.

Схема 6

Реагенты и условия: /, Chc20, DMF, 72 ч; PfpOH, DCC, EtOAc, 0°C rt, 14 ч; разделение изомеров; //, 3-азидопропиламин, THF; NH3

Синтез азидопроизводных цианиновых красителей показан на схеме 7. Кислоты 24-27

были синтезированы с приемлемыми выходами из соответстующих индолениновых солей

методом ступенчатой сборки «в одном горшке». Действие на эти кислоты

дисукцинимидилкарбоната и последующая конденсация образующихся активированных эфиров с

-7-

З-аминопропилазидом дает соответствующие амиды; таким образом были синтезированы азидопроизводные красителей СуЗ (28), Су5 (29), Су3.5 (30) и Су5.5 (31).

Схема 7

Реагенты и условия: /, PhN=CHNHPh или PhN=CHCH2CHNPhHCl, Ас20, 120°С, 30 мин; Ру, 12 ч.; ii, DSC, СН2С12, 2 ч; 3-азидопропиламин, CH2CI2, 12 ч.

Чистые 5- и 6-изомеры азидоироизводных ксантеновых красителей JOE (33), TAMRA (36), ROX (37) были получены из соответствующих кислот, как показано на схеме 8 (кислоты были любезно предоставлены М.В. Квачом и Д.А. Цыбульским, ИФОХ HAH РБ, Минск).

Н02С' 34R,= Н, R2 = Me(TAMRA)

35R,,R2 = -(CH2)3- (ROX)

Схема 8

Реагенты и условия: /, DSC, СН2С12; 3-азидопропиламин, DMF, 12 ч; и, водн. NH3, 12 ч.

36 R,= Н, R2 = Me (TAMRA) 37R1,R2 = -(CH2)3- (ROX)

Большинство применимых в молекулярной биологии флуоресцентно меченых олигонуклеотидов и зондов для ПЦР в режиме реального времени имеют метку на 5'-конце. Для удобного введения 5'-терминальной ацетиленовой группы нами был синтезирован реагент 39 (схема 9).

Nv^X^OH

NCv^

9 1

N-^TV' N

Схема 9

Реагенты и условия: /, РГрОП, ЮСС, ЕЮАс, 4 ч; гидрохлорид транс-4-аминоциклогексанола, триэтиламин, ОМР, 12 ч. И, 2-цианэтоксибис(диизопропиламино)фосфин, тетразолид диизопропиламмония, СН2СЬ, 12 ч.

С использованием реагента 39 были синтезированы модельные олигонуклеотиды, на которых была продемонстрирована эффективность реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения для получения конъюгатов с азидопроизводными флуоресцентных красителей 22, 23, 28-31, 33, 36, 37. Было показано, что реакция [3+2]-диполярного циклоприсоединения, в отличие от реакции активированных эфиров с аминами, не требует больших избытков низкомолекулярного реагента. Мечение протекает полностью при использовании всего 1.2-2 экв азидопроизводного (рис. 1); при этом возможно легкое

масштабирование реакции на загрузки до 100 o.e. (>300 нмоль). С помощью реакции диполярного циклоприсоединения был синтезирован ряд флуоресцентно меченых олигонуклеотидов (рис. 2).

Чтаюэквивалентоваэида время, мин

Рис. 1. Зависимость конверсии исходного олигонуклеотида от числа эквивалентов азида 29 (слева); ВЭЖХ сырого продукта по окончании реакции циклоприсоединения (справа). Пик при 35 мин соответствует продукту, при 8 мин - исходному олигонуклеотиду.

Рис. 2. Электрофореграммы очищенных продуктов циклоприсоединения (олигонуклеотид Т]0). Изображение получено путем сканирования геля в видимом свете. Слева направо: красители перилен (аЬХах 446 нм, отА.тах 454 нм), РАМ (аЬХ,а* 494 нм, "Х** 517 нм), ЮЕ (а1Хах 525 нм, "Хах 548 нм), ТАМИЛ (аЬХах 565 нм, с1Хах 580 нм), СуЗ (аЬХах 550 нм, егХах 568 нм), ЯОХ (аЬХах 570 нм, С1Хах 576 нм), СуЗ.5 (а1Хах 602 нм, "Хих 617 нм), Су5 (а1Хах 647 нм, С1Хах 673 НМ), Су5.5 (аЬХах 688 НМ, "Хах 711 нм).

Было продемонстрировано использование полученных с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения дважды-меченых зондов в ПЦР реального времени. По эффективности эти зонды не уступали образцам, синтезированным посредством мечения амино-модифицированных олигонуклеотидов соответствующими активированными эфирами, и существенно превосходили образцы, полученные с использованием фосфамидитных производных цианиновых красителей (рис. 3). Большая эффективность постсинтетического мечения в случае цианиновых красителей объясняется отсутствием контакта между лабильным цианиновым красителем и реагентами, используемыми в процессе наращивания цепи и для конечного деблокирования олигонуклеотида.

ЦИКЛЫ

Рис. 3. Испытания зондов в модельной системе ПЦР реального времени. Красные кривые - зонд, полученный с помощью диполярного циклоприсоединения; синие кривые - с помощью фосфорамидита. Представлены три серии (отрицательный контроль, две концентрации мишени).

4. Синтез конъюгатов бисимида перилен-2,3>9,10-тетракарбоновой кислоты

Олигонуклеотидные конъюгаты бисимида перилен-2,3,9,10-тетракарбоновой кислоты (БПТК) представляют большой интерес с точки зрения их флуоресцентных свойств и способности к образованию триплексных ДНК-структур. Кроме того, производные БПТК проявляют интересные полупроводниковые свойства в органических полевых транзисторах и имеют перспективы использования в молекулярной электронике.

Существенной сложностью для получения таких конъюгатов является крайне низкая растворимость производных БПТК. Мы решили использовать реакцию [3+2]-диполярного циклоприсоединения, хорошо зарекомендовавшую себя в синтезе олигонуклеотидных производных малорастворимого азида 18, для получения конъюгатов БПТК.

40, R=OH -

41, R = OSiMe2f-Bu

42, R = N3

93%

99%

iii

Схема 10

Реагенты и условия: i, 2-(2-аминоэтокси)этанол, 130°С, 3 ч; /7, (PhO)2PON3, Ph3P, DEAD, THF; iii, TBDMSC1, Py, 75°C, 2 ч.

Синтез исходного диазида 42 показан на схеме 10. Диол 40 оказался недостаточно растворимым для характеризации посредством ЯМР; с целью характеризации он был переведен в описанный ранее силиловый эфир 41. Попытки синтезировать диазид 42 с помощью мезилирования или тозилирования диола 40 и последующего нуклеофильного замещения в соответствующем сульфонате под действием азид-иона были неудачными, по-видимому, из-за низкой растворимости диола 40. В результате, азид 42 был с высоким выходом синтезирован по реакции Мицунобу с использованием дифенилфосфорилазида в качестве донора азидогруппы. Растворимость азида 42 в DMSO при 90°С составляет всего около 10"5 М; растворимость его в водно-органических фазах еще ниже. Тем не менее, с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения в 70% водном DMSO удалось достичь приемлемых (40-50%) выходов диаддуктов (табл. 3). Примечательно, что, изменяя соотношение азида и ацетиленового олигонуклеотида, с помощью реакции циклоприсоединения можно получать как moho-, так и диаддукты. Структуры аддуктов были подтверждены данными масс-спектров MALDI-TOF (данные не приведены).

Таблица 3. Выходы полученных конъюгатов с диазидом 42.

„ г, Моноаддукт Диаддукт Исходный Соотношение __^ J

олигонуклеотид азид:олигонуклеотид шифр выход, % шифр выход,%

ON1 1:2 А1М 0 A1D 41

ON2 1:2 А2М 0 A2D 59

ON3 1:2 АЗМ 29t A3D 9

ON1 1:1 А1М 36 AID 42

ON2 1:1 А2М 35f A2D 35

ON3 1:1 АЗМ 40 A3D 11

^ моноаддукт АЗМ является аномальным продуктом расщепления диаддукта (см. схему 11).

Интересно отметить, что в случае аддукта АЗО, содержащего 3'-терминальную модификацию, в процессе реакции происходило гидролитическое расщепление одной из фосфодиэфирных связей диаддукта, сопровождавшееся образованием моноаддукта аномальной структуры и олигонуклеотидфосфата (схема 11). Продукты реакции были выделены с помощью гель-электрофореза и идентифицированы методом МАГЛЬТОР. Такой процесс гидролиза фосфодиэфирной связи не является типичным и особенно удивителен в свете стабильности как исходного олигонуклеотида ОШ, так и образующегося аномального моноаддукта АЗМ. По-видимому, этот процесс связан с участием функциональных групп второй олигонуклеотидной цепи и является следствием особенностей вторичной структуры диконъюгата АЗО.

Продукт фрагментации

Олигонуклеотидфосфат 4402.0 / 4412.8я

Схема 11. Фрагментация диаддукта АЗО.

" Результаты анализа МАЬ01-Т0Р (найдено / вычислено)

5. Синтез конъюгатов олигонуклеотидных триконъюгатов и сборка наноструктур на их основе

Высокая эффективность реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения, а также устойчивость исходных азидов и ацетиленов в условиях реакции позволили получить олигонуклеотидные триконъюгаты. Для конъюгации по схеме 12 были синтезированы симметричные триазиды.

В качестве исходного нами было выбрано доступное соединение - розоловая кислота 43. Ее восстановление боргидридом натрия привело к образованию С^-симметричного производного трифенилметана, которое через трифлат 45 и реакцию Соногаширы с гомопропаргиловым спиртом было переведено в триол 46. Из соединения 46 гидрированием был синтезирован восстановленный триол 47. Из триолов 46 и 47 действием карбонилдиимидазола были получены триимидазолиды, которые, без выделения, действием 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этиламина переводились в карбаматные азидопроизводные 48 и 49. Эти производные имеют сходную структуру, но несколько различную жесткость линкеров. При этом линкеры имеют достаточно большую длину и гидрофильность, что способствует протеканию [3+2]-диполярного циклоприсоединения с ацетиленовыми олигонуклеотидами сразу по трем азидогруппам.

Схема 12

Реагенты и условия: /, ЫаВН4, ЕЮН, АсОН; И, ТШ, Ру, 0°С->П, 12 ч; ш, бутин-4-ол, Е^Ы, Р(1(РРЬз)4, Си1, ОМР, 12 ч; IV, Н2, 10% Р(1'С, МеОН, 12 ч; V, //Д-карбонилдиимидазол, СН2С12> 5 ч; 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этиламин, 12 ч.

Реакцию конъюгации проводили в отработанных на соединениях перилена условиях. Содержание ОМЭО в реакционной смеси, благодаря относительной гидрофильное™ исходных

азидов, стало возможным снизить до 20%. Продукт конъюгации выделяли гель-электрофорезом или ВЭЖХ. Типичная электрофореграмма продуктов реакции показана на рис. 4.

Рис. 4. Электрофоретический анализ реакции конъюгации азида 48 и олигонуклеотида ON1. Дорожки: 1. Реакционная смесь. 2-5. Выделенные ВЭЖХ продукты: 2 и 3 - побочные продукты реакции (диаддукт, продукт окислительного сдваивания ацетиленового олигонуклеотида); 4 -целевой триаддукт, 5 - исходный ацетилен + продукт гидролиза карбаматной связи.

В ходе реакции в некоторой степени протекали процессы, приводившие к образованию побочных продуктов: окислительная димеризация ацетиленовых олигонуклеотидов и гидролиз карбаматной связи в аддуктах (схема 13). Выход целевых триконъюгатов (табл. 4), после выделения с помощью гель-электрофореза, составил около 40%. Их структуры подтверждены масс-спектрами MALDI-TOF (данные не приведены).

Н20 ^

♦ h2N—

Схема 8

Было предпринято исследование поведения данных триконъюгатов в условиях

гибридизации с комплементарными последовательностями. Предполагалось, что гибридизация

- 15-

конъюгатов, содержащих комплементарные последовательности, может приводить к образованию дискретных или периодических ДНК-наноструктур.

Таблица 4. Триконъюгаты олигонуклеотидов.*

Продукт Исходный олигонуклеотид Исходный азид

AR1

XCA-TTA-CAT-CCA-GAC

///

AR2

XGT-CTG-GAT-GTA-ATG

AFI

XCA-TTA-CAT-CCA-GAC

X =

AF2

XGT-CTG-GAT-GTA-ATG

* Реагент для введения ацетиленовой модификации был любезно предоставлен И. А. Прохоренко

ДНК-наноструктуры интересны с точки зрения создания на их основе систем детекции биомолекул и электронных устройств нового типа.

Большинство полученных к настоящему моменту наноструктур имеют в своем составе немодифицированные ДНК-последовательности. В то же время очевидно, что включение в их состав химических модификаций и точек разветвления может существенно увеличить их разнообразие и функциональность.

В первую очередь была изучена гибридизация триаддуктов с комплементарными олигонуклеотидами (схема 14; здесь и далее комплементарные олигонуклеотиды обозначены разноцветными стрелками). Однородность образующихся двухцепочечных звездообразных структур была доказана электрофорезом в 1%-ном агарозном геле с визуализацией SYBR Green I -красителем, специфичным для двухцепочечной ДНК (рис. 5).

Схема 14

1 2 3 4 5

Рис. 5. Электрофоретический анализ звездообразных (см. схему 14) структур в 1%-ном агарозном геле. Дорожки: 1. АЯ1+С^2; 2. АП+(Ж2; 3. АЯ1+(Ж2; 4. АР1+(Ж2; 5. Маркер молекулярной массы; подвижность конъюгатов соответствует линейной ДНК длиной около 100 п.о.

Гибридизация двух комплементарных аддуктов представляет собой более интересный случай по причине многообразия возможных наноструктур - как дискретных, так и полимерных.

Схема 15

Простейшей из возможных структур является «наноацетилен» - напоминающая органическую молекулу ацетилена структура, состоящая из двух точек разветвления, соединенных тремя двухспиральными доменами ДНК (схема 15).

Другим предельным случаем является образование полимерной графитоподобной структуры (схема 16). Следует отметить, что помимо предельных случаев, возможно образование бесконечного множества олигомерных структур, содержащих различное число молекул конъюгатов.

Схема 16

Конъюгаты готовили к гибридизации путем очистки их гель-электрофорезом или ВЭЖХ и обессоливания на сефадексе в бессолевом буфере. Гибридизацию проводили в концентрации компонентов 5x10"6 М посредством нагревания смеси олигонуклеотидных конъюгатов до 95°С и последующего быстрого охлаждения до комнатной температуры. Смесь анализировали с помощью гель-электрофореза в агарозном геле.

Оказалось, что гибридизация конъюгатов в воде приводит почти нацело к образованию «наноацетилена». Присутствие солей в концентрации 0.5 М способствует практически

полной полимеризации (рис. 6). Использование вместо М^2+ других ионов металлов приводит к промежуточным результатам - образованию олигомеров наряду с «наноацетиленом» и полимером.

т Ш

1 2 3 4 5 6

Рис. 6. Различия продуктов гибридизации триаддуктов в присутствии и в отсутствие Дорожки: 1. АИ+АЯ2, 0.5 М 2. АП+АК2; 3. АИ+АР2, 0.5 М 4. АП+АР2; 5.

А1*1+АК2, 0.5 М 6. АК1+АК2. Для компенсации артефактов электрофореза, связанных с

различным ионным составом образцов, концентрация во всех смесях перед нанесением на

гель была уравнена посредством его добавления в те образцы, которые его не содержали.

Для объяснения этого результата мы использовали аналогию с электростатическим отталкиванием одноименных зарядов. Олигонуклеотидные конъюгаты имеют отрицательный заряд в водных растворах при нейтральных значениях рН. Образование олиго- и полимерных структур способствует концентрированию одноименного заряда в небольшом объеме. Поэтому в растворах с низкой ионной силой (например, в деионизированной воде) этот процесс становится энергетически невыгодным, и образуются структуры наименьшего размера. При увеличении ионной силы эффект концентрирования заряда нивелируется (особенно этому способствуют двухзарядные ионы магния), и решающий вклад начинают вносить другие факторы, такие как необходимость деформации молекулы триконъюгата для образования наноацетилена. Очевидно, эти факторы способствуют полимеризации.

Образование слоя полимера при смешении комплементарных конъюгатов было доказано методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). С помощью АСМ в контактном режиме монослой полимера был процарапан и измерена его толщина. Она составила ~2 нм, что хорошо согласуется с литературными данными о толщине ДНК-дуплекса (рис. 7). Однако разрешить сетчатость структуры полимера с помощью АСМ не удалось даже в тэппинговом режиме.

Section Analysis

L 742.19 nm

RMS 1.852 nm

1с DC

RaCIc) 0.994 nm

Rmax 7.650 nm

Rz 4.268 nm

Rz Cnt 4

Radius 5.206 ym

Si gma 3.696 nm

Surface distance 743.65 nm

Horiz distanced.) 742.19 nm

vert distance 2.176 nm

Angle 0.168 °

Surface distance

Horiz distance

Vert distance

Angle

Surface distance

Horiz distance

Vert distance

Angle

Spectral period

Spectral freq

Spectral RMS amp

Рис. 7. АСМ изображение (контактный режим) монослоя полимера, полученного по схеме 15. Измеренная толщина процарапанного иглой монослоя составляет ~2.2 нм.

Для преодоления этой сложности нами была проведена гибридизация триконъюгата AR1 с комплементарным диконъюгатом БПТК A2D (схема 17). Простой расчет показывает, что размер

пор для такого «нанографита», в допущении его идеальной гексагональной симметрии, должен составлять порядка 11 нм (против 5 нм в случае полимера из двух комплементарных триконъюгатов).

Схема 17

Смесь двух конъюгатов после отжига в присутствии соли Mg2+ была нанесена на подложку из атомарно гладкой слюды. АСМ изображение образца показано на рис. 8. В то время как теоретическая гексагональная структура полимера подверглась существенному искажению (по-видимому, за счет недостаточной жесткости линкеров конъюгатов), ее ячеистая структура отчетливо видна. Толщина монослоя составляет 2 нм, что согласуется с представлениями о диаметре ДНК-дуплекса.

Digital Instruments NanoScope

1.000 pm

1.001 Hz 512

Height 5.000 nm

Scan size Scan rate Number of samples Image Data Data scale

Рис. 8. ACM изображение (тэппинговый режим) монослоя полимера, полученного по схеме 17. Толщина монослоя - около 2 нм.

выводы

1. Синтезировано три амидофосфитных реагента и твердофазный носитель для получения олигонуклеотидов, содержащих терминальную ацетиленовую группу. Синтезированы азидопроизводные десяти флуоресцентных красителей.

2. Синтезированы 3'- и 5'-терминальные ацетиленовые производные олигонуклеотидов, и с помощью реакции диполярного циклоприсоединения с высокими выходами получены их конъюгаты с флуоресцентными красителями, в том числе зонды для ПЦР.

3. Синтезированы олигонуклеотидные диконъюгаты бисимида перилен-2,3,9,10-тетракарбоновой кислоты (БПТК), а также триконъюгаты олигонуклеотидов с органическими триазидами.

4. Изучена гибридизация олигонуклеотидных конъюгатов БПТК и триолигонуклеотидных конъюгатов, сопровождающаяся образованием дискретных и полимерных ДНК-наноструктур.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Устинов А.В., Коршун В.А. Олигонуклеотиды, содержащие остатки арилацетилена: синтез и постсинтетическая модификация с помощью 1,3-диполярного циклоприсоединения. Изв. АН, Сер. хим., 2006 (7), 1220-1226 (Ustinov A.V., Korshun V.A. Oligonucleotides containing arylacetylene residues: synthesis and post-synthetic modification via [3+2] cycloaddition. Russ. Chem. Bull., 2006 (7), 1268-1274.)

2. Ustinov A.V., Dubnyakova V.V., Korshun V.A. Perylene diimide-oligonucleotide conjugates constructed by click chemistry. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 26 (6/7), 751-754 (2007).

3. Kvach M.V., Prokhorenko I.A., Ustinov A.V., Gontarev S.V., Shmanai V.V., Korshun V.A. Reagents for the selective immobilization of oligonucleotides on solid supports. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 26 (6/7), 809-813 (2007).

4. Kvach M.V., Tsybulsky D.A., Ustinov A.V., Stepanova I.A., Bondarev S.L., Gontarev S.V., Korshun V.A., Shmanai V.V. 5(6)-Carboxyfluorescein revisited: new protecting group, separation of isomers, and their spectral properties on oligonucleotides. Bioconjugate Chem., 18 (5), 1691-1696 (2007).

5. Kvach M.V., Ustinov A.V., Stepanova I.A., Malakhov A.D., Skorobogatyi M.V., Shmanai V.V., Korshun V.A. Convenient synthesis of cyanine dyes: reagents for labeling of biomolecules. Eur. J. Org. Chem., 2008 (12), 2107-2117.

6. Ustinov A.V., Dubnyakova V.V., Korshun V.A. A convenient "click chemistry" approach to perylene diimide-oligonucleotide conjugates. Tetrahedron, 64 (7), 1467-1473 (2008).

Тезисы конференций

1. Устинов A.B., Астахова И.В., Квач М.В., Шманай В.В., Стеценко Д.А., Дюбанкова Н.Н., Коршун В.А., Малахов А.Д. Молекулярный конструктор: расширение возможностей

-21 -

нанотехнологии нуклеиновых кислот. XVII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2005, 64.

2. Устинов А.В., Квач М.В., Шманай В.В., Коршун В.А. Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие этинильную группу: синтез и реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения к азидам. XVIII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2006, 63.

3. Ustinov A., Dubnyakova V., Korshun V. Click chemistry on DNA: a versatile tool for nanotechnology and photonics. XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. Conference Book. Bern, Switzerland, 2006,103.

4. Kvach M., Prokhorenko I., Ustinov A., Gontarev S., Korshun V., Shmanai V. Reagents for selective conjugation of oligonucleotides. XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. Conference Book. Bern, Switzerland, 2006, 137.

5. Устинов A.B., Квач M.B., Дубнякова B.B., Прохоренко И.А., Шманай В.В., Коршун В.А. Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения в синтезе модифицированных олигонуклеотидов и ДНК-наноструктур. Международная конференция "Физико-химическая биология", посвященная 80-летию академика Д.Г. Кнорре. Сборник трудов. Новосибирск, 2006, 177.

6. Dubnyakova V.V., Ustinov A.V., Korshun V.A. Branching and joining by click chemistry: where bioconjugation meets nanotechnology. Nucleic Acid Chemical Biology (NACB) PhD Summer School "Novel Synthetic Nucleic Acids and the Targeting of Biologically Important RNAs". Abstracts. Odense, Denmark, 2007, P-17.

7. Дубнякова B.B., Устинов A.B., Коршун В.А. Самосборка биоконъюгатов органических азидов с ДНК с образованием наноструктур. XX Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2008, 86.

8. Квач М.В., Устинов А.В., Цыбульский Д.А., Коршун В.А., Шманай В.В. Флуоресцентные реагенты для мечения биополимеров. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Сборник материалов. Новосибирск, 2008,277.

9. Устинов А.В., Дубнякова В.В., Квач М.В., Шманай В.В., Коршун В.А. Модифицировать или не модифицировать? ДНК-наноструктуры, содержащие необычные точки разветвления. IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Сборник материалов. Новосибирск, 2008, 312.

Заказ № 45/02/2009 Подписано в печать 20.02.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 1)] -тш.с/г.ги; е-таИ:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Устинов, Алексей Викторович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

САМОСОБИРАЮЩИЕСЯ ДНК-НАНОСТРУКТУРЫ (обзор литературы).

1. Разветвленные наноструктуры, полученные из немодифицированной ДНК.

2. Дискретные ДНК-наноструктуры.

3. Периодические ДНК-наноструктуры.

4. Разветвленные наноструктуры, полученные модификацией ДНК.

5. Молекулярные устройства на основе ДНК и обработка информации.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Синтез реагентов для модификации олигонуклеотидов.

2. Отработка реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения на модельном азиде.

3. Синтез флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов по реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения.

4. Синтез конъюгатов бисимида перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты.

5. Синтез олигонуклеотидных триконъюгатов и сборка наноструктур на их основе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертация по химии, на тему "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур"

Развитие химии олигонуклеотидных конъюгатов оказало колоссальное влияние на прогресс в молекулярной биологии. Секвенирование ДНК, ПЦР в режиме реального времени, флуоресцентная детекция точечных мутаций, гибридизационно-иммуноферментный анализ, флуоресцентная in ^/^-гибридизация - это лишь несколько примеров молекулярно-биологических методов, невозможных без использования модифицированных олигонуклеотидов.

Благодаря специфичности реакции и высокой стабильности исходных компонентов стал возможным синтез разветвленных олигонуклеотидных конъюгатов - ранее весьма труднодоступных блоков, представляющих большой интерес для сборки ДНК-наноструктур. ДНК-наноструктуры являются сравнительно малоизученными и весьма интересными объектами, которые, возможно, в ближайшем будущем найдут применение в медицинской диагностике и технологии изготовления электронных устройств. Исследованию самосборки разветвленных олигонуклеотидных конъюгатов с образованием наноструктур посвящена часть настоящей работы.

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

САМОСОБИРАЮЩИЕСЯ ДНК-НАНОСТРУКТУРЫ обзор литературы)

В последнее время все большее внимание исследователей привлекают наноструктуры - объекты, имеющие размер порядка нескольких нанометров, созданные из низкомолекулярных соединений посредством самосборки. Интерес к наноструктурам обусловлен новыми перспективами нанотехнологии: возможность расположения атомов в пространстве в строго определенном порядке позволит создать материалы с изменяемыми свойствами и огромный спектр наноустройств, таких как химические сенсоры, вычислительные устройства и компоненты памяти.

Принципиально, наноструктуры могут изготавливаться двумя путями — «сверху вниз» (top-down) и «снизу вверх» (bottom-up). Примером подхода «сверху вниз» является фотолитография, современный метод изготовления микропроцессоров — наноструктур, уже сейчас имеющих огромное применение.

Самосборка представляет собой гораздо более технологичный и существенно менее разработанный метод построения объектов нанометровых размеров «снизу вверх». В отличие от фотолитографии, она позволяет легко масштабировать производственный процесс, представляющий собой

5' 3 5 3' attggcatacg т т А т g g с простое смешение химически taaccgt + atgcaataccg

3,1 1 1 1 1 1 g, з ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 5- синтезированных компонентов наноструктур в нужном соотношении. Основная же сложность данного подхода состоит в дизайне этих

5' 3' 5' 3'

I I I I I I I I I I I.— компонентов, способных к attggcatacgttatggc taaccgtatgcaataccg

I | | | | | I .— предсказуемой и строго

3' 5 3' 5' специфической агрегации.

ДНК представляет собой прекрасную матрицу для создания 5' 3' нанообъектов [1—131;

I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—1—I—I—I—I—I— attggcatacgttatggc taaccgtatgcaataccg предполагается, что ДНК' ■IIIIIIIIIIIIIIIIг г

Рис. 1. Использование «липких концов» н ан о структуры могут наити применение в области наноэлектроники [14], использоваться для создания новых материалов [15,16,17], а также для решения ряда биомедицинских задач, таких как детекция биомолекул и доставка лекарств в клетку [18,19].

Именно ДНК была выбрана в качестве материалов для создания нанообъектов потому, что ее самосборка легко программируется. В отличие от других синтетических полимеров и биополимеров, агрегация смеси одноцепочечных ДНК легко предсказуема и определяется их последовательностями. Одно- и двухцепочечные фрагменты ДНК различной длины и последовательности могут быть легко получены при помощи автоматизированного олигонуклеотидного синтеза и хорошо разработанных ферментативных методов молекулярной биологии. Так, например, уже более 35 лет известно [20], что два фрагмента двухцепочечной ДНК могут быть нековалентно связаны при помощи «липких концов» — взаимно комплементарных одноцепочечных последовательностей (рис. 1)

Параметры образующейся при гибридизации комплементарных цепей структуры ДНК-дуплекса хорошо известны [21]. ДНК-дуплекс имеет диаметр около 2 нм, что соответствует нижней границе размеров, интересных для нанотехнологии.

В то время как для создания двумерных и трехмерных наноструктур значительный интерес представляют разветвленные компоненты, одно- и двухцепочечная ДНК топологически линейна. В связи с этим возникает проблема синтеза топологически нелинейных структур из ДНК. В зависимости от природы точки ветвления топологически нелинейные ДНК-структуры можно разделить на наноструктуры из немодифицированной ДНК (ветвление которых основано исключительно на комплементарности), и наноструктуры, основанные на модификации ДНК (ковалентной или использующей нековалентно связывающие ДНК молекулы).

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

выводы

3. Синтезированы олигонуклеотидные диконъюгаты бисимида перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты (БПТК), а также триконъюгаты олигонуклеотидов с органическими триазидами.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает сердечную благодарность В.А. Коршуну за руководство диссертационной работой, постоянную помощь, заботу и поддержку.

Автор благодарен коллегам из Лаборатории химии нуклеиновых кислот ИБХ РАН, помогавшим выполнению настоящей работы. Автор особенно признателен М.В. Квачу, В.В. Дубняковой, Д.А. Цыбульскому, М.В. Скоробогатому и А.Д. Малахову за участие в ряде экспериментов; В.В. Шманаю, С.Г. Гонтареву, Ю.И. Габрусю за олигонуклеотидный синтез; К.Р. Бирих - за предоставление оборудования для горизонтального электрофореза, ряда реагентов, и ценные консультации; Т.С. Зацепину - за тестирование зондов для ПЦР реального времени; 3.0. Шенкареву, К.Д. Надеждину, А.С. Парамонову (ИБХ РАН) и А.С. Перегудову (ИНЭОС РАН) за запись ЯМР-спектров; Д.Г. Алексееву - за запись спектров MALDI-TOF; Г.К. Жавнерко (ИХНМ НАН РБ, Минск, Белоруссия) за АСМ исследования; сотрудникам Лаборатории Молекулярных технологий для биологии и медицины ИБХ РАН за предоставление в пользование спектрофлуориметра.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Устинов, Алексей Викторович, Москва

1. Seeman, N.C. DNA components for molecular architecture. Acc. Chem. Res., 1997, 30(9), 357-363.

2. Niemeyer, C.M. DNA as a material for nanotechnology. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36(6), 585-587.

3. Seeman, N.C. Nucleic acid nanostructures and topology. Angew. Chem. Int. Ed., 1998, 57(23), 3220-3238.

4. Csaki, A.; Maubach, G.; Born, D.; Reichert, J.; Fritzsche, W. DNA-based molecular nanotechnology. Single Mol., 2002, 5(5/6), 275-280.

5. Seeman, N.C.; Belcher, A.M. Emulating biology: building nanostructures from the bottom up. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002, PP(Suppl 2), 6451-6455.

6. Seeman, N.C. DNA: beyond the double helix. Macromol. Symp., 2003, 207(1), 237-244.

7. Seeman, N.C. Biochemistry and structural DNA nanotechnology: an evolving symbiotic relationship. Biochemistry, 2003, 24(42), 7259-7269.

8. Wengel, J. Nucleic acid nanotechnology—towards Angstrom-scale engineering. Org. Biomol. Chem., 2004, 2(3), 277-280.

9. Gothelf, К. V.; LaBean, Т.Н. DNA-programmed assembly of nanostructures. Org. Biomol Chem., 2005, 5(22), 4023-4037.

10. Samori, В.; Zuccheri, G. DNA codes for nanoscience. Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44(8), 1166-1181.

11. Gothelf, K.V.; Brown, R.S. A modular approach to DNA-programmed self-assembly of macromolecular nanostructures. Chem. Eur. J., 2005, 77(4), 1062-1069.

12. Lin, C.; Liu, L.; Rinker, S.; Yan, H. DNA Tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem, 2006, 7(8), 1641-1647.

13. Feldkamp, U.; Niemeyer, C.M. Rational design of DNA nanoarchitectures. Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45(12), 1856-1876.

14. Bhalla, V.; Bajpai, R.P.; Bharadwaj, L.M. DNA electronics. EMBO reports, 2003, 4(5), 442-445.

15. Storhoff, J.; Mirkin, Ch. A. Programmed materials synthesis with DNA. Chem. Rev., 1999, 99(1), 1849-1862.

16. Seeman, N. C. DNA in a material world. Nature, 2003, 421(6921), 427-431.

17. Aldaye, F.A.; Palmer, A.L.; Sleiman, H.F. Assembling materials with DNA as the guide. Science, 2008, 527(5897), 1795-1799.

18. Klefenz, Н. Nanobiotechnology: from molecules to systems. Eng. Life Sci., 2004, 4(3), 211-218.

19. Ко, S.; Liu,H; Chen Y.; Mao,C. DNA nanotubes as combinatorial vehicles for cellular delivery. Biomacromolecules, 2008, 9(11), 3039-3043.

20. Cohen, S. N.; Chang, A. C. Y.; Boyer, H.W.; Helling, R.B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, 70(11), 32403244.

21. Зенгер, В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1987.

22. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res., 1964, 56(3), 282304.

23. Ma, R.-I.; Kallenbach, N.R.; Sheardy, R.D.; Petrillo, M.L.; Seeman, N.C. Three-arm nucleic acid junctions are flexible. Nucleic Acids Res., 1986,14(24), 9745-9753.

24. Kallenbach, N.R.; Ma, R.-L, Seeman, N.C. An immobile nucleic acid junction constructed from oligonucleotides. Nature (London), 1983, 505(5937), 829-831.

25. Wang, Y.; Mueller, J.E.; Kemper, В.; Seeman, N.C. Assembly and characterization of five-arm and six-arm DNA branched junctions. Biochemistry, 1991, 50(23), 5667-5674.

26. Seeman, N.C. Molecular craftwork with DNA. Chem. Intell., 1995, 7(1), 38-47.

27. Kim, J.-S.; Sharp, P.A.; Davidson, N. Electron microscope studies of heteroduplex DNA from a deletion mutant of bacteriophage 0X-174. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, 69(1), 1948-1952.

28. Lilley, D. M. J.; Clegg, R. M. The structure of the four-way junction in DNA. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1993, 22, 299-328.

29. Eis, P.S.; Millar, D.P. Conformational distributions of a four-way DNA junction revealed by time-resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry, 1993, 52(50), 13852-13860.

30. Sha, R.; Liu, F.; Bruist, M.F.; Seeman, N.C. Parallel helical domains in DNA branched junctions containing 5',5' and 3',3' linkages. Biochemistry, 1999, 38(9), 2832-2841.

31. Petrillo, M.L.; Newton, C.J.; Cunningham, R.P.; Ma, R.-I.; Kallenbach, N.R.; Seeman, N.C. The ligation and flexibility of four-arm DNA junctions. Biopolymers, 1988, 27(9), 1337-1352.

32. Li, Y.; Tseng, Y.D.; Kwon, S.Y.; D'Esperaux, L.; Bunch, J.S.; McEuen, P.L.; Luo, D. Controlled assembly of dendrimer-like DNA. Nature Mater., 2004, 5(1), 38-42.

33. Fu, T.-J.; Seeman, N.C. DNA Double-crossover molecules. Biochemistry, 1993, 52(13), 3211-3220.

34. Li,X.; Yang,X.; Qi, J.; Seeman, N.C. Antiparallel DNA double crossover molecules as components for nanoconstruction. J. Am. Chem. Soc., 1996,118(26), 6131-6140.

35. Qi,J.; Li,X.; Yang, X; Seeman. N.C. Ligation of triangles built from bulged 3-arm DNA branched junctions. J. Am. Chem. Soc., 1996,118(26), 6121-6130.

36. Seeman, N.C. In the nick of space: generalized nucleic acid complementarity and DNA nano techno logy. Synlett, 2000(11), 1536-1548.

37. Seeman, N.C. DNA nicks and nodes and nanotechnology. Nano Lett., 2001, 7(1), 22-26.

38. Shen, Z; Yan, H.; Wang, Т.; Seeman, N.C. Paranemic crossover DNA: a generalized Holliday structure with application in nanotechnology. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(6), 1666-1674.

39. Zhang, X.; Yan, H.; Shen, Z.; Seeman, N.C. Paranemic cohesion of topologically-closed DNA molecules. J. Am. Chem. Soc., 2002,124(44), 12940-12941.

40. Chen, J.-H.; Kallenbach, N.R.; Seeman, N.C. A specific quadrilateral synthesized from DNA branched junctions. J. Am. Chem. Soc., 1989, 777(16), 6402-6407.

41. Chen, J.; Seeman, N.C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature (London), 1991, 550(6319), 631-633.

42. Zhang, Y.; Seeman, N.C. Construction of a DNA-truncated octahedron. J. Am. Chem. Soc., 1994,776(5), 1661-1669.

43. Zhang, Y.; Seeman, N.C. A solid-support methodology for the construction of geometrical objects from DNA. J. Am. Chem. Soc., 1992,114(1), 2556-2563.

44. Goodman, R. P.; Berry, R. M.; Turberfield, A. J. The single-step synthesis of a DNA-tetrahedron. Chem. Comm., 2004(12), 1372-1373.

45. Goodman, 1IP.; Schaap, I.A.T. Tardin, C.F.; Erben, C.M.; Berry, R.M.; Schmidt, C.F.; Turberfield, A.J. Rapid Chiral Assembly of rigid DNA building blocks for molecular nanofabrication. Science, 2005, 310(5154), 1661-1665.

46. Shih, W.M.; Quispe, J.D.; Joyce, G.F. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature, 2004, 427(6915), 618-621.

47. He, Y.; Ye, Т.; Su, M.; Zhang, C.; Ribbe, A.E.; Jiang, W.; Mao, C. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature, 2008, 452(7184), 198-201.

48. Мао, С.; Sim, W.; Seeman, N.C. Assembly of Borromean rings from DNA. Nature, 1997, 386(6621), 137-138.

49. Kuhn, H.; Demidov, V.V.; Frank-Kamenetski, M.D. Topological links between duplex DNA and a circular DNA single strand. Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38(10), 1446-1449.

50. Roulon, Т.; Le Cam, E.; Escud, C. A new supramolecular structure made of two different plasmids linked by a circular oligonucleotide. ChemBioChem, 2006, 7(6), 912-915.

51. Weizmann, Y.; Braunschweig, А.В.; Wilner, O.I.; Cheglakov, Z.; Willner, I. A polycatenated DNA scaffold for the one-step assembly of hierarchical nanostructures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 705(14), 5289-5294.

52. Liu, Y.; Ke, Y.; Yan, H. Self-assembly of symmetric finite-size DNA nanoarrays. J. Am. Chem. Soc., 2005, 727(49), 17140-17141.

53. Yan, H.; LaBean, Т.Н.; Feng, L.; Reif, J.H. Directed nucleation assembly of DNA tile complexes for barcode-patterned lattices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 700(14), 81038108.

54. Park, S.H.; Pistol, C.; Ahn, S.J.; Reif, J.H; Lebeck, A.R.; Dwyer, C.; LaBean, Т.Н. Finite-size, fully addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45(5), 735-739.

55. Rothemund, P. W.K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature, 2006, 440(7082), 297-302.

56. Seeman N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol., 1982, 99(2), 236-247.

57. Deng, Z.; Mao, C. Molecular lithography with DNA nanostructures. Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43(31), 4068^1070.

58. Mao, C.; Sun, W.; Seeman, N.C. Designed two-dimensional DNA Holliday junction arrays visualized by atomic force microscopy. J. Am. Chem. Soc., 1999, 727(23), 5437—5443.

59. Liu, Y.; Yan, H. Modular self-assembly of DNA lattices with tunable periodicity Small, 2005, 7(3), 327-330.

60. Liu, D.; Wang, M.; Deng, Z.; Walulu, R.; Mao, C. Tensegrity: construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. J. Am. Chem. Soc., 2004, 726(8), 23242325.

61. Winfree, E.; Liu, F.; Wenzler, L.A.; Seeman, N.C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature, 1998, 394(6693), 539-544.

62. Liu, F.; Sha, R.; Seeman, N.C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. J. Am. Chem. Soc., 1999, 727(5), 917-922.

63. Garibotti, A.V.; Knudsen, S.M.; Ellington, A.D.; Seeman, N.C. Functional DNAzymes organized into two-dimensional arrays. NanoLett., 2006, 6(7), 1505-1507.

64. LaBean, Т.Н.; Yan, H.; Kopatsch, J.; Liu, F.; Winfree, E.; Reif, J.H.; Seeman, N.C. Construction, analysis, ligation, and self-assembly of DNA triple crossover complexes. J. Am. Chem. Soc., 2000, 722(9), 1848-1860.

65. Reishus, D.; Shaw, В.; Brun,Yu.; Chelyapov, N.; Adleman, L. Self-assembly of DNA double-double crossover complexes into high-density, doubly connected, planar structures. J. Am. Chem. Soc., 2005, 727(50), 17590-17591.

66. Ding, В.; Sha, R.; Seeman, N.C. Pseudohexagonal 2D DNA crystals from double crossover cohesion. J. Am. Chem. Soc., 2004, 725(33), 10230-10231.

67. He, Y; Chen, Y.; Haipeng, L.; Ribbe, A.E.; Mao, C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays. J. Am. Chem. Soc., 2005, 727(35), 12202-12203.

68. He, Y.; Tian, Y.; Chen, Y.; Deng, Z; Ribbe, A.E.; Mao, C. Sequence symmetry as a tool for designing DNA nanostructures. Angew. Chem. Int. Ed., 2005, 44(41), 6694-6696.

69. Liu, H.; He, Y.; Ribbe, A.E.; Mao, C. Two-dimensional (2D) DNA crystals assembled from two DNA strands. Biomacromolecules, 2005, 6(6), 2943-2945.

70. He, Y.; Tian, Y.; Ribbe, A.E.; Mao, C. Highly connected two-dimensional crystals of DNA six-point-stars. J. Am. Chem. Soc., 2006,128(50), 15978-15979.

71. Mitchell, J.C.; Harris, J.R.; Malo, J.; Bath, J.; Turberfield, A.J. Self-assembly of chiral DNA nanotubes. J. Am. Chem. Soc., 2004,126(50), 16342-16343. .

72. Rothemund, P.W.K.; Ekani-Nkodo, A.; Papadakis, N.; Kumar, A.; Fygenson, D.K.; Winfree, E. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. J. Am. Chem. Soc., 2004, 726(50), 16344-16352.

73. O'Neill, P.; Rothemund, P.W.K.; Kumar, A.; Fygenson, D.K Sturdier DNA nanotubes via ligation. NanoLett., 2006, 6(7), 1379-1383.

74. Park, S.H.; Barish, R.; Li, Я; Reif, J.H.; Finkelstein, G.; Yan, H.; LaBean, Т.Н. Three-helix bundle DNA tiles self-assemble into 2D lattice or ID templates for silver nanowires. NanoLett., 2005, 5(4), 693-696. r

75. Wei, В.; Mi, Y. A new triple crossover triangle (TXT) motif for DNA self-assembly. Biomacromolecules, 2005, 6(5), 2528-2532.

76. Mathieu, F.; Liao, S.; Kopatsch, J.; Wang, Т.; Mao, C.; Seeman, N.C. Six-helix bundles designed from DNA. NanoLett., 2005, 5(4), 661-665.

77. Yin, P., Hariadi, R.F.; Sahu, S.; Choi, H.M.T.; Park, S.H.; LaBean, Т.Н.; Reif, J.H. Programming DNA tube circumferences. Science, 2008, 527(5890), 824-826.

78. Sharma, J.; Chhabra, R.; Cheng, A.; Brownell, J.; Liu, Y.; Yan, H. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science, 2009, 525(5910), 112-116.

79. Liu, H.; Chen, Y.; He, Y.; Ribbe, A.E.; Mao, C. Approaching the limit: can one DNA oligonucleotide assemble into large nanostructures? Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45(12), 1942-1945.

80. Kuzuya, A.; Numajiri, K; Kimura, M.; Komiyama, M. Single-molecule accommodation of streptavidin in nanometer-scale wells formed in DNA nanostructures. Nucleic Acids Symp. Ser., 2008, No. 52, 681-682.

81. Sharma, J.; Ke, Y.; Lin, C.; Chhabra, R.; Wang, Or, Nangreave, J.; Liu, Y.; Yan, H. DNA-tile-directed self-assembly of quantum dots into two-dimensional nanopatterns. Angew.

82. Chem. Int. Ed., 2008, 47(28), 5157-5159.

83. Korshun, V.A.; Pestov, N.B.; Nozhevnikova, E.V.; Prokhorenko, I.A.; Gontarev, S.V.; Berlin, Yu.A. Reagents for multiple non-radioactive labelling of oligonucleotides. Synth. Comm., 1996, 26(13), 2531-2548.

84. Shchepinov, M.S.; Udalova, I.A.; Bridgman, A.J.; Southern, E.M. Oligonucleotide dendrimers: synthesis and use as polylabelled DNA probes. Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447—4454.

85. Shi, J.; Bergstrom, D.E. Assembly of novel DNA cycles with rigid tetrahedral linkers. Angew. Chem. Int. Ed., 1997, 36 (1/2), 111-113.

86. Scheffler, M.; Dorenbeck, A.; Jordan, S.; Wtistefeld, M.; von Kiedrowski, G. Self-assembly of trisoligonucleotidyls: the case for nano-acetylene and nano-cyclobutadiene. Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38(22), 3311-3315

87. Grimau, M.G.; Iacopino, D.; Avino, A.; de la Torre, B.G.; Ongaro, A.; Fitzmaurice, D.; Wessels, J.; Eritja, R. Synthesis of branched oligonucleotides as templates for the assembly of nanomaterials. Helv. Chim. Acta, 2003, 86(8), 2814-2826.

88. Tumpane, J.; Lundberg, E.P.; Wilhelmsson, L.M.; Brown, Т.; Norden, B. Addressable molecular node assembly functional DNA nanostructures. Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 97-98.

89. Eckardt, L.H.; Naumann, K; Pankau, W.M.; Rein, M.; Schweitzer, M.; Windhab, N.; von Kiedrowski, G. Chemical copying of connectivity. Nature, 2002, 420 (6913), 286.

90. Mitra, D.; Di Cesare, N; Sleiman, H.F. Self-assembly of cyclic metal-DNA nanostructures using ruthenium tris(bipyridine)-branched oligonucleotides. Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43(43), 5804-5808.

91. Gothelf, К V.; Thomsen, A.; Nielsen, M.; Clo, E.; Brown, R.S. Modular DNA-programmed assembly of linear and branched conjugated nanostructures. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(4), 1044-1046.

92. Yang, H.; Sleiman, H.F. Templated synthesis of highly stable, electroactive, and dynamic metal-DNA branched junctions. Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 720(13), 2477-2480.

93. Niemeyer, C.M.; Adler, M. Nanomechanical devices based on DNA. Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41(20), 3779-3783.

94. Chen, Y, Lee, S.-H., Mao, Ch. A DNA nanomachine based on a duplex-triplex transition. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2004, 43(40), 5335-5338.

95. Shen, W.; Bruist, M.F.; Goodman, S.D.; Seeman, N.C. A protein-driven DNA device that measures the excess binding energy of proteins that distort DNA. Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43(36), 4750-4752.

96. Shin, J.-S.; Pierce, N.A. Rewritable memory by controllable nanopatterning of DNA. Nano Lett., 2004, 4(5), 905-909.

97. Wang, H. Games, logic and computers. Scientific American, 1965, November, 98-106.

98. Barish, R.D.; Rothemund, P.W.K.; Winfree, E. Two computational primitives for algorithmic self-assembly: copying and counting. Nano Lett., 2005, 5(12), 2586—2592.

99. Coulson, D.R. Tetrakis (Triphenylphosphine) palladium (0). Inorg. Synth., 1972, 13, 121— 124.

100. Caruthers, M.H.; Barone, A.D.; Beaucage, S.L.; Dodds, D.R.; Fisher, E.F.; McBride, L.J.; Matteucci, M.; Stabinsky, Z; Tang, J.-Y. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Meth. Enzymol. 1987,154, 287-313.

101. Bannwarth, W.; Trzeciak, A. A simple and effective chemical phosphorylation procedure for biomolecules. Helv. Chim. Acta, 1987, 70(1), 175-186.

102. Carboni, В.; Benalil, A.; Vaultier, M. Aliphatic amino azides as key building blocks for efficient polyamine syntheses. J. Org. Chem., 1993, 55(14), 3736-3741.

103. Lewis, W.G.; Magallon, F.G.; Fokin, V.V.; Finn, M.G. Discovery and characterization of catalysts for azide-alkyne cycloaddition by fluorescence quenching. J. Am. Chem. Soc., 2004, 726(30), 9152-9153.

104. Drechsler, G.; Smagin, S. Zur Darstellung von Trimelliteinen und 5'-Carboxyfluoresceinen. J. Prakt. Chem, 1965, 25(5/6), 315-324.

105. Haralambidis, J.; Angus, K.; Pownall, S.; Duncan, L.; Chai, M.; Tregear, G.W. The preparation of polyamine-oligonucleotide probes containing multiple non-radioactive labels. Nucl. Acids Res, 1990, 75(3), 501-505.