Синтез спейсерированных олигосахаридных цепей шликолипидов глобо- и ганглио- серий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

ЧЕШЕВ Павел Евгеньевич

СИНТЕЗ СПЕЙСЕРИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДНЫХ ЦЕПЕЙ ГЛИКОЛИПИДОВ ГЛОБО- И ГАНГЛИО- СЕРИЙ

02.00.03 - органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -2005

Работа выполнена в лаборатории химии гликоконъюгатов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН

Научный руководитель: доктор химических наук Н.Э. Нифавтьев

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Я.В. Возный доктор химических наук Д.В. Яшунский

Ведущая организация: Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « 10 » июня 2005 г. в 1130 часов на заседании диссертационного совета К 002.222.01 по присуждению ученой степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН по адресу: Москва, Ленинский проспект, 47, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН

Автореферат разослан мая 2005 г,

С

« ^ »I

Ученый секретарь диссертационного совета К 002.222.01

доктор химических наук

Л.А. Родиновская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСППСА РАБОТЫ

Актуальность работы: Природные глюсолипиды глобо- и ганглио- серий играют важную роль в процессах межклеточного узнавания, адгезии и пролиферации. Основную функцию при этом несут именно углеводные цепи данных гликолипидов, которые влияют на развитие целого ряда опасных заболеваний. В частности, олигосахаридные цепи глобо- и гакглыо-гликолипидов являются лигандами микробных токсинов и адгезинов, а также известны как онкоассоциированные антигены. Кроме того, развитие некоторых опасных невропатий, протекающее по аутоимунному механизму, сопровождается выработкой антител против олигосахаридных цепей гликолипидов, в особенности ганглиозидов.

Весьма ограниченная доступность соединений рассматриваемых типов из природных источников ставит задачу разработки методов их peino- и стереонанравленного химического синтеза. Нужно отметить, что несмотря на большое количество работ, посвященных синтезу гапглиозидов и глобозидов, разработка эффективных методов их получения остается одной из самых сложных задач современной химии углеводов. Поскольку для проведения биохимических исследований in vitro наиболее удобны олигосахаридные цепи, связанные с разнообразными носителями и метками, то особенно актуальным представляется получение целевых соединений в форме гликозидов, содержащих необходимую для конъюгации спейсерную группу.

Цель работы: Настоящая диссертация посвящена разработке синтеза олигосахаридных цепей гянглио-гликолипидов асиало-GMi (GAi), GM2, GMi и Fuc-GMi, а также глобо-гликолипидов Gb.» и Gbs, содержащих спейсерный 2-аминоэтильный агликон, позволяющий проводить конъюгацию с носителями и метками.

Научная новизна и практическая ценность работы: В настоящем исследовании разработан синтез олигосахаридных цепей глобо- и ганглио-гликолипидов при использовании в качестве гликозилдоноров тиогликозидов на основе галактозамина и дисахарида p-D-Gal-(l-*3)-D-GalN. Изучен процесс переноса агликона с пгакозилакцептора на гликозилдонор, побочно протекающий при гликозилировании тиогликозидов галактозамина. Показано, что при гликозилировании и-нитрофенилтиогликозидов галактозамина побочный перенос агликона не происходит. На основе предложенных рациональных конвергентных синтетических схем, использующих унифицированные синтетические блоки, получены спейсерированные производные ганглиозидов Fuc-GMj, GMi, GM2 и асиало-GMi, а также глобозидов Gbs и Gb.). Синтезированные соединения использованы в качестве молекулярных зондов для изучения углеводной специфичности лектинов.

Публикации: По теме настоящей диссертации опубликовано 4 статьи. Отдельные материалы работы были представлены в виде тезисов на 4-й летней школе по зеленой химии (Венеция, Италия, 2001 г.) и на XVH Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), а также доложены на Кпяуурга мппгшщ ученых ИОХ РАН в 2003 г.

j »»UC. НАЦИОНАЛЬНАЯ I

БИБЛИОТЕКА I

.,. оУТЖ j

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного получению гликозилдоноров на основе дисахарида р-О-0а1-( 1 ->3)-0-йаИЧ, предназначенных для проведения а- и р-гликозилирования, и их применению в синтезах олигосахаридных цепей природных гликоконъюгатов, а также обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Общий объем диссертации 129 страниц, библиография содержит 92 ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Целевые структуры.

Целевыми объектами синтеза в данной работе являлись 2-аминоэтилгликозиды углеводных цепей ганглио- (1-4, рис. 1) и глобо-гликолипидов (5 и 6, рис. 2).

Рис. 1 Синтезированные гакгяио-олигосахариды асиало-GMi (GAO, GM2, GMi и Fuc-GMi.

Наличие в целевых соединениях 2-аминоэтильной спейсерной группы позволяет проводить их конъюгацию с разного рода носителями и метками и, таким образом, создавать инструменты для проведения гликобиологических и медицинских исследований.

Я» он СООН

м<

г ем, A,B,C.D,E

4 Fuc-GM, *.B.C,D,E.F

Ж

б аь4 А.В. C.D

« аь9 А,в. с, о. е

Рис. 2 Синтезированные глобо-доигосахарнды Gb4 и Gb5.

Стратегия синтеза.

При проведении ретросинтетического анализа целевых соединений 1-6 во внимание принимались их следующие ключевые структурные особенности: последовательность моносахаридных остатков и конфигурация гликозидных связей в углеводном скелете, присутствие -связанного Л^-ацетилгалактозамина, наличие аминогруппы в агликоне, а также a-связанных терминальных остатков N-ацетилнейраминовой кислоты (для соединений 1, 3, 4) и фукозы (4). Поскольку наиболее крупные олигосахаридные цепи старших структур ганглио- и глобо- рядов содержат в своем составе цепи структур меньшего размера, то при выборе общей стратегии получения целевых соединений 1-6 учитывались, прежде всего, результаты ретросинтетического анализа наиболее синтетически сложных соединений -гексасахарида 4 и пентасахаридов 3 и 6.

Ретросинтетический анализ аминоэтилгликозида 3 показал, что наиболее эффективные пути построения его углеводного скелета основаны на схемах [1+4] и [2+3] сборки с использованием набора унифицированных моно- и дисахаридных интермедиатов 7, 9, 10 и 12, что позволяет свести к минимуму разнообразие применяемых синтетических блоков (схема 1) При получении пентасахарида 3 нами были последовательно исследованы обе схемы сборки - [1+4], с ключевой конденсацией блоков 7 и 8, и [2+3] с конденсацией блоков 9 и 11. Последняя схема оказалась более продуктивной и легла в основу синтеза гексасахарида 4.

Ключевым вопросом при разработке стратегии синтеза целевых соединений, в особенности сиалилированных производных 3 и 4, являлся выбор эффективного метода получения синтетического блока на основе дисахарида P-D-Gal-(l->3)-D-GalNAc, пригодного для проведения (5-гликозилирования. Соответствующие ЛГ-фталоильные производные, традиционно используемые для [3-галактозаминилирования, плохо применимы для синтеза сиалилированных структур из-за жестких условий удаления jV-фталоильной защиты, несовместимых с присутствием сложноэфирной группы в остатке нейраминовой кислоты. Использование другой распространенной группы доноров на основе 2-азидо-2-дезокси-аналогов fp-D-Gal-(l->3)-D-GalN3] было ограничено из-за невысокой 0-стереоизбирательности гликозилирования ими. Поэтому в данной работе были исследованы ДО-трихлорацетильные производные типа 9, в которых защитная группа при азоте не только обеспечивает необходимую p-стереоизбирательность гликозилирования, но и может быть удалена или переведена в //-ацетильную в мягких условиях. Впервые соединения такого типа были использованы в синтезе глюкозаминогликанов и ранее не применялись для получения углеводных цепей глобо- и ганглио-гликолипидов.

Синтезы сиалилированных структур 2-4 в настоящей работе проводили с использованием сиалилдонора 7. Выбор бензилированных производных лактозы 10 и 12 объясняется их более высокой реакционной способностью по сравнению с бензоилированными или ацетил ироваиными аналогами.

V

Схема 1. Ретросинтетический анализ спейсерированного производного пентасахарида вМ, (3).

Стратегия синтеза прочих целевых структур была разработана нами с использованием всех основных принципов, обсуждавшихся выше.

Получение сиейсерированных лактозных гликозилакцепторов.

Общим предшественником лактозных гликозилакцепторов 10, 12 и 19 являлся

азидоэтиллактозид 15, который получали конденсацией доступной ацетобромлактозы 13 с хлорэтанолом с последующей заменой атома хлора на азидную группу (схема 2).

а

я!

Р

13

14 К = Ас, 1?1=С1

ж

Е

1в, Я=Н, ^+Я2=>СМе2 12, Я=Вп, ^ = Р2=Н 10 Я = Вп, Я1 = МРМ, (?г=Н

17, Н, ^^»СИРИ

18 R = Вп; ^ =

19, Я - Вп, ^»Н.^Вг

Схема 2. а: С1СН2СН2ОН, Нв(СК)2/НкВг2; б: №N3, ДМФА, 18-краун-6; в: МеОКа/МеОН; г: Ме2С(ОМе)2, ТвОН; д: КаН, ВпВг, ДМФА; е: СН3СООН, I; ж: Ви28пО/Толуол, п-метоксибензилхлорид; з: РЬСН(ОМе)2, ТвОН; и: ВгС1/Ру.

Наличие -СНгКз группы в агликоне дисахарида 15 подтверждалось характерным химическим сдвигом сигнала ОСН2СН2Кз в спектре |3С-ЯМР (5 51.0 м. д.).

Избирательно защищенные моногидроксильные гликозилакцепторы 10 и 19 получали региоизбирательным введением З'-О-метоксибензильной или б'-О-бензоильной группы в диолы 12 и 18, соответственно. Последние получали путем региоизбирательного 3',4'- или 4',6'-ацеталирования гептаола 15, исчерпывающего бензилирования остальных гидроксильных групп и удаления ацетальной защиты.

Получение гликозилдоноров на основе дисахарида В-Р-Са1-(1 -»ЗУ-Р-Са^

Возможны два подхода к получению производных дисахарида Р-0-Са1-(1->3)-В-0а1К при использовании галакталя в качестве исходного. Первый включает галактозилирование галакталя с последующим азидонитрованием образующегося галактозилгалакталя. Второй - первоначальное азидонитрование галакталя с последующим галактозилированием соответствующего производного галактозамина. Нами были исследованы оба варианта.

Галактозилирование производных галакталя. В синтезе галактозилгалакталя 22 в качестве исходного мы использовали известный диол 20 (схема 3). При гликозилировании акцептора 20 2,3,4,б-тетра-0-ацетил-В-галактопиранозилтрихлорацетимидатом 21 (смесь а-

и р- изомеров) в дихлорметане в присутствии ВР3.Е120 искомый дисахарид 22 был получен с выходом 35%.

СЛ

I —-081РН2

он

1РП2Ви-(

'Ьг'Ви

ОС(КН)ССЬ

№

Я

20

22(35%)

Схема 3. а: ВР^О, СН2С12

Наличие в продукте 22 (1->3)-гликозидной связи следовало из смещения в 'Н-ЯМР спектре сигнала протона Н-4 (но не Н-3) в более слабое поле на 1.35 м.д. после О-ацетилирования свободной гидроксильной группы в продукте 22. р-Конфигурация созданной гликозидной связи в 22 подтверждалась характерной величиной КССВ 8.3 Гц.

Невысокий выход в этой реакции ограничивал дальнейшее использование соединения 22 для препаративного получения целевого гликозилдонора на основе дисахарида Р-В-ОЫ-(1-»3)-В-ОаГН, тем более, что наличие в гликалях двойной связи существенно ограничивает возможности оптимизации условий их гликозилирования. Поэтому более подробно нами был изучен альтернативный метод получения о- и р- гликозилдоноров на основе дисахарида р-Б-ваЩ—>-3)-0-0аГМ путем галактозилирования производных 2-азидо-2-дезокси-1 -тио-Р-О-галактозы.

Галактозилирование производпых 2-азидо-2-дезокси-1-тио-Р-0-галактозы. При исследовании данного подхода в качестве первой группы галактозил-акцепторов нами были рассмотрены фенилтиогликозиды 25 и 26, синтезированные взаимодействием азидохлорида галактозы 23 (получен из три-0-ацетил-Г>-галакталя) с тиофенолом (схема 4).

Схема 4. а: РЬБИУЛаН, ТГФ; б: МеСЖа, МеОН; с: РЬСН(ОМе)2, (±)-камфор-10-сульфоновая кислота, СНзОТ; д: ВиРЬ^С!, ОМАР, Ру.

26(90%)

Превращение р-азидохлорида 23 в а-тиогликозид 24 проводили действием тиофенолята натрия в абсолютном тетрагидрофуране, замещение при этом проходит селективно с обращением конфигурации. Некоторые потери в выходе продукта реакции объясняются протеканием побочного восстановления азидной группы в аминогруппу под действием тиофенола. Тиогликозид 24 далее полностью дезацетилировали и переводили в бензилиденовое производное 25 и в 6-О-силилированный диол 26.

При гликозилировании моногидроксильного производного 25 ацетобромгалактозой 27 (схема 5) в условиях реакции Гельфериха происходило полное разложение реагентов без образования продукта гликозилирования (табл 1, опыт 1). При проведении реакции в дихлорметане в присутствии трифлата серебра (опыт 2) образовывалась сложная смесь продуктов, в которой отсутствовал дисахарид требуемого строения, а основным компонентом являлся фенил-2,3,4,6-тетра-0-ацетил-1-тио-Р-В-галактопираиозид 29 (схема 5), выделенный с выходом 24%. Последний представлял собой продукт переноса тиофенильного агликона из молекулы гликозилакцептора на гликозилкатион. Строение соединения 29 установлено с помощью спектроскопии ЯМР. В частности, присутствие тиофенильного агликона и его ^-конфигурация подтверждались величиной химического сдвига сигнала Н-1 (5 4.7 м.д.) с характерной КССВ .Дд 10 5 Гц и сигнала С-1 (8 87.5 м.д.) в спектрах ]Н- и ВС-ЯМР соединения 29.

Перенос агликона, очевидно, вызван преимущественной атакой гликозилкатиона, образующегося из бромида 27, по атому серы в агликоне, а не по гидроксильной группе при С-3 (схема 5). Реакционная способность последней, скорее всего, снижена из-за наличия азидогруппы при С-2. При гликозилировании акцептора 25 в других растворителях, температурных условиях или с помощью других распространенных типов доноров, включая трихлорацетимидат 21 (табл. 1, опыт 3) и фторид 28 (опыт 4), во всех случаях наблюдали сходный результат с преобладанием в смеси продукта переноса агликона 29 без заметного образования продуктов гликозилирования.

Промотор

д^СаШ -„

и_

21 аф-ОС(МН)СО,

27 а-В'

28 а-е

Схема 5. Галактозюшрование производных фенил-2-азидо-2-дезокси-1-тио-галакозы.

Примечательным является факт образования соединения 29 и в случае гликозилирования галахтозилфторидом 28, хотя из литературных источников известно, что при гликозилирования тиогликозидов гликозилфторидами образования продуктов переноса агликона обычно не происходит.

Получив отрицательный результат в экспериментах по галактозилированию моногидроксильного производного 25, мы изучили перспективы использования диольиого гликозилакцептора 26. Можно было ожидать, что реакционная способность гидроксильной группы при С-3 в диоле 26 окажется выше, чем в моногидроксильном производном 25, например, из-за отсутствия структурных ограничений, вызваных присутствием 4,6-бензилиденовой группы. Однако при гликозилировании диола 26 ацетобромгалактозой 27 (схема 5; табл. 1, опыты 5 и 6) единственным дисахаридным продуктом реакции был не требуемый Р-(1->3)-, а Р-(1->4)-связанный дисахарид 30. Последний соответствует структурному элементу шоганглио-олигосахаридных цепей.

Таблица 1. Результаты реакций галактозилирования произодных 2-азидо-2-дезоксигалактозы 25,30,36,37 и 40.

Опыт Реактанты Промотор Растворитель Температура, °С Продукт Выход,%

1 25 + 27 Н8(СЫ)2/Н8Вг2 СН3СЫ 20 - -

2 25 + 27 СН2С12 -40--30 29 24

3 25 + 21 ВРз-Е^О СН2С12 -30--20 29 -40*

4 25 + 28 АеОТР8па2 Толуол 10-15 29 -30*

5 26 + 27 АиОТГ СН2С12 -40—30 30 48**

6 26 + 27 Толуол -40—30 30 56

7 26 + 21 ВРз-Е^О сн2а2 -30--20 29 30*

8 26 + 28 А^ТОвпСЬ Толуол 0-10 29 20*

9 36 + 27 А^ТГ СН2С12 -30--20 38 57

10 32 + 27 А§ОТГ СН2С12 -30--20 37 48

11 33 + 27 АвОТГ Толуол -30 --20 39 37

* Приблизительная оценка выхода по данным ТСХ.

** Неполная конверсия акцептора, выход рассчитан на прореагировавший акцептор.

Наличие именно (1—>4)-связн в полученном продукте однозначно следовало из сравнения спектров 'Н-ЯМР дясахарида 30 и его О-ацетилированного производного. Так, при переходе от мопогидроксильного производного 30 к продукту его ацетилирования наблюдается смешение сигнала протона Н-3 в более слабое поле на 1.1 м.д. (6 3.94 5.04 м.д.), тогда как величина химического сдвига сигнала протона Н-4 практически не изменяется. Наличие (1->4)-связи подтверждалось также слабопольным

положением сигнала С-4 (6 77.5 м.д.) остатка галактозамина в спектре ПС-ЯМР дисахарида 30. Варьирование температурных условий реакции (от -30 до -10°С) и использование в качестве растворителя толуола приводило лишь к изменению степени конверсии исходного акцептора 26 и возрастанию выхода изомерного продукта 30, но не к образованию целевого продукта с р-(1-»3)-связью. Эти результаты трудно было предсказать заранее, т.к. обычно экваториальная гидроксильная группа при С-3 в производных галактозамина считается более реакционноспособной, чем аксиальная при С-4. В то же время, при использовании как галактозилтрихлорацетимидата 21, так и галактозилфторида 28 в качестве гликозилирующих агентов (опыты 7, 8) реакция шла по пути образования продукта переноса агликона29.

Как известно, введение элекгроноакцепторной нитрогруппы в ароматическое кольцо фенилтиогликозидов существенно снижает нуклеофильность атома серы. В нашем случае такое снижение нуклеофильности должно было воспрепятствовать процессу переноса агликона. Для проверки этого предположения нами вместо фенилтиогликозидов 25 и 26 бьии использованы их 4-нитрофенильные аналоги 32, 33 и 36

Производные (4-нитрофенил)-2-азидо-2-дезокси-1-тио-галаткозы 32, 33 и 36 получали из хлоридов 23 и 34 согласно схеме 6 по методике, ранее предложенной для получения аналогичных производных с гякжо-конфигурацией.

'СвШМОгР 32 (72%)

;СеН<М02-|> 33 (90%)

-Р"

8СаНЦОгр

36 (66%)

Схема 6. а: 4-Ж)2РЬ8Н, Na2COз, Ви^вС^, ЕЮАс/Н20; б: МеСЖа, МеОН; в: РЬСН(ОМе)2, (±)-камфор-10-сульфоновая кислота, СНзСИ; г: ВиРЪ^а, БМАР, Ру.

В условиях межфазного катализа в двухфазной системе этилацетат - 1М водный Na2COз хлориды 23 и 34 реагировали с п-нитротиофенолом с образованием

соответствующих гликозидов 31 и 35 с полным обращением конфигурации при аномерном центре, что подтверждалось характерными величинами КССВ Ж г 5.4 Гц и 10 Гц в спектрах 'Н-ЯМР соединениий 31 и 35, соответственно. Далее, 4-нитрофенилтиогликозид 31 переводили в бензилиденовое производное 32 и 6-О-силилированный диол 33, а соединение 35 - в продукт 36.

Как и следовало ожидать, гликозилирование р-нитрофеншггиогликозида 36 ацетобромгалактозой 27 в дихлорметане в пристутствии трифлата серебра проходило по пути образования целевого дисахарида 38 (атака по 0-3, схема 7) без образования продукта переноса агликона. Требуемый Р-(1-»3)-связанный дисахарид 38 бьи получен с выходом 57% (опыт 9, табл. 1).

Атака по О- 3

ОЯ®

И'

о-ЗОДНОгР -РЬСН

о-ведчМОг-ф ЯРРИг'Ви и

р-ЗЗД^ОгР ■ РИСН -

Я1 и»

37 о-ЗСДООг-я -РИСН-

38 дедоо») -РИСН.

десдоог-р Ас Ас

40

ЗС«Н9Н0гр

о

'ОЯРИг'ви

Схема 7. Галактозилирование производных (4-нитрофенил)-2-азидо-2дезокси-1-тио-галаткозы.

Р-Конфигурация созданной гликозидной связи подтверждалась характерной величиной КССВ 7.9 Гц, а направление гликозилирования - слабопольным положением сигнала С-3 остатка галактозамина (80.3 мд ) в спектрах *Н- и ,3С-ЯМР дисахарида 38. Проведение реакции в толуоле привело к заметному снижению выхода продукта гликозилирования. При галактозилировании а-нитрофенилтиогалактозида 32 бромидом 27 (опыт 10) соответствующий дисахарид 37 был получен с выходом 48%. Строение продукта 37 подтверждалось данными ЯМР так же, как и для дисахарида 38.

Опыт по гликозилированию догола 33 галактозилбромидом 27, как и в случае конденсации последнего с фенилтиогликозидом 26, приводил к образованию только Р -(1 ->4) -связанного продукта (дисахарид 39, схема 7).

Таким образом, из рассмотренных нами путей синтеза дисахаридного глюсозилдонора на основе дисахарида Р-0-0а1-(1-»3)-В-Са11>Г, схема основанная на реакции соединений 36 и

27 представлялась предпочтительной. В полученном по данной реакции дисахариде 38 удаляли бензилиденовую защиту с последующим исчерпывающим О-ацетилированием, что приводило к полному ацетату 40 с количественным выходом. Последний не содержит соучаствующей группы при С-2 и представляется удобным агентом для проведения а-гликозилирования.

Получение бис-Л'-трихлорацетильных гликозилдоноров 41 и 42. Следующей задачей работы было получение из соединения 40 эффективного гликозилдонора, применимого для проведения р-гликозилирования Для этого было необходимо перевести азидогруппу в соучаствующую ДГ-трихлорацетильную группу, а ароматическую нитрогрупп) агликона - в менее электроноакцепторную №ацильную. Для сокращения числа стадий синтеза нами были изучены различные способы одновременного восстановления нитро- и азидпой групп с последующим одновременным /У-трихлорацетилированием Наличие атома серы в дисахариде 40 не позволяет использовать для восстановления каталитическое гидрирование. Из прочих агентов подходящих для совместного восстановления ароматической нитро- и алифатической азидогрупп нами были отобраны и исследованы следующие: насыщенный раствор сероводорода в водном пиридине, раствор в

метаноле, суспензия борида никеля в боратном буфере, хлорид олова (П), хлорид олова (П)/боргидрид натрия, цинк в уксусной кислоте. Условия этих реакций отрабатывались при использовании моносахарида 35 в качестве модельного субстрата (схема 8).

Восстановление сероводородом или сульфидом натрия, равно как и суспензией борида никеля, приводило по данным ТСХ к образованию сложных смесей, которые далее не анализировались. Использование хлорида олова (II) позволило, после трихлорацетилирования диамина, получить целевой продукт 41 с выходом 44% (схема 8, а).

9А° ОАС

°А|= ОАс

а, 6 или в, б —

вс^Ог-р -* Ас0-\^^«Л^ЗС«Н4ИНС(0)СС1,

ННС(0)СС1з

35 41 (44 - 62%)

•ОАс ОАе

^Асб N1 Асб ЫНС(0)СС1,

40 42 (61%)

Схема 8. а: впСЬ, ЕЮН, 40 °С; б: С13СС(0)С1, Е13К, СН2С12; в: гп/НОАс, ТГФ.

Применение системы хлорид олова (П)/боргидрид натрия не привело к существенным изменениям картины протекания реакции (по данным ТСХ). Наиболее успешно

восстановление протекало при использовании цинка в уксусной кислоте (схема 10, в). В этом случае выход дитрихлорацетата 41 составил 62%.

При восстановлении дисахарида 40 цинком в уксусной кислоте и последующем ЛГ-трихлорацетилировании требуемый дисахаридный гликозилдонор 42 был получен с общим выходом 61% (схема 8). Восстановление азидной и нитрогрупп до аминов при получении соединений 41 и 42 подтверждалось наличием в их 'Н-ЯМР спектрах сигналов алифатической (8 6.8 м.д., д, Лн,2 Ю Гц) и ароматической (5 8.4 м.д., с) амидогрупп.

Получение аминоэтилгликозидов углеводных цепей гликолипидов асиало-СМ; и СМ;.

Далее нами была исследована эффективность синтеза пентасахарида 3 согласно сборке [1+4] при использовании гликозиддонора 42 и акцептора 10. Поскольку данная схема включает первоначальное получение избирательно защищенного моногидроксильного производного тетрасахарида асиало-ОМ] (8, схема 1), то сначала нами был проведен модельный эксперимент по синтезу спейсерированного производного тетрасахаридной цепи асиало-ОМ] (1). В качестве такого эксперимента нами проводилась коденсация дисахаридного донора 42 и моногидроксильного лактозного блока 19, более устойчивого при гликозилироваиии в присутствии ТГОН, чем метоксибензиловый эфир 10 (схема 9).

Схема 9. a: NISATOH, СН2С12, MS-4Â; б: CAN, CH3CN/H20; в: NaOH, Ме0Н/Н20; г: Ас20, NaOH, д: Н2, Pd/C, Вос20; е: CFjCOOH, Н20/Ме0Н; ж: NIS/ТГОН, CH3CN

Активация тиогликозида 42 протекала наиболее эффективно при использовании в качестве промотора системы N-иодсукцинимид (NIS) -трифторметансульфокислота (ТГОН) в дихлорметане при -20°С и требовала лишь каталитических количеств кислоты Поскольку прибавление концентрированной кислоты приводило к разложению тиогликозида 42, то

нами использовался 5-10% (об.%) раствор ТЮН в дихлорметане. Конденсацией 42 и 19 требуемое производное асиало-GMi 43 было получено с высоким выходом 69%.

Р-Конфигурация созданной гликозидной связи однозначно подтверждалась характеристической величиной КССВ J/-.2- 8.7 Гц в спектре 1Н-ЯМР, а положение гликозилирования - слабопольным положением сигнала С-4' (5 72.5 м.д ) в спектре ,3С-ЯМР.

Следующим шагом к получению целевого продукта 1 было удаление ацильных защитных групп в тетрасахариде 43 и перевод ААтрихлорацетильной группы в jV-ацетильную. Для этого превращения использовался щелочной гидролиз с последующим Л'-ацетилированием, поскольку альтернативное одностадийное восстановительное дехлорирование, например действием трибутилстаннана, несовместимо с присутствием азидной группы, легко подвергающейся восстановлению. Скорость гидролиза Л^-трихлорацетильной группы в производных галактозамина зависит от типа соседнего заместителя при 0-3. В тех случаях, когда при 0-3 находился моносахаридный остаток (как в соединениях 43, 47, 49), реакция проходила медленно и требовала нагревания до 50°С. В случае же соединений 50 и 51, несущих 3 -О-ацети льную группу, пиролиз .У-трихлорацетильной группы мог быть осуществлен при комнатной температуре.

В соединении 43 далее удаляли все ацильные защитные группы обработкой раствором 1М NaOH в водном метаноле с последующим Л'-ацетилированием уксусным ангидридом образующейся свободной аминогруппы в остатке галактозамина (схема 9, в-е). При проведении гидрогенолиза полученного продукта над Pd/C не удается полностью удалить бензильные группы, что, видимо, связано с отравлением катализатора образующимся амином. Для его связывания гидрогенолиз над Pd/C проводили в присутствии Вос20. После удаления Вос-защиты с аминогруппы действием трифторуксусной кислоты в водном метаноле, целевое производное асиало-GMi 1 выделяли гель-фильтрацией с общим выходом 72%, считая на защищенный продукт 43. Строение соединения 1, в частности конфигурации аномерных центров, направления межзвеньевых связей и наличие аминоэтильного агликона подтверждено данными 'Н- и 13С-ЯМР спектроскопии. Отнесение сигналов проводили с использованием двумерной коррелляционной спектроскопии 'Н-'Н COSY и 'Н-'3С COSY.

Далее нами был проведен синтез моногидроксильного производного 8 со скелетом асиапо-GMi (схема 1), необходимого для выполнения сборки пентасахарида GM] по схеме [1+4]. Конденсацией гликозилакцептора 10 и донора 42 в дихорметане в присутствии NIS и ТЮН был получен тетрасахарид 44 с выходом 63% (схема 9). Р-Конфигурация остатка галактозамина в соединении 44 подтверждалась характеристической величиной КССВ J г 2- 8.4 Гц в спектре 'Н-ЯМР, а положение гликозилирования - слабопольным положением в спектре ,3С-ЯМР сигнала С-4' (5 72.8 м.д.). В соединении 44 удаляли метоксибензильную защитную группу при обработке церийаммонийнитратом в водном ацетопитриче г образованием моногидроксильного производного 45

Попытки сиалилирования тетрасахарида 45 тиогликозидом 7 (схема 9, ж) не привели к образованию сколь-либо заметных количеств требуемого продукта. Вместо этого, донор 7

претерпевал элиминирование этантиола с образованием гликаля 46, в то время как гликозилакцептор оставался непрореагировавшим. Скорее всего, наличие объемного заместителя в положении 0-4' остатка лактозы, создает стерические препятствия для присоединения остатка сиаловой кислоты по О-З'.

Следующим этапом работы было изучение возможности синтеза аминоэтилгликозида вМ] 3 по схеме сборки [2+3]. В этом случае мы исходили из первоначальной конденсации диольного лактозного гликозилакцептора 12 и тиогликозида 7 (схема 10, а) Как известно, сиалилирование 3',4'-диольных производных лактозы происходит региоизбирательно по 0-3' Данную реакцию проводили в абсолютном ацетонитриле, что способствует образованию а-сиалозидов в отсутствие соучаствующей группы в доноре. Целевой трисахарид 11 был получен нами с выходом 79% практически без образования нежелательного р-изомера. Надо отметить, что данный результат превосходит известные для реакций сиалилирования различных производных лактозы сиалил-донорами без соучаствующей группы при С-3. Для описанных в литературе случаев выходы не превышали 70% и, при этом, реакции протекали с невысокой стереоселективностью

Гликозилирование трисахарида 11 дисахаридным гликозилдонором 42 проводившееся в условиях, аналогичных применявшимся для получения тетрасахаридов 43 и 44, приводила к производному СМ] 47 (схема 10, б) с высоким выходом 85%, считая на прореагировавший акцептор.

Схема 10. а: МвЛТОИ, СНзСИ; б: ИЙ/ТЮН, СН2С12; в: ИаОН, МеОН/Н20; г: Ас20, ЫаОН, д- Н2, РсЗ/С, Вос20; е: СР3СООН, Н20/Ме0Н.

Р-Конфигурация созданной гликозидной связи подтверждалась характеристической

11 (78%)

величиной КССВ Jr,r 8.6 Гц в спектре 'Н-ЯМР, а положение гликозилирования -слабопольным положением сигнала С-4' (8 76.3 м.д.) в спектре 13С-ЯМР. Удаление защитных групп в пентасахариде 47 проводили по методике, аналогичной использовавшейся для получения тетрасахарида 1. Целевое производное GMi 3 выделяли с помощью колоночной хроматографии на обратной фазе с общим выходом 85%, считая на защищенный 47. Строение 3, а именно конфигурации аномерных центров, направления межзвеньевых связей и наличие аминоэтильного агликона, подтверждено данными спектров 'Н- и 13С-ЯМР, по аналогии с тетрасахаридом 1. а-Коифигурация остатка нейраминовой кислоты в продукте 3 подтверждена величиной химического сдвига протонов H-3eq (8 2.70 м д.) и Н-4 (8 3.70 м.д.), что находится в полном соответствии с известными эмпирическими правилами.

Получение аминоэтилглякозида углеводной цепи гликолипнда Gb<.

Известные из литературных источников примеры использования О-трихлорацетимидатных производных дисахарида ß-D-GaI-(l ->3)-D-GalN с N-фталоильной защитной группой в качестве гликозилдоноров для получения цепи Gbj по схеме [2+3] характеризовались невысокими выходами, что было связано с побочной перегруппировкой исходного гликозилимидата в соответствующий гликозиламид.

гга»

а

j ^.UbZ^ —.UBZ^

1---

49(73%) BIO.

i -ив* ^uai

Nj

б,в,г,д

в, Gb5 (86%)

Схема 11. а: КК/ТГОН, СН2С12; б: КаОН, Ме0Н/Н20; в: Ас20, МаОН, г: Н2, Рс1/С, Вос20; д: СТзСООН, Н20/Ме0Н

Использование гликозилдонора 42 позволило существенно увеличить эффективность конденсации по данной схеме. Так, гликозилированием донором 42 полученного ранее в

нашей лаборатория моногидроксильного производного глоботриозы 48 в условиях, использовавшихся при получении олигосахаридов 43, 44 и 47, с выходом 73% нами было синтезировано избирательно защищенное производное пентасахаридной цепи глобозида Gbs 49 (схема 11).

Омыление сложноэфирных и Л^-трихлорацетильной групп в пентасахариде 48 и последующие N-ацетилирование, гидрогенолиз и выделение конечного продукта проводили в условиях, аналогичных использованым для синтеза олигосахаридов 1 и 3. Строение продукта 6 подтверждалось данными спектров 'Н- и !3С-ЯМР, как описано выше для соединений 1 и 3.

Получение аминоэтилгликозидов углеводных цепей гликолипидов СМ г и СЬ4.

Производные тетрасахаридов ОМ2 и ОЬ4 были получены нами с использованием моносахаридного гликозилдонора 41 Так, конденсацией тиогликозида 41 и трисахарида 11 в дихлорметане в условиях, аналогичных использовавшимся в синтезе 47, было получено защищенное производное ОМ2 50 (схема 12, а) с выходом 67% Защитные группы в продукте 50 удаляли по методике, аналогичной использовавшейся для получения соединений 1,3 и 6.

°Р«олс соом. ^

AcO

2, GM2 (68%)

Лс&Х-л.Д^'0 50 (67%) ci,cc(0)nh

Схема 12. а: NIS/TfOH, СН2С12; б: NaOH, Ме0Н/Н20; в: Ас20, NaOH, г: Н2, Pd/C, Вос20; д: CF3COOH, Н20/Ме0Н.

Производное тетрасахаридной цепи ОЬ4 51 получали конденсацией трисахарида 48 и тиогликозида 41 в условиях синтеза тетрасахарида 50 с выходом 88% (схема 13, а).

б, в, г, д

, Gb4 (54%) J

51 (88%)

Схема 13. а: NIS/ ТГОН, СН2С12; б: NaOH, Ме0Н/Н20; в: Ас20, NaOH, г: Н2, Pd/C, Вос20; д: CF3COOH, Н20/Ме0Н.

Превращение соединения 51 в продукт 5 проводили по методике, использовавшейся нами в синтезе аминоэтилглихозидов 1-3 и 6. Целевой аминоэтилглшсозид 5 был получен с общим выходом 54%, считая на исходный 51.

Строение аминоэтилгликозидов 2 и 5, в частности, конфигурация и положение гликозилирования моносахаридных остатков, подтверждено данными спектров 'Н- и ПС-ЯМР также, как это делалось для соединений 1,3 и 6.

Получение аминоэтилгликозида гексасахаридной цепи гангпио-гликолипида Рис-СМ;.

С учетом синтетической схемы, успешно реализованной для получения пентасахридной цепи ганглиозида вМь синтез гексасахаридной цепи гликолипида Рис-бМ! проводился нами по схеме сборки [3+3] гликозилированием сиалиллактозного акцепторного блока 11 гликозилдонором 56 на основе трисахарида Риса(1->2)Оа1р(1->3)ОаПЧ (схемы 14 и 15).

Для получения трисахаридного донора 56 сначала было необходимо синтезировать избирательно защищенное производное дисахарида 42 со свободной гидроксильной группой при С-2 остатка галактозы. Для этого в соединении 42 полностью удаляли все О-ацетильные защитные группы, а полученный гексаол далее бензилиденировали с образованием диола 52 (схема 14). Попытка получения З'-бензоата 53 бензоилированием 2',3'-станнилиденового интермедиата, получаемого при обработке диола 52 дибутилоловооксидом, оказалась нерезультативной, поскольку приводила к смеси нужного продукта и побочного 2',3'-дибензоата вне зависимости от соотношения, в котором брались станншшденовое производное диола 52 и бензоилхлорид.

Альтернативно было изучено бензоилирование диола 52 с использованием вместо бензоялхлорида менее реакционноспособного бензоилцианида, которое, как известно, для 2,3-диольных производных галактозы проходит региоизбирательно по положению 0-3. В этих условиях З'-бензоат 53 был получен с выходом 89%.

Для стереоселективного фукозилирования моногидроксильного производного 53 нами был выбран избирательно защищенный фукозилтрихлорацетимидат 54, при использовании которого, как было показано ранее в нашей лаборатории, обеспечивается особенно высокая а-стереоизбирательность гликозилирования. Так, взаимодействием имидата 54 с моногидроксильным производным 53 в дихлорметане в присутствии ТМЯОТГ искомый трисахарид 55 был получен с выходом 93%.

Наличие кислотолабильных бензилиденовых защитных групп в трисахариде 55 ограничивало его применение в качестве гликозилдонора. Поэтому соединение 55 далее переводили в пентаацетат 56, более устойчивый к кислым условиям гликозилирования.

Схема 14. а: NaOMe/MeOH; б: PhCH(OMe)2, (±)-камфор-10-сульфоновая кислота; в: BzCN, EtjN; г: TMSOTf, СН2С12; д: АсОН, 80°С; е: Ас20/Ру.

Следующей стадией было гликозилирование донором 56 сиалилактозного гликозилакцептора 11. При проведении данного гликозилирования в условиях синтеза соединений 47 и 50 требуемое гексасахаридное производное 57 было получено с высоким выходом 76% (схема 15). Строение соединения 57 подтверждалось данными спектроскопии ЯМР В частности, о ß-конфигурации созданной гликозидной связи свидетельствовала характеристическая величина КССВ Jr г 10 Гц в спектре 'Н-ЯМР.

Для превращения избирательно защищенного производного 57 в целевой аминоэтилгликозид 4 использовалась та же последовательность реакций, что и при получении аминоэтилгликозидов 1-3, 5 и 6. Однако в этих условиях целевой продукт 4 был получен с выходом 24% в смеси с jV-монохлорацетильным производным 58 (62%) которую разделяли с использованием обращенно-фазовой колоночной хроматографии.

Строение 4, в том числе положение и конфигурация моносахаридных остатков, подтверждалось данными спектров 'Н- и 13С-ЯМР, как описано выше для соединений 1-3, 5 и 6, а кроме того данными масс-спектра, в котором наблюдали пик с m/z 1210.2, соответствующий иону [M+Na]+ для соединения 4.

В спектре 'Н-ЯМР гексасахарида 58 относительная интегральная интенсивность

сигнала, находящегося в области 8 2.0-2.1 м.д. характерной для протонов ацетильной группы, оказалась равной 3 вместо требуемых 6 единиц (две И-ацетильные группы в целевом 4), в то время как сигналы атомов Н-2' (5 3.6 м.д.) и С-2' (6 53 м.д.) являлись характерными для остатка галактозамина с ацилированной аминогруппой. Эти данные говорили о наличии в остатке галактозамина М-ацильной группы, отличной от ацетильной, поскольку единственная по данным спектра ацетильная группа принадлежит остатку Кеи5Ас.

Схема 15. а: ШБ/ТГОН, СН2С12; б: КаОН, Ме0Н/Н20; в: Ас20, НаОН; г: Н2, РсУС, Вос20; д: СРзСООН, Н20/Ме0Н.

Природа неизвестной ацильной группы была установлена на основании совокупности данных ЯМР. В спектре 'Н-ЯМР гексасахарида 58 имелись сигналы двух протонов в виде дублетов (6 4.1 м.д. и 4.2 м.д) (СЦгО), которые по данным спектров ШС^С и НМВС коррелировали с сигналами атомов углерода при 5 43.7 м.д. (СН2С1) и 6 170.9 м.д. (С(0)МН), соответственно. Найденные величины хорошо согласуются с известными величинами химических сдвигов для хлорацетильной группы. Наличие в спектре НМВС корреляции

между сигналом карбонильного углерода хлорацетильной группы и протоном Н-2 остатка галактозамина однозначно подтверждает ее положение. Другим подтверждением строения аминоэтилгликозида 58 являлись данные его масс-спектра, в котором наблюдали интенсивный пик с т/г 1244.2, соответствующий иону [М+Ыа]+.

Образование продукта 58 очевидно связано с неполным удалением трихлорацетильной группы при щелочной обработке соединения 57 и ее последующим частичным гидрированием в хлорацетильную. Нужно отметить, что полноту удаления трихлорацетильной группы трудно контролировать с помощью ТСХ по двум причинам. Во-первых высвобождающаяся аминогруппа, по-видимому из-за пространственной затрудненности, дает слишком слабую реакцию с нингидрином, что наблюдается и при удалении трихлорацетильной группы в соединениях 43 и 47. Во-вторых, в процессе дезацилирования образуется заряженный полиол, хроматографическая подвижность которого при дальнейшем удалении трихлорацетильной группы меняется очень незначительно, что затрудняет определение полнота его превращения в нужный амин.

Соединение 58, наряду с олигосахаридами 1-6, будет использовано в исследованиях углеводной специфичности лектинов.

Получепие неогликоконъюгата углеводной цепи ганглиозида СМ] с полнаконламидом.

Из пентасахаридного производного вМ1 3 был получен неогликоконъюгат с полиакриламидом для использования в качестве поливалентного антигена в экспериментах по исследованию углеводной специфичности лектинов.

Конъюгат 60 получали конденсацией аминоэтилгликозида 3 с л-нитрофениловым эфиром полиакриловой кислоты 59 в присутствии триэтиламина (схема 16). Соотношение 3 и 59 выбиралось таким образом, чтобы одна молекула углеводного лиганда приходилась в среднем на пять звеньев полимерной цепи, поскольку такое распределение является оптимальным для использования в гликобиологических экспериментах.

СОгЫр

сошт

сокнсн2снгон

а, 6

3 +

п

ш

59

60

ОНон с оон

я =

н1

-о-

Схема 16. а: Е13М, ДМФА, ДМСО; б: НО(СН2)2Ш2.

Оставшиеся непрореагировавшие карбоксильные группы в поливалентной матрице 59 переводили в К-(2-гидрокси)этиламидные обработкой избытком этаноламина. Гликополимер 60 в виде триэтиламмониевой соли по карбоксильным группам остатков нейраминовой кислоты выделяли гель-хроматографией на Sephadex LH-20 с количественным выходом.

ВЫВОДЫ

1. Реализованы конвергентные схемы синтеза спейсерированных форм линейных и разветвленных олигосахаридяых цепей гаигтео-гликолипидов Fuc-GM], GMi, асиало-GMi и GM2, а также глобо-гликолипидов Gbs и Gb4.

2. Проведено систематическое исследование гликозилирования арил-2-азидо-1-тио-галактозидов различными галактозилдонорами и изучена возникающая при этом проблема переноса тио-агликона.

3. В качестве эффективного р-гликозиддонора в синтезах углеводных цепей ганглио-и глобо- гликолипидов предложен дисахарид (4-трихлорацетамидофенил)-2-дезокси-3,4,6-три-(?-ацетил-1-тио-2-трихлорацетамидо-р-£)-галакгопиранозид.

4. На основе спейсерированного производного пентасахарида GMi получен поливалентный неогликоконъюгат.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Чешев П. Е., Кононов Л. О., Цветков Ю. Е., Шашков А. С., Нифантьев Н. Э. "Тиогликозидаые а- и (5-гликозилдоноры на основе дисахарида P-Z)-Gal-(l->3)-D-GalNAc." Биоорган. Химия, 2002,28,462-473.

2. Чешев П. Е., Хатунцева Е. А., Гербст А. Г., Цветков Ю. Е., Шашков А. С., Нифантьев Н. Э. "Синтез аминоэтилгликозидов олигосахаридных цепей гликолипидов Gb3, Gb4 и Gb5." Биоорган. Химия, 2003,29, 372-381.

3. Чешев П. Е., Кононов JI. О., Цветков Ю. Е., Шашков А. С., Нифантьев Н. Э. "Синтез аминоэтилгликозидов олигосахаридных цепей ганглиозидов GMi и асиало-GMi." Биоорган Химия. 2004,30,68-79.

4. Nifantiev N.E., Sherman A.A., Yudina O.N., Cheshev Р.Е., Tsvetkov Yu.E., Khatuntseva E.A., Kornilov A.V., Shashkov A S. "New schemes for the synthesis of glycolipid oligosaccharide chains." Pure Apll. Chem.,2004, 76,1705-1714.

5. Cheshev P. "Syntheses of spacer-armed oligosaccharide chains of natural globo- and ganglio-glycolipids." 4th Summer school on Green Chemistry, Venice, Italy, 2001, Book of Abstracts 10.

6. Н.Э. Нифантьев, П.Е. Чешев, A.A. Шерман, О.Н. Юдина, Ю.Е. Цветков, Е.А. Хатунцева, A.B. Корнилов, Е.В. Сухова, А.С.Шашков "Синтез углеводных цепей природных гликолипидов." XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Казань, 2003, сборник докладов, 42.

Принято к исполнению 05/05/2005 Исполнено 06/05/2005

Заказ № 837 Тираж. 150 экз..

000 «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 7894

»-8559