Дезактивация триплетных состояний ароматических аминокислот и их остатков в белках тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.13 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.М.ЭМАНУЭЛЯ

рГ8 ОЛ

На правах рукописи УДК 541.1 ; 377.3

БИБИКОВ Сергей Борисович

ТОДЕЗАКТИВАЦИЯ ТРИПЛЕТНЫХ СОСТОЯНИЙ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ И ИХ ОСТАТКОВ В БЕЛКАХ

0] .04.13 - электрофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Научные руководители: доктор биологических наук,

кандидат физико-математических наук, профессор K.M. Львов доктор физико-математических наук, профессор В.Н. Спектор

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор М.К.Пулатоеа доктор физико-математических наук, профессор С.Ф. Тимашов

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 1997 года в

часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д200.53.02 при Институте биохимической физики РАН по адресу: 117334, Москва, ул.Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Объединенного Института химической физики РАН.

Автореферат разослан "' 1997 года

Ученый секретарь Специализированною Совета кандидат физико-математических наук

В.А.Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Исследования фотофизических процессов, исходящих в белках, аминокислотах и модельных соединениях при 1ичных условиях (в жидкой и замороженной фазах, в различных растворах, )бавками донорных и акцепторных групп, при разных рН и т.д.) остаются /альными и привлекают интерес многих исследователей с различных точек 1ия. Такой интерес обусловлен, следующими причинами.

Во-первых. Как известно, чувствительность молекулы белка к ближнему у ультрафиолетового (УФ) диапазона определяется наличием в ее составе itkob трех ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и тгофана. Триптофан является одним из производных индола и представляет >й хромофор, поглощающий в УФ части спектра солнечной радиации > 290 нм), достигающей поверхности Земли. Первичным фотопроцессом в скуле белка является ионизация именно триптофаиового остатка, эовождающаяся потерей триптофан содержащим белком ферментативной юности. Поэтому фотофизика триптофана определяет во многом реакцию совой молекулы на солнечную УФ-радиацию и, следовательно, является чом к пониманию механизма взаимодействия живых систем с излучением жнего УФ-диапазона.

Во-вторых, специфическое распределение энергетических уровней ¡ужденных состояний индольного ядра, приводящее к длительной (т = 6.8 с 77 К) фосфоресценции наряду с высокой чувствительностью ¡ужденных состояний этого хромофора к его микроокружению делает элсодержащие соединения удобными для моделирования и изучения офизических процессов, протекающих в белках с участием триптофанилов. будет сказано дальше, несмотря на отличия процессов, происходящих при натной температуре и в застеклованных (77 К) растворах хромофоров, рода дезактивации энергии поглощенного УФ кванта одинакова. Это дает (ожность использовать триптофан в составе белка в качестве зонда, :твительного к своему микроокружению и информационным изменениям, уцированным соседними молекулами и макромолекулами (другими гами, ДНК и т.д.) в биологически активных соединениях.

Исследования фотоиндуцированного переноса энергии и заряда в ярных застеклованных растворах хромофора на примере производных ола, ароматических аминокислот и белков интересно с точки зрения

понимания электрофизических процессов в сложных неупорядоченных системах.

Надо заметить, что температура играет существенную роль в фотоиндуцированных процессах, происходящих в триптофане и других индол содержащих молекулах. Поэтому результаты, полученные в экспериментах с замороженными образцами являются важным звеном в интерпретации фотофизических явлений, имеющих место в белках при 20 "С. Эксперименты при низкой температуре делают удобным изучение свойств триплетного состояния благодаря увеличению его времени жизни. Таким образом удается избежать внутренней конверсии в основное состояние вследствие дезактивации при столкновениях, имеющей место в жидких растворах.

Отметим также, что триптофан и его аналоги, а также содержащие их белки до сих пор не были подробно изучены с точки зрения возможных механизмов дезактивации высоковозбужденных триплетных состояний (Тг ). Поэтому в литературный обзор включены и другие, более изученные ароматические соединения. Цель и задачи-рабам.

Целью настоящей работы является исследование эффекта дезактивации триплетного состояния Т1 триптофана, других производных индола и некоторых белков под действием света в области триплег-триплетного г1Хо«.иво'лиужденнос триплетное Т2* - состояние. В работе сформулированы следующие основные задачи:

- Определить условия возникновения аффекта тушения фосфоресценции триптофана, других ароматических аминокислот, а также модельных соединений, включающих индольное ядро.

- Выявить механизм световой дезактивации триплетных состояний в триптофане, производных индола и других ароматических аминокислот в застеклованных растворах.

- Оценить влияние состояния матрицы растворителя, донорно-акцепторных добавок и рН раствора (перед замораживанием) на фотофизические процессы, протекающие при дезактивации триплетною состояния молекулы хромофора.

- Исследовать триптофанил и тирозил содержащие белки на предмет присутствия вышеуказанного эффекта и обсудить принципиальную возможность использования эффекта для изучения структурно-конформациоиных свойств и белков.

Научная новизна работы. •

Обнаружено эффективное фототушение фосфоресценции застеклованных я 77 К растворов ароматических аминокислот (триптофана, тирозина), а :же застеклованных растворов производных индола (с добавками кпторов) под действием света в области длин воли 400 < X < 500 нм.

Показано, что процесс тушения фосфоресценции идет через возбуждение >рого тринлетного состояния хромофора (переход Тг *- ТО с последующей шзаиией молекулы хромофора и захватом электрона акцептором либо $ушками, образующимися в матрице при стекловании раствора. Установлено tCTite акцепторных групп боковой цепи ароматических аминокислот в эцессе фотодезактивации триплетных состояний ароматического ядра.

Установлено, что величина предельной концентрации триплетных :тояний триптофанилов и тирозилов не изменяется в соответствии с шчеством этих остатков' к молекуле белка. Основным каналом активации, определяющим степень заселенности триплетных состояний в [ках, является процесс тушения этих состояний под светом в области шдег-гриплетного поглощения. Разная степень заселенности триплетных гтояпий в белках определяется, по-видимому, разной организацией в них ггемы обшей миграции энергии.

Обнаружено эффективное фототушение фосфоресценции застеклованных л 77 К растворов белков, под действием света в области ¡шин волн ) < X < 500 нм. Показана зависимость величины эффекта от степени егации и молекулярного размера белковых молекул в застеклованном творе.

Апробация работы. Часть результатов работы была представлена на ждународной конференции «Science and Technology of Synthetic Metals» :ул, Корея, 1994); работа обсуждалась на семинарах Отдела электроники -анических материалов и Отдела кинетики химических и биологических шессов Института биохимической физики им. U.M. Эмануэля РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных юты.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора хратуры, трех глав оригинальных исследований, выводов и списка тированной литературы из наименований. Работа изложена на

страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во Введении обоснование актуальности исследований, выполненных в работе, сформулированы цель работы, ее научная новизна и практическая значимость.

В первой части обзора литературы рассмотрены основные теоретические подходы, разработанные к настоящему времени применительно к внутримолекулярным и межмолекулярным процессам переноса энергии и заряда в жидкой и замороженной средах. Проведен анализ серии работ , в которых наблюдался эффект тушения фосфоресценции ряда соединений (флуорен, ди- и трифениламин, бифенил, хризен, карбазол и другие), связанный с триплет-трипдетным переносок энергии хромофора при 77 К. Рассмотрены модели процессов, связанных с ионизацией молекулы хромофора под действием света. Проанализированы данные исследований ЭПР, связанных с фотопроцессами в ароматических пептидах и белках.

Во второй части обзора литературы приведены 'фотофизические параметры индолов, триптофана, тирозина, ■ используемые в' дальнейшем обсуждении результатов исследований.

Исследовались растворы триптофана, индола','тирозина, дипептия'а ТРИ-ГЛИ в водных и водно-этиленглихолевьгх (\УЕС>) растворах (при соотношении вода-этиленгликоль 1:1 по объему). В качестве акцепторов электрона использовали добавки уксусной кислоты, ацетона, глицина. Перед проведением измерений образцы замораживались при 77К. Водно-этиленгликолевые растворы хорошо стеклуются при охлаждении. При необходимости перед замораживанием раствор титрор.али 10 Н КаОН или 5Н НС1 и измеряли значение рН на рН-метре «рН-121». Были использованы Ь-триптофан, индол, тирозин,' фирмы «КеапаЬ и остальные реактивы фирмы «Реахим». Чистоту водно-этиленгликолевых растворов и добавок (ацетона, кислот, щелочи) контролировали в процессе проведения экспериментов по спектрам люминесценции и поглощения. Под величиной рН раствора мы подразумеваем значение рН раствора, измеренное непосредственно перед замораживанием образца.

:унок 1. Установка для измерения люминесценции замороженного при 77 К образца при действии двух' источников света: 1 - ртутная лампа сверхвысокого давления ДРШ 500, 2 - кварцевые линзы, 3 -водяной фильтр, 4 - стеклянные фильтры, 5 - диафрагма, 6 -камера для дьюара, 7 - кварцевый дьюар с жидким азотом, 8 -образец, 9 - два вращающихся диска (900 об/мин) с вырезанными взаимодополняющими сегментами, 10 - ртутная лампа ДКсШ 120, 11 - монохроматор, 12 - затвор, 13 - приемный монохроматор, 14 -фотоумножитель, 15 - усилители тока и напряжения, 16 -цифровой осциллограф, 17 - компьютер.

Для проведения измерений люминесценции от образца была создана ановка, показанная на рис.1. Заселение нижнего тршшетного состояния ществлялось светом от ртутной лампы мощностью 120 Вт ДКсШ-120 (10), »шедшим через монохроматор (11), настроенный на максимум полосы лощения Бо О» « 280 + 290 нм). Ширина полосы пропускания

юхроматора на полувысоте составляла 10 нм. Возбуждение перехода Т[ осуществлялось светом ртутной лампы сверхвысокого давления Ш-500 мощностью 500 Вт (1). Для устранения длинноволновой части ктра, приводящей к нагреванию образца, использовался водный фильтр (3) щиной 5 см. Дня выбора нужного диапазона длин волн применялись клянные светофильтры (4) (ЖС-11, ЖС-12, СЗС-21, и другие); для

наблюдения процессов, протекающих при двухквантовой ионизации, использовали свет лампы ДРШ-500 (1) прошедший водяной фильтр (3) и УФ фильтр (4) (УФС-5, УФС-1). Оптические оси двух источников света (первый А. = 280 нм и второй X 2: 400 им) были взаимно перпендикулярны и пересекались на образце (8) в кварцевом дыоаре (7). Входное и выходное оптические отверстия камеры (б) с образцом, лежащие на оптической оси второго источника света (1), попеременно перекрывались двумя дисками (9) с вырезанными взаимодополняющими сегментами, вращающимися вокруг этой же оси со скоростью до 900 об/мин. Таким образом, за счет попеременного открытия входного и выходного отверстий камеры, исключалась возможность попадания светового потока второго источника (1) в приемный монохроматор (13). Приемный монохроматор (13) при действии одного либо двух источников был открыт только для света люминесценции образца. Собранный оптической системой стандартным образом и прошедший через приемный монохроматор (13), свет люминесценции образца попадал на фотоумножитель ФЭУ-39А (14), сигнал с которого через предварительный У5-11 и согласующий У7-6 усилители (15) подавался на цифровой осциллограф С9-8 (16), соединенный с ЭВМ (17).

При измерении спектра люминесценции использовался только первый источник света.

Кинетические измерения светового тушения фосфоресценции производили следующим образом. Вначале заселяли светом от первого источника триплетные состояния хромофора в застеклованном растворе до выхода фосфоресценции на стационарный уровень. Затем открывали затвор (12а) второго источника и одновременно закрывали затвор (126) первого источника света, при этом автоматически включалась запись сигнала на цифровой осциллограф, соединенный с компьютером.

ЭПР спектры снимали на радиоспектрометре РЭ-1306, соединенном с компьютером через цифровой запоминающий осциллограф С9-8.

Спектры поглощения в УФ и видимом оптическом диапазонах измеряли с помощью двухлучевого спектрометра «Specord».

Гпява 3. Фотолез активация триапегных состояний триптофана, тирозина.

При исследовании люминесценции застеклованных растворов белков и ароматических аминокислот нами было обнаружено, что присутствие в2 возбуждающем свете спектральной состакпяющей видимого диапазона (для

)фана, и частности, в области длин волн 400 < X < 500) снижает ;ивность стационарной фосфоресценции. Такой спектральный диапазон тствует энергиям ниже порога ионизации молекулы хромофора с го трнплетного состояния. Поэтому изучение механизма дезактивации го триплетного состояния привлекает к себе внимание как с точки 1 общего понимания фотофизических процессов, происходящих в ных стеклах и замороженных растворах, содержащих молекулы фора, так и с точки зрения применения обнаруженного эффекта для шя конденсированных сред, содержащих хромофор, в перную очередь, лованных и жидких растворов белков.

1 .21.00.85 0-6

X

ь

о ^

■ 0.40.2 0.0

б

-I— 20

40 ьО

Время, сек

80

—i 10?

юк 2. Эффект светового тушения фосфоресценции водно-этиленгликолевош раствора триптофана (10"4М): «а» - свет X к 280 нм включен, «б» - свет 400 <Х < 500 нм включен, «в» -свет 400 < X < 500 нм выключен, «г» - свет X и 280 нм выключен.

Рис.2 демонстрирует эффект снижения интенсивности фосфоресценции гофана в водно-этиленгликолевом стекле (77К) при комбинированном гении. Участок "а-б" демонстрирует кинетику нарастания юресценции триптофана сразу после включения возбуждающего света нм). В момент "б" открывали затвор второго источника света,

облучающего образец светом в диапазоне длин волн 400 <Х < 500 им. Интенсивность фосфоресценции, при этом, существенно снижмась до некоторого нового стационарного уровня (участок "б-в")- Прекращение облучения светом от второго источника приводило к восстановлению исходного уровня фосфоресценции ("в-г"). Момент "г" соответствует началу темповой дезактивации молекул триптофана. Регистрация велась на длине волны 435 им. Форма спектра фосфоресценции оставалась неизменной.

На рис. 3 приведен измеренный спектр действия эффекта (о) в сравнении СС СПСХ'Грс"»; триплет-триплетного поглощения (из работы Ш). Точки спектра действия были получены при использовании соответствующих светофильтров, через которые проходил свет от второго источника. Рис. 3 демонстрирует гот факт, что спектр действия эффекта совпадает со спектром триплет-триплетного поглощения. Изменений интенсивности флуоресценции при действии света второго источника в условиях нашего эксперимента обнаружено не было.

Внешне похожий эффект светового снижения интенсивности фосфоресценции был обнаружен и исследован в работах группы М.В. Алфимова [2], где наблюдалось снижение интенсивности фосфоресценции хромофора при действии света в области Т-Т поглощения для ароматических молекул в толуоле, этаноле и некоторых других растворителях при 77 К в присутствии для ряда ароматических соединений (нафталин, флуорен, ди- и трифениламин,_бифенил, хртси, карбазол и другие). В этих работах было обнаружено, что возможен перенос энергии с высоковозбужденных триплетных состояний молекул ароматических соединений на молекулы матрицы растворителя в замороженном (77 К) состоянии. Карбазол, растворенный в толуоле, возбуждали светом в области 81 <- Бо перехода (к ~ 320 нм). При действии света одновременно в области Тг Т) перехода (X ~ 500 540 нм) наблюдали тушение фосфоресценции. Авторы предположили, что обеднение Ъ - уровней молекул карбазола является следствием того, что, после возбуждения молекулы карбазола в йисо^овозоужденное триплетное состояние, возможен перепое энергии на триплетный уровень матрицы (толуола). Аналогичная картина высвечивания фосфоресценции акцептора имела место и для пары дифениламин-дифенил.

D О Эффект тушения

фосфоресценции, у.е.

360 380 400 420 440 460 480 500 520 X, нм

исунок 3. Сплошная кривая - длинноволновая часть спектра триплет-триплетного поглощения, «о» - спектр действия эффекта снижения фосфоресценции при действии света второго источника (ненормированный).

Триплет-триплетный (Т-Т) перенос энергии возможен и стеклообразных астворах и жестких средах (например, в замороженных растворах юматических соединений) между триплетными состояниями молекул. Для гого процесса необходимо наличие акцептора энергии, причем, как правило, X) химическое строение и, следовательно, взаимное расположение эиплетных. уровней донора и акцептора несущественно. Перенос энергии с жилетного уровня донора на нижерасположенный триплетный уровень щептора может сопровождаться сенсибилизированной фосфоресценцией шептора. Триплет-триплетный перенос совершается по обменному механизму характеризуется малым радиусом действия, близким к сумме радиусов олекул. Концентрационная зависимость явлений, вызванных Т-Т переносом ^пример, тушение акцептором фосфоресценции донора или ;нсибилизированная фосфоресценция акцептора), подчиняется закону еррена:

ЬрЬю - " ехР I

(1)

где и интенсивности фосфоресценции в отсутствие и в

присутствии акцептора, соответственно; К0 - радиус сферы вокруг молекулы донора, попадание в которую молекулы акцептора приводит и не попадание в которую не приводит к переносу энергии, Яа - радиус сферы, приходящейся на одну молекулу акцептора, обычно < 10 А.

Как известно, люминесцентные свойства триптофана и его аналогов определяются прежде всего их ароматическим индольным ядром. Следовательно, естественно было предположить наличие аналогичного эффекта у засгеклованных растворов индола. Однако, застеклованные растворы индола показали, в отличие от растворов триптофана, очень слабый эффект снижения интенсивности фосфоресценции при действии видимого света в области триплет-триплетного перехода.

Можно сделать вывод о том, что существенную роль в эффекте тушения фосфоресценции вторым квантом света играет наличие у молекулы триптофана боковой группы в Сз - положении. Световое тушение фосфоресценции также наблюдалось для производных индола с другими заместителями в том же положении: индсхлил-З-пропионоюй кислоты (-О]у-СН2-СООН) и инщолил-3-масляной кислоты (-СН2-СН2-СН2-СООН). Этот результат указывает на существенную роль труппы СООН в происхождении наблюдаемого эффекта при отсутствии аминогруппы. Однако, это не исключает роли аминогруппы в наблюдаемом эффекте: в случае, когда обе группы присутствуют в боковой цепи, они конкурируют за захват электрона, ушедшего с индольного ядра, причем сродство к электрону выше для аминогруппы. Незначительные различия в эффективности светового тушения фосфоресценции для триптофана и для Са-производных индола могут быть связаны как с наличием у триптофана группы -ГШг , так и с различным расстоянием от группы -СООН до индольного кольца.

Были исследованы застеклованные растворы индола с добавками уксусной кислоты или ацетона. В обоих случаях обнаружено появление эффекта тушения и его рост синбатно с ростом концентрации добавки. Так как при добавлении ацетона величина рН не замороженных растворов оставалась практически неизменной, то эффект для индола нельзя связать

мо с изменением кислотности раствора. На рис.4 приведена зависимость »рифма соотношения интенсивности фосфоресценции /9 образца раствора ола без акцепторной добавки к интенсивности / раствора с добавкой от ее центрации. Полученная зависимость соответствует зависимости Перрена (1) арактерным радиусом сферы эффективного взаимодействия »6 А, что >рит в пользу близкодействующего механизма взаимодействия, например, енного типа, или связанного с переносом заряда. Однако, в наших опытах астворе отсутствуют активные хромофоры, кроме индола (триптофана), и [ не удалось наблюдать никакой иной фосфоресценции при наличии ректа (обусловленной, например, примесями); кроме того, миграция ргии по триплетным состояниям индола (триптофана) не может привести к жениго интенсивности фосфоресценции, да и концентрация хромофора шком мала (~ КГ4 М) для этого эффекта. Следовательно, снижение ценности триплетных состояний не связано с триплет-триплетным многом и мятпштс.

Ш11Г)

сунок 4. Концентрационная зависимость дезактивации фосфоресценции через Т2-состояиия индола (С1шд = 1.5-И)'4 М) в смеси метанол + уксусная кислота при 77 К от концентрации уксусной кислоты (обработка результатов по Перрену). / и /» - интенсивности фосфоресценции ири наличии и в отсутствие акцептора соответственно).

Предположив существование дополнительного канала дезактивации энергии с уровня Тг с константой скорости к- и решив систему уравнений, связывающих заселенности всех состояний в стацинарном случае, получим выражение для заселенности нижнего трипетного состояния [Т1]:

[т,]с,=---Я1 (2)

к0+Фзте51х + --^—£т1т

где п - концентрация хромофора, к0 - константа скорости дезактивации Т1-состояния; /5, 1т - коэффициенты экстинкции и интенсивности возбуждающего света в области переходов Ба 81 и Тг Ть соответственно, Ф5Г - квантовый выход интеркомбинационной конверсии Т1 <- 5], ктт - константа скорости внутренней конверсии из Т2 в Т1 .

Для того, чтобы исключить из рассмотрения влияние интенсивности возбуждающего источника света и заселенности триплетных состояний, для характеристики эффекта светового тушения была выбрана разность скоростей затухания фосфоресценции ее максимуме (437 нм для триптофана) при действии света в области Т-Т перехода и без него.

Запишем выражения для кинетики заселенности триплетных уровней Т] и Тг после выключения возбуждающего света в области 81 <- во перехода:

3{Тх]= ~ko[Tl]- £гг1 т[Т]] + kj-plTj]

ПТ] ' (3>

= етт1тУГ{\- ктт [ Т2 ] - кх [ Г2 ]

at

где егт- коэффициент экстинкции в области триплет-триплетного перехода, 1т - интенсивность света в этой же области, к0 - скорость темновой дезактивации Ti - уровней. Решив эту систему уравнений для случаев h = 0 и 1т* 0, получим следующее выражение для заселенности триплетного состояния [Til:

|[7;] = Лехр (-V0 /г=0 1 .

ку

где äkpk=ew-Ir--~—~.

Kx + Krr

Пронорционапьность Д kfk и 1т хорошо подтверждается экспериментально (рис.5). Измерения A kfh проводили следующим образом. Вначале заселяли нижнее триплетное состояние до стационарной величины светом от ртутной лампы ДКсШ-120 на длине волны X«280 им и после его выключения определяли скорость темновой дезактивации Ti -состояния к0. Затем снова заселяли нижнее триплетное состояние, после чего одновременно выключали • свет с X « 280 нм и включали свет от лампы ДРШ-500 с выделенной областью триплет-триплетного поглощения (фильтр ЖС-П), проводя измерение скорости световой дезактивации Ti-состояния kv + Akph, откуда и определяли Д/с^На рис.б показана зависимость константы A kph от концентрации ацетона, добавленного в раствор индола в WEG (Сш < 0.1 М).

ß0+ AipO, с'

0,24-

0,220.20- .. 6' Тршттофан+ацетон > ,

0,18- Ж' о-;...* " ж. -— \ Индоя+адетон

0,16-

0,14-

0,12-1

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1 , V.е.

Т '

Рисунок 5. Зависимость константы светового тушения фосфоресценции замороженных при 77 К растворов индола и триптофана в \УЕО (1:1 V) (Сивд,тРя= Ы0"3М) с добавкой ацетона (Са„ = 0.1М) от интенсивности света в области тршшет-триплстного поглощения.

Как нетрудно видеть, гаках зависимость соответствует зависимости Перрена для добавки уксусной кислоты. Заметим, что при Ст = 0 имеем Л крН * 0. Это связано с тем, что точность измерения малых величины А крк

выше, чем малых изменений интенсивности фосфоресценции Л/рЛ, которые использовались в предыдущих работах. Одним из утверждений данной работы является предположение о том, что рассматриваемый эффект связан с переносом заряда

Аналогичным образом растет А при добавлении ацетона в раствор триптофана.

Ак , с"1

ph

С ,м

ац

Рисунок 6. Зависимость константы AiPh замороженных при 77 К растворов индола в WEG (1:1 v) (Оиш, = МО"3 М) от концентрации добавленного в раствор ацетона Сац.

Для доказательства предположения об ионизации хромофора как основной причине фотодезактивации нижнего триплетногс состояния были исследованы спектры ЭПР в области свободных радикалов (Н и 3300 Гс) растворов индола и триптофана в WEG после облучения их двумя источниками света в той же конфигурации, что и при измерении Akph. Обнаружено, что при таком облучении действительно появляется и растет прямо пропорционально времени облучения (в наших условиях эксперимента

:е менее 1.5 часа) сложный сигнал ЭПР, включающий в себя суммарный пектр катион-радикала хромофора и анион-радикала этиленгликоля (п тсутствие ацетона) или ацетона. При измерениях спектра ЭПР растворов риптофана после облучения светом в области Т-Т перехода (в WEG, при тех :е условиях) с ацетоном наглядно видна эволюция спектра: от спектра адикала этиленгликоля к спектру радикала ацетона (рис.7).

н, кГс

исунок 7. Спектр ЭПР замороженного при 77 К раствора триптофана в WEG (l:lv) (Стря = 1-Ю'3 М), возникающий после одновременного облучения образца светом длиной волны 280 нм и светом в области Т2 <- Ti перехода в течение 20 мин., в зависимости от количества добавленного в раствор ацетона.

Такая же картина наблюдается и для растворов индола с ацетоном. Во :ех измерения амплитуда центрального максимума оказалась зопорциональной площади проинтегрированного сигнала. Количественной 1рактеристикой скорости «светового» образования радикалов мы считаем иность скоростей роста сигнала ЭПР ЛУэпр при облучении одновременно >умя источниками света и только светом в области \ « 280 им.Рисупок S :монстрирует на примере индола, что существует корреляция между

скоростью процесса образования радикалов (А V3rlP) под действием света в области триплет-триплетного перехода от концентрации ацетона в растворах индола и скоростью процесса световой дезактивации триплетньгх состояний Д kph: зависимость линейна и проходит через начало координат.

ÄF , мин1 эпр

1.2

1 о

О 8

0.6

0.4

0.2

00 0

Рисунок 8. Корреляция между разностью скоростей образования радикалов ДУэпр при облучении раствора индола (Сивд = МО 3 М) в WEG (i:lv) двумя И одним источниками света в области Тг Ti и Si <—So переходов, соответственно, и константой при

концентрации добавленного в раствор ацетона 0 < Сш ^ 0.1 М.

Это подтверждает предположение о возможности переноса заряда с молекулы хромофора в высоковозбужденном триплетном состоянии на молекулы акцептора с образованием радикальных пар в растворе как причине тушения фосфоресценции индола и его производных. Наличие гетероатома азота в индольном ядре нарушает симметрию молекулы и приводит к неполной делокализации я-сопряженной системы и к повышенной электронной плотности на атоме азота. Это ведет в свою очередь к высокому дипольному моменту молекулы индола и значительному его изменению при переходе в возбужденное состояние и к эффективному влиянию полярного растворителя на хромофорное ядро. Так как среда представляет собой твердую матрицу

ч-1-1-'-1-1-1-■-1-■-1-■-1—

.000 0.005 0 010 0.015 0.020 0.025 0.030

Дк , с-1

рЬ

(стекло), то эффекты, связанные с сольватацией иона после взаимодействия хромофора с квантом света, отсутствуют (хотя возможны дипольные кулоновские взаимодействия заряженных групп хромофора и растворителя до стеклования). Это означает, что, по сравненню с жидкой фазой, электрон, эжектированный в матрицу, имеет более высокую вероятность рекомбинации с материнской молекулой. Конкуренцию рекомбинации ммут составить либо введенные в раствор до стеклования акцепторные группы, либо образовавшиеся при стекловании ловушки в стекле.

- 0.10

- 0.05

"I-1---1-1--1-1— —1

5 6 7 8 9 10 11 12

<- 0.00

рН

'исунок 9. Зависимость сигнала ЭПР и константы скорости светового тушения фосфоресценции засгекдоваиного раствора тирозина в \\'КС (Стар = 1-Ю"3 М, 77К) от рН раствора перед замораживанием.

Нами было проведено изменение эффективности тушения фосфоресценции и скорости образования радикалов при облучении растворов ■ирозина и триптофана при различных значениях рН перед замораживанием »аствора. Как известно, в растворах тирозина при рН Ю происходит

депротонирование его фенольного ядра, и молекула приобретает отрицательный заряд. Таким образом, в тирозине при рН > 10 имеются две отрицательно заряженные группы - на фенольном ядре и в боковой цепи, в то время как в триптофане - только одна (в боковой цепи). Этот дополнительный заряд на фенольном ядре тирозина в области рН > 10 уменьшает эффективный положительный заряд хромофора после его первичной световой ионизации. Это затрудняет рекомбинацию электрона с катион-радикалом, что должно приводить к увеличению скорости образования радикалов и к увеличению эффекта светового тушения фосфоресценции в случае щелочных рН растворов тирозина перед стеклованием.

Это действительно имеет место: на рис.9 виден излом кривой для (рН) и скачок величины сигнала ЭПР в окрестности рН 10. Незначительное снижение величины Мрн в области рН < 10 можно объяснить, предположив, что дезактивация высоковозбужденных триплетных Тг состояний тирозина в таких условиях идет с участием ионизированной аминогруппы боковой цепи. При возрастании рН до 10 происходит уменьшение доли ионизированных аминогрупп -МНз+ боковой по сравнению с неионизированными аминогруппами -МНг- Это приводит: 1) к снижению средней вероятности процесса переноса заряда с фенольного хромофора на аминогруппу, и следовательно, к уменьшению эффекта тушения триплетных состояний; 2) к увеличению вероятности выхода эжектированного электрона в растворитель, и, следовательно, к увеличению доли радикалов растворителя в сигнале ЭПР. Такая точка зрения подтверждается изменением формы спектра ЭПР; при нейтральных и кислых рН наблюдается сигнал с преобладанием синглета катион-радикала, а при щелочных рН возрастает доля характерного триплета радикала этиленгликоля (рис.10). Кроме того, ни величина эффекта фстотушения фосфоресценции (Дйрь), ни скорость роста радикалов при облучении раствора тирозина при нейтральных рН светом длиной волны 280 нм и светом в области Тг <- Т] перехода не зависит от концентрации ацетона вплоть 0.3 М, что также подтверждает высказанные предположения.

-2

-4

6

4

О

•8

2

-6

3.20

3 25

3 30

Н, кГс

унок 10. Спектр ЭПР замороженного при 77 К раствора тирозина в \*/Ей (l-.lv) (Сгри = 1-Ю"3 М), возникающий после одновременного облучения образца светом длиной волны 280 ни и светом в области Тг Т) перехода в течение 20 мин., в зависимости от количества добавленного в раствор ацетона.

Известно, что индольное ядро отличается от фенодьного более |Ьективным взаимодействием с полярным растворителем. Для геклованных растворов триптофана не наблюдали характерного для юзина увеличения сигнала ЭПР после облучения двумя источниками свега I увеличении величины. рН, но наблюдали рост величины в « 2 раза ) изменении рН от 1.7 до 11. Это может быть связано с перераспределением юновского заряда вокруг молекулы таким образом, что при диффузии жтированного электрона к материнской молекуле хромофора возрастает юягноегь захвата электрона акцепторными группами боковой цепи.

При интерпретации этих данных важно помнить, что фактически захват жтронов возможен не только акцепторами (например, карбоксильной или •шо группами), но и дефектами структуры матрицы (ловушками), ектроны, захваченные такими ловушками, ммут рекомбинировать с эмофором при термическом или световом возбуждении, что

проиллюстрировано на рис.11. Действующий свет (А, > 620 нм) ие может привести к возбуждению какого-либо электронного перехода в молекуле хромофора. При этом из рисунка хорошо видно, что молекула хромофора после рекомбинации оказывается в возбужденном триплетном (а не синглетном) состоянии. Это объясняется, во-первых, более высокой плотностью триплетных состояний и, во-вторых, более низким расположением энергетических уровней Тг-состояний по сравнению с Згсостояниямя.

/ , 1ит

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

-0.1

Рисунок 11. Спектр люминесценции застеклованного (77 К) раствора тирозина в WEG (l:lv) (СтНр= М(Г3М, рН=П) и триптофана в WEG (l:lv) (CIpa = 110"3М, рН=10.8) при возбуждении светом 620 нм, после облучения Уф светом в течении 1 мин. (ДКсШ-500, водяной фильтр, 5-мм УФС-5).

Итак, мы можем предложить следующий механизм эффекта светового тушения фосфоресценции застеклованных растворов таких хромофоров, как триптофан, тирозин и их остатков в белках. При действии на хромофор, находящийся в нижнем триплетном состоянии, света в области Т-Т перехода имеет место внутренняя конверсия - переход хромофора из состояния Ti в состояние Та. Реакционная способность хромофора в этом случае возрастает (состояние предионизации). Помимо внутренней конверсии обратно в Т|-

у.с.

250 300 350 400 450 500 550 X , нм

яние, возможны следующие процессы: (а) ионизация хромофорного ядра хтированием электрона в объем (это наблюдается для растворов индола, офана, тирозина при рН > 10). Эжектировашшй электрон после ишзации может быть захвачен ближайшими акцепторными группами орителя, например, в растворах триптофана и индола в присутствии (торов. В этом случае имеет место акт фототушения триплетного яния. Электроны, не захваченные матрицей, после термализации ундируют к катион-радикалу. При этом есть вероятность захвата рона акцепторными группами (-МНэ+ и -СО) боковой цепи молекулы, гакже приводит к фототушению триплетного состояния, (б) Перенос рона с ядра хромофора в высоковозбужденном триплетом состоянии на гторную группу боковой цепи (например, тирозин при рН < 10) также )дит к эффекту световой дезактивации триплетного состояния.

При изучении действия ультрафиолетового излучения на белки было iaiio, что в твердой матрице имеет место двухквантовая ионизация части экислотных остатков. Промежуточным состоянием поглощающим второй света является триплетно-возбужденное состояние остатка ггической аминокислоты. Нами был исследован вопрос о возможной :ни заселения триплетных состояний остатков ароматических окислот и об участии этих состояний в переносе энергии электронного ■ждения в молекуле белка. С одной стороны, время жизни таких 1яний велико и это способствует увеличению заселенности триплстных 1сй. С другой стороны, миграция энергии между различными этическими аминокислотными остатками облегчает заселение триплстных |яний одних и затрудняет заселение этих состояний в других остатках. В >ящей работе для ряда белков проведено сопоставление предельной енности триплетно-возбужденных состояний триптофанилов и тирозилов. В табл.1 приведено значение относительного числа триплетных >яний в молекуле (пт), соответствующее предельной стационарной ентрации триплетных состояний в условиях нашего эксперимента, рое определялось по формуле:

пт =(ст4б)/(сбт4),

; - молярная концентрация триптофана или тирозина в образце, се -рпая концентрация белка к образце, А - амплитуда сигнала ЭПР летного состояния триптофана или тирозина в образце с предельной

концентрацией этих состояний, Аб - то же для тршпофанилов или тирозилов в белке.

Таблица 1. Относительного числа триплетных состояний пт остатков триптофана и тирозина в молекуле белка в застеклованном (77 К) водно-глицериновом растворе.

Колич-во пт Колич-во пт

Белок остатков остатков

Триптофан Тирозин

САЧ 1 1.0 18 3.9

САБ 2 1.7 19 2.4

Личный альбумин 3 1.9 9 1.4

Трипсин 4 1.6 10 1.8

Пепсин 5 2.0

Глобин 5 2.1 11 4.0

ДНКаза 5 3.1 29 4.8

Лизоцим б 0.5 3 1.4

а-химотрипсиноген 8 1.8 4 1.8

Прежде всего, заметим, что предельная стационарная концентрация триплетных состояний дня триптофана и триптофанила в сывороточном альбумине человека при одинаковой молярной концентрации аминокислоты и белка имеет одно значение. Так как молехула САЧ содержит только один триптофанил, это означает, что заселенность Т1-состояний триптофана и триптофанила в САЧ одинакова. Можно было ожидать, что в разных белках предельная концентрация ^-состояний будет пропорциональна числу триптофашадов в белковой молекуле. Действительно, в молекуле САБ имеется два триптофанила, а значение пт =1.7. Однако, в яичном альбумине, трипсине, пепсине, глобине, и а-химотрипсиногене, в которых число триптофанипов на молекулу больше двух, значение п остается близким к двум. В ДНКазе значение пт = 3.1 при пяти триптофанилах па молекулу. Интересен результат, полученный для лизоцима - значение пт — 0.5 при шести триптофанилах на молекулу. Подобное ограничение относительной предельной стационарной концентрации Тгсостояпий наблюдается и для тирозилов (табл.1.). Значение пт для тирозилов в разных белках меняется примерно от 1.5 до 5, в то время

: число этих остатков меняется от 3 до 29. Таким образом в белках чествует процесс, ограничивающий предельную концентрацию триплетно-бужденных состояний триптофанилов и тирозилов.

Предложенный нами механизм фототушения Т1-состояний позволяет >ясиить полученные результаты. Действительно, остатки триптофана и юзина имеют более высокие (на порядок) скорости реакции со свободными ктронами, чем акцепторные группы боковой цепи аминокислоты -СО и Нз+ . Увеличение числа хромофоров в молекуле белка приводит к росту оятности фототушеиия Т[-состояний хромофоров. Этот процесс и приводит ограничению предельной стационарной концентрации Т) -состояний в ках.

Поняв механизм фототушения триплетных состояний замороженных творов ароматических кислот (триптофан, тирозин) под действием света в [асти триплет-триплетного поглощения, можно сопоставить величины 1аметров этого эффекта для различных белков со структурой и 1формационными свойствами белковых молекул. Отметим, что величина ь светового тушения фосфоресценции (триплстпых состояний) (Магических аминокислот является удобной интегральной характеристикой : изучения конформационных свойств белков.

Для иллюстрации в таблице 2 приведены данные исследования для :оторих белков при разных значениях рН в замороженных водном и водно-леигликолевом растворах. Данные таблицы позволяют делать выводы о чествовании корреляции между размером белковой молекулы, степенью егации и величиной эффекта:

- В водно-этиленгликолевом растворе величина фототушении Ак?ъ растает с увеличением размера глобулы молекулы белка, так как личивается количество акцепторов, окружающих хромофорные ядра.

- Величина Акрь для стеклующихся водно-этиленгликолевых растворов ков (а) меньше, чем для замороженных водных растворов растворах (б). ) связано с тем, что молекулы белка в водном растворе при замораживании шца образуют агрегаты, размер которых превышает размер даже юсителыю больших молекул САЧ, САБ и других, что отражается в мнении величины эффекта - для водных растворов даже небольших 1екул (РНК.аза, папаин, трипсин) А<:рь выше, чем для водпо-ленгликолевых растворов относительно крупных глобулярных молекул

САБ, глобин). Особый случай представляет молекула коллагена карпа: в

отличие от глобулярных белковых молекул, она жестко вытянута вдоль одной оси, плотность упаковки а1регатов мала, при этом наблюдается меньшая величина Дк^ ■ '

Таблица 2. Фототушение триплегных состояний в белках светом в области триплет-триплетного поглощения. Концентрации выбраны из условия одинаковой оптической плотности для всех образцов, а) Растворитель: вода-этиленгликоль (1:1у).'

Образец С(М) Мол. вес Ттемн Д£рь

(сек) рН <2 нейтр. рН > 10

РНКаза 2.4Х10"4 13.7 4.0 0.46 0.33 0.75

Лизоцим 1.0x10^ 13.7. 2.2 0.21 0.52 0.89 .

Пап айн 1.1хЮ4 21 5.5 0.70 0.29 0.70

Трипсин ТбхЮ"4 24 5.9 0.36

Тршшшчшгнбит. 1.6х10"4 24 5.7 0.27 0.18 0.50

яичн. альбумин 1.0x10'* 45 6.2 0.49

ДНКаза 7.3х10"5 62 3.8 0.46

Глобин 7.3x10'5 62 5.9 0.38 0.53 0.86

САЧ 5.9x10 5 69 4.2 0.65

САБ 5.9хЮ"3 69 5.7 0.15 0.64 0.90

Коллаген карпа - - 2.2 0.23

б) Растворитель; вода

Образец ССМ) Мол. вес "Стемн А£рь

РНКаза глхю"1 13.7 . 4.0 0.85

Папаин 1.1х10ч 21 5.5 0.96

Трипсин 1-бхЮ"4 24 5.3 0.84

Коллаген карпа - - 2.2 0.54

- В щелочных (истинных) растворах, при рН > 10, эффект фототушения фосфоресценции возрастает для всех образцов, что связано с изменением заряда молекулы в результате протонирования аминогрупп, и уменьшением вероятности рекомбинации эжектированных электронов с катион-радикалами. Обращает па себя внимание тот факт, что Д£Рп для щелочных нодпо-этиленгликолевых растворов близко к значению Д£Р1, для водных растворов.

го можно трактовать как следствие практически полного захвата кектированнмх зарядов в матрице в обоих случаях.

- В области нейтральных и в особенности кислых рН перед мораживанием раствора (истинный раствор) наиболее сильно проявляются шформапионные свойства молекулы белка, приводящие к характерным для 1Ждого белка вкладам в величину Afcpл.

Список цитированной литературы. J. Moan, Israel J. Chem., v.97, 1971, p.637.

В.И. Скворцов, M.B. Алфимов. Замедленная флуоресценция при дезактивации высокоеозбужденных триплетных состояний. ДАН СССР, т.291, №5, 1986, с. 1166-1169.

ВЫВОДЫ.

Обнаружен и изучен эффект фототушения фосфоресценции стеклованных при 77 К растворов триптофана, ' тирозина, индола под йствием света в области длин волн 400 500 нм. "■

Показано, что процесс тушения фосфоресценции связан с возбуждением орого триплетного состояния хромофора (переход Тг <- ТО, с ионизацией >лекулы хромофора и взаимодействием электрона с. акцептором матрицы или жовой цепи аминокислоты.

Обнаружено эффективное фототушение фосфоресценции застеклованных эи 77 К растворов белков, под действием света- в области длин волн )0 < X < 500 нм. Показана зависимость величины эффекта от степени регации и молекулярного размера белковых молекул 8 растворе при 77 К.

Установлено, что величина предельной концентрации триплетных »стояний трипгофанилов и тирозилов не изменяется *-в соответствии с их >личеством в молекуле белка. Основным каналом- ^ 'дезактивации, 1ределяющим степень заселенности триплетных состояний '■ в ' белках, дается процесс тушения этих состояний под светом в области • триплет-«плетного поглощения по предложенному нами механизму:-'''-'"

Основной материал диссертации опубликован в следующих работах:

1. Львов K.M., Кузнецов С.В., Бибиков С.Б., Костиков А.П. Заселенность триплетно-возбужденных состояний триптофанилов и тирозилов в белках. Биофизика, т.38, вып.5, 1993, с.741-745.

2. Львов K.M., Кузнецов С.В., Бибиков С.Б., Костиков А.П. Индуктивно-резонансный перенос энергии между молекулами триптофана в триплегтно-возбужденном состоянии. Биофизика, т.39, вып.2, 1994, с.251-255.

3. S.B. Bibikov, S.V. Kuznctsov and K.M. L'vov. Fotodeactivation. of the tryptophan triplet state by C=0 fragment of earboxyl group. Proceeding of the International Conference on Science and Technology of Synthetic Metals, July 24*29, 1994, Seoul, Korea., p.508.

4. S.B. Bibikov, S.V. Kuznctsov and K.M. L'vov. The influence of C=0 group on photodeactivation processes in tryptophan. Synthetic Metals, v.71, 1995, p. 2061-2062.