Структура, межмолекулярные взаимодействия и фотофизические процессы в биоактивных системах, содержащих тиамин, пируват и триптофан тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

го««.*«-? ■ • !

с''Дсг'Т1.I

БЕЛОРУССКИЙ' ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

СПС"1

На правах рукописи удк 535.37: 543.424

КЙВАЧ Леонид Николаевич

■ фотофизические-Т^СЭД^^

СОДЕРЖАЩИХ ТИАМИН, ПИРУВАТ И ТРИПТОФАН

01.04.05 — оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 535.37-.543.424

КИВАЧ Леонид Николаевич

СТРУКТУРА, МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И ООТОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В БИОАКТИВНЫХ СИСТЕМАХ, СОДЕРЖАЩИХ ТИАМИН, ПИРУВАТ И ТРИПТОФАН

01.04.05 —оптика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Работа выполнена на кафедре общей и теоретической физики Гродненского государственного университета им.Я.Кунащ

Официальные ошонентн:

доктор физико-математических наук, профессор Жбанков Р.Г. доктор физико-математических наук, профессор Умрейко Д.С. доктор .биологических наук, профессор Черницкий Е.А.

Ведущая организация- Институт молекулярной и атомной фишки

Защита диссертации состоится 24 марта '1993 г.. в 14 часов на заседании специализированного Совета Д 056.03.09 Белорусского государственного университета (220080,г.Кееск, прош. Ф.Скорины 4, главный корпус, ауд. 206).

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского госудаственного университета.

Автореферат разослан 23 февраля 1993 годе.

Ученый секретарь Снещажззгрованного совета

АН Беларуси

о

доцвн?

Б.Ф.Стельмах

з

ОЙЦАЯДАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одним из наиболее фундаментальных вопросов энзшологии является выяснение механизма действия ферментов, благодаря которому сложные белковые соединения осуществляют специфичный и эффективный катализ. Ответ на него представляется весьма трудной задачей, решение которой требует всестороннего использования данных, полученных в результате применения различных, подходов и методов.

Известно, что среди ферментативных систем, играющих основную роль в общем обмене веществ в клетке, выделяются комплексы

тиамйнзавнсимых ферментов, а их числе пирузатдекарбоксилаза я тиаминкиназа. Тиамкновне ферменты катализируют значительное количество реакций, которые можно свести к нескйяьким основным типам: нескислигельное декарбоксилирование а-кетокислот и синтез еде ютов; окислительное декарбоксилирование а-кетокислот, в том числе и шрувата; образование и расщепление а-оксикетонов и ди-кетонов. Во всех случаях коферментную функцию выполняют тиамин и его производило.

Тиамин широко применяется в лечебной практике как витаминный и формакодинамический агент; в наши дни применение тиаминди-фосфата (ТДФ, кокарбоксилаза) при сахарном диабете и сердечнососудистых ззболеЕаниях общепринято. В изучении функциональной значимости тиамина ¡алеется большое количество данных, полученных з опытах на низотных к з клинике, о лечебном эффекте тиамина и тиамшздифосфата, специфических функциях атомов и групп в молекуле витамина. Использование модельных систем позволила представить отдельные тшяиязагасшые ферментативные процессу, в виде схем последовательных элементарных реакций. Некоторые из этих реакций удалось осуществить в опытах-с тиаминовыми ферментами, токазав их реальность в условиях ферментативного катализа. Йзу-

ЗЭНИЮ К2?5Л*ТТГ"?СК0Й' ФуНКЬКЯ ТЗФ В рЭЗКЦШТ Д9К8ТЗ{5СКСЙЛИр0В8гШЯ

мровкноградной кислоты (ПК), являющейся важнейшим метаболитом углеводного обмена, связующим звеном в превращениях белков, • зет-хзв и углеводов, также посвящен обширный литературный материал. Имеется ряд данных по структуре ПК и ее ионных форм.

Анализ имеющегося" литературного материала показывает, что 1ти процессы в большинства случаев постулируются и описываются ж фактически существующие без особо удачнных попыток их спрог-

нозировать. Последнее, на наш взгляд, возможно осуществить лишь при изучении физических аспектов упомянутой проблемы. Тем не менее, до сих пор практически отсутствуют данные о строении активного центра таких ферментов как тиаминкиназа и пируватдекарбок-силаза, о природе и энергетике межмолекулярных взаимомодействий в нем; то же касается внутримолекулярных процессов в молекулах тиамина и его производных. Большое значение в рассматриваемом плане имеет изучение межмолекулярных взаимодействий тиамина с пировиноградной кислотой, строения пировиноградной кислоты и еб ионных форм, комплексов пировиноградной кислоты, тиамина с ионами металлов (кофакторов), участвующих в осуществлении ферментативного катализа! Еще меньше данных имеется оО общей структуре указанных ферментов, их функциональных группах, внутримолекулярной подвижности и возможных путях регуляции их каталитической активности.

В то же время современные методы кинетической споктрофлуо-риметрии, комбинационного рассеяния света (КР) и гигантского КР (ГКР) позволяют решать перечисленные вопросы. По сути дела, изучение внутримолекулярной динамики ферментов, связи между структурой и их функцией позволяет подойти к решению допроса о возможностях управления ею. Поэтому такие исследования могут существенно развить представления о механизмах функционирования перечисленного класса соединений.

Исходя из выше изложенного, целью настоящей работа являлось изучение строения, электронной структуры производных тиамина, закономерностей спектроскопических проявлений специфических взаимодействий, происходящих в системах, содержащих растворитель, ткзмик, ионы металлов, пировиноградну» кислоту, адсороиругдую поверхность, ферменты, и их роли в процессах функционирования последних.

Достижение поставленной цели предполагало решение следующих задач:

1. Изучение путей дезактивации электронно-возбужденных состояний з производных тиамине и влияние ив них температуры, внутри- и мехмолекулярных специфических взаимодействия.

2. Выявление взаимосвязи между спектрально-кинетическими характеристиками люминесценции, спектра»! К? и'структурными формами производных тиамина, пировиноградной кислоты и триптофана, существующими в различных средах.

3. Изучение влияния специфических взаимодействий в модельных системах, содержащих тиамин, пировиноградную кислоту, триптофан, имидазол, ионны двухвалентных металлов в растворах ¡i в адсорбированном на поверхности состоянии, на их спектроскопические характеристики.

4. Изучение спектров КР и ГКР, а также собственной лхминос-цокции тиаетнкшазы и иируватдекарбоксилазы и связанных с ниш зондов и меток и влияния на люминесцентные характеристики указанных систем ионов двухвалентных металлов, субстратов и эффекторов ферментативных реакций.

5. Разработку аппаратуры и методов обработки экспериментальных данных длл спзктрально-канвтических исследований „люминесценции и КР.

Научная новизна работы.

В диссертационной работе обладают научной новизной:

- результаты спектрально-кинетических исследований люминесценции производных тиамина, пировиноградной кислоты и та комплексов с ионами двухвалентных металлов в различных растворителях и при различных рН, позволившие построить схему их элоктронно-воз-Оунденных состояний, определить пути и механизмы д-эзактпваиии последних к выявить закономерности влияния специфических ззапмс-действий окружения на электронную структуру указанных хромого-ров;

- полученные из анализа спектров КР и ГКР ти&эдшадифссфггя ;; пирувата данные о структуре этих молекул в растворах ¡i в адсорбированном на поверхности состоянии, данные о наличии

ской ассоциации мекду ними в адсорбированном состоянии и зависимости структуры данного комплекса от потетталз поверхности;

- выводы с гетерогенности, гидрофоОности и малой иодадкисс • гн ^¿кроокрукешш триптофановых остатков в тиаминкиназе и пиру-затдекарбоксилазе, о влиянии на внутримолекулярную подвижность указанных белков ионов двухвалентных металлов, субстратов и эффекторов ферментативных реакций, которые оыли сделаны исходя л.; ;эзультатоз спектрально-кпнетических исследований дшинасцонци*!;

- яр9дложз|ше модели структуры активных центров тиямкнкй-»азы к шфуватдекарбоксилазы, как результат .анализа выполнен,их i работе спектроскопических исследований модельных систем и фер-¡ентшх комплексов.

Научная и практическая значимость работа.

Подученные в работе результаты связывают воедино электронное строение, структуру, физико-химические (в частности, спектрально-люминесцентные) свойства обширного класса биоорганических соединений, в том числе тиамина, пирувата, триптофана, с их биохимической активностью. Построенные модели активных центров тиа-минкиназы и пируватдекарбоксилазы и обнаруженные эффекты влияния внешних факторов на структурную организацию и динамику данных ферментов позволили прояснить механизмы их функционирования и регулирования ряда биохимических процессов в системах жизнедеятельности живых организмов. Выявленные закономерности влияния различных эффекторов на внутримолекулярную динамику упомянутых ферментов свидетельствуют о принципиальном значении спонтанной подвижности белковых структур в процессах ферментативного катализа и указывают на возможные пути его регуляции. Полученные результаты по исследованию процессов релаксации мекмолекулярных взаимодействий в ферментах развивают представления спектроскопии межмолекулярных взаимодействий в сложных многокомпонентных системах. Созданные установки и развитые методы исследования люминесценции с субнаносекундным временным разрешением, КР и ГКР отражают современные тенденции в развитии техники и методики спектроскопии и могут найти широкое применение при решении многих научных и производственных задач.

Защищаемые положения:

1. Систематика уровней энергии, электронных переходов между ниш для тиамина и рассматриваемых в работе молекулярных комплексов.

2. Фотофизические процессы в комплексах тиамина с пировино-градной кислотой и ионами металлов, осуществляющиеся в соответствии с их структурой и электронным строением.

3. Влияние внешней среды (растворителя, адсорбирующей подложки, температур«) на спектроскопические характеристики и ферментативную активность тивминкиназы и пируватдекарбоксилазы; особенности структуры и фотофизических свойств заморожешшх водных и водно-солевых растворов упомянутых систем.

4. Структурная организация тиаминкиназы и пируватдекарбоксилазы и их комплексов с ионами двухвалентных металлов с учетом специфических взаимодействий между ниш.

5. Роль различных эффекторов изученных ферментов и их хро-

мофоров в преобразовании энергии электронного возбуждения и пути

их влияния на биохимические процессы.

6. Построение моделей структуры активных центров ферментов и ближайшего окружения на основании спектроскопических исследований (на примере тиаминкиназы и пируватдекарбоксилазы).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы докладывались на XIII Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Польша, Вроцлав, 197? г.), XXIV, XXV, XXVII Совещаниях по люминесценции (Минск, 1377 г., Самарканд, 1979 г., Харьков 1S82 г., Караганда, 1989 г.), IV Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979 г.), VI Межреспубликанской конференции биохимиков (Юрмала, 1981 г.), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982 г.), Всесоюзном семинаре "Физика быстропротекающих плазменных процессов" (Гродно, 1986 г.), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988 г.), XX Всесоюзном съезде по спектроскопии (Киев, 1988 г.), XII Всесоюзном совещании по применению колебательных спектров к исследованию неорганических и координационных соединений (Минск, 1989 г.). П Межреспубликанской школе-семинаре "Современные проблемы спектроскопии, лазерной физики и плазмы", (Минск, 1990 г.), Всесоюзной конференции "Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных" (Ташкент, 1990 г.), XX конференции Европейского биохимического общества (Венгрия, Болотон, 1990 г.), XII, XIII Международных конференциях по спектроскогош комбинацинного рассеяния света (США, Колумбия, 1990 г., Германия, Вюрцбург, 1992 г.), XX Европейском конгрессе по молекулярной .спектроскогош (Югославия, Загреб, 199Í г), 17 Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (¿кглия, Йорк, 1991 г.), VII Всесоюзной конференции по спектроскогош биополимеров (Харьков, 1991 г.), XXI Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Австрия, дана, 1992 г.).

Публикации.

Основные результаты работы опубликованы в 59 статьях, тезисах докладов, в трудах конференций и совещаний.

Личный вклад автора.

В диссертации изложены результаты работ, выполненных'.автором лично и под его руководством вместе с учениками - Маскевичем З.А., Гачко Г.А., Маскевичем A.A., Подтынченко С.Г., Вороничем

'■'-■•. 8

В.Е., Стрекаль Н.Д., Башариным С.К. Ряд работ выполнялся совместно с Институтом биохимии АН РБ (г. Гродно), Институтом биоорга-ничэской химии РАН им. Шемякина (г, Москва), лабораториями НШ ПФП им. А.Н. Севченко, а также кафедрами физического факультета Белгосуниверситета (г. Минск).

Вклад автора диссертации в упомянутые выше публикации заключался в определении направления и постановке конкретной задачи исследования, в разработке методик эксперимента и расчетных "моделей, непосредственном участии в выполнении измерений, проведении анализа и обобщения полученных результатов.

Диссертационная работа выполнена на кафедре общей и теоретической физики Гродненского государственного университета им.Я.Купалы в 1976-1992 г. в соответствии с плановыми научными исследованиями по темам, входящим в планы АН СССР и АН БССР. Ряд из этих тем выполнялось по постановлениям ГКНТ СССР и Правительств СССР и республики.

Структура работы.-

Диссертация состоит из введения, семи глав, выводов и библиографии. Полный объем работы составляет 299 страниц, включая 102 рисунка, 38 таблиц и 361 наименование цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована цель работы, ее научнвя новизна и практическая значимость и основные защищаемые положения.

Первая глава является методической. В ней описаны созданные установки для проведения спектрально-кинетических исследований люминесценции, КР, а также методы математической обработки спектральных и кинетических измерений. Описана методика измерения спектров ГКР с использованием золей, электрохимической ячейки и островковых пленок. Основное внимание уделяется предлагаемому методу обращения свертки кривых затухания флуоресценции. Показаны возможности метода для анализа многокомпонентных растворов красителей, указаны критерии, используемые для определения качества аппроксимации.

Исследования спектрально-кинетических характеристик флуоресценции производились на автоматизированном импульсном спект-рофлуориметре, созданном на базе двух монохроматоров, действие •которого основано на статистическом методе регистрации законов излучения (метод многоканального временного анализа). В качестве импульсного источника возбуждения служила газоразрядная лампа с

•Т

; э.

частотой следования импульсов -40 кГц и длительностью 1,2+1,4 не. Для измерения стационарных спектров люминесценции вместо импульсного источника света установки использовалась ртутная лампа ДРШ-500 ют ксеноновая - ДКСШ-150. Анализатор IOA-TO в этом случае работал в режиме многоканального счбтчика, на вход которого поступали "стоповые" импульсы ФЗУ. Управление работой флуоримет-ра, а также обработка результатов осуществлялись с помощью вычислительного комплекса 15. ВУМС-28-025, ЭВМ ДВК-3 или IBM PC/AT.

Для регистрации спектров КР был создан автоматизированный спектрометр на база монохроматора ДФС-12. Источником возбуждения служил импульсный лазер ЛТИ-701. Применение импульсного возбуждения и временной селекции снизило темповые шуш более чем на два порядка, что позволило не учитывать их при регистрации. Управление спектрометром осуществлялось прй помощи вычислительного комплекса ДВК-2М, к внешней магистрали' которого подключались: устройство управления, параллельный интерфейс и устройство последовательного обмена. Програмное обеспечение спектрометра состояло из программ управления и пакета программ "Спектр" для обработки результатов измерений. Спектрометр работал в двух режимах: многократного сканирования и накопления в каздой точке участка спектра.

Для регистрации ГКР использовали электрохимическую ячейку, которую включали в обычную схему потенциостатирования. Гидрозоли серебра готовили восстановлением металла из раствора его нитратной соли боргидридом натрия или тринатриевой солью лимонной кислоты. Серебряные островковые пленки на стеклянной подложке приготавливали напылением в вакууме.

Предложен метод обращения свёртки с использованием алгоритма Пауэлла. Известно, что в импульсной флуориметрии регистрируемые кривые затухания флуоресценции F(t) представляют свбртку функции затухания флуоресценции i(t), соответствующей бесконечно короткому импульсу возбуждения, временной .зависимости интенсивности импульса лампы L(t) и функции отклика системы регистрации R(t):

F(t)=flt)«L(t)*K(t) . Обозначив $(t)-L(t)*K(t), равенство можно представить в виде:

F(t)=J<{>(t) i(t-t* )dt' .

На основании оптимизационного алгоритма Пауэлла разработан метод определения параметров флуоресценции а, т. при ее мультиэкспо-ненциальном представлении:

i(t)= I aexpl- 4 ] ,

i = i i

гдэ a и т. - амплитуда и коэффициент затухания 1-й компоненты.

Для учёта спектральной зависимости функции отклика системы регистрации был применён метод, основанный на использовании эталонного соединения, икающего моноэкспоненциальное затухание флуоресценции. Измерение затухания флуоресценции эталона производится при тех же'условиях; что и исследуемого вещества. Качество аппроксимации оценивалось по значению статистического критерия Хг а также путем визуального обследования временной зависимости взвешенных» остатков и их автокорреляционной функции. Да основании модельных расчётов проведен анализ ошибок при разложении кривых затухания на 2, 3 и 4 экспоненты при наличии шумов. Погрешность в определении т менее 6% при 1< 3, при 1=4 погрешность в определении т достигает 20% и 50? для амплитуды. Показана возможность использования данного метода для определения индивидуальных спектральных и кинетических характеристик трбх и четырбх-кошонентных растворов красителей.

Для определения, параметров анизотропии затухания флуоресценции также использовался рационализированный алгоритм Пауэлла. Метод позволяет моделировать закон затухания анизотропии суммой трех экспонент.

Вторая глава посвящена анализу литературного и оригинального материала по электронным спектром поглощения и испускания производных тиамина. Основное внимание уделяется анализу исследований природы электронно-возбужденных состояний и люминесцентных свойств различных, ионных форм тиамина. Рассмотрены схема уровней энергии и пути внутримолекулярного мекхромофорного синг-лет-синглетного и триллет-тришштного переноса энергии электронного Еозбуздения. Показана определяющая роль специфических внутри- и межмолёкулярных взаимодействий с участием аминогруппы в процессах дезактивации электронного возбуждения тиамина.

В начале главы описаны объекты исследования. Основными объектами слугмли: тиамин (Т, рис.1); его кофермонтная форма ТДФ; ПК; тркптофзн; тиоминовые ферменты - тиамикиназз,'осуществляющая в метке фзсфэрилирование тиамина, и пируватдекарбоксилаза

(ДПК),' осуществляющая декарбоксилирование ПК. Кроме того, для решения различных задач исследования • использовались многие структурные аналоги тиамина, ПК и триптофана, а также имидазол, блуоресцентные - зонда 1 -анилинонафталин-8-сульфонат (AHG) и 2-

голуидинонафталин-6-сульфонат (ТНС), флуоресцентные метки: пири-хоксаль-5'-фосфат (ПАЛФ) и тиахромдифосфат (ТхДФ), одно- и двух-сриптофановые белки: нейро- и кардиотоксины.

Исследование спектров люминесценции тиамина в этаноле при . '7 К показало, что' спектральное положение полосы флуоресценции заствора тиамина (vMaKC=3°9°0 см"') хорошо коррелирует с полохе-гаем полосы флуоресценции раствора отдельно взятого пиримидино-юго компонента, а спектральное положение полосы фосфоресценции Ч.о«,„=22100 см-') - с положением спектра отдельно взятого тиа-

М8 КС

юлового компонента. На основании того, что спектр люминесценции ■иамина в этаноле не зависит от длины волны возбуждения и спектр юзбуждения люминесценции совпадает со спектром поглощения сдэ-:ан вывод о том, что в молекуле ®5мина имеет место внутримоле-улярный перенос энергии с тиазолового компонента на пиримидино-ый по синглетным уровням энергии и с пиришдинового на тиазоло-ый по триплепным уровням. Наличие внутршолекулярного синглет-инглетного переноса энергии з молекуле тиамина подтверждено из-ерениями степей: поляризации люминесценции.

На основании анализа полученных результатов и литературных анных о природе электронно-возбужденных состояний родственных оединений предложена схема электронно-возбужденных состояний иамина (рис.1}.

G целью выяснения влияния заместителей на электроную струк-

уру тиамина и пути деградации энергии электронного возбуждения его молекуле были исследованы спектры поглощения и спектралъ-з-кинетические характеристики низкотемпературной люминесценции пиртовых растворов ряда производных тиамина, отличающихся свои-биологическими свойствам. Замещение аминогруппы тиамина в '-положении на гидроксильную группу и водород, приводящее к из-знанию электронной' структуры пиримидинового компонента, а также зрушоние я-системы тиазолового кольца, приводит к значительному зменению спектрально-люминесцентных свойств раствора. Причем ¡местители в пиримидиновом цикле тиамина, главным образом, вли-зт на параметры флуоресценции, а заместители в тиазоловом ~ на фаметры фосфоресценции. •

V, С1Г1

40000 -

30000 -

20000 -

tir л ®/üh\

: "^сн^едон

Рис.1 Схема уровней энергии тиамина.

i

Показано, что фосфорелированные производные тиамина, имеющие важное биологическое значение, по энергетическим и кинетическим характеристикам возбужденных состояний хромофоров не отличаются от тиамина.

Для выяснения механизмов температурного тушения флуоресценции растворов производных тиамина исследовано влияние температуры на спектрально-кинетические характеристики тиамина и аналога его флуоресцирующего хромофора в поливиниловом спирте и стеклующихся спиртах. Kaie твордаэ, так и аидаие растворы тиамина характеризуются сильным температурным туюеииек. При этом при комнатной температуре пх флуорэецзкция нз обнаруживается. Установлено, что температурное тушение флуоресценции растворов тиамина явля-отся, глаыдйй образом, тушйкием первого рода. 'Рушение флуоресценции первого рода наблюдалось также при нагревании растворов 2-метил-4-ачино-5-зтоксиметштиришдина и отсутствовало у растворов 4'-дезамико-Т. Исходя из этого, высказано предположение, что температурное тушение флуоресценции тиамина связано с изменением знергии специфических внутри- и межмолекулярных взаимодействий с участием аминогруппы. Показано, что плавление спиртового раствора активирует процессы тутопия флуоресценция. Температурное гу-meiüio флусросценпхи растворов г-камжа второго рода вносит йамет-№ий вклад з уменьшение квантового выхода при текпорстурах

Тсетья глава сонер;:-;ит результаты расчетов колебательного спектра л силового ноля мономера ПК, интерпретацию спек гроз KP дамеро я четырех с§ форм, существующих в водных рзствор-х, а константы со акций гидратации к дассошташа. Рассмотрена лшшее-центные свойства водных и водно-солевых растворов ПК. На осяова-этих данных сбсугсдается структура ПК и ее <|5»зйко-хш,шескав евректериатики в различных растворителях.

Для интерпретации спектров KP ПК был проведен рассчет коле-Заний мономера с внутримолекулярной водородной связью (рис.2а). г £

М Ö Н,С ,0----П—0. о

3 V 4 J \ if \ //

.с—с .с—с ,с-с

// \ '/ \ // \

J> 0 0—И----Q CLL

ЧГ 3

Рис.2 Мономер с внутримолекулярной водородной связью (а) и циклический димер (б) ПК.

В табл.1 приведены экспериментальные и рассчитанные частоты нормальных колебаний мономера ПК, формы колебаний и распределение потенциальной энергии по формам. На основании сравнения спектров КР был сделан вывод о том, что интерпретация колебательных спектров и силовые поля димера (рис.20) и мономера ПК близки.

Таблица 1

Экспериментальные, расчетные частоты V (см-1) и форма колебаний

мономера ПК

по- Экспе- Расчет Форма колебаний и распределение

лоса римент потенциальной энергии, %

238,2 ï(CtC^C3 )35-у(СгС101 >31 -У(01С,02 )20

393,4 ■у (С3Сг03)42+у(0,0,0г)34

V .407 394,2 р(Сг03)67+р(С10г)31

548 518,3 у(С,СгС3 >31+У <0.0,0, ) 14+Q(C2C3 ) 13

613 609,7 у(сз020з)3(^р(0г0з1^)14+0(с10г)13

717,9 р(С,0г)70-р(Сг03)23

775 760,4 а{С1Сг)32+у{01С10г)21-у{СгС101 >10

Ув 978 972,3 0(0303)66-0(0,0, )17

1023,4 IpiCgCgHg )-Э(СгС3Н4))73+ [а(Н2С3Н3 )-а(1^0дН4)]16

У11 .1135,9 0(0,0, )36-Q(C,C2)17+p(C,0,H, )15 СЭ(0гСзНз )+Э(СгС3Н4)]-[а(НгС3Н3) +a(H2C3H4)]54-Q(C203)18

1214,0

1353,9 [р(сго3Нг)+^(сго3Нз)+^(С2С3Н4)] -lod^OgHa )+a(HgC3H4 )+а(Н3С3НЛ ) 188

1387,5 Р(С,0,^)48-0(0,0, )25

1402,8 [aiHgCgHg )-а(НгС3НЛ ) 184- WCgC^ )-Р(С2С3Н4))15

У1б 1424 1431,1 1а(НзС3НД )-а(НгС3Н3 )-а(1^03Н4 ) 1 +j>(C2C3H2)88

У17 1738 1736,0 Q(C203)72

1792 1805,8 0(0,02)67+^(020,0,)11

и19 2932 2931,0 [q(CgHg)+q(С3Н3)+q(С3НД))100

VZO 2978,5 Cq(C3Hj)-q(03H4)l100

3029 3028,9 [qCO^ )-Ч<СэНз )-q<C3H4 ) 199

У22 3462,9 q(0,H,)100

Интерпретация спектров КР водных растворов ПК (табл.2) дана

исходя из представления о существовании равновесия ей четырех Форм (см. схему; форму III называют пируватом). Для этого была

I III

СН3С0С00Н + НрС СНзСОСОО" + К,0 + н+

I

CH,C(CH)„C00H CILC(ОН)^СОО" t- н+

3 с <- 3 2

II

IV

пена зависимость спектров КР водннх растворов Г"' ст рН и кон-

центрации.

Таблица 2

Частоты у (см"1) и отнесение спектров КР форм ПК в водном растворе

полоса I II III IV

^„ 270 270

V' -420 420 412

420

550 568 543

1 645 L'J С С ÜJ

! 790 837 344 791

'^23 * 893

! "в 384 929 386

1 > 1024 1024

MtO 1110 сп- ^/■•Jkj

I ¿д. I 1180 11 55 1180 1183

полоса

1 Л у„ _*

db V13

"г б** V16

18

'19-

го

-1280

I3G1

' ! -120

f 74 0 -' 740 2930

3C03 3003

II

[II IV

1260' !

■ 1 SCO ! ;

1 40H| 1365 •

' 1 405 .

1446¡ i 426 ! i-1 SEO !

1715 2943

3003 3003

i 7 f 9 I

2930 j-29401

301 ni !

Примечание:

* V , V. , и \> - соответственно, полосы колебаний р(0Н), Ст'.^ -и 8(СОЯ; групяы С (ОН);,- ТИДраТИр0В81Ш0й ПК,

... Ч V,

с О I

дэнтные колебания группы ООО-,

г7 соответственно, симметричные и антиспмметричнко зз-

Для изучения влияния на излучательные электронно-колебательные переходы специфических взаимодействий были исследована спектры фосфоресценции заморокеннСго водного раствора ПК. В спе-

ктре излучения раствора проявляется отчетливая колебательная структура. Помимо полосы чисто электронного перехода в спектре имеются три полосы, обусловленные электронно-колебательными переходами. При возбуждении в максимуме спектра поглощения частоты максимумов полос спектра фосфоресценции равны: 1>оо=23890±10, уО1=22240±10, уО2=20630±10, уоз*189Э0 см-1. Найденные из этих данных колебательные частоты указывают на то, что в спектре фосфоресценции активным является только валентное колебание хромофорной группы (а-карбонил).

Спектральные характеристики фосфоресценции ПК ич>) не зависят от частоты возбуждающего света при ув>28000 см"1. При возбуждении на краю спектра поглощения <28000 см-1) наблюдается батохромное смещение спектра фосфоресценции и увеличение колебательной частоты V. Таким образом, люминофоры, поглощающие в более низкочастотной области спектра, имеют более низкочастотное излучение и более высокую частоту колебаний карбонильной группы. Гетерогенность излучающих центров обусловлена наличием в ' замороженной матрице мономерных и агрегированных молекул ПК, которые вследствие флуктуаций межмолекулярных взаимодействий распределены по энергиям чисто электронных переходов хромофоров.

В четвертой главе рассмотрен экспериментальный материал по модельным исследованиям комплексов содержащих кофермент, субстрат, ионны металлов и аминокислоты. Анализируются результаты исследований по влиянию ионов двухвалентных металлов на систему электронно-колебательных состояний производных тиамина и пирови-ноградной кислоты, а также межмолекулярному переносу анергии электронного возбуждения между ними. Рассмотрена структура данных молекул я их комплексов, адсорбированных на поверхности металла. Основное внимание уделяется проявлениям неферментативной ассоциации производных тиамина и пирувата и взаимодействию пиру-вата с триптофаном и имидазолом методами люминесценции и гигантского комбинационного рассеяния света (ГКР).

На основании изучения спектров КР и ГКР на золях серебра тиамина, его пиримидинового и тиазолового компонентов и ТДФ, а также литературных данных, сделана интерпретация колебательных спектров этих соединений.

Исследованы спектры ГКР пиримидинового компонента, тиамина и ТДФ, адсорбированных на серебряных электродах, при различных потенциалах. В спектрах ГКР, адсорбированного на поверхности

электродов, ТДФ (табл.3) но сравнению с Т происходит перераспределение интенсивностей полос. Эти различия спектров ТДФ и Т связываются с присутствием двух фосфатных групп, которые изменяют

- - Таблица 3

Частоты V (см ) и относительные интенсивности ..(в скобках) линий спектров КР водных растворов и ГКР адсорбированных на .^-электродах при различных потенциалах ТДФ и его комплекса с ПК

ТДФ ТДФ+ПК Тип колебаний*'

Водный раствор -0,65В -0,5В -0,3В -0,1В -0,5В -0,3В -0,1В

582 232 575 (Ю) 220 579 (13) 218 579 (24) 220 579 (20) 230 580 (19) 220 576 (16) 210 580 (16) Молекула- металл П(деф)

628 620 (10) 618 (36) 618 (40) 618 622 (28) 625 (44) 625 (75) Тз(деф)

672 665 (70) 662 (80) 665 (70) Тз(С-Б)

700 680 (30) 680 (30) 680 (60) 680 (70) 685 (85) 679 (117) 676 (135) Те««)

755 749 (100) 749 (100) 749 (100) 749 (100) 755 (100) 756 (100) 756 (100) П(дых)

1111 1112 (75) 1110 (12) 1110 (15) 1120 (9) 1120 (10) 1120 (10) ~СНг-

1235 1210 (100) 1208 (108) 1211 (90) 1217 (50) 1218 (115) 1220 (150) 1218 (120) ГТз(С-М) |П (С-Л)

1302 1290 (12) 1290 (10) 1290 (7) 1286 (10) 1290 (12) 1290 (10) П(деф)

1350 1352 (25) 1355 (25) 1356 (25) 1356 (25) 1355 (25) П(деф)

1393 1380 (33) 1378 (33) 1379 (45) 1375 (35) 1379 (30) 1402 (16) 1380 (33) 1401 (10) 1378 (37) ГЦдеф) СН3(деф)

1460 1450 (40) 1430 (10) 1430 (5) СН2(деф)

1516 1490 (16) 1490 (16) 1490 (10) 1495 (14) 1495 (15) Тз(С=С)

1553 1532 (16) 1532 (16) 1540 (25) 1545 (30) 1540 (25) |ГЦС=С) 1Тз(С=С) П(С=С)

1603 - 1590 (40) 1590 (59) 1598 (70) 1595 (40)

1633 1632 (200) 1630 (180) 1632 (140) 1633 (140) 1640 (150) 1650 (173) 1651 (1?5) П(С-С)

Примечание^'деф- деформационное,дох- дыхательное;(>^=514,5 нм).

распределение электронной плотности в тиазоловом (Тз) цикле, в результате чего существенную роль в адсорбции начинает играть атом серы. Оптимум адсорбции ТДФ по сравнению с Т сдвигается в сторону более положительных потенциалов. Обнаружены две области потенциала электрода, при которых имеют место изменения структурно комплекса ТДФ-металл. При потенциалах электрода, больших -0,4-*--0,5 В, изменения в адсорбционном слое обусловлены непосредственным взаимодействием с поверхностью атома серы Тз цикла. При ф>-0,2 В связывание молекул ТДФ с поверхностью металла обес- ' печивается дифосфатной группой. -

Для получения информации о взаимодействии ионов двухвалент ных металлов с ПК было изучено влияние биологически важных ионов На+, и Zn2+,Ha колебательную структуру спектров фосфоресценции их замороженных водных растворов.

Добавление в водный раствор ПК соли f.!gClg приводит к коротковолновому -сдвигу и изменению формы спектра фосфоресценции. При этом спектры излучения сильно зависят от частоты возбуждения. ' Очевидно, в водно-солевом растворе имеются излучающие центры с различными значения?® электронно-колебательных уровней энергии. Добавление в водный раствор ПК солей NaCl и ZnSO^ приводит к изменениям спектров фосфоресценции качественно таким же, как и добавление соли MgClg. Неоднородность излучающих центров объяснена на' основе представления о существовании в замороженном водном растворе мономерных, агрегированных к связанных с ионами металла молекул хромофоров. При этом молекулы ПК, сольватироваяные ионами, имеют большие значения энергии Тп п*-»30-перехода. Это означает, что ионы металла непосредственно взаимодействуют с неподе-ленной парой кислорода а-карбонильной группы ПК.

Анализ результатов по влиянию ионов металлов на спектральные характеристики растворов ПК позволил сделать вывод, что специфические взаимодействия этой молекулы с растворителем и ионами металлов могут уменьшать энергию химических связей (в том числе

При адсорбции ПК на поверхности боргидридного и нитратного гидрозолей усиливаются симметричные валентные колебания группы COO" (-1400 см-1), и валентные колебаний связи 0,-Cg (-840 см-1). Кроме того, при адсорбции на цитратном золе увеличена интенсивность полос (-940, 1030, 1360 и 1430 см"1) деформационных коле- ' баний метальной группы, что свидетельствует о взаимодействии

этой группы с поверхностью металла. Предложены две геометрии адсорбции ПК на золях, в которых взаимодействие с поверхностью осуществляется посредством карбоксильной группы.

Присутствие ПК существенно влияет на адсорбцию ТДФ на поверхности серебра (табл.3). При потенциале электрода -0,5 В ПК способствует увеличению интенсивности спектра и приводит к высокочастотному сдвигу полос, связанных с колебаниями тиазола и полносимметричным дыхательным колебанием пиримидинового (П) кольца. Повышение потенциала электрода от -0,5 до -0,1 В приводит к значительному росту сигнала КР. Увеличение интенсивности всего спектра, а так же относительной интенсивности полос Тз'кекпапзп1 та по отноненгс? к пиримидкновсму при повышении потенциала электрода указывает на появление в результате взаимодействия ТДФ и ПК избыточного отрицательного заряда в районе тиазолового кольца. Следовательно, взаимодействие проиходит через этот компонент. Значительное увеличение относительной интенсивности полос спектра ГКР, связанных с колебаниями"атома серы, при повышении потен-тала, указывает на то, что э-тот атом играет определяющую роль в адсорбции комплекса ТДФ-ПК. Роль атома серы в связывании молекул СДФ с поверхностью заметно увеличивается при положительных поте-шкалах и в присутствии ПК (табл.3).

Для получения информации о центрах связывания ПК с ТДФ исследовано влияние кофермента на спектры фосфоресценции субстрата. Обнаружено, что излучающие центры, имеющие связанные с ТДФ :ромофоря, фосфоресцируют в более коротковолновой области спект-)а. Кроме того, они имеют несколько меньшее значение частоты ко-[ебательной полосы. Это указывает на то, что ТДФ непосредственно ¡заимодействует с а-карбошлом ПК. Ассоциация с коферментом, но-:идимому, может приводить к ослаблению не только связи 0г=03, но ; связи С,-Од.

При добавлении к спиртовому раствору тиамина ПК наблюдается ушэние его флуоресценции, сопровождающееся появлением сенсибя-изирозанной фосфоресценции тушителей. Тушение флуоресценции ра-твора тиамина ПК не сопровождается сокращением ее длительности, оэтому сделан вывод, что-в основном состоянии мезду тиамином и К имеет место специфическое взаимодействие, приводящее к ассо-иации их молекул. ■ Исследование межмолекулярного переноса энер-ии между производными тиамина и ПК позволило установить, что ПК зеоциирует также с ТДФ и его тиазоловым компонентом и не ассо-

циирует с витаминонеактивными 4-окси-Т и тетрагидро-Т.

Для выяснения механизма тушения флуоресценции жидких растворов ПК были проведены исследования модельных систем, содержащих в качестве флуорофоров триптофан или другие соединения, отличающиеся спектральными параметрами и зарядом, а в качестве тушителей - ПК и еб производные.

Показано, что тушение флуоресценции водных растворов триптофана ПК является динамическим и обусловлено переносом энергии электронного возбуждения. Важную роль в тушении играют также, ионные взаимодействия между молекулами.

Исследовано влияние пирувата и его производных на флуорес-. ценцию традиционных белковых зондов АНС и ТНС. Из полученных ре-, зультатов следует, что тушение свечения растворов экие соодине-. ний ПК и этиловым эфиром ПК является тушением 1-го и 2-го рода.

Получен спектр ГКР имидазола, адсорбированного на поверхности островковых'пленок из ьтанольного раствора. Он существенно отличается относительной интенсивностью полос от спектра спонтанного КР и спектра ГКР на серебряных электродах. Добавление ПК в спиртовой раствор имидазола приводит к значительному увелнче-. нша интенсивности полос ГКР. Б наибольшей степени это относится . к полосе 933 см-1 плоских деформационных колебаний кольца, а таккэ к полосе валентных колебаний "молекула-металл", для которой характерно не только увеличение интенсивности, но и высокочастотный сдвиг. 226 —* 250 см"1. Данные изменения показывают, что ПК способствует более эффективной адсорбции имидазола на серебряной поверхности. .

Пятая глава посвящена анализу закономерностей изменения структуры и внутримолекулярной подвижности, белков, проявляющейся через флуоресценцию триптофановых хромофоров. Рассмотрены результаты исследований конформационных состояний триптофана в водных растворах. Определены энергии активации температурных процессов тушения конформэров триптофана. Дан анализ кинетики затухания интенсивности и анизотропии собственной флуоресценции одно- и двухтриптофановых белков на примере нейро- и кардиоток-синов.

Исследована температурная зависимость кинетики флуоресценции триптофана б В20. Функция затухания его свечения описывается суммой двух экспонент с т =5,50 и т2=1,60 не, отнесенных к излучению двух конформеров. При увеличений температуры происходит

практически одинаковое относительное уменьшение т4 и т2, однако

вклад компоненты с меньшим т при этом увеличивается. Вычисленные на основаниии исследования зависимостей т^КТ) и т2=1(Т) значения энергии активации температурах процессов тушения" каждого из конформэров триптофана Е* и Е7' имеют близкие значении. Зн> указывает нэ то, что тушение флуоресценции конформеров имеет одинаковую физическую природу. ®Гаким процессом является внутримолекулярный перенос заряда с участием молекул растворителя.

Кка-этические исследования флуоресценции токсинов: иолрогок-синоа I, II и III (соответственно НТ-1, 1ГГ-11 и НГ-111) и карди-отоксинов II и III (КТ-И и КТ-Ш )■ показали, что затухание их ^ррг/пг^а^иаг^р^ги тополю аппроксимируется с^р^мой ивух экспонент. На основании отсутствия батохромного сдвига спектров при краевом возбуждении (305 нм) и нагревании растворов до 60°С сделан вывод о том, что'' процессы диполь-дипольной релаксации протекают за времена, более короткие, чем длительность флуоресценции и причиной неэкспоненциальности затухания флуоресценции токсинов является наличие нескольких конформационных состояний триптофанилов

1,- ; ! ^.'00.':»^ -'ОМА Ьа 1иЫч.Ы-т

деПстзняг.:и ^рог.^Форов о окружением - полярными группам; Олизрас-пл а».л«окисж>тннх остатков к молоку л роды. Подтверяа^ни-

'_>гп'о скупит неизменность значения т :л т, по спектру ^'¡уо-тспвнгьт,, на'люда^мп^ "ля олчоуриш-офа«' «к* токсинов ШТ-ТП, КТ-ГХ :: К?~Ш). Ка ооьэзакки расчета вводов хромофоров ь про-делах веой по..:сс» испускания для КТ-Ш онрздолэнн яндквкдуаль-1Шо спектрн двух конформеров триптофана.

У двухтриптофановых нейротоксинов 'I и II на коротковолновом л то; шсволновом краях спектрои кнЗдпдавтся зависимость югич-тнл аппроксимации, а также значений т и т от л- . Для ¡ш Волков

1 1.2 '¿VI

затухание флуоресценции, возможно, описывается суммой трех и более экспонент, имеющих близкие значения т, и их разделение при обращении свертки невозможно.

Детально проанализированы литературные дгзшьм ко флуор-'с -рентным исследованиям внутримолекулярной подвижное?« а белках. Особое внимание при этом уделено влиянию подвижности на споктря-ныще зависимости степени поляризации Флуоресценции и ки^лику затухания анизотропии свечения белковых хромофоров. Приведены результаты собстве1ШЫХ исследований затухания анизотропии флуо-зесценцки КТ-Ш. Математический анализ кривой'затухания анизот-

рогаш флуоресценции показал,' что для него аппроксимация является наилучшей, если представлять затухание анизотропии суммой двух экспонент:

гЮ-р.ехр^ -¡у + ргехр[~ -Щ ,

где ©4=2,4, ©г=0,20 не, ^=0,068, 0г=О,182. Значение ©4 отнесено к броуновскому вращению всей белковой макромолекулы, а ва- к характеристике внутримолекулярной динамики триптофанилов. Стерический угол внутреннего вращения имеет значение ф=26°, что указывает на достаточно большую свободу движений триптофанилов. Наличие субнаносекундной подвижности трипто-фанидов способствует их быстрой диполь-дипольно'й релаксации, следующей после акта возбуждения.

■ В шестой главе представлены экспериментальные данные по исследованиям собственной флуоресценции тиаминкиназы и ее комплексов с субстратами, кофакторами, эффекторами, а также с помощью флуоресцентных зондов и меток. Определена локализация триптофа-новых хромофоров в белке. Классифицированы три типа триптофанилов, различающихся длительностью, положением спектра флуоресценции и подвижностью. Анализируются конформационно-динамические изменения молекулы бежа при связывании с тиамином, аденозин-3-фосфатом (АТФ), пируватом и ионами металлов. Определены типы участков связывания с молекулой фермента и их число. Обсуждаются результаты по организации структуры активного центра тиаминкиназы и механизмам ферментативной реакции фосфорилирования тиамина. Представлена модель активного центра тиаминкиназы.

Спектрально-люминесцентные параметры тиаминкиназы приведены в табл.4. Коротковолновое положение максимума спектра собственной флуоресценции (Хыакс=328 нм) а также результаты селективного тушения подтверждают, что излучающие триптофанилы локализованы внутри белковой глобулы в гидрофобном окружении. Они недоступны отрицательно заряженным ионам I", мало доступны положительно заряженным ионам Сз+ и доступны нейтральным молекулам акриламида.

Для'тиаминкиназы при комнатной и более низкой температурах, вероятно, реализуется условие ти>ТфЛ. Этот вывод вытекает из результатов исследования температурной зависимости спектров флуоресценции раствора белка.

23

Таблица 4

Спектрально-кинетические параметры флуоресценции тиаминкиназы

293 К 77 К

Г'Н , макс л ? нм Д\/2 нм В т, не ^макс НМ ДХ1/2 км Т, НС

?,з' 32770,5 5271 0,1370,01 2,4570,05 31770,5 4511 5,370,1

7,3 32870,5 5371 0,1470,01 2,5570,05 31770,5 4571 -

7.3* 335+0,5 5671 0,0870,01 1,5470,03 ... - -

7,33 3^470,5 5971 0,1770,01 2,9270,05 32070,5 4871 -

3,5 332+0,5 5771 0,1270,01 2,2070,05 - - -

11.0 334*0,5 5871 0,1170,01 1,9070,05 - -

Примечание:'>^=280 нм; гТ=328 К; Зв 6 моль/л мочевине.

Для получения дополнительной информации о свойствах отдельных излучающих центров тиаминкиназы была исследована спектральная зависимость кинетики затухания флуоресценции. На основании полученных результатов излучающие триптофанилы разделены на три хромофорный группы, имеющие рвпяачяо«» положение максимумов спск-?роз флуоресценции (Х^-ЗЗО. >^,/=320 км) и дмя-ельностя

{соответственно " т,-2/'6±0.30, ^ = 1,10±0,П не).

Гетерогенное'». трютто^знклоь обуславливает спектральные записи-¡»а.":»«'. поляризации, зжтзльностк и батохрожый сдвиг споктрг. флуоресценции.

Пс.^лвдова-шв ко'.'плогссв тизмишашазы с ТКС гтокеззло, что Т^гС б коь'.л аэкс;- с т^гминкинагой имеет корсткозолкозое полскенле спектра флуоресценции (\иакс=443 нм).''Зто свидетельствует о его -сгп^го-'ГТ; "3 Г'ир:<"ой;см воле учасике мпкролэкула.

•'^■.•..¡С'Ллгно ог:сутст;;нс н-нос^кундкой с-иаксеиЕ: хромофоров, Глазной причиной незкепоненциэльнбети законов затухания свечения [хлуорэецэции ТКС является гетерогенность центров связывания белее. Математический анализ кривых затухания ясказся, что о*пт го-

шшрс-кокупру&тся пгп представлении закона затухания флуоре-¡аандак суммой двух экспонент с различными значениями длительного;: т -'.1,2±0,41 и "г-2,3±0,12 не. Два компонента затухания ¡луоресценции обусловлена свечением двух различных центров. Хро-:офоры, имеющие большую длительность, расположены в более гадро-обных участках бедка. Их вклад в флуоресценцию связанного с беком ТИС составляет 92% при х. =430 нм. Высокие значения степени

поляризации (Р=0,27), постоянные в пределах всей полосы флуоресценции, свидетельствуют о жесткости окружения зонда, имеющего большую длительность, и отсутствии переноса энергии возбувдения между ними. •

С целью получения информации о влиянии субстратов (АТФ и тиамин) и кофакторов (ионы двухвалентных металлов) на структуру и динамику тиаминкиназы было, исследовано их влияние на параметры собственной флуоресценции фермента. Обнаружено, что связывание тиамина с тиаминкиназой сопровождается уменьшением интенсивности и незначительным длинноволновым сдвигом спектра еб триптофановой флуоресценции. При этом заметных изменений степени поляризации флуоресценции не наблюдалось. Качественна такие же изменения параметров флуоресценции имели месФо при замене тиамина на его фосфорные эфиры. Взаимодействие фермента с АТФ приводит к принципиально иным спектральным изменениям флуоресценции. В этом случае наблюдалось коротковолновое смещение спектра излучения триптофанилов. На основании полученных результатов и дополнительных исследований модельных систем сделан вывод, что тиамин связывается в активном центре фермента за счет пиримидинового, а АТФ - за счет аденинового циклов, и в результате этого происходят локальные конформационные изменения в молекуле белка.

Исследование влияния ионов М^*, Мпг+ и Саг+ на параметры люминесценции тиаминкиназы выявило корреляцию наблюдаемых изменений спектров и интенсивности флуоресценции фермента и его активности. Показано,. что ионы металла участвуют в связывании АТФ с ферментом. .

Рассмотрено влияние пирувата и его структурных аналогов фосфоенол- и этилпирувата на флуоресцентные свойства тиаминкиназы. Обнаружено двухфазное смещение спектра флуоресценции от концентрации пирувата в растворе (рис.3). При концентрациях пирувата до 6- Ю-4 М прослеживается длинноволновый, а при более высоких - коротковолновый сдвиг спектра. Батохромное смещение спектра сопровождается уменьшением интенсивности, длительнсти и степени поляризации (особенно при регистрации на длинноволновом крае) флуоресценции. Эти результаты согласуются с данными биохимических исследований (рис.3), выявивших два (ингибирующий и ак-тквирущуй) центры связывания пирувата на тиамшшшазе. Сделан вывод, что регуляция активности тиамикиназной реакции отруватом может осуществляться посредством изменения внутримолекулярной.

подвижности белка. Корреляция между биохимическим действием и флуоресцентными свойствами наблюдалось также при использовании структурных аналогов пирувата.

0.02 -

1-г

20 С. мыоль/л

Рис.3 Зависимость эффективности тушения V? (1), положения спектра флуоресценции (1') и удельной ферментативной активности

(2) тиаминкиназы от концентрации пирувата моль/л, ^=296, Хфд=340 нм). '

(С.

0,8-10"

Для более детального изучения структурных особенностей тиаминкиназы исследовано влияние субстратов, кофакторов и оФ1«кто-ров на параметры флуоресценции комплексов белка с флуоресцирующей меткой ПАЛФ и флуоресцентными зондами ТНС и А НС. Обнаружены два центра связывания ПАЛФ с белком, отлкчогаиося спектральными и кинетическими параметрами флуоресценции. Локализация метки в белке обеспечивает гомоперенос унерпш электронного возбуждении, а также эффективный гетероперенос с трштофашшэв третьего типа, находящихся в наиболее гидрофобном окружении. Кроме того, один из центров е9 связывания находится вблизи центра аллостернческой регуляции, так как его флуоресценция тушится гшруватом. Пируват

также эффективно тушит, главным образом за счет тушения 1-го рода, флуоресценцию связанного с тиаминкиназой ТНС, что указывает на их конкуренцию за место связывания с гидрофобной областью белка. Анализ влияния субстратов на флуоресценцию комплекса белка с флуоресцирующими молекулами показал, что тиамин занимает более гидрофобное место в активном центре, чем АТФ, Причем при связывании АТФ с ферментом гидрофобность центра сорбции тиамина повышается. Этому способствуют также ионы металлов. На основании анализа совокупности проведенных исследований предложена модель организации активного центра тиаминкиназы (рис.4).

В седьмой главе-проанализированы результаты спектроскопических исследований пируватдекарбоксилазы. Представлены параметры собственной флуоресценции и спонтанного КР растворов фермента. Рассмотрены результаты исследований флуоресценции зонда ТНС и метки тиахромдифосфата, связанных с ЩЩ в активном центра. Предложена модель организации активного центра фермента, в которой пирувату отводится важная роль фиксации ,ТДФ на белке.

Исследования спектрально-кинетических и поляризационных характеристик флуоресценции ПДК (табл.5) в ano- (без кофермента ТДФ) и холоформе (в комплексе с ТДФ) показали, что излучающие триптофанилы локализованы в относительно гидрофобном, малодоступном воде окружении. Вместе с тем существует заметная гетерогенность микроокружения хромофоров, которая определяет сложный характер кривых высвечивания флуоресценции белков. Замечено, что холо-ГЩК (ХПДК) имеет более жесткую (менее подвижную), чем опо-ЦЦК (АЛДК) структуру, для которой обнаруживается наносекундная динамика.

Таблица 5

Параметры собственной флуоресценции ХГЩК и АЛДК при концентрации 1,5-10"6 моль/л (X =296, X. =330 нм)

Комплекс \дакс' ^ р VW нс WA3

ХВДК 331,0 0,23 6,71/3,81/0,48 0,11/0,37/0,52

ХГЩК п 331,5 0,25 - -

А1Ш 332,5 0,22 5,93/2,88/0,46 0,21/0,30/0,49

А1ЩК п 336,0 0,24 - -

Тримечание:1 ^=305 км.

Получении спектры КР * ГКР нативной ХПДК. В спектре КР 5елка наиболее интенсивными являются полосы колебаний амид-1 [1635 см-1) и амид-Ш (1285 см"1) полипептидной цепи, а также сарбоксильных групп (1395 см-1) аминокислотных остатков. Прояв-шются также полосы, принадлежащие колебаниям ароматических ами-гакислотных остатков (триптофана, тирозина и фенил ал анина) и Б-Б ;вязи. Анализ спектра КР ХГЩК позволил заключить, что структура (той молекулы в высокой степета а-спиральна за счет большого мела дасульфидных связей.

В. спектре ГКР ХПДК, адсорбированной на серебряном электроде :е обнаруживаются полосы ароматических аминокислот, что езидете-ъствует об их удаленности от поверхности и локализации в инте-ьерз белковой глобулы. Анализ спектра ГКР при потенциалах элек-рода -0,65^-0,15 В показал, что вблизи мест сорбции белка на оверхности находится ТДФ. Его ориентация в молекуле белка тако- -а, что при потенциале поверхности -0,65 В вблизи еВ находится иримидиновый компонент (в том числе аминогруппа), а при более

положительных потенциалах к поверхности приближается атом серы тиазолового цикла. Сделан вывод о высокой чувствительности геометрии расположения ТДФ в активном центре от заряда микроокружения и неучастии атома серы и аминогруппы кофермента в связывании с ферментом. .

Для получения дополнительной информации о микроокружении активного центра ПДК были проведены исследования с использованием флуоресцентного зонда ТНС (табл.6). Исходя из полученных спектрально-кинетических и поляризационных параметров флуоресценции комплексов ГЩК+ТНС и влияния на них ТДФ и ПК сделан вывод, что зонд имеет с ХПДК два, а с А1ЩК - три центра связывания. Причем в последнем случае два, а первом один, находятся в активном центре фермента. Коротковолновое положение спектра флуоресценции и высокие значения степени поляризации свидетельствуют о том, что в целом молекула зонда достаточно жестко фиксируется на белке, хотя все центры адсорбции в этом плане неоднозначны. Вешние пи-рувата соместно с ионами fig2+ на флуоресценцию комплекса АПДК+ ТНС показало, что пируват имеет независимый от ТДФ центр связывания в активном центре фермента. Причем микроокружение этой области более гидрофобное и в то же время более подвижное, чем ■ микроокруженив области связывания ТДФ.

Таблица 6

Параметры флуоресценции комплексов ХПДК и АПДК с зондом ТНС, пируватом, Mg2* и ТДФ в максимуме спектра излучения при концентрации ХПДК и АПДК - 1.5-10"6, ТНС- 2-Ю-5, ТДФ- 1,5-Ю"5, Mg2+ -1-Ю"3, пирувата (Пир) - 1-Ю"2 моль/л

Комплекс хв,нм Р А/Аг

ХДДК+ТНС 350 427,8 0,32/0,301' 12,4/5,2 0,45/0,55

390 432,6

АЩК+ТНС 350 434,2 0,33 11,3/4,0 0,73/0,27

АЩК+Mg2 *+ТНС 350 433,8 0,33 10,9/4,3 0,69/0,31

390 436,1

АПДК+М^+Пир+ТНС 350 434,7 0,35 10,0/3,7 0,71/0,29

390 435,8

Примечание:1'концентрация ТНС- 6-Ю-5 моль/л.

Для изучения активного центра ПДК информативными являются флуоресцентные характеристики связанной с белком метки тиахром-дкфосфата (ТхДФ). ТхДФ является продуктом окисления ТДФ, содер-

кит те же активные группировки (за исключением Ш2), что и кофе-рмент, является п-сопряженной хорошо флуоресцирующей молекулой. Обнаружено, что ТхДФ, связанный с белком имеет моноэкспоненциальное затухание со временем 1,8 не, анологичннм, как в" водном растворе и низкие значения степени поляризации (Р=0,12) флуоресценции. Исходя из этого сделан вывод, что ТхДФ связан в активном центре ПДК только дифосфатной группой, и в отличие от ТДФ атом азота пиримидинового цикла в связывании не участвует, хотя имеет аналогичную электронную плотность. При добавлении пирувата в -раствор, содержащий комплексы АГЩК+ТхДФ, зарегистрировано сильное тушение 1-го рода флуоресценции метки, указывающее на близость места сорбции пирувата и я-сопряжэшюго цикла метки. Базируясь на вытекающих из экспериментальных данных выводах о структуре и свойствах активного центра ПДК предложена новая модель эго организации (рис.5).

Рис.5 Модель организации активного центра пируват декарбоксилазы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. На основании изучения спектрально-кинетических' и поляризационных характеристик люминесценции растворов производных тиамина , их пиримидинового и тиазолового компонентов и гшрувата в различных растворителях -и в замороженных водных растворах при различных рН определены излучательные характеристики ионных форм производных тиамина и ПК, построена диаграмма электронно-возбужденных состояний тиамина: Показано, что в его молекулах имеет место перенос энергии электронного возбуждения- с тиазолового компонента на пиримидиновый по синглетным, а в обратном направлении по триплетным уровням. В процессах температурного и концентрационного тушения люминесценции производных тиамина и пиримидина решающая роль принадлежит специфическим межмолекулярным взаимодействиям с участием аминогруппы.

2. Экспериментально выявленные закономерности проявления специфических взаимодействий производных тиамина и пировиноград-ной кислоты (ПК) с ионами двухвалентных металлов в излучательных свойствах их растворов позволили установить, что эффективным ■ центром связывания у производных тиамина с ионами двухвалентных металлов является атом азота в Т;'-положении, а у пирувата' а-карбонил. В спиртовых и водных растворах при 77 К тиамин и биологически активные.его производные благодаря ионным взаимодействиям, тиазолового компонента тиамина и карбоксильной группы ПК образуют в основном состоянии комплекс с пировиноградной кислотой. При этом происходит синглет-синглетный перенос энергии с молекул витамина на молекулы пирувата со 100$ эффективностью. Определены кинетические параметры этого переноса.

3. В результате комплексообразования значительные изменения испытывает силовое поле а-карбонила. Его учет дал возможность рассчитать колебательные частоты пировиноградной кислоты, на основании чего сделано отнесение полос спектров КР шести форм ПК, существующих в растворах, по форме колебаний.'Анализ зависимости спектров КР ПК 'от рН позволил определить константы реакции диссоциации и Гидратации.

4. Обнаружено гигантское усиление КР света адсорбированного на гидрозолях и электродах ТДФ. Важную роль в его усилении играют короткодействующие "химические" механизмы усиления, определяющие высокую чувствительность интенсивности полос ГКР к наличию контакта молекулы с металлом и геометрии адсорбции.. На осно-

, 31

вании зависимости спектров ГКР. ТДФ от' потенциала электрода установлено, что геометрия адсорбции меняется с изменением потонциа-. ла. При низких потенциалах -0,65 В адсорбция происходит преимущественно через аминогруппу, и гетероатомы пиримидинового компонента; при -0,4 В - посредством атома серн и при потенциалах Полое -0,2 В - дмфосфэтной группой.

5. Усиление КР ТДФ ка серебряных электродах значительно возрастает в присутствии ггирувата, который адсорбируется на гидрозолях посредством карбоксильной vpyimu. Ою особенно харяктер-но для полос, обусловленных колебаниями тиазолового компонента при положительных потенциалах. Сделан вывод, что положительно заряженная поверхность ичдуцируо? взаимодействие'мевду тиазоло-вым компонентом ТДФ и пируватом, а ассоциация обусловлена взаимодействием мевду карбоксильной группой пирувата и четвертичным атомом азота ТДФ.

6. Методом спектроскопии ГКР показано, что адсорбированный на поверхности островковых серебряных пленок пируват и ПК ассоциируют с имидазолом. На основании анализа характера изменения относительной интенсивности полос спектра ГКР имидазоло при добавлении пирувата и ПК предложона структура комплексов имидазол-гофуза? и имидэзол-ÍIK, адсорбированных на серебряной поверхности.

7. Спектрально-кинетическими методами показано существование конформеров трит-офзновых остатков цэйро- и нардиотоксинов, равновесие мокду которыми изменяется при изменении температуры раствора. Установлено, что тушение штруватом флуоресценции триптофана в водных растворах к белках происходит вследствие индуктивно-резонансного переноса энергии с флуорофора на туштель. Используя пируват в качестве тушителя, изучена локалпагдтя к зарядовое окружение трипто^знилов в белках. Показана их гетерогенность, проявляющаяся в различии подвижности, длительности свечения и энергии взаимодействия с окружением.

8. На основании исследования собственной флуоресценции три-пто-Юиилов и с использованием флуоресцентного зонда ТИС и флуоресцентной мотки ШМ установлено, что при взаимодействии тиа-минкиногы с тиамином и АТФ происходят локальные коНформацйииные перестройки ф-чрмонта, которые усиливаются при внесении ионов двухвалентных металлов. При этом взаимодействие с тиамином увеличиваем/а с АТФ - уменьшает подвижность.белковой структуры.

9. По влиянию пирувата и других аллостерических эффекторов на флуоресцентные характеристики комплексов тиаминкиназы с флуоресцентными зондами и метками показано, что связывание эффекторов в аллостерических центрах приводит к изменению спонтанной подвижности и локальным изменениям структуры фермента. Предложена структура организации активного центра тиаминкиназы.

10. На основе изучения спектрально-кинетических и поляризационных характеристик триптофановой флуоресценции, спектров KP и ГКР пируватдекарбоксилазы установлено, что молекула белка имеет преимущественно а-спиральную структуру и плотную упаковку за счет S-S связей; ароматические аминокислотные остатки локализованы вдали от поверхности в гидрофобных окружениях. Обнаружено, что конформация ТДФ в активном центре пируватдекарбоксилазы чувствительна к заряду микроокружения. При повышении потенциала поверхности, на которой адсорбированы молекулы белка, от -0,65 В до -0,15 В тиазоловый компонент ТДФ приближается к поверхности.

11. Флуоресцентные исследования пируватдекарбоксилазы с помощью зонда THG и метки тиахромдифосфата позволили установить, что активный центр фермента представляет собой гидрофобную полость с малоподвижным микроокружением, в которой размещаются ТДФ, пируват и ионы двухвалентных металлов. Предложена структура активного центра. При этом пирувату отводится важная роль в связывании ТДФ с белком посредством ионов металлов.

12. Создана высокочувствительная автоматизированная спектрально-кинетическая аппаратура. На основе алгоритма Пауэлла разработан аффективный, устойчивый к шумам метод разложения экспериментальных сверток кривых затухания флуоресценции для импульсной флуорометрии при аппроксимации законов затухания любым числом экспонент.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Кивач Л.Н., Попечиц.В.И.,. Саржевский A.M. Влияние межмолекулярных взаимодействий на спектральную зависимость анизотропии испускания растворов производных антрацена при изменении концентрации/ /ЖПС.- 1976.- Т.24, № Б.- С.822-828.

2. Блинов Г.Е., Гайсенок В.А., Кивач Л.Н. и др. Проявление внутримолекулярных колебаний и релаксационных эффектов в спектральной зависимости степени поляризации//Вестник БГУ, сер.1.-1977.- Л» 1.

3. GachKo G.A., KiYach L.N., Komjak A.I. et all. Electronic exl-

ted states and luminescence properties of thiamine and its derivatives/ZAbstr. XIII European Congress of molecular spectroscopy. Wrozlaw, 1977.- P.420.

4. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Комяк А.И. и др. Электронная структура и поляризация" люминесценции Производных пиримидина // Тез.докл. XXIV Всесоюзн.сов. по люминесценции. Минск, 1977.

- С.77. •

5. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Комяк A.M. и др. Электронная структура и поляризация люминесценции производных пиримидина // Изв.АН СССР. Сер.физическая.- 1978.- Т.42,-J* 3,- С.645- 649.

6. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич А.А.и др. О природе полос поглощения аминопиримидинов // Дакл.АН БССР, 1979.- Т.23, 5 10.- С.925-928.

7. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Островский Ю.М. Различия электронной структуры китаминоактивннх и неактивных производных тиамина//Тез.докл.Всесоюзн.биохим.съезда. 4.11. Москва, 1979.- С.28-29.

8. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич Ü.A. и др. Исследование внутримолекулярного переноса заряда, и энергии в производных тиамина // Тез.докл.XXVI Всесошн.соь.люминесценция. Самарканд, 1979.- С.94.

9. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. Люминесцентные характеристики некоторых производных тиамина//Докл.АН БСОР.-1931.- Т.25, # Э." С.852-855.

0. Арцукевич А.Н., Кивач Л.Н., Гачко Г.Л., и др. Исследование комплексов производных тишина и u-кетокислот с ионами двухвалентных металлов и аминокислотами //Тр.IV бйохим.конф. Прибалтийских республик, Белоруссии и Ленинграда. Риги; зи-

■ нагло, 1331С. 187-183.

1. Акимов А.К., Ворспай E.G., Ге-mo Г.А., Кивач. л.11. я др. Вн-

■ сокочувствителышй метод измерения квантового выхода и спектров флуоресценции растворов при наличии фосфоресценции // АПС,- 1932,- Т.36, .» 4.- С.692.

2. Гачко Г.А., Кивач Л.Н. Излучагилыке сьойства аминониркма-Д!ШОВ//1ез.докд.Всесоюзн. биофаз. съезда. 4.1. Москва, 'Т€2.

- С.7.

3. Гачко Г.А., Кизач Л.К., Маскевич С,А. и др. Температурное и--концентрационное тушение люминесценции тфимидинов/УТез.локл. Всесоюзн.сов. по молекул.люминесценции. Харьков, 1982.- С.62.

14. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Коява В.Т. и др. Исследование низкотемпературной люминесценции производных тиамина в водных растворах//ЖПС.- 1983.- Т.38, Jé 3.- С.396-402.

15. Гачко Г.А., Кивач Л.Н.,' Маскевич С.А. и др. Изучение гидратации пировиноградной кислоты методом комбинационного рас-сеяшя//Докл.АН БССР.- 1983,- Т.27, Jé 10.-. С.946-949.

16. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. Температурное тушение флуоресценции растворов тиамина //ЖПС.- 1904.- Т.41, №6.- С.933-937.

17. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. Изучение спектров комбинационного рассеяния водных растворов пировиноградной кислоты//ЖПС.- 1984.- Т.41, № 5.- С.757-763.

18. Степуро И.И., Заводник И.Б., Мороз А.Р., Островский Ю.М., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Структура и люминесцентные свойства пировиноградной-кислоты в водных растворах-// Журн. физ.хим.- 1984.- Т.58, № 4.- С.929-932.

19. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. О спектральной неоднородности излучающих центров водных растворов производных тиамнна//Ш1С.- 1984.- Т.40, Je 5.- С.851-853.

20. Воронич В.Е., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Особенности межмолекулярного переноса энергии электронного возбуждения между тиамином и пировиноградной кислотой в растворах // ЖПС.-1984.- Т.41, № 1.- С.159-162.

21. Воронич В.Е., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Влияние ионов

р i р i

Мл и Zn " на низкотемпературную люминесценцию водно-солевых растворов производных тиамина //Докл.АН БССР.- 1985.-Т.29, № 6.- С.561-564.

22. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. Влияние ионов двухвалентных металлов на фосфоресценцию растворов пировиноградной КИСЛ0ТЫ//ЖПС.-1985.- Т.42, №2.- С.282-285.

23. Воронич В.Е., Гачко Г.А., Маскевич С.А. Стабилизация мощности излучения лазера ЛТИ-701//ПТЭ.- 1986, Jé 5.- С.167-168.

24. Гачко Г-А., Зыбельт В.К., Кивач Л.Н. и др. Автоматизированный спектрометр с временным разрешением//Тез.докл.Всесоюзн. семинара "Физика быстропротекающих плазменных процессов". Гродно, 1986.- С.61-62.

25. Гачко Г.А., Быбельт В.К., Кивач Л.Н. и др. Автоматизированный импульсный спектрофлуориметр // ЖПС.- 1987.- Т.47, # 2.-С.335-339.

26. Гачко Г.А., Зубко И.Л.; Зыбельт В.К., Кивач Л.Н. и др. Тушение флуоресценции водных растворов триптофана пирупптом // ЖПС.- 1987.- Т.4?, » 5.- с". 748-753.

37. Гачко Г.А., Зыбельт В.К., Кивач Л.Н. и др. Автоматиированный спектрометр комбинационного рассеяния 7/ ЖПС.- 1983.- Т.49, № 4- С.692-695.

28. Гачко Г.А.,. Кивач Л.Н., Маскевич' С.А. и др. Исследование специфических взаимодействий в модельных системах, содержащих пируват//Тез.докд.ХХ Всесоюзн.съезда по спектроскопии.-Киев, 1988.- 4.1.- С.361.

29. Черникевич И.П., Гриценко O.A., Кивач Л.Н. и др. Физикохи-мические характеристики тиаминкиназы дрокжсй//1сз. .докл. IV •Всесоюзн.конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами. Ташкент, 1988.- С.279.

Ю. Маскевич A.A., Маскевич С.А., Кивач Л.Н. и др. Фотофизические процессы и внутримолекулярная, подвижность тиаминкиназы из пивных дрожжей//Тез.докл. IV Всесоюзн. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами, 19-22 сентября, 1988 г.- Ташкент, 1988»- С.109-110.

31. Воронин В.Е.. Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Автоматизированный спектрофлуориметр с лазерным возбуждение!,', з стандарте КАШК//Весц1 АН БССР.- 1989,- Ji 6.- С.60-63.

32. Башарин С.К., Маскевич A.A., Маскевич С.А. Гачко Г.А., Кивач Л.Н. Метод обработки результатов кинетических исследований флуоресценции //Тез.докл. Всесоюзн.сов. по молекул, люминесценции, 2-6 октября 1989 г.- Караганда, 1939.- С.179.

33. Башарин С.К., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Разложение свертки кривых затухания флуоресценции// ЖПС.- 1989.- Т.52, >5 1.-С.48-52.

34. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич O.A., и др. Структура, спектра KP и ГКР пирувата натрия //Тез. докл. XII Всесоюзн. совещ.примен.колеб.спектров исслед.неорг.коорд. соед. Минск, 1989.- С.95.

35. Кивач Л.Н., Ксенофштоь М.А., Подткнченко С.Г. и др. Колебательный спектр л силовое ноле мономера пировиногрядной ХИСЛОТН//ДОКЛ.АН БССР,- 133;).- Т.33, * 4.- С. 321-324,

ИЗ. Маскевич С.А., Масю-нич A.A., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Применение методов кинетической флуориметрии для исследования динамики и структуру токсинов // Весц! АН БССР.- 1989.-

Jfe 6.- С.56-60. •

37. Воронин В.Е., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Спектроскопические исследования металлорганических комплексов производных тиамина//Тез.докл.Х11'Всесоюзн.сов. "Применение колебательных спектров к исследованию неорганических и координационных соединений". Минск, 1989.- С. 138.

38. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. Исследования электронно-возбужденных состояний тиамина и их применение для изучения модельных систем // ГОС.- 1989.- Т.51, # 1.-С. 153.

39. Черникевич И.П., Маскевич А.А., Наумов А.В., Маскевич С.А. Кивач Л.Н. и др. Физико-химические свойства тиаминкиназы дрожжей saccharomyces carlabergensls // Укр.биохим.журн.-

1989.-' Т.61, # 5.- С.34-42. ' '

41. Гачко Г.А., Кивач Л.Н,, Маскевич С.А. и др. Спектральная неоднородность'излучающих центров замороженных водных растворов ПИрувата/УКЛС.- 1990. -Т.52, J6 4.- С.576-581.

42. Маскевич А.А., Башарин С.К., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. и др. Анализ затухания флуоресценции при наличии непрерывного распределения излучателей по длительности // ЖПС.- 1990.- Т.53, & 4.- С.557-563.

43. Маскевич А.А., Черникевич И.П., Маскевич С.А., Кивач Л.Н. Исследование структуры и динамики тиаминкиназы дрожжей заа-chromyces carlsbergensia при взаимодействии с тиамином и аллостерическими зфФекторами//Тез.докл.конф. "Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных". 12-14 июня, 1990 Г.- Ташкент, 1990.- С.24-26.

44. Chernlkevlch I.P., Gachko G.A., Klvach L.N. et all. Inves-' ligation of structure and dynamics of thiamine kinase from brewer'a yeast by means sti'eady and time-resolved fluorl-

' metry//Proceeding of the FEBS Hungarian H.Boloton, 1990.

45. Маскевич А.А., Черникевич И.П., Маскевич С.А., Кивач Л.Н. и др. Флуоресцентные исследования внутримолекулярной подвижности тиаминкиназы из' пивных дрожжей // Журн.физ. химии. -

1990.- Т.64, & 8.- С.2162-2168.

46. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. Спектроскопические исследования специфических взаимодействий пировиног-радной кислоты в модельных системах // ШС,- 1990.- Т.52, J6 5,- 0.818-824.

47. Маскевич С.А., Соколов К.В., Кивач Л.Н. и др. Спектры гигантского комбинационного рассеяния и структура адсорбированных на поверхности серебра тиамина, тиаминдифосфата и пирупата// Биоорг.химия.- 1990.- Т.16, #11.- С.1552-1562.

48. Maskevich S.A., Sokolov K.V., Klvach L.N., et all- Surface enhanced Raman- spectroscopy of corboxylase and pyruvate complexes//Proc.XII Intern.Conf. Raman Spectroscopy. USA. Columbia, 1990.- P.300-301.

49. Strekal N.D., Gachko G.A., Klvach L.N. et all. SERS study of the thiamine derivatives with pyruvate //Abstract of XX th European Congress of Molecular Spectroscopy. Jugoolavija. Zagreb, 1991.- P.335.

50. Maskevich A.A., Chernlkevinh I.P., Gachko G.A., Klvach L.N, et. all. Fluorescence Invppt.igation о Г thiamine klnaze properties during interaction with substrates, metlial Ions and allosterlc efIectors//Proceedlng of the Fourt Conference of Biological Molecules. York (UK), 5991.- P.253-254.

51. Маскович С.А., Маскевич А.А., Черникевич И.П., Кивач JI.H,. и др. Исследование и структуры и динамики активного центра пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей методом спектроскопии ГКР и импульсной фяуорико7ри«'/Я*з. докл. VII жж$. по сггоктрог'колпп Си-полкмгроь. ларьков, С. 164.

Gh-.-ггЛ v • '.'"¡i I.?., Basharin S.K, , Klvach L.N. si "i:.. Thc--'.'.¿у o' ~iructu;Y an-.l оупс-ласз of acli'.o corner of :.vi*uva~ •.e ■I'-cai't-cc.ila^o from brewer's yom. of ¿th

noe S;:^c::vooopv of Biologies) Koleeules, Уorks : 9i'1 ?.255-256.

V,n.r Uucxain'.n Л. А., ГйЧКО Г.A., Sib'O^iiiW. , Киьач л.Н. и др. Влияние субстратов, кофакторов к эфйэкто-

по» "7р:.'к?::ру дпна-'И к у ти т'-'пкл^/кк. к кг у-'г.УгУ.

5ч. jsiisKevich S.A., Cheralkevich I.?., Gachko G.A., Klvach L.N. et all. The study of pyruvate decnrboxllase frora brewer's

yeast by Ныпап spectroscopy. / * '"u D'iv-

rr, к-v:,--■■-■ni

. •-.•'if-j ~ \г.:ь u pyivpiwapiieie coippiex with pymvate decarboxilase from brewer's yeast. Vlena. Austria, 1992.-

за

P.200.

56. Strekal N.D., Gachko G.A., Kivach L.N. et all. SERS study of the complexes 'of thiamine derivatives with pyruvate //J. Mol Structure.- 1992.- V 267,- P.287-296.

57. Маскевич А.А., Черникевяч И.П., Маскевич С.А., Кивач JI.H.

■ Роль структуры и динамики тиамиккиназы из пивных дрожжей в

регуляции-метаболизма витамина В,: флуоресцентные исследова-ния//Тез.докл,Н Всесоюзн.конф. "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение". Москва, 1992.- Т.1.- С.15.

58. Maskevich S.A., Klvach L.H., Podtynchenko S.G., Zanevsky G.V. Influence of solvent and pyruvate on SER spectra of Imidazole adsorbed on silver island fllms//Additlonal poster abstract Xllltft International conference of Rafflan spectroscopy. V/urzburg, Germany.- 1992.- P.110-111.

59. Strekal K.D., Gachko G.A., Kivach L.N., Maskevich S.A.. The study of active center of pyruvate decarboxylase from breve-r's yeast by SERS//Addltional poster abstract Xlllth International confference of Raman spectroscopy. Wurzburg, Germany.- 1992.- P.110-111.