Спектры гигантского комбинационного рассеяния и структура адсорбированных биомолекулярных систем на основе тиаминовых и флавиновых соединений тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

Белорусский государственный университет

РГБ ОД

л. » ! ' , •

СП | » ; • • .;

УДК 543.424+577.164.111

СТРЕКАЛЬ НАТАЛЬЯ ДМИТРИЕВНА

СПЕКТРЫ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ И СТРУКТУРА АДСОРБИРОВАННЫХ

БИОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ТИАМИНОВЫХ И ФЛАВИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

01.04.05 - оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Минск - 1995

Работа выполнена на кафедре общей и теоретической физики Гродненского государственного университета им. Я. Купалы

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук доцент С.А. МАСКЕВИЧ

доктор физико-математических наук профессор А.И. КОМЯК

Официальные оппоненты

доктор физико-математических наук профессор М.П ЦВИРКО

доктор биологических наук профессор С.Н. ЧЕРЕНКЕВИЧ.

Оппонирующая организация

Институт атомной и молекулярной физики АНБ

Защита состоится 10 _1995 года в 14 _

часов на заседании Совета Д 056.03.05 по присуждению ученой степени кандидата наук в Белорусском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (220080, г. Минск, пр. Ф. Скорины 4, Главный корпус, ауд. 206).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского государственного университета.

Автореферат разослан Ю октя^РЛ. 1995 года.

Ученый секретарь Совета доцент

Стельмах В.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации

Метод гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) света, открытый в начале 70-ых годов, позволяет исследовать структурно-функциональную организацию как простых органических молекул, так и сложных молекулярных комплексов на границе раздела фаз. Среди ГКР-активных субстратов в настоящее время широко используются анодированные серебряные электроды в электрохимической ячейке. Их главным преимуществом, важным для изучения природы ГКР, является возможность плавного изменения шероховатости поверхности путем подбора условий проведения окислительно-восстановительного цикла (ОВЦ) и контроль потенциала поверхности. Однако к настоящему времени не рассмотрен ряд вопросов, связанных с особенностями усиления ГКР молекул, адсорбированных на анодированных электродах: мало уделяется внимания причинам зависимости спектров ГКР от потенциала электрода, не установлены спектральные критерии проявления определенной геометрии адсорбции молекул, содержащих различного типа адсорбционные центры, а также бихромофорных молекул, к числу которых относятся тиаминовые производные. Мало известно о спектральных проявлениях специфических межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое.

Флавин-содержащие молекулярные системы являются удобными объектами для выяснения причины зависимости спектров ГКР от потенциала электрода в силу своих окислительно-восстановительных свойств.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось выяснение механизмов усиления отдельных полос в спектрах ГКР и установление спектральных критериев структурно-конформационных переходов тиамин- и флавин-содержащих молекулярных систем, адсорбированных на положительно заряженной поверхности серебра. Достижение поставленной цели потребовало решения следующих задач:

-провести оптимизацию получения спектров исследуемых соединений и исследовать основные механизмы усиления ГКР;

-интерпретировать спектры ГКР тиамина и его производных, полученных при различных потенциалах электрода и рН электролита;

-изучить влияние ионов . двухвалентных металлов, а также аминокислот и пирувата на спектры ГКР тиамина и тиаминдифосфата (ТДФ) при различных рН;

-определить зависимость формы и положения полос в спектре ГКР флавинадениндинуклеотида (ФАД) от структурно- функционального состояния молекулы, а также присутствия этанола;

получить и интерпретировать спектры • ГКР адсорбированных пируватдекарбоксилазы (ПДК) и алкоголь оксидазы (АО) как в нативном, так и диссоциированном состоянии, выявить спектральные критерии оценки функционального состояния адсорбированного фермента.

Научная новизна полученных результатов.

При решении поставленной задачи выявлены основные механизмы усиления ГКР тиамина, адсорбированного на анодированном электроде и с учетом этого произведена интерпретация спектров ГКР тиамина и его производных. Показано, как в спектрах' ГКР проявляются особенности ионного и конформационного состояния адсорбированных молекул. На основании данной интерпретации сделан- вывод о том, что в процессе адсорбции тиамина и окситиамина из раствора электролита сохраняется конформация этих молекул. Кроме того, при исследовании специфического взаимодействия ТДФ с ионами двухвалентных металлов показано, что вблизи поверхности имеет место изменение конформации комплекса при увеличении положотельного потенциала электрода. Впервые представлены и проанализированы спектры ГКР ПДК. Кроме того, установлена корреляция между сигналом ГКР фермент- связанного ФАД и особенностями четвертичной структуры АО. Показано, что адсорбированная белковая система при определенных условиях сохраняет ферментативную, активность.

Практическая значимость полученных результатов.

Предложенная методика получения спектров ГКР сложных молекулярных комплексов, а также их интерпретация могут быть использованы . для изучения различных молекулярных систем в адсорбированном состоянии. 4

Выводы о конформационном состоянии адсорбированных молекул, о существовании специфического взаимодействия между тиамином и пируватом в приповерхностном слое, а также о влиянии ионов

двухвалентных металлов и гистидина на структурно-конформационное состояние адсорбированного тиамина могут быть использованы для постановки модельных экспериментов в области биохимии и их интерпретации. А именно, при исследованиях и моделировании микроокружения активных центров пируватдегидрогеназного ферментативного комплекса. Кроме того, установление специфичности вышеупомянутых взаимодействий может быть принято за основу при разработке конкретных путей иммобилизации ферментных комплексов на базе ПДК.

Вывод о сохранении активности алкогольоксидазой, адсорбированной на анодированной поверхности серебра, может быть использован, во-первых, для разработки и создания биосенсоров спиртов с ГКР-регистрацией, и, во-вторых, в соответствующих областях биотехнологии для создания систем на основе иммобилизованного фермента.

> Основные положения, выносимые на защиту.

1. Вывод о независимости .соотношения вкладов дальнодействующего и короткодействующего механизмов от степени анодирования при суммарном количестве заряда, прошедшем через поверхность электрода, от 12 до 18 мКл и, основанная на этом выводе, интерпретация спектров ГКР тиамина и ФАД при различных значениях рН электролита.

2. Подход к интерпретации зависимости спектров ГКР тиаминовых и~ флавиновых соединений от потенциала электрода с позиции изменения структурно-конформационного состояния молекул в адсорбционном слое, индуцированном положительно заряженной поверхностью.

3. Методика получения стабильных спектров ГКР тиамин- и флавин- содержащих белковых комплексов.

Личный вклад соискателя.

В диссертации изложены результаты полученные лично автором, а также анализ этих результатов, выполненный совместно с научными руководителями Маскевичем С.А. и Комяком А.И. Соавторы Кивач Л.Н. и Гачко Г.А. также участвовали в постановке экспериментов и в обсуждении экспериментальных результатов. Исследование рельефа поверхности электрода методом туннельной и атомно-силовой

микроскопии - выполнены в лаборатории Отдела проблем ресурсосбережения при участии Свекло И.Ф. Соавторы Черникевич И.П. и Арцукевич И.М. участвовали в подготовке соединений и проведении биохимических исследований, не включенных в данную диссертацию. Соколов К.В. и Ходорченко П.В оказывали, помощь в освоении метода ГКР и проведении кбнтрольных измерений.

Апробация полученных результатов.

Результаты. исследований, включенные в диссертацию докладывались на международных конференциях и конгрессах ~ХН, XIII и XIV ■ Международных конференциях по Раман- спектроскопии, проводившихся соответственно в Колумбии (США) в 1990 г., в Вюрцбурге (Германия) в 1992 г. и в Гонг- Конге в 1994 г.; XX, XXI и XXII Европейских конгрессах по молекулярной спектроскопии, проводившихся соответственно в Загребе (Югославия) в 1991г., в Вене (Австрия) в 1992 г.и в Эссене (Германия) в 1994 г.; VII конференции, по спектроскопии биополимеров, состоявшейся в Харькове в 1991 г.; 4-ой и 5-ой Международных конференциях по применению лазеров в науках о жизни, проводившихся соответственно в Июваскюля (Финлядия) в 1992 г. и в Минске (Беларусь) в 1994 г.; Питтсбургских международных конференциях - по аналитической химии и прикладной спектроскопии (США) в 1993 и 1994 годах; 4-ой Европейской конференции по спектроскопии биомолекул^состоявшейся в Йорке (Великобритания) в 1991 г.; на I Международной конференции по лазерной физике и спектроскопии, состоявшейся в Гродно в 1993 г. и на 1-ом съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков в Минске в 1994 г.

Опубликованность результатов.

Результаты диссертации опубликованы в 7 статьях в научных журналах, 4 статьях в сборниках и 11 тезисах конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения и пяти глав основной части. Общий объем диссертации составляет 136 страниц, 36 страниц занимают иллюстрации и таблицы, список литературы состоит из 152 наименований.

Содержание диссертации.

Во введении обоснована цель работы, ее научная новизна и практическая значимость, а также основные защищаемые положения.

В первой главе ' дана краткая характеристика физической природы ГКР по печатным материалам, касающимся этого явления. Кратко рассмотрены основные теории, описывающие эффект ГКР, а также продемонстрирована применимость метода спектроскопии ГКР к решению широкого круга задач, связанных с различными классами биомолекул. Показаны преимущества и недостатки при использовании той или иной экспериментальной системы применительно к задачам, решаемым этим методом.

Во второй главе подробно описаны объекты исследования, их физико-химические свойства и место в сложных биомолекулярных системах. Так, молекула тиамина состоит из пиримидинового и тиазолового компонентов, соединенных метиленовым мостиком:

- Ш2 , - С2Н4ОН -Тиамин (Т)

- Н, 1?2 - С2Н4ОН - 4'-дезаминоТ

- ОН , В2 - С2Н4ОН - 4'-оксиТ

- Ш2 , - С2Р207Н7 -ТДФ..

Она не является л-сопряженной системой. Отдельно взятые компоненты тиамина являются гетероциклическими соединениями и, как и другие азотсодержащие ароматические гетероциклические молекулы," характеризуются недостатком я-электронов.

ПДК выполняет свою функцию в составе пируватдегидрогеназного комплекса, осуществляющего каталитическое окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты, имеет упорядоченную строго организованную структуру. Коферментом комплекса является ТДФ.

АО осуществляет окисление короткоцепочечных первичных спиртов, замещенных первичных спиртов, а также формальдегида. Простетической группой АО является ФАД, который отщепляется после кипячения фермента в течение 5 мин при 100°С. ФАД состоит из нуклеотидного фрагмента, соединенного с рибофлавином.

Л 1 о/г К

I I

н - сн,

Спектры ГКР исследуемых веществ на серебряных электродах были получены с помощью электрохимической ячейки, включенной в схему потенциостатирования на базе полярографического анализатора РА-2, (ЧССР), работающего в режиме классической 3-х э'лектродной полярографии. Модификация ГКР-активной поверхности, т.е. создание поверхностных шероховатостей добивались проведением в 3-х электродном режиме одного или нескольких ОВЦ. Спектры КР измерялись на спектрометре ДФС-52М (ЛОМО). Диалоговый вычислительный комплекс ДВК - ЗМ спектрометра был сопряжен с ПЭВМ РС/АТ 386 БХ. Контроль за топографией поверхности пленок осуществляли с помощью атомно-силового микроскопа, разработанного и созданного в Отделе ресурсосбережения АН РБ (г. Гродно).

Полуэмпирические расчеты частот и форм колебаний 2,5-диметил-. 4-аминопиримидина и 3,4-диметил-5-оксиэтилтиазола' были выполнены с использованием фирменного пакета программ МОРАС. Для расчета силовых постоянных и колебательного спектра исследуемых молекул в качестве исходных параметров использовались декартовы координаты, взятые из данных рентгено-структурного анализа.

В третьей главе рассматриваются вопросы отнесения полос в спектрах КР тиамина и его производных, механизмы усиления ГКР, а также спектры ГКР адсорбированных на поверхности анодированных электродов,тиамина, 4'-окси-Т, 4'-дезамино-Т и ТДФ при различных рН электролита и потенциалах электрода.

Зависимые от рН структурные превращения в молекулах тиамина связаны с тем, что молекула в своем составе имеет подвижные протоны, связанные с атомами азота. В связи с этим, при рассмотрении спектров КР тиаминовых производных нас в первую очередь интересовали полосы, связанные с характеристическими колебаниями тех групп атомов молекулы, которые являются чувствительными к ее ионному состоянию. •

Представлены результаты исследования степени шероховатости поверхности анодированного электрода и зависимость ГКР сигнала тиамина и ФАД от условий анодирования, а также зависимость спектров ГКР пиримидинового аналога тиамина от длины волны возбуждения.

Анализ полученных результатов показывает, что увеличение суммарного заряда (3, прошедшего через электрод во время ОВЦ, приводит к изменению сигнала ГКР адсорбируемых молекул и не сопровождается изменением относительных интенсивностей отдельных

полос в спектрах. Исследование поверхности электрода с помощью атомно-силового микроскопа до и после анодирования показало, что проведение ОВЦ в режиме (<3=12 мКл), который соответствует оптимальному сигналу ГКР, на поверхности рабочего электрода образуются случайные шероховатости, средние геометрические размеры, которых (5^150 нм) могут обеспечить усиление КР за счет возбуждения "продольных" локализованных плазмонов. Кроме того, при более детальном рассмотрении рельефа поверхности (рис. I) видно, что имеются случайные шероховатости с характерными размерами 5»0,2 нм, что является хорошей предпосылкой для реализации короткодействующего "молекулярного" механизма усиления сигнала ГКР.

л

0.4

* * { ч х »¡? «¡у'Дш^'Т!?У:

со у ^ * * ч »

о

0,006

H-iPJ viwWreK »4 Zf.-'fr**,':)'" » ' ¡уудЩр л«

♦ { ч ТгФг^Ят'. Ж'1; \ iiSH'ilfi

- 1 , •t'iy&i ||

ШШё яшм ft

ifmiii yr Ш- 'Г' 1 *

0,009 0

0,009

Рис. 1. АСМ изображение участка поверхности анодированного серебряного электрода.

С целью оценки вклада данного, механизма в усиление ГКР тиамина было изучено влияние длины волны возбуждения на спектры ГКР для молекул аналога его- пиримидинового компонента. Исследования показали, что в спектрах ГКР, полученных при различных, длинах волн возбуждения в области 450-650 нм, имеет ' место изменение относительных интенсивностей полос, связанных с колебаниями гетероциклического кольца. Рост интенсивности спектра возбуждения ГКР при продвижении в красную область (для полосы 765 см-1) характерен для реализации близкодействующего "молекулярного" механизма усиления, связанного с резонансным КР комплекса молекула-металл, в то же время .слабая зависимость полосы 782 см"1 от длины волны возбуждения свидетельствует в пользу дальнодействующего

механизма усиления ГКР. Существенно, что определяющее форму спектра ГКР соотношение вкладов короткодействующих и дальнодействующих механизмов усиления некритично к степени анодирования, а, следовательно, любые изменения в спектрах при изменении внешних условий (рН, потенциал электрода) могут быть связаны либо с модификацией структуры молекул, либо с изменением потенциала взаимодействия м^жду ними и поверхностью. Исследования, выполненные нами на .ферментных системах, доказывают, что для того, чтобы зарегистрировать ГКР сигнал тиамина или ФАД, встроенных в сложную белковую глобулу необходим непосредственный контакт последних ,» с поверхностью. Это означает, что включение электромагнитного механизма является необходимым, но не достаточным условием для наблюдения эффекта ГКР на таких субстратах.

В табл. 1 представлено отнесение полос в ГКР спектрах тиамина, адсорбированного на- поверхности рабочего - электрода в условиях нейтрального и кислого электролита и при различных потенциалах электрода.

Таблица 1

Отнесение основных полос в спектрах ГКР тиамина при различных рН и потенциалах электрода__'__._

рН 6,6 рН 2,3 тип колебания

-0,65 -0,50 -0,30 -0,50 -0,30 -0,20

В В В В В В

232 220 218 230 220 210 молекула-металл

594 - - 586 586 586 Тз, (деф)

- - - 623 625 625 Тз, у(С-Б)

679 - 663 665 665 Тз, 8(БСМ)

755 755 752 751 751 752 П, (дых)

- 1206 1212 1215 1217 1216 П, (деф), у(Ш2)

1282 1282 - 1287 1287 1287 П, (деф)

- - - 1390 1390 1390 8(СН3)

1609 1598 1586 1600 - - у(С-С), у(С-1М)

— 1640 1644 1641 у(С=С), у(С=Ы)

Примечание: (деф) -деформационное кольца; (дых) -дыхательное кольца; V - валентное; 8-деформационное; у-неплоское;Тз-тиазолового кольца; П-пиримидинового кольца.

Разделение вкладов колебаний тиазолового и пиримидинового компонентов .в области 600-700 см-1 произведено на основании сравнения спектров ГКР 4-метил-5-оксиэтилтиазола в цитратном и 2-метил-4-амино-5-этокснметил-пиримидина в боргидридном гидрозолях серебра. Показано, что полосы с частотами около 750, 1218, 1280 и 1600 см-1 соответствуют усиленным поверхностью колебаниям пиримидинового компонента тиамина, 'а смещение полосы 1600 см-1 к положению 1640 см-1 однозначно свидетельствует о состоянии протонирования пиримидинового компонента адсорбированного тиамина. Полосы с частотами 660 и 680 см-1 принадлежат усиленным поверхностью колебаниям тиазолового компонента тиамина. Соотношение интенсивностей полос 1218 и 1280 см"1, а также 680 и 750 см-1 является спектральным критерием оценки геометрии адсорбции молекул тиамина и его производных.

На основании анализа зависимости относительных интенсивностей полос 240, 668 и 1639 см-1 от потенциала электрода при рН электролита 3,5 показана активная роль ионов хлора в адсорбции протонированных молекул тиамина. Константа скорости реакции протонирования в адсорбционном слое имеет значение, по крайней мере, меньшее или равное 3,1, что существенно отличается от рК для раствора, равное 4,9.

Исходя из представлений о возможных конформациях молекул производных тиамина в растворах и кристаллах и рассмотренных нами спектров ГКР, мы попытались • с помощью компьютерного моделирования построить модели комплекса молекула-метал-л для различных потенциалов электрода. Оказалось, что установленные методом рентгеноструктурного анализа' конформации этих молекул вполне согласуются с нашими выводами об их центрах, активно взаимодействующих с поверхностью серебра при тех или иных условиях.

В четвертой главе приведены результаты исследования модельных и белковых систем, содержащих тиамин, методом ГКР.

Интенсивность сигнала ГКР ТДФ, адсорбированного на поверхности серебра в кислой среде в присутствии ионов Мп2+ в 5-7 раз больше, чем без ионов. _Кроме того, положение основных полос в спектре претерпели высокочастотное смещение по сравнению с их положением в спектре ГКР ТДФ, адсорбированного из обычного 0,1 М ЫаС1 электролита при тех же значениях потенциала электрода и рН, а именно: 749->754, 1210—>1216 и 1632-^1646 см1. Эти данные свидетельствуют, что в результате образования комплексов с ионами

10

л

происходит перераспределение электронной плотности в пиримидиновом компоненте молекул витамина. В результате этого происходит локализация электронной плотности в области аминогруппы. Имеющиеся различия в спектрах ТДФ, связанного и несвязанного с Мп2+, можно объяснить тем, что за счет одновременного связывания дифосфатной группы и пиримидинового цикла ионы металла несколько уменьшают угол между гетерокольцами в молекуле витамина. В результате изменения угла создаются более благоприятные условия для взаимодействия с поверхнрстью атома Б при адсорбции молекул ТДФ посредством аминогруппы.

.Из полученных экспериментальных данных по влиянию пирувата на спектры ГКР производных тиамина видно, что в спектрах отчетливо проявляются специфические межмолекулярные взаимодействия, которые имеют место в адсорбционном слое.

Сравнение спектров ГКР смеси тиамин+триптофан (1:13) со спектрами ГКР отделено взятых тиамина и триптофана указывает на уменьшение сечения КР адсорбированного тиамина в присутствии молекул триптофана. Данный результат не противоречит данным об образовании комплекса с переносом заряда между ТДФ и триптофан в растворе. Некоторое смещение отдельных полос для обеих молекул, а именно: 1206-Я 214, 1282^-1279, 679->666, 1609-^1598 см1 (для тиамина) и 1353—^1346, 1252—»1242 см-1 (для триптофана) может свидетельствовать о наличии взаимодействия между ними также и в адсорбционном слое. В ^результате комплексообразования уменьшается адсорбционная способность молекул тиамина.

Наличие в спектре ГКР смеси тиамин+гистидин при потенциале -0,65 В одновременно полос с частотами 1600 и 1638 см1, а также полос средней интенсивности с частотами 1214 и 1279 см-1 указывает на присутствие в адсорбционном слое молекул тиамина в протонированной и нейтральной формах одновременно.

Процесс адсорбции тиамина в присутствии гистидина приводит к протонированию молекул тиамина. Такое влияние молекул гистидина на адсорбцию тиамина является специфичным, поскольку ГКР спектры смесей тиамин+имидазол, тиамин+аспарагин, полученные при данных экспериментальных условиях не отличаются от спектров отдельно взятого тиамина. Процесс протонирования индуцирован поверхностью и имеет место благодаря особенностям химического строения обоих соединений. Высокая специфичность ассоциации молекул тиамина и гистидина заставляет всерьез рассматривать гистидиновый остаток, как возможный центр связывания молекул витамина в тиаминкиназе.

Анализ спектров ГКР ПДК показывает следующее.

Молекулы кофермента, связанные с нативным белком, удалены от его поверхности или, иными словами,, спрятаны в глубине гидрофобного "кармана" активного центра. Основные адсорбционные группы молекулы ТДФ, по всей видимости, задействованы в связывании с- активным центром. Вследствие этого не удается получить ГКР сигнала ТДФ, от нативного белка. Проведение дополнительного ОВЦ в присутствие белка способствует освобождению кофермента (частично или полностью) из гидрофобного "кармана". В адсорбционном слое молекулы кофермента испытывают- влияние как со стороны ПДК, так и со стороны поверхности электрода. Наиболее отчетливо это проявляется после . проведения ОВЦ, который, возможно, способствует разрушению некоторых связей в пределах белковой глобулы и частичному освобождению кофермента. Конкурирующее взаимодействие ТДФ с поверхностью белка и с поверхностью серебра разрешается в пользу поверхности серебра после вымывания остатков буфера.

В пятой главе представлена и проанализирована зависимость ГКР спектров ФАД от потенциала электрода. Проведен анализ состояния окисления изоаллоксазинового цикла и выявлены спектральные критерии - оценки этого состояния у адсорбированных молекул ФАД. Представлены спектры ГКР АО выделенной из двух различных культур: Candida boidinii (С. boidinii) и Pichia pastoris {P. pastoris). Анализ полученных результатов проведен с точки зрения особенностей четвертичного строения АО, а также функционального состояния ФАД как простетической группы фермента.

Исследование зависимости спектров ГКР ФАД, адсорбированного на . поверхности серебряного электрода от потенциала поверхности, а. также привлечение результатов спектрофотометрических и спектрофлуориметрических исследований показало, что при потенциале *Ф=-0,65 В в объеме ячейки нарабатывается восстановленная форма ФАД, а именно, ФАД Щ. Восстановленная форма обладает меньшей адсорбционной способностью, чем окисленная. Адсорбция восстановленной формы осуществляется , посредством боковых заместителей гетероцикла I.

Различия спектров ГКР АО P.pastoris, стабилизированной и нестабилизированной азидом натрия, свидетельствуют о том, что в процессе проведения ОВЦ не происходит полной диссоциации фермента и освобождения ФАД. Влияние NaN3 на спектры ГКР АО P.pastoris является результатом некоторых различий в геометрии адсорбции

изоаллоксазинового компонента ФАД на поверхности из-за дополнительной фиксации азидом кофермента на белке.

Спектры ГКР АО выделенной из C.boidinii, представляют собой сигнал ГКР ФАД, адсорбированный на поверхности электрода посредством боковых метальных заместителей гетерокольца I. Такая ситуация может иметь место только в случае, если в АО C.boidinii полярные заместители гетерокольца III ФАД прочно связаны с белком и даже в условиях проведенного ОВЦ эта связь не разрывается. Большая степень анодирования поверхности, необходимая для получения ГКР сигнала-АО (С. boidinii), чем АО (P. pastoris), а также принципиальные различия в спектрах связаны, вероятно, с особенностями четвертичной -структуры белка.

Уменьшение ГКР сигнала для проб с низкой активностью можно объяснить процессом ассоциации белковых олигомеров. Вследствие ассоциации ФАД становится недоступным субстрату. По всей видимости ФАД также недоступен поверхности серебра, находясь внутри ассоциированной белковой глобулы и его освобождение, индуцированное реанодизацией, является маловероятным процессом.

Серия экспериментов по изучению влияния этанола на ГКР спектры АО показала, что адсорбированная белковая система сохраняет способность к связыванию субстрата.

Основные результаты и выводы диссертации

1. С целью выяснения механизмов усиления отдельных полос в спектрах производных тиамина было изучено влияние степени шероховатости анодированного электрода на интенсивность линий ГКР. Установлено, что максимальному сигналу ~ ГКР соответствуют шероховатости с характерными размерами порядка 150 нм, которые обеспечивают усиление КР . за счет возбуждения продольных локализованных плазмонов. Показано, что при возбуждении КР в зелено-красной области спектра существенный вклад в усиление полос вносят также чувствительные к геометрии адсорбции, короткодействующие механизмы (образование комплекса металл-тиамин, перенос электронной плотности к реакционным центрам молекулы и др.), что проявляется в зависимости спектров ГКР от длины волны возбуждения: Определяющее форму спектра ГКР соотношение вкладов . короткодействующих и дальнодействующих механизмов усиления некритично к степени анодирования электрода.

2. С использованием пакетов квантово-механических и полуэмпирических расчетов (МОРАС) произведены расчеты частот и форм колебаний аналогов пиримидинового и тиазолового компонентов тиамина. Результаты этих расчетов сопоставлены с соответствующими спектрами КР водных растворов указанных соединений. Показано, что полосы с частотами около 750, 1218, 1280 и 1600 см'1 соответствуют усиленным поверхностью колебаниям пиримидинового компонента тиамина, а смещение полосы 1600 см"1 к положению 1640 см-1 однозначно свидетельствует о состоянии протонирования пиримидинового компонента адсорбированного тиамина. Полосы с частотами 660 и 680 см-1 принадлежат усиленным поверхностью колебаниям тиазолового компонента тиамина. Соотношение интенсивностей полос 1218 и 1280 см-1, а также 680 и 750 см*1 является спектральным критерием оценки геометрии адсорбции молекул тиамина и его производных.

3. Интерпретированы спектры ГКР адсорбированных на поверхности анодированного электрода ТДФ и 4'-окси-Т и 4'-дезамино-Т при различных значениях рН электролита. На основании анализа спектров ГКР установлено, что основные центры связывания с поверхностью металла осуществляются посредством гетероатомов азота и серы соответственно для пиримидинового и тиазолового компонента, а также тс-электронной системы кольца и реакционных групп 1МНо и СН3.

4. Установлены основные причины зависимости спектров ГКР производных тиамина' и ФАД от потенциала электрода. Эти причины обусловлены влиянием на спектры ГКР слабо связанных протонов, а также восстановлением молекул ФАД при адсорбции. Выявлена узкая спектральная" область (1250-1350 см-1) наиболее- чувствительная к изменениям электронной структуры молекулы ФАД в пределах изоаллоксазинового компонента в окисленной форме.

5. Обнаружены и интерпретированы изменения в спектрах ГКР тиамина и его производных, адсорбированных в присутствии ионов Мп2+, пирувата и ряда аминокислот как результат проявления специфических межмолекулярных взаимодействий между изучаемой молекулой и ионом металла или молекулой аминокислоты. Индуцированные положительно заряженной поверхностью металла специфические мёжмолекулярные взаимодействия в приповерхностном слое проявляются в спектрах ГКР в изменении конформации адсорбированных молекул (ТДФ+Мп2+), в изменении их ионного состояния (тиамин+гистидин), геометрии адсорбции (тиамин+ пируват) либо в уменьшении адсорбционной способности (тиамин+триптофан).

6. Впервые получены спектры ГКР пируватдекарбоксилазы и алкогольоксидазы, адсорбированных на поверхности анодированного электрода и исследованы зависимости положения и интенсивностей полос от потенциа'ла. Показано, что сигнал ГКР адсорбированных ферментов принадлежит коферментам данных молекул. Выявлены спектральные полосы 1255- и 1340 см-1, чувствительные к степени связи ФАД с белком, особенностям четвертичной структуры белка и присутствию эффекторов.

, 6. Разработана методика адсорбции белковых систем на поверхности анодированного электрода, включающая помимо проведения окислительно-восстановительного ■ цикла перенесение электрода с адсорбированным белком в чистый электролит. Методика позволяет получать стабильные спектры ГКР белковых систем. На примере алкогольоксидазы показано, что адсорбированная на электроде белковая система при определенных - условиях сохраняет способность к связыванию субстрата.

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Кивач JI.H., Ксенофонтов М.А., Подтынченко С.Г., Стрекаль Н.Д. Колебательный спектр и силовое поле мономера пировиноградной

. кислоты. //ДАН БССР.- 1989.-Т. 33, № 4,- С. 321-323.

2. Гачко Г.А., Кивач JI.H., Маскевич.С.А., Подтынченко С.Г., Соколов В.К., Стрекаль Н.Д. Структура, спектры KP и ГКР'гшрувата натрия / / Тез. докл. XII Всесоюзн. сов. "Применение колебательных спектров к исследованию неорганических и координационных соединений",-Минск, 1989,-С.184.

3. Maskevich S.A., Kivach L.N., Sokolov K.V., Chumanov G.D., Strekal N.D., Nabiev I.R. Surface enhanced Raman - spectroscopy of cocarboxylase and pyruvate complexes //Proc. Xll Int. ConL Raman Spectr, eds. Durig J.- New York: Jon Wiley & Sons.- 1990,- P.300-3Ö1.

4. Маскевич C.A., Соколов K.B., Кивач JI.H., Подтынченко С.Г., Стрекаль Н.Д., Ходорченко _ П.В. " Спектры гигантского комбинационного рассеяния и структура адсорбированных на поверхности серебра тиамина, тиаминдифчсфата и пирувата//Биоорганическая химия,- 1990.- Т. 16, № 11,- С. 15521562.

5. Strekal N.D., Gachko G.A., Kivach L.N., Maskevich S.A., ■ Podtynchenko S.G. SERS study of the thiamine derivatives with

pyruvate / / Abstr. XXth Eur. Congr. Mol. Spectr.- Zagreb (Jugoslavia), 1991.-P.385

6. Chernikevich I.P., Basliarin S.K., Maskevich S.A., Kivach L.N., Strekal N.D., Voronich V.H. The study of structure and dynamics of active center of pyruvate decarboxilase from brewers yeast //Pros. 4th Eur. Conf. Spectr. Biol. Mol., eds. Hester J.- York (England), 1991,- P.255-256.

7. Кивач Jl.H., Маскевич A.A., Маскевич С.А., Черникевич И.П., Стрекаль Н.Д., Коротаева И.Л. Исследование структуры и динамики активного центра пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей методом спектроскопии ГКР и импульсной флуориметрии //Тез. докл. VII конф. по спектроскопии биополимеров.- Харьков, 1991,-С.164.

8. Strekal N.D., Maskevich S.A., Gachko G.A., Kivach L.N. The study of active center of pyruvate decarboxylase from brever-s yeast by SERS // Proc. XIHth Int. Conf. of Raman Spectr, eds. Kifier R.- New York: Jon Wiley & Sons.- 1992,- P..-P.A120-A121.

9. Strekal N.D., Gachko G.A., Kivach L.N., Maskevich S.A. SERS study of the complexes of thiamine derivatives with pyruvate// J. Mol. Struct.- 1992.- V 267,- P. 287-296.

10. Maskevich S.A., Chernikevich I.P., Gachko G.A., Kivach L.N., Podtynchenko S.G., Strekal N.D. The study of pyruvate decarboxilase from brewers yeast by Raman spectroscopy / /Abstr. XXIth Eur. Congr. Mol. Spectr.- Viena (Austria), 1992,- P.200.

11. Kivach L.N., Maskevich S.A., Chernikevich I.P., Gachko G.A., Strekal N.D. Study of pyruvate decarboxylase and thiamine kinase from brewers yeast by SERS,//Laser Spectr. Biomol.- SPIE, 1993.-V.1921.- P.315-321.

12. Maskevich A.A., Chernikevich I.P., Maskevich S.A.,' Strekal N.D. Application of fluorescence and SERS spectroscopy to Control Functional State of thiamine kinase / / Abst. Pittsburg Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectr.- Atlanta (USA), 1993.- P. 135.

13. Стрекаль Н.Д., Маскевич С.А. Исследование протолитических реакций в тиамине, адсорбированном на поверхности серебряных электродов, методом ГКР //Тезисы докладов 1-ой международной конференции по лазерной физике и спектроскопии,- Гродно,- 1993.--С.165-166.

14. Strekal N.D., Artsukevich I.M., Maskevich S.A., Kivach L.N., Chernikevich I.P. Study of structure and functions states of Alcohol

Oxidase by SERS method //Abst. 5th Int. Conf. Laser Appl. Life Scien.-Minsk (Belarus),1994.-P.121.

15. Strekal N.D., Artsukevich I.M., Maskevich S.A.,. Kivach L.N., Chernikevich I.P, The SERS study of separation of coenzymes from Pyruvate Decarboxilase and Alcohol Oxidase / / Abst. XIV Int. Conf. Raman Spectr.- Hong-Kong.-1994.- P.A199-A200.

16. Maskevich S.A., Gachko G.A., Maskevich A.A., Strekal N.D. Fluorescence features of some organic compounds and proteins adsorbed on , rough surfaces//Laser spectroscopy of Biomolecules. SPÍE.- 1994- V.237&- P. 196-194

17. Maskevich S.A., Gachko G.A., Maskevich A.A., Strekal N.D. Fluorescence features of proteins, adsorbed on rough silver surface •/ / Abst. 5th Int. Conf. Laser Appl, Life Scien.- Minsk (Belarus), 1994.-P.113.

18. Maskevich S.A., Strekal N.D., Artsukevich I.M., Maskevich A.A., Goulyai I.E., Kivach L.N.. SERS and fluorescence investigation of Alcohol Oxidase. / / Proc. Pittsburg Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectr.- Chicago( USA) - 1994,- P.122.

19. Maskevich S.A., Strekal N.D., Artsukevich I.M., Kivach L.N.. SERS and fluorescence investigation of structure of protein-bounded FAD.// Abstr. 22th Eur. Congr. Mol. Spectr.- Essen (Germany).- 1994.- P.291.

20. Strekal N.D.,- Maskevich S.A., Artsukevich I.M., Kivach L.N., Chernikevich LP. Study of structure and functional states of alcohol oxidase by surface- enhanced Raman spectroscopy //Laser spectroscopy of Biomolecules. SPIE.- 1994-.-V. 2370.-P.131-135.

21. Маскевич С.А., Стрекаль Н.Д., Арцукевич И.М., Кивач Л.Н.. Спектроскопические исследования структурных превращений алкоголь оксидазы, . адсорбированной на серебряном электроде//Тезисы , докладов 1-го съезда белорусского общества фотобиологов и биофизиков.-Минск.-1994,- С.119.

22. Maskevich S.A., Strekal N.D., Artsukevich 1.М., Kivach L.N.. Surface enhanced Raman ^scattering investigation of protein-bound flavin adenine dinucleotide* structure.//J. Mol. Str.-1995,- V. 349,- P. 5-8.

РЕЗЮМЕ

Стрекаль Наталья Дмитриевна СПЕКТРЫ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ И СТРУКТУРА АДСОРБИРОВАННЫХ БИОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ТИАМИНОВЫХ И ФЛАВИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

/

Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР), анодированные серебряные электроды, механизмы . усиления сигнала комбинационного рассеяния, производные тиамина, флавинадениндинуклеотид (ФАД), пируватдекарбоксилаза (ПДК), алкогольоксидаза (АО).

Объект исследования: спектральные проявления структурцо-конформационных превращений* адсорбированных биомолекулярных систем на основе тиаминовых и флавиновых соединений.

Цель работы: выяснение механизмов усиления отдельных полос в спектрах ГКР и установление спектральных критериев структурно-конформационных переходов тиамин- и флавин- содержащих молекулярных систем, адсорбированных на положительно заряженной поверхности серебра.

Методы исследования и аппаратура: метод спонтанного и гигантского комбинационного рассеяния, атомно-силовая микроскопия поверхности. Спектрометр ДФС-52М (ЛОМО); диалоговый вычислительный комплекс ДВК - ЗМ, сопряженный с ПЭВМ РС/АТ 386 ЭХ; атомно-силовой микроскоп; полярографический анализатор РА-2 (ЧССР).

Результаты и новизна: выявлены основные механизмы усиления ГКР тиамдна, адсорбированного на анодированном электроде и произведена интерпретация спектров ГКР тиамина и его производных. Показано, как в спектрах ГКР проявляются особенности ионного и конформационного состояния адсорбированных молекул Впервые представлены и проанализированы спектры ГКР ПДК. Установлена корреляция между сигналом ГКР фермент- связанного ФАД и особенностями четвертичной структуры АО. Показано, что адсорбированная белковая система при определенных условиях сохраняет ферментативную активность.

Применение результатов работы: предложенная методика получения спектров ГКР сложных молекулярных комплексов, а также их интерпретация могут быть использованы для изучения различных молекулярных систем в адсорбированном состоянии. Установление специфичности межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое

18

\

может быть принято за основу при разработке конкретных путей иммобилизации ферментных комплексов на базе ПДК.

Вывод о сохранении активности АО, адсорбированной на анодированной поверхности серебра, может быть использован, во-первых, для разработки и создания биосенсоров спиртов с ГКР-регистрацией, и, во-вторых, в соответствующих областях биотехнологии для создания систем на основе иммобилизованного фермента.

Рэзюмэ

Стрэкаль Наталля Дзмгграуна СПЕКТРЫ Г1ГАНЦКАГА КАМБ1НАЦЫЙНАГА РАССЕЙВАННЯ I СТРУКТУРА АДСАРБ1РАВАНЫХ Б1АМАЛЕКУЛЯРНЫХ С1СТЭМ НА АСНОВЕ Ц1АМ1НАВЫХ I ФЛАВ1НАВЫХ ЗЛУЧЭННЯУ

Пганцкае камбшацыйнае рассейванне (ГКР), мехашзмы узмацнення,, анадз1раваныя сярэбраныя электроды, вытворныя шамша, флавшадешндзшуклеатщ (ФАД), шрувадзжарбакалаза (ПДК), алкагольаксщаза (АО).

Аб'ект даследвання: спектральный праяуленш структурна-канфармацыйных станау адсарб1раваных малекулярных астэм на аснове щамшавых '1 флавшавых злучэнняу.

Мэта работы: высвятленне мехашзмау- узмацнення .асобных -палосау у спектрах ГКР ! вызначэнне спектральных кр1тэрыяу структурна- канфармацыйных пераходау адсарб^раваных на дадатна заражанай паверхш серабра малекулярных астэм, у склад яшх уваходзяць щамш 1 флавш.

Метады даследвання 1 апаратура: метад спантаннага 1 пганцкага камбшацыйнага рассеяния, атамна-сшавая мшраскашя паверхш, спектрометр ДФС-52М (ЛОМО); Д1ялага-выл1чальны комплекс ДВК - ЗМ, ПЭВМ РС/АТ 386 БХ; ат.амна-силавы мжраскоп; паляраграф1чны анал1затар РА-2 (ЧССР).

Рэзультаты I ■ нав1зна: вызначены асноуныя мехашзмы узмацнення ГКР щамша, адсарб1раванага на анадз1раваным электродзе 1 праведзена ¡нтэрпретацыя спектрау ГКР щамша 1 яго вытворных. Паказана, як у спектрах ГКР праяуляюцца асабл!васщ юнната \ канфармацыйнага стану. адсарб1раваных малекул. Упершыню прадстаулены 1 праанал1заваны спектры ГКР ПДК, установлена карэляцыя пам1ж с1гналам ГКР фермент-звязанага ФАД \ асаблГвасцям1

чацвярщчнай структуры АО. Паказана, што адсарб1раваная бялковая сктэма пры пэуных умовах захоувае ферментатыуную актыунасдь.

Прымяненне выншау працы: прапанаваная методыка атрымання спектрау ГКР ПДК i АО, а таксама ix штэрпрытацыя могуць выкарыстоувацца для вывучэння розных малекулярных астэм у адсарб^раваным стане. Устанауленне спецыф1чнасщ мшмалекулярных узаемадзеянняу у адсарбцыйным ела! можна прыняць за аснову пры распрацоуцы канкрэтных шляхоу ¡мабшзацьп ферментных комплексау на базе ПДК. Вывад аб захаванш актыунасщ АО, якая адсарб1равана на' анадз1раванай паверхш серабра, можна выкарастаць па-першае, для распрацоую i стварэння 6iac3Hcapay сшртоу з ГКР-рэпстрацыяй i, па-другое, у адпаведных гал'мах б1атэхналоп! для стварэння астэм на аснове ¡мабшзаванага фермента.

Abstract

Strekal Natalya Dmitrievna

SURFACE-ENHANCED RAMAN SPECTRA AND STRUCTURE OF ADSORBED BIOMOLECULAR SYSTEMS ON THE BASIS OF THIAMIN AND FLAVIN COMPOUNDS

Surface-enhanced Raman .scattering (SERS), the mechanism of enhancement, anodized silver electrodcs, thiamin derivatives, flavinadenindinucleotid (FAD), pyruvatedecarboxilase (PDC), alcoholoxidase (AO).

The object of investigation: the spectral development of structural and conformational states of adsorbed molecular systems containing thiamin and flavin compounds.

The aim of work: the elucidation of enhancement mechanisms of some bands in the SERS spectra and establishment of spectral criterion's of structural and conformational changes in thiamin and flavin containing molecular systems adsorbed on-the positive charged silver surface.

Methods and equipment: the methods of normal and surface-enhanced Raman scattering, atom-force microscopy of surface, spectrometr DFS-52M (LOMO); dialogue-computering complex DVK-3M, joining with IBM PC/AT 386 DX; atom-force microscop (Grodno); polarographic analyzator PA-2.

Results and innovation: there are disclosed the main mechanism of SERS enhancement of thiamin adsorbed on anodized electrode and interpretation of SERS spectra of thiamin and its derivatives was made.

20 v '

There are showed that in the SERS spectra the peculiarities of ion and conformational states of adsorbed molecules were exposed. For the first time the SERS spectra of pyruvatedecarboxilase are presented and discussed. The correlation between th$ SERS signal of protein-bounded FAD and peculiarities of structure of alcoholoxidase is determined. It is showed that adsorbed protein system under certain conditions retains the fermentative activity.

Applications of the results: the proposed method of registration and interpretation of SERS spectra of PDC and AO can be used for examination of different molecular systems in adsorbed state. The determination of specific features of intramolecular interactions available in adsorption layer can become a basis for the elaboration of concrete ways of immobilization of protein "complexes containing pyruvatedecarboxilase. The conclusion, on retaining activity of alcoholoxidase adsorbed on an anodized silver surface can be used firstly in the field of the -elaboration and creation of SERS-detecting biosensor of alcohol, and secondly in relevant fields of biotechnology for creation of systems on the basis if immobilized protein.

Подписано к печати 28.09.95 Формат 60x84 1/16 Усл. печ. л. 1,16. Тираж 100 экз. Бесплатно. Заказ .

Отпечатано на ротапринте Гродненского государственного университета им. Янки Купалы. Республика Беларусь. 230023, г. Гродно, ул. Ожешко, 22.