Создание и изучение ДНК-стабилизированных люминесцирующих кластеров серебра тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

На правах рукописи

Волков Иван Леонидович

СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ДНК-СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ КЛАСТЕРОВ СЕРЕБРА

02.00.06 - высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

■ ШЮЛ 2014

Санкт-Петербург — 2014 005550374

005550374

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете.

Научный руководитель: профессор кафедры молекулярной

биофизики Санкт-Петербургского государственного университета, доктор физико-математических наук, профессор

Касьяненко Нина Анатольевна

Официальные оппоненты: заведующий лабораторией №10

Института высокомолекулярных соединений РАН, доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Паутов Владимир Дмитриевич

•

профессор кафедры «Биофизика» Института физики, нанотехнологий и телекоммуникаций СПбГПУ, доктор биологических наук, доцент Скворцов Алексей Николаевич

Ведущая организация: Национальный исследовательский

центр "Курчатовский институт", ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им.

Б. П. Константинова РАН,

г. Гатчина, Ленинградская область.

Защита диссертации состоится 25 сентября 2014 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д212.232.33 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 198504, г. Санкт-Петербург, Петродворец, Ульяновская 1, физический факультет СПбГУ, малый конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького СПбГУ и сайте Санкт-Петербургского государственного университета spbu.ru

Автореферат диссертации разослан 25" июня 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.232.33, к. ф.-м. н.:

Поляпичко А. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Нанокластеры металлов, содержащие до нескольких десятков атомов, представляют особый класс нанообъектов, в электронные свойства которых существенный вклад вносят квантово-размерные эффекты, благодаря чему их электронно-энергетическая структура становится подобна молекулярной. Особенный интерес представляют кластеры благородных металлов (золота, серебра), которые показывают хорошую способность к люминесценции. Использование таких структур в качестве люминесцирующих биометок требует создания устойчивых в водных растворах систем. Для этого были разработаны методики получения полимер-стабилизированных кластеров с использованием синтетических и биологических полимеров. Особый интерес представляют ДНК-стабилизированные люминесцирующие кластеры серебра. Благодаря высокому сечению поглощения и значительному квантовому выходу, а также хорошей биосовместимости и фотостабильности, такие кластеры считаются перспективными для использования в качестве молекулярных сенсоров и зондов для биомиджинга. Согласно литературным данным, уникальным свойством ДНК-стабилизированных кластеров является влияние последовательности ДНК-матрицы, стабилизирующей кластер, на его спектральные свойства. Наличие долгоживущего возбужденного темнового состояния и возможность модулирования его заселенности дополнительной длинноволновой засветкой делает кластеры перспективными объектами для микроскопии сверхвысокого разрешения и методик синхронного детектирования. Однако данные о фотофизических параметрах возбужденных состояний были получены ранее только для кластеров одной спектральной группы, излучающих в красном диапазоне спектра, хотя люминесценция подобных структур наблюдалась при разных длинах волн. Поэтому более подробное изучение люминесцентных свойств кластеров, синтезированных на различных матрицах, представляется актуальным. Использование кластеров в качестве флуоресцентных меток для цитологических исследований подразумевает наличие способов их эффективной транспортировки через клеточную мембрану, разработка которых также является актуальной задачей. Известно, что комплексы высокомолекулярной ДНК с синтетическими поликатионами являются

широко изученными системами для создания генных векторов. Включение в такую ДНК-полимерную наночастицу флуоресцирующих структур представляется перспективным способом упаковки кластеров для транспортировки внутрь клетки. Решению этих вопросов и посвящена диссертационная работа. Сказанное выше показывает, что выполненные в работе исследования представляют практический интерес и могут быть использованы в био- и нанотехнологических разработках.

Целью работы является создание и изучение свойств люминесцирующих ДНК-стабилизированных нанокластеров серебра и создание на их основе ДНК-полимерных наночастиц.

В связи с этим в диссертации решаются следующие задачи:

1. Подбор оптимальных условий для синтеза люминесцирующих кластеров серебра, стабилизированных высокомолекулярной ДНК, и изучение их спектральных свойств.

2. Получение ДНК-полимерных наночастиц, включающих кластеры серебра, и изучение их спектральных свойств в растворе и на поверхности графита.

Научная новизна работы заключается в следующем. Впервые продемонстрирована возможность синтеза кластеров на высокомолекулярной природной ДНК. Впервые была предложена и экспериментально проверена возможность включения кластеров в ДНК-полимерные наночастицы. Получены новые данные о фотофизических параметрах возбужденных состояний кластеров, показывающие высокую эффективность перехода ДНК-стабилизированных кластеров в темновое состояние. Метод зондово-усиленной флуоресцентной сканирующей микроскопии был впервые применен для исследования ДНК-полимерных наночастиц, включающих флуоресцирующие кластеры серебра.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методика, позволяющая синтезировать люминесцирующие кластеры серебра на тимусной ДНК.

2. Проведена оценка значений сечения поглощения, квантового выхода и времени жизни темнового состояния для кластеров с максимумом возбуждения 532 нм.

3. Показана возможность формирования ДНК-полимерных флуоресцирующих наночастиц, содержащих кластеры серебра.

4. Показано, сформированные в растворе флуоресцирующие наночастицы ДНК-кластер-полимер сохраняют свои флуоресцентные свойства при высаживании на поверхность графита.

5. Методом зондово-усиленной флуоресцентной микроскопии получены спектры высаженных на поверхность графита флуоресцирующих ДНК-полимерных наночастиц с пространственным разрешением, превышающим дифракционный предел.

Практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о возможности создания люминесцирующих биосовместимых ДНК-полимерных наночастиц. Высокий квантовый выход темнового состояния ДНК-стабилизированных кластеров, оценка величины которого выполнена в работе, обеспечивает преимущество при использовании кластеров для микроскопии сверхразрешения и для их детектирования методом восстановления синхронно усиленного флуоресцентного изображения по сравнению с другими флуорофорами.

Достоверность полученных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных результатов, а также согласованностью данных, полученных различными методами.

Результаты работы докладывались и обсуждались на международных конференциях:

1. Ivan Volkov, Fluorescence Properties of Silver Nanoclusters in DNA solution / Ivan Volkov, Alexey Kononov, Ruslan Ramazanov, Nina Kasyanenko // Quantitative Imaging and Spectroscopy in Neuroscience (QISIN), September 16-19, 2012, Saint-Petersburg, Russia, P. 55-56.

2. Ivan Volkov, Study of the interaction of silver nanoparticles and Ag+ ions with DNA / Ivan Volkov, Mikhail Varshavskiy Alexey Kononov, Valeriy Rolich, Nina Kasyanenko // Biophysical Society 56th Annual Meeting, Can-Diego, California, USA, February 25 - 29,2012.

По результатам данной работы опубликовано 2 статьи в рецензируемых научных журналах и 2 тезисов докладов.

Личный вклад автора заключается в непосредственном проведении всех экспериментов (кроме исследований образцов методами электронной микроскопии и измерения кинетики люминесценции, которые были выполнены на оборудовании ресурсных центров СПбГУ), в обработке и анализе полученных данных, участии в обсуждении результатов, подготовке публикаций по теме диссертации и написании работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и содержит 134 страницы, 76 рисунков и 4 таблицы, список использованных источников включает 131 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы исследования, сформулированы цели и задачи работы, раскрыты научная новизна, практическая значимость полученных результатов, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В главе 1 диссертации рассматриваются основные представления о структуре и свойствах наночастиц и нанокластеров металлов, имеющиеся в литературе на сегодняшний день. Проведен анализ данных о синтезе, структуре и фотофизических свойствах люминесцирующих ДНК-стабилизированных кластеров серебра, синтезируемых на коротких олигонуклеотидах с заданными последовательностями оснований.

В главе 2 кратко изложены физические основы методов исследования, использованных в работе, а также описаны протоколы приготовления люминесцирующих структур с использованием тимусной ДНК. В работе были использованы следующие методы: стационарная флуоресцентная спектроскопия (Hitachi 850 и Fluorolog-3) спектроскопия поглощения (СФ-56), нелинейная флуоресцентная спектроскопия насыщения с использованием импульсных и непрерывного лазеров, Х=532 нм, электронная микроскопия (Carl Zeiss Merlin, Carl Zeiss Libra 200FE), конфокальная и зондово-усиленная флуоресцентная микроскопия (ИНТЕГРА Спектра), динамическое рассеяние света (Photocor Complex), гель-электрофорез, вискозиметрия, круговой дихроизм (Mark IV). Исследования частично выполнены с использованием оборудования ресурсных центров СПбГУ («Нанотехнологии», «Оптические и лазерные методы исследования вещества» и «Диагностика функциональных материалов для медицины, фармакологии и наноэлектроники»).

Для приготовления образцов использовали коммерческий препарат тимусной ДНК («Sigma», молекулярная масса М = 8106 определена вискозиметрически); реактивы (AgN03, NaN03, KMn04, NaBH4) квалификации х.ч. полиаллиламин (М= 1,5-103), предоставленный к. х. н О. В. Назаровой (ИВС РАН). Анализ показал, что при используемых концентрациях компонентов (Сднкот 0 до б -10"4 Мосн. и CAgN03 от 0 до

1,2 10" М) оптимальным с точки зрения интенсивности люминесценции является значение г = С^+УЕДНК] = 0,2 - 0,3 (рис. 1) и СКаВН4 Ю"5 М. 16

и

1,4

О 12

=1

а ю

1 0

>

► * 610-* М

- ► • 2.4-10'5 М

6-10: м

-

г 3 'г

т -5 1 _,

• О 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Рис. 1. Зависимость интенсивности флуоресценции растворов, содержащих синтезированные на ДНК кластеры серебра, отнесенная к концентрации ДНК, от г = С[^+]/[ДНК] (отношения концентраций ионов серебра и фосфатных групп ДНК), Данные получены через сутки после добавления восстановителя (Сиавш = 1' 10'5 М) в раствор комплексов ДНК с ионами серебра. Концентрация Ag+ показана на рисунке. (Хех = 510 нм/Хет = 600 нм).

\ ,1**5*3 вт

В главе 3 рассмотрены спектральные свойства кластеров серебра, синтезированных на высокомолекулярной природной ДНК. Показано, что в растворе ДНК в 0,005 М ЫаШ3 с использованием разработанной в работе методики формируются кластеры, излучающие на различных длинах волн в

зависимости от длины волны возбуждения (рис. 2). Однако при возбуждении люминесценции на полосе поглощения ДНК отчетливо видно, что в спектре испускания присутствуют две неразрешенных полосы, относительная интенсивность которых меняется с течением времени (рис. За). В таком

Рис. 2. Спектры испускания кластеров через 24 часа после начала реакции (>.ех даны на рисунке).

Воздух

КМпО,

Рис. 3. Временные изменения после добавления восстановителя спектров испускания кластеров (Хех = 280 нм), приготовленных в обычных условиях (а), при барботировании раствора азотом (б) и при добавлении различных концентраций КМп04 (в) через 90 мин. после добавления ЫаВН4.

случае можно выделить кластеры двух основных типов, излучающие в красной области спектра (максимум около 690 им), преобразующиеся с течением времени в кластеры, излучающие в желтом диапазоне (максимум около 580 нм). Наблюдаемые изменения спектра могут быть замедлены при барботировании раствора азотом (рис. 36) или ускорены добавлением в раствор окислителя - перманганата калия (рис. Зв), что указывает на окислительную природу трансформации кластеров. Для этих двух групп кластеров получены близкие значения времен жизни люминесценции 2,4±0,1 не, что согласуется с имеющимися в литературе данными для подобных кластеров, синтезированных на синтетических олигонуклеотидах.

Спектры возбуждения и поляризации люминесценции кластеров (рис. 4а) имеют три электронных перехода. Степень поляризации на полосе самого длинноволнового перехода

Р = 0,45±0,03 (рис. 46) близка к максимальному значению 0,5. Следовательно, кластеры

действительно жестко связаны с молекулой ДНК, время вращательной диффузии которой много больше времени жизни возбужденного состояния

флуорофора, что, согласно уравнению Перрена, приводит к предельной поляризации. Самая коротковолновая интенсивная полоса в спектре возбуждения кластеров имеет максимум на 260 нм и форму, совпадающую со спектром поглощения ДНК (рис. 4а). Возбуждение в этой области приводит к испусканию всего ансамбля кластеров, а поляризация Р = 0,08±0,01 соответствует углу между направлением дипольных моментов осцилляторов поглощения (оснований ДНК) и испускания (кластеров) приблизительно 60°.

При восстановлении серебра без ДНК при тех же концентрациях остальных компонентов в спектре поглощения раствора фиксируется пик плазмонного резонанса (рис. 5), который проявляется существенно слабее для

к им

Рис. 4. Спектры возбуждения флуоресценции, поглощения (а) и поляризационные спектры (б) кластеров серебра. Спектры скорректированы на эффект внутреннего фильтра.

изучаемых растворов с кластерами. Вместе с тем, на изображениях, полученных методом электронной микроскопии, видны наночастицы серебра. Образцы готовили, помещая каплю люминесцирующего раствора ДНК с кластерами на углеродную подложку, после ее высушивания при комнатной температуре образец травили в кислородной плазме для уменьшения толщины подложки и увеличения контраста изображения. Можно различить фракцию частиц размером около 1 нм (рис. 6), которые, в предположении их сферической формы, содержат несколько десятков атомов, что близко к теоретической оценке размеров исследуемых люминесцирующих кластеров. К сожалению, мы не можем достоверно утверждать, что они являются искомыми люминесцирующими кластерами, так как методика приготовления образца не позволяет исключить наличие нелюминесцирующих структур. Для понимания того, связаны ли наблюдаемые частицы с ДНК, был приготовлен образец: на углеродную подложку наносили каплю исследуемого раствора и через минуту подложку промывали направленной струей воды и высушивали на воздухе.

Рис. 5. Спектры поглощения растворов, приготовленных восстановлением серебра в присутствии или отсутствии ДНК, через сутки после приготовления. Слешз = 2,4-10'5 М, Сшив = МО"5 М во всех растворах.

Рис. 7. Изображение ориентированного

„ ^ _ «жгута» ДНК и наночастиц серебра на

Рис. 6. ПЭМ изображения структур, высаженных 1 "

г 1е углеродной подложке, полученное

на углеродную подложку из раствора, Г „ ,

3 ' - , „ комбинацией растровой (режим регистрации

содержащего кластеры серебра (а, б), и \ / \ -

г С , \ вторичных электронов) (а) и просвечивающем

соответсвующие профили интенсивности (в), .Г

(б-г) электронной микроскопии (ПЭМ).

отражающие размер различимых частиц.

Сформированные таким образом «жгуты» ориентированных молекул ДНК практически не содержат наночастиц, большинство которых, по-видимому, находится в растворе и не взаимодействует с ДНК (рис. 7).

Для исследования фотофизических параметров флуорофоров методом спектроскопии насыщения были выбраны кластеры, излучающие в желтом диапазоне спектра. Апробация методики проводилась с использованием красителя родамина 6Ж (К.Нос1 6С). В работе получено аналитическое выражение для зависимости интенсивности люминесценции 1от энергии пикосекундного импульса Е:

где .у — площадь пучка, И — постоянная Планка, V — частота света, А — коэффициент, включающий инструментальный фактор, оптическую плотность и квантовый выход люминесценции. Из аппроксимации экспериментальной данных формулой (2) (рис. 8а), было получено значение сечения поглощения кластеров (о! = (4.2±0,2)-1СГ16 см2). Корректность используемой методики подтверждает аналогичная оценка, выполненная для родамина (01 = (4.2±0,2)-10"'6 см2), что в пределах погрешности совпадает с данными, приведенными в литературе. В наносекундном режиме возбуждения (рис. 86) выполненный расчет константы перехода кластеров в темновое состояние с использованием трехуровневой модели дал значение кпз = (1.0±0.1 )• 108 с"1, что свидетельствует о чрезвычайно высоком значении квантового выхода в темновое состояние (24±3 %.). Для стационарного процесса (возбуждение непрерывным лазером) получено выражение:

где а - коэффициент, включающий инструментальный фактор, концентрацию молекул и константу скорости испускания, 1ех — интенсивность возбуждающего света, т - время жизни люминесценции. Из аппроксимации полученной в эксперименте зависимости интенсивности люминесценции кластеров от интенсивности возбуждения (рис. 8в) выражением (3) было получено время жизни темнового состояния i0ff = 15±5 мкс, что близко к значению, имеющемуся в литературе для кластеров, излучающих в красном диапазоне. Столь высокая эффективность образования и сравнительно долгое время жизни темнового состояния приводят к тому, что при достаточно

Ifi = Л( 1 - е shv)

(2),

(3),

Рис. 8. Зависимость интенсивности флуоресценции родамина 6Ж и кластеров серебра при Х= 553 нм и 600 нм соответственно при возбуждении пикосекундными (а), и наносекундными (б) импульсами; зависимость интенсивности интегральной люминесценции и заселенности темнового состояния для кластеров и родамина при непрерывным возбуждении (в). Кривые

„ астт

отмасштабированы так, что их начальный наклон, определенный как —, совпадает.

слабых интенсивностях возбуждения -50 Вт/см2 в темновом состоянии находятся около 20 % кластеров (рис. 8в).

Структурные изменения ДНК, индуцируемые ионами серебра и кластерами, исследовались методами спектроскопии поглощения, кругового дихроизма, вискозиметрии и гель-электрофореза. Спектр КД ДНК в комплексе с ионами Ag+ существенно отличается от спектра свободной ДНК (рис. 9), что согласуется с данными из литературы. Добавление восстановителя сопровождается изменениями в спектре, который становится близким к спектру КД свободной ДНК. Через сутки после приготовления систем спектры КД ДНК меняются, особенно существенно в области положительной полосы. Добавление КМп04 в раствор ДHK-Ag0, индуцирует быстрое образование люминесцирующих структур и вызывает такое же изменение спектра КД, которое наблюдается для люминесцирующего раствора через сутки после добавления восстановителя. Формирование комплекса ДНК-А§+ в условиях эксперимента не приводит к существенному изменению приведенной вязкости раствора (рис. 10), что согласуется с данными, имеющимися в литературе. Через 30 минут после начала реакции восстановления также не наблюдается изменения вязкости растворов в пределах погрешности. Добавление КМп04 в раствор ДHK-Ag0 через 90 минут также практически не влияет на вязкость растворов. Таким образом, люминесцирующие структуры не приводят к существенному изменению объема молекулярного клубка сразу после приготовления систем. Этот результат подтверждается и методом гель-электрофореза. Однако через сутки после добавления восстановителя приведенная вязкость растворов комплексов ДHK-Ag0 падает приблизительно на 40 %. Для таких систем

наблюдается и изменение электрофоретической подвижности образца: комплекс ДHK-AgCI движется быстрее, чем нативная ДНК, и полоса размывается. Эти данные указывают на уменьшение размеров макромолекулы. Естественно предположить уменьшение термодинамической жесткости ДНК, скорее всего, ввиду частичной дестабилизации двойной спирали.

// 1 У Рч^

\0 , ЧгУ/* \\ уг X/ ^ ' м !1

- дик

- ДНК + *'«Ш14-Дотк*

- ДНК + КМп04-Звмяму1 ' ДИК-Ал" - М »ни. !

- ДНК-Ак7 - 1 сутки

- ДНК-А8-30 минут

- ДНК-Ар — I сугкн

* ♦

О док-а« << ч»«»>

♦ ДШ-Лр

О дис-лцкуш»

240 26« 280 300 о ОА о.» )

и ММ г

Рис. 9. Спектры КД ДНК в свободном состоянии, в Рис. 10. Приведенная вязкость растворов

комплексе с ионами серебра, после их ДНК в комплексе с Ag+ и с кластерами

восстановления №ВН4 и при добавлении КМп04. через 30 мин и через 1 сутки после

Концентрации реагентов: Сднк = 1,2'10"* Мое., Са^оз добавления восстановителя, а также после

= 2,4«№5М, См„вн4= 110-5М, Скмп04= М0"6М. добавления КМп04. Сднк = 2,4-10"4 М™

В главе 4 рассматривается получение компактных ДНК-полимерных наночастиц, включающих кластеры серебра, и изучаются их спектральные свойства. Соответствующие наночастицы были получены сливанием растворов ДНК с кластерами серебра и полиаллиламина в 0,005 М ИаИОз при отношении концентраций их ионогенных групп Т<Г/Р=1,5, что обеспечивало формирование достаточно однородных компактных структур, как это видно из данных динамического светорассеяния (рис. 116). Их размер согласуется с результатом метода электронной микроскопии (рис. 11а). Как и для обычных генных векторов, использование ДНК с кластерами в комплексе с поликатионом приводит к потере ее электрофоретической подвижности (рис. Ив). Кластеры, находящихся в ДНК-полимерной наночастице, не теряют люминесцентных свойств, причем степень поляризации люминесценции Р ~ 0,45 говорит о том, что кластеры по-прежнему связаны с ДНК. Таким образом, кластеры образуют с ДНК достаточно устойчивый комплекс, который практически не разрушается при конденсации ДНК, хотя последняя

мкм

Рис. 11. ПРЭМ-изображение компактных ДНК глобул, содержащих кластеры серебра. Врезка: распределение частиц по размерам (а); Функция распределения по размерам компактных глобул ДНК и ДНК-Ая0 (б); Изображение геля с комплексами ДНК: 1 - ДНК-А§°, 2 - конд. ДНК-А§°, 3 -свободная ДНК, 4 - конд. ДНК (в). Сдак = 1,2 10"4 М<*„., СА8ноз = 2,4-Ю"5 М, Сц«вш = МО"3 М, Скм»04 = I 10"6 М.

претерпевает достаточно сильные структурные изменения. Люминесцирующие глобулы, сформированные на основе ДНК-полимерного комплекса, и содержащие кластеры серебра, сохраняют свои спектральные свойства при высаживании на поверхность графита, как это было показано методом зондово-усиленной флуоресцентной спектроскопии (ТЕРБ). Сканирование топографии производилось в режиме туннельной микроскопии, усиление сигнала вблизи зонда составило 3—4 раза. На рис. 12 показана топография образца, на которой различимы отдельные ДНК-

Рис. 12. СТМ изображение конденсированных ДНК-

полимерных глобул, содержащих кластеры серебра (а,б) и ТЕРЭ -изображение (в) выделенной (б) области (изображение отражает интегральный люминесцентный сигнал в области 650-800 нм при возбуждении 633 нм); спектры (г), полученные от отдельных глобул, изображенных на (в).

полимерные частицы размером около 100 нм и зондово-усиленный люминесцентный сигнал от этих же частиц. Данный метод дает пространственное разрешение несколько десятков нанометров, что на порядок превышает возможности конфокальной микроскопии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ВЫВОДЫ

1. Определены оптимальные условия синтеза люминесцирующих кластеров серебра, стабилизированных высокомолекулярной ДНК в растворе, изучены их временные изменения и спектральные свойства.

2. Установлено, что возбуждение люминесценции кластеров может производиться как на полосе поглощения кластеров, так и на полосе поглощения ДНК, что указывает на локализацию кластеров вблизи азотистых оснований ДНК.

3. Установлена гетерогенность образующихся кластеров, которая проявляется в зависимости положения максимума полосы испускания от длины волны возбуждающего света.

4. Показано, что при возбуждении люминесценции на полосе поглощения ДНК в спектре испускания присутствуют две неразрешенных полосы для кластеров, излучающих в красной области спектра, преобразующихся с течением времени в кластеры, излучающие в желтом диапазоне.

5. Для этих двух групп кластеров получены близкие значения времен жизни люминесценции 2,4±0,1 не.

6. Показано, что угол между направлением дипольных моментов осцилляторов поглощения (оснований ДНК) и испускания (кластеров) равен приблизительно 60°.

7. Методом нелинейной флуоресцентной спектроскопии насыщения для одного типа кластеров с максимумом полосы испускания около 600 нм получено значение сечения поглощения а = (3,8±0,2)-10"16 см2, квантовый выход темнового состояния (24±3)% и время жизни темнового состояния (15±5) мкс.

8. ДНК-полимерные-наночастицы, имеющие размер (100±50) нм и образующиеся в результате конденсации ДНК, содержащей люминесцирующие кластеры серебра, сохраняют люминесцентные свойства при высаживании на поверхность'графита.

9. Отдельные ДНК-полимерные-наночастицы были визуализированы методом зондово-усиленной люминесцентной спектроскопии.

10. Получены спектральные изображения ДНК-полимерных наночастиц с люминесцирующими кластерами с пространственным разрешением, превышающим дифракционный предел.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Volkov, I. L., Fluorescent silver nanoclusters in condenced DNA / Volkov, I. L.; Ramazanov, R. R.; Ubyvovk, E. V.; Rolich, V. I.; Kononov, A. I.; Kasyanenko, N. A. // ChemPhysChem. -2013. -15. P. 3543-3550.

2. Volkov I. L., DNA-stabilized silver nanoclusters with high yield of dark state / Volkov I. L., Serdobintsev P. Yu., Kononov A. I. // J. Phys. Chem. C. -2013.-117. P. 24079-24083.

Подписано к печати 23.06.14. Формат 60 х 84 Vie Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать цифровая. Печ. л. 1,00. Тираж 100 эxj. Заказ 603 9

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Тел.: (812)428-4043,428-6919

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра молекулярной биофизики

04201460376

На правах рукописи

Волков Иван Леонидович

Создание и изучение ДНК-стабилизированных люминесцирующих кластеров серебра

02.00.06- высокомолекулярные соединения

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д.ф.-м.н, профессор Касьяненко Н.А.

Санкт-Петербург - 2014

Оглавление

Введение..........................................................................................................................................3

Глава 1. Современные представления о свойствах нанокластеров металлов..............................8

1.1. Классификация металлических частиц и их основные свойства.....................................8

1.2. Кластеры в водных растворах. Полимер-стабилизированные кластеры......................13

1.3. ДНК-стабилизированные кластеры серебра......................................................................21

Глава 2. Методы исследования и используемые материалы......................................................44

2.1. Измерение флуоресценции................................................................................................44

2.2. Нелинейная флуоресцентная спектроскопия насыщения.................................................45

2.3. Микроскопия.......................................................................................................................47

2.4. Другие методы исследования.............................................................................................52

2.5. Подготовка систем для исследования................................................................................55

2.6. Синтез ДНК-стабилизированных кластеров серебра.........................................................56

Глава 3. Кластеры серебра, синтезированные на тимусной ДНК................................................68

3.1. Стационарная люминесценция кластеров.........................................................................68

3.2. Характеристика систем методами электронной микроскопии.........................................77

3.3. Фотофизические параметры возбужденных состояний ДНК-стабилизированных кластеров....................................................................................................................................91

3.4. Исследование систем методами спектроскопии поглощения, кругового дихроизма, вискозиметрии и гель-электрофореза....................................................................................102

Глава 4. ДНК-полимерная глобула, включающая флуоресцирующие кластеры серебра.......111

Заключение..................................................................................................................................122

Список литературы......................................................................................................................124

Введение

Актуальность темы исследования. Нанокластеры металлов, содержащие до нескольких десятков атомов, представляют особый класс нанообъектов. При столь малых размерах существенный вклад в их электронные свойства вносят квантово-размерные эффекты, благодаря чему их электронно-энергетическая структура становится подобна молекулярной. Особенный интерес представляют кластеры благородных металлов (золота, серебра), которые показывают хорошую способность к люминесценции. Кластеры серебра, первоначально синтезированные в твердых матрицах, показали свою перспективность в качестве люминофоров. Использование таких структур в качестве люминесцирующих биометок требует создания устойчивых в водных растворах систем. Для этого были разработаны методики получения поЛймер-стабилизированных кластеров с использованием синтетических и биологических полимеров [1].

Особый интерес представляют ДНК-стабилизированные люминесцирующие кластеры серебра. Благодаря высокому сечению поглощения и значительному квантовому выходу, а также хорошей биосовместимости и фотостабильности [1], такие кластеры считаются перспективными для использования в качестве молекулярных сенсоров и зондов для биомиджинга [2]. Согласно литературным данным, уникальным свойством ДНК-стабилизированных кластеров является вариация длины волны испускания кластера в зависимости от последовательности азотистых оснований в ДНК-матрице, на которой синтезируется кластер [3]. Изменение люминесценции при взаимодействии таких структур с другими молекулами ДНК могут стать основой для создания принципиально новых флуоресцентных зондов. Хотя исследования в этой области ведутся интенсивно на протяжении около 10 лет и накоплено большое количество эмпирических данных, структура комплекса ДНК-кластер до сих пор неизвестна.

Наличие долгоживущего возбужденного темнового состояния и возможность модулирования его заселенности дополнительной длинноволновой засветкой делает кластеры перспективными объектами для микроскопии сверхвысокого разрешения и методик синхронного детектирования [4]. Однако данные о фотофизических параметрах возбужденных состояний были получены ранее только для кластеров одной спектральной группы, излучающих в красном диапазоне видимого света, поэтому более подробное изучение этих свойств представляется актуальным.

Использование кластеров в качестве флуоресцентных меток для клеточных исследований подразумевает наличие способов их эффективной транспортировки через клеточную мембрану. Несмотря на наличие некоторых успешных примеров в этой области, они не лишены недостатков, поэтому разработка новых способов доставки флуорофоров в клетку все еще остается актуальной задачей. Благодаря уникальным физико-химическим свойствам, молекула ДНК предоставляет широкие возможности для создания наноразмерных структур. Так, например, комплексы высокомолекулярной ДНК с синтетическими поликатионами являются широко изученными системами для создания генных векторов. Включение в такую ДНК-полимерную глобулу флуоресцирующих структур представляется перспективным методом упаковки кластеров для транспортировки внутрь клетки. Такие структуры могут выгодно отличаться от полупроводниковых квантовых точек, имеющих больший размер и высокую токсичность.

Целью работы является создание и изучение свойств люминесцирующих ДНК-стабилизированных нанокластеров серебра и создание на их основе компактных люминесцирующих ДНК-полимерных наночастиц.

В связи с этим в диссертации решаются следующие задачи:

1. Подбор оптимальных условий для синтеза люминесцирующих кластеров серебра, стабилизированных высокомолекулярной ДНК и изучение их спектральных свойств.

2. Получение компактных ДНК-полимерных наночастиц, включающих кластеры серебра, и изучение спектральных свойств этих наночастиц, находящихся в растворе и иммобилизованных на поверхности.

Для решения поставленных в работе задач применялись следующие методические подходы и методы исследования. В качестве стабилизирующей матрицы для синтеза кластеров использовали тимусную ДНК («Sigma», ММ = 8-106 Да). Синтез кластеров проводился химическим восстановлением ионов серебра, образующих комплекс с ДНК, с помощью боргидрида натрия. Свойства кластеров исследовали методами флуоресцентной спектроскопии. Для характеристики систем использовали также методы спектроскопии поглощения, нелинейной флуоресцентной спектроскопии насыщения, электронной микроскопии, динамического рассеяния света, гель-электрофореза. Это позволило получить информацию об основных спектральных свойства кластеров, свойствах их возбужденных состояний, а также охарактеризовать изучаемую многокомпонентную систему в целом. ДНК, содержащая кластеры, подвергалась конденсации синтетическим поликатионом полиаллиламином. Полученные таким образом ДНК-полимерные флуоресцирующие глобулы, находящиеся на графитовой подложке, были изучены методами конфокальной и зондово-усиленной флуоресцентной микроскопии.

Научная новизна. В работе продемонстрирована возможность синтеза кластеров на высокомолекулярной природной ДНК. Впервые была предложена и экспериментально проверена возможность включения кластеров в ДНК-полимерные наночастицы. Получены новые данные о фотофизических параметрах возбужденных состояний кластеров, показывающие высокую эффективность перехода ДНК-стабилизированных кластеров в темновое состояния. Новый метод зондово-усиленной флуоресцентной сканирующей микроскопии был успешно применен для исследования одиночных флуоресцирующих кластеров на подложке.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана методика, позволяющая синтезировать люминесцирующие кластеры серебра на тимусной ДНК и направленно изменять их спектральные свойства.

2. Проведена оценка значений сечения поглощения, квантового выхода и времени жизни темнового состояния для одного типа кластеров.

3. Показана возможность формирования ДНК-полимерных флуоресцирующих наночастиц, содержащих кластеры серебра. Показано, что такие частицы сохраняют свои флуоресцентные свойства при высаживании на поверхность графита.

4. Методом зондово-усиленной флуоресцентной микроскопии получены спектры флуоресцирующих кластеров с пространственным разрешением, превышающим дифракционный предел.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о возможности создания люминесцирующих биосовместимых ДНК-полимерных наночастиц. Высокий квантовый выход темнового состояния ДНК-стабилизированных кластеров, оценка величины которого выполнена в работе, обеспечивает преимущество при использовании кластеров для микроскопии суперразрешения и для их детектирования методом восстановления синхронно усиленного флуоресцентного изображения по сравнению с другими флуорофорами.

Достоверность полученных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных результатов, а также согласованностью данных, полученных различными методами. Выводы, сделанные на основе экспериментальных результатов, частично согласуются с имеющимися в литературе теоретическими и экспериментальными данными. Результаты работы докладывались и обсуждались на международных конференциях:

1. Ivan Volkov, Fluorescence Properties of Silver Nanoclusters in DNA solution / Ivan Volkov, Alexey Kononov, Ruslan Ramazanov, Nina Kasyanenko // Quantitative Imaging

and Spectroscopy in Neuroscience (QISIN), September 16-19, 2012, Saint-Petersburg, Russia, P. 55-56.

2. Ivan Volkov, Study of the interaction of silver nanoparticles and Ag+ ions with DNA / Ivan Volkov, Mikhail Varshavskii, Alexey Kononov, Valeriy Rolich, Nina Kasyanenko // Biophysical Society 56th Annual Meeting, Can-Diego, California, USA, February 25 - 29, 2012.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Volkov, I. L., Fluorescent silver nanoclusters in condenced DNA / Volkov, I. L.; Ramazanov, R. R.; Ubyvovk, E. V.; Rolich, V. I.; Kononov, A. I.; Kasyanenko, N. A. // ChemPhysChem. - 2013. -15. P. 3543-3550.

2. Volkov I. L., DNA-stabilized silver nanoclusters with high yield of dark state / Volkov I. L., Serdobintsev P. Yu., Kononov A. I. //J. Phys. Chem. C. - 2013. -117. P. 24079-24083.

Глава 1. Современные представления о свойствах

нанокластеров металлов

1.1. Классификация металлических частиц и их основные свойства

В силу особых свойств, которые отсутствуют у объемных структур тех же материалов, наночастицы и нанокластеры металлов нашли широкое применение в различных прикладных задачах: химическом катализе, медицине, биотехнологиях и др. При уменьшении размеров частицы все большая доля атомов принимает участие в поверхностных явлениях. Когда размер металлической частицы становится соизмерим с длиной волны падающего электромагнитного излучения, начинают проявляться плазмонные свойства, которые обеспечиваются коллективными колебаниями электронного газа 8 металле. В еще меньших частицах, размер которых сопоставим с длиной волны де Бройля электрона, начинают проявляться квантово-размерные эффекты, заключающиеся в появлении дискретных энергетических уровней. Отсюда видно, что наноразмерные структуры по праву занимают особую область в физике и химии конденсированного состояния вещества, а их фундаментальные исследования обеспечивают развитие нанотехнологий.

В Таблице 1.1 приведена классификация частиц, а также их основные размерные параметры, согласно работам [5, 6]. Из таблицы следует, что в случае, когда размер частицы металла превышает сотни нанометров (количество атомов в такой частице > Ю10), доля атомов, находящихся на поверхности, много меньше 1 по отношению к атомам в объеме. Такие частицы по своим свойствам практически не отличаются от объемного металла (кристалла), и их свойства описываются в рамках теоретических представлений физики твердого тела [5]. Спектр электронных состояний для таких материалов является квазинепрерывным, образуя валентную зону (рис. 1.1 (а)), заполненную электронами, переходящую в зону проводимости.

Таблица 1.1. Классификация частиц согласно работам [5, 6].

Типы объектов

Характеристики 1. Молекулярные кластеры II. Кластеры твердого тела III. Микрокристаллы IV. Частицы компактного вещества

Количество атомов N < 10 102-103 103 -104 >105

Соотношение поверхность/объем не определено 1 <1 « 1

Размер, нм 12 3 5 7 >10

■6=0 -5<КТ -5>кТ _б»кТ

Металлическая Металлическим . Металл Атом

маночастица нанокластер

(а) (б) (в) (г)

Рис. 1.1. Модель электронной структуры объемного металла (а), металлической наночастицы (б), металлического кластера (частицы-изолятора) (в) и атомной (молекулярной) электронной структуры (г) согласно работе [7].

При уменьшении размеров частиц до нескольких десятков нанометров количество атомов в частицах оказывается порядка 102 - 107, при этом доля поверхностных атомов значительно увеличивается. Последнее приводит к тому, что в свойства частицы значительный вклад вносят поверхностные явления. Это объясняет, например, сильные каталитические свойства металлических наночастиц [8]. Одним из важнейших физических свойств металлических наноразмерных частиц является поверхностный плазмонный резонанс. Суть этого явления состоит в следующем. При взаимодействии электромагнитного излучения с металлическими наночастицами подвижные электроны проводимости частиц смещаются относительно положительно заряженных ионов металлов решетки. Это смещение носит коллективный характер, при котором движение электронов согласованно по фазе (рис. 1.2). Если размер частицы много меньше длины волны падающего света, то перемещение электронов

приводит к возникновению диполей. В результате возникают Кулоновские силы, стремящиеся возвратить электроны в положение равновесия. Величина возвращающей силы пропорциональна величине смещения, как для типичного осциллятора, поэтому можно говорить о наличии собственной частоты коллективных колебаний электронов в частице, которая зависит от четырех основных факторов: плотности электронов, эффективной массы электрона и формы распределения зарядов. На резонансную частоту влияет также поверхностный заряд частицы [9]. Если частота падающего света совпадает с собственной частотой колебаний свободных электронов вблизи поверхности металлической частицы, наблюдается резкое увеличение амплитуды колебания электронной плазмы, квантовым аналогом которой является плазмон. Такое коллективное движение электронов получило название поверхностный плазмонный резонанс. У частиц благородных металлов (золото, серебро) этот эффект проявляется в виде эффективного поглощения падающего излучения на частотах видимого диапазона спектра. Оптические свойства коллоидных растворов металлических частиц были известны еще Майклу Фарадею [10]. Гюстав Ми [11] разработал аналитическую теорию решения уравнений Максвелла для расчета спектров экстинкции (поглощения и рассеяния) сферических частиц, которая и по сей день актуальна. На рис. 1.3 показаны спектры поглощения сферических серебряных частиц разных размеров.

Рис. 1.2. Схема плазмонных осцилляций, показывающая смещение облака электронов проводимости под действием электромагнитного поля [12].

Электронные уровни металлических наночастиц дискретны, но они расположены столь часто, что «зазор» между верхним занятым и нижним свободным уровнем меньше кТ (рис. 1.1 (б)). Это приводит к тому, что при нормальных условиях электроны могут беспрепятственно занимать вышележащие уровни в соответствии со статистикой

Ферми и участвовать в проводимости. Ввиду такого строения электронных уровней о наличии люминесценции в таких структурах говорить не приходится.

W)

CL а0 10 Й, за « ел во Размер малой оси (нм)

Диаметр частиц (нм)

Диаметр частиц (нм)

Диаметр частиц (нм)

300 400 500 600 700 600 Длина волны (нм)

300 «С 500 600 700 800 Длина волны (нм)

300 400 500 600 700 800 Длина волны (нм)

300 400 50С «О 700 800 Длина волны (нм)

Рис. 1.3. РЭМ-изображения серебряных наночастиц различного размера и формы, их распределение по размерам и спектр поглощения соответствующих коллоидов [13].

Перейдём к рассмотрению более мелких металлических частиц, состоящих из нескольких атомов. Такие частицы принято называть металлическими кластерами или нанокластерами. Их свойства, в основном, определяются так называемыми квантово-размерными эффектами, которые начинают проявляться, когда размер области локализации свободных носителей заряда (электронов) становится соизмеримым с длиной волны де Бройля Хв в металле. Вместо непрерывной плотности электронных состояний (характерной для металлов), кластеры, сос�