Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния света и структурная организация адсорбированных на металлической поверхности молекулярных систем тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

Ол

Белорусский государственный университет

УДК: 543.424:535.370:547.963 МАСКЕВИЧ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СПЕКТРОСКОПИЯ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ АДСОРБИРОВАННЫХ НА МЕТАЛЛИЧЕСКОЙ ПОВЕРХНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ

СИСТЕМ

01.04.05 - Оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Минск - 1995

Работа выполнена на кафедре общей и теоретической физики Гродненского государственного университета им. Я. Купалы

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук профессор Л. Н. Кивач

доктор физико-математических наук профессор Б. М. Джагаров

доктор физико-математических наук профессор Д. С. Умрейко

доктор физико-математических наук доцент И. М. Гулис

Оппонирующая организация:

Институт физики АНБ им. Б.И. Степанова

Защита состоится М*фг 1995 года в часов

на заседании Совета Д 056.03.05 по присуждению ученой степени доктора наук в Белорусском ордена Трудового Красного Знамени государственном университете (220080, г. Минск, пр. Ф. Скорины 4, Главный корпус, ауд. 206).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белорусского государственного университета.

Автореферат разослан // яаяфя_1995 года.

^Ученый секретарь Совета ^—~

■ доцент Стельмах В.Ф.

ВВЕДЕНИЕ

Прогресс, достигнутый в последние десятилетия в изучении строения веществ на молекулярном и атомном уровнях, во многом связан с развитием методов лазерной спектроскопии. Одной из тенденций в развитии современной лазерной физики является изучение закономерностей взаимодействия лазерного излучения с молекулярными системами различного уровня организации. На этой основе разрабатываются новые методы контроля и модификации материалов, способы диагностики и лечения различных заболеваний, широко исследуются молекулярная организация и механизмы функционирования биологически активных систем. К числу наиболее информативных методов исследования молекулярной структуры и межмолекулярных взаимодействий относится метод комбинационного рассеяния (КР) света, который, однако, в своем традиционном виде имеет низкую чувствительность.

Совершенно новые уникальные возможности этого метода появились после открытия в 1978 году явления гигантского или поверхностно усиленного КР. Оказалось, что при адсорбции на специфических шероховатых поверхностях металлов (Ад, Си, Аи, РО эффективное сечение- КР молекул может увеличиться на 5-7 порядков. Бурное развитие данного метода в последние годы позволило достичь рекордной чувствительности (до 10 *18 моля вещества) и существенно расширить круг решаемых задач. В частности, исследование спектров гигантского КР (ГКР) органических молекул, адсорбированных на специфических шероховатых поверхностях металлов, позволяет решать не только задачи, связанные с их строением, но и с взаимодействием молекул с поверхностью металла и физхимии самой поверхности. .

Наиболее важной и интенсивно развиваемой в последнее время областью применения метода ГКР являются науки биомедицинского профиля. Развитие данного метода применительно к исследованию сложных биоорганических молекул и надмолекулярных комплексов позволило уже сегодня решить многие вопросы структуры ряда белковых молекул, локализации хромофоров в них и в клетке.

Вместе с тем, в настоящее время существует целый комплекс нерешенных проблем, связанных как с физикой самого явления ГКР, так и со спецификой его применения для решения различных прикладных задач. Прежде всего необходимо отметить, что на сегодняшний день, не существует единого взгляда на природу явления' ГКР. Развитие данного метода идет по пути накопления базы данных о

спектрах ГКР различных классов органических молекул и выработке подходов к их интерпретации. В связи с этим исследование методом ГКР спектроскопии систем с различным уровнем организации от простых молекул до сложных биомолекулярных имеет важное значение для развития как самого метода, так и создания единой теории явления ГКР.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации.

В настоящее время сложились два подхода к объяснению явления ГКР: один исходит из локального, увеличения напряженности электрического поля возбуждающей волны благодаря шероховатости поверхности, с которой взаимодействует исследуемая молекула; второй базируется на изменении поляризуемости молекул при адсорбции. Однако ни одна из существующих моделей не позволяет даже качественно объяснить все особенности спектров ГКР.

К настоящему времени выполнено большое число исследований, посвященных изучению закономерностей формирования спектров ГКР как простых органических молекул, так и сложных молекулярных ансамблей. Известно, что усиление ГКР определяется структурой поверхности и спектром поверхностных плазмонов, характером, взаимодействия молекул с поверхностью. Однозначно установлено, что в спектрах ГКР проявляется геометрия адсорбции молекул. Показана важная роль гетероатомов и электроно-донорных заместителей в молекулах и анионов электролита в создании определенной геометрии адсорбции. Показано, что спектры ГКР зависят от потенциала поверхности; определены основные причины этой зависимости.

Вместе с тем, остается не рассмотренным ряд вопросов, связанных с особенностями усиления ГКР молекул, адсорбированных на различного типа ГКР-активных поверхностях. Очень мало экспериментальных работ, в которых в комплексе исследуются структура и оптические свойства поверхности металла и спектры ГКР адсорбированных молекул различного типа. Поэтому результаты спектральных измерений одних и тех же молекулярных систем, полученных различными авторами и в различных экспериментальных условиях, зачастую противоречивы и их трудно обобщить. Не установлены спектральные критерии проявления определенной геометрии адсорбции молекул, содержащих различного типа адсорбционные центры. Мало известно о спектральных 'Проявлениях

специфических межмолекулярных взаимодействий в адсорбционном слое.

При изучении физических механизмов гигантского КР, как правило, не затрагиваются другие виды вторичного излучения, в частности люминесценция. Вместе с тем, изучение такого явления как люминесценция имеет самостоятельную научную и практическую ценность для фотофизики адсорбированных молекулярных систем.

Среди многочисленных исследований прикладного характера с использованием метода ГКР по количеству публикаций явно превалируют работы биологического плана. В настоящее время данный метод эффективно используется при исследовании самых сложных биомолекулярных комплексов и живых клеток. Однако при решении задач биомолекулярной структуры самой серьезной и неразрешенной проблемой является вопрос о нативности молекул. Сложность здесь заключается в том, что на практике не удается осуществить независимый контроль нативности молекул в тех же экспериментальных условиях, в которых регистрируются спектры. Поэтому вопрос о взаимосвязи спектров ГКР со структурно-функциональным состоянием биомолекул в адсорбционном слое является злободневным.

Целью данной работы было исследование механизмов усиления ГКР света адсорбированных молекул поверхностью тонких пленок серебра и серебряных электродов, а также особенностей проявления в спектрах ГКР и люминесценции структурной организации находящихся в адсорбционном слое молекулярных систем (от простых органических молекул до сложных биомолекулярных комплексов).

Достижение указанной цели предполагало решение

следующих задач:

1. Модернизация существующих и разработка новых способов получения ГКР-активных шероховатых поверхностей серебра.

2. Экспериментальное исследование спектров ГКР широкого класса органических молекул различного химического строения и с различными оптическими характеристиками, адсорбированных на различного типа поверхностях.

3. Изучение зависимости коэффициента усиления ГКР от длины волны возбуждения и от расстояния между молекулами и поверхностью с различной шероховатостью и выявление таким образом основных закономерностей усиления.

4. Исследование влияния специфических межмолекулярных взаимодействий в приповерхностном слое на спектры ГКР и ГРКР органических молекулярных комплексов.

5. На основе отнесения полос спектров ГКР производных тиамина построение моделей структуры комплекса молекула-металл при различных потенциалах поверхности.

6. Исследование характера изменений спектрально-кинетических характеристик флуоресценции ряда хромофоров при их адсорбации на специфических поверхностях серебра и оценка возможности использования усиленной поверхностью флуоресценции для исследования адсорбированных монослоев биомолекул.

7. Получение и интерпретация спектров ГКР адсорбированных пируватдекарбоксилазы, алкогольоксидазы и различных форм гемоглобина и выявление спектральных критериев оценки их функционального состояния.

Связь работы с крупными научными программами.

темами.

Исследования по теме были начаты в 1978 году в Гродненском госуниверситете им. Я.Купалы на кафедре общей и теоретической физики, где и были получены основные результаты. Работа выполнялась в соответствии с планами важнейших исследований РБ по программе "Спектроскопия", заданиями Министерства образованя и науки РБ и в рамках международного проекта "Новейшие спектроскопические подходы к изучению биомолекулярной структуры на молекулярном и клеточном уровнях", выполняемого совместно с Институтом биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Россия), Йоркским университетом (Англия), Реймским университетом (Франция), Институтом химфизики Макса Планка в Мюльхейме (Германия) и Сельскохозяйственным институтом в Афинах (Греция) и поддерживаемого ассоциацией ШТАБ (грант № 93-1829).

Научная новизна работы заключается в том, что в ней

впервые:

1. Исследованы механизмы усиления ГКР и ГРКР для широкого класса ароматических и гетероциклических молекул с поверхностно-активными и неактивными заместителями, адсорбированных на различного типа шероховатых поверхностях серебра. На основании полученных результатов сформулирован единый подход к объяснению

причин различия спектров поверхностно усиленного и обычного КР или РКР, который основан на взаимодействии коллективных электронных резонансов поверхности с тс-электронами молекул и влиянии внутримолекулярных колебаний на эффективность этих взаимодействий.

2. Путем высокотемпературного отжига получены ГКР-активные серебряные островковые пленки с близким к синусоидальному профилем и благодаря этому имеющие в фиолетовой области полосу плазмонного возбуждения с полушириной около 90 нм; они обладают и обладающие существенно большим дальнодействием усиления ГКР. Показаны преимущества данных пленок перед традиционно используемыми для получения спектров ГКР положительно заряженных и незаряженных органических молекул, а также при работе с такими растворителями как ацетонитрил и спирты.

3. Обнаружена активация ГКР молекулярных систем, адсорбированных на островковых пленках, неорганическими и органическими анионами. Показано, что это явление связано с усилением специфического взаимодействия молекул с поверхностью. Обнаружено, что в случае осаждения на серебряные островковые пленки молекул спиропиранов из растворов, специфические взаимодействия с молекулами растворителя и поверхностью приводят к раскрытию пиранового кольца.

4. Методом ГКР впервые исследованы структурно-конформационные состояния производных тиамина, а также специфические взаимодействия гемина с имидазалом, производных тиамина с пируватом, ионами двухвалентных металлов и аминокислотами в адсорбированном состоянии. Показано, что структура образующихся при этом комплексов зависит от потенциала поверхности.

5. Обнаружено, что функциональное состояние тиаминкиназы, алкогольоксидазы, пируватдекарбоксилазы и гемоглобина (в эритроцитарных клетках) имеет четкие проявления в характеристиках ГКР. Установлено, что адсорбированная на ГКР-активных субстратах белковая система при определенных условиях сохраняет ферментативную активность.

6. На примере связанного с сывороточным альбумином человека зонда 2-п-толуидиннафталинсульфоната показано, что в случае адсорбции белков на ГКР-активных поверхностях можно добиться усиления флуоресценции поверхностью.

Практическая значимость полученных результатов.

Выявленные спектральные особенности проявления электромагнитных и химических механизмов усиления ГКР для различных классов (ароматические и гетероциклические) органических молекул могут быть основой для интерпретации спектров ГКР такого типа молекул, адсорбированных на различного типа поверхностях.

Созданные новые ГКР-активные субстраты с большим дальнодействием усиления в виде отожженных островковых пленок серебра могут быть широко использованы для анализа структуры органических молекул в адсорбированном состоянии, а также различных пигментов в составе белков и биомембран, находящихся вдали от их поверхности. Они уже сегодня используются для этих целей в Реймском университете (Франция) и Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина РАН (Москва).

Предложенная методика получения спектров ГКР сложных молекулярных комплексов,, а также их интерпретация могут быть использованы для изучения различных молекулярных систем в адсорбированном состоянии.

Выводы о конформационном состоянии адсорбированных молекул, о существовании специфического взаимодействия между тиамином и пируватом в приповерхностном слое, а также о влиянии ионов двухвалентных металлов и гистидина на структурно-конформационное состояние адсорбированного тиамина могут быть использованы для моделирования микроокружения активных центров

пируватдегидрогеназного ферментативного комплекса. Кроме того, установление специфичности вышеупомянутых взаимодействий может быть принято за основу при разработке конкретных путей иммобилизации ферментных комплексов на базе пируватдекарбоксилазы.

Подобранные условия адсорбции на шероховатой поверхности серебра, при которых сохраняется активность алкогольоксидазы, могут быть использованы, во-первых, для разработки и создания биосенсоров с ГКР-регистрацией, и, во-вторых, в соответствующих областях биотехнологии для создания систем на основе иммобилизованного фермента.

Обнаруженные эффекты усиления шероховатой поверхностью серебра флуоресценции некоторых хромофоров, связанных с белками, свидетельствуют о перспективности использования таких поверхностей в иммуноферментном флуоресцентном анализе и возможности создания

нового информативного метода для детектирования структуры и динамики биомолекулярных слоев.

Экономическая значимость.

Реализация предложенных в диссертации путей практического использования результатов исследований позволит создать ряд простых высокочувствительных аналитических методик для биохимии и медицины, способных упростить или заменить дорогостоящие биохимические методики. Устаноаяенные в работе факты отщепления витаминов от природных белков при электрохимических процессах указывают на возможный путь получения витаминов из отходов биотехнологического производства.

Защищаемые положения

1. Вывод о вкладах и спектральных проявлениях электромагнитных и химических механизмов усиления ГКР для ряда ароматических и гетероциклических молекул, адсорбированных на серебряных островковых пленках и анодированных электродах, основанный на функциональной взаимосвязи между спектрами ГКР и микроструктурой поверхности.

2. Обоснование спектральных особенностей ГКР и ГРКР сложных органических молекул с точки зрения влияния внутримолекулярных колебаний на эффективность взаимодействия локализованных поверхностных плазмонов с 7С-электронами молекул.

3. Заключение о спектральных критериях оценки структурно-конформационных состояний производных тиамина и ФАД, а также тиамин-, флавин- и гемсосодержащих молекулярных ансамблей и рекомендации к их практическому использованию в аналитических целях; вывод об индуцировании ГКР-активной поверхностью комплексообразования тиамина с пируватом и гистидином.

4.Спектральные особенности флуоресценции зонда 2-п-толуидиннафталинсульфоната, связанного с альбумином, и 1,3,5-трифенилпиразолина, адсорбированных на серебряных островковых пленках, проявляющиеся в результате электромагнитного усиления свечения поверхностью.

5. Способ получения новых ГКР-активных субстратов путем высокотемпературного отжига тонких серебряных пленок, увеличивающего дальнодействие усиления ГКР и селективность в детектировании положительно заряженных органических молекул.

Апробация работы.

Результаты диссертации дакладывагись: на XX Всесоюзном съезде по молекулярной спектросколии (Киев, 1988); XII Всесоюзном совещании "Применение колебательных спектров к исследованию неорганических и координационных соединений" (Минск, 1989); VII конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991); XXI, XXII и XXIII Международной конференции по Раман спектроскопии соответственно в Колумбии . (США, 1990), Вюрцбург (Германия, 1992) и Гонг Конге, (1994); XII, XVII и XVIII Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии соответственно в Загребе (Югославия, 1991), Вене (Австрия, 1992) и Эссене (Германия, 1994); Питтсбургской международной конференции по аналитической химии и прикладной спектроскопии в Атланте (США, 1993) и Чикаго (США, 1994); V, VII и VIII Международной конференции по спектроскопии биомолекул соответственно в Иорке (Англия,. 1991), Лаутраки (Греция, 1993) и Лилле (Франция, 1995); III и IV Международной конференции по лазерам в науках о жизни в Юваскула (Финляндия, 1992) и Минске (1994); I и И Международной конференции по лазерной физике и спектроскопии (Гродно, 1993 и 1995); 1-ом съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994); Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (С.-Петербург, 1995).

Опубликованность результатов.

Основные результаты работы опубликованы в 33 статьях в журналах, 10 статьях в сборниках материалов международных конференций и 22 тезисах докладов конференций и совещаний.

Личный вклад автора.

В диссертации изложены результаты работ, выполненных автором лично и под его руководством вместе с учениками Н.Д. Стрекаль и Г.Т. Василюком, В.Г. Заневским. Профессор Л.Н. Кивач, являясь научным консультантом, оказывал помощь в постановке научных задач. Доценты Г.А. Гачко и A.A. Маскевич, а также ведущий научный сотрудник С.Г. Подтынченко оказывали помощь в проведении экспериментов, обработке и обсуждении полученных результатов. Ведущий научный сотрудник И.П. Черникевич, ведущий научный сотрудник Д.А. Опарин и старший научные сотрудники И.М. Арцукевич и И.Б. Заводник -сотрудники Института биохимии АН РБ готовили препараты для исследования и проводили цикл биохимических исследований,

относящихся к изучаемым объектам. Сотрудники Института биоорганической химии РАН И.Р. Набиев, К.В. Соколов и П.В. Ходорченко оказывали помощь в освоении методики ГКР, обсуждении результатов и проводили ряд контрольных измерений. Ведущий научный сотрудник Отдела ресурсосбережения АН РБ И.Ф. Свекло оказал помощь в получении изображений поверхности серебра с помощью атомно-силовой микроскопии. Вклад автора диссертации в указанные выше публикации заключался в определении направления и постановке конкретных задач исследования, в разработке методик исследования и выборе объектов, непосредственном участии в выполнении измерений, анализе и обобщении полученных результатов.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, б глав, выводов и списка цитируемой литературы. Полный объем работы составляет 270 страниц, включая 96 рисунков, 13 таблиц и 282 наименования цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована цель работы, ее научная новизна и практическая значимость, изложены основные защищаемые положения и краткое содержание работы.

Первая глава содержит краткий обзор литературных данных, посвященных физической сущности явления ГКР, основным экспериментальным системам для наблюдения данного явления, его применению к исследованиям биомолекулярной структуры и особенностям люминесценции молекул, адсорбированных на поверхности металлов.

В соответствии с общепринятым подходом анализ теоретических моделей сделан исходя из того, что интенсивность КР определяется величиной индуцированного внешним электромагнитным полем с напряженностью Е(ш) дипольного момента Р(о) в молекуле, обладающей поляризуемостью а(га).

Р(со ) = а(ю)хЕ(о)

(I)

По этой причине все модели, объясняющие явления ГКР, разделены на две группы. Первую составляют те, что рассматривают изменение поляризуемости молекул при адсорбции на шероховатых поверхностях металлов и таким образом, базируются на короткодействующем "химическом" характере усиления. Во вторую группу включены модели, которые исходят из увеличения напряженности Е(ю) локального поля возбуждающей волны. В обоих случаях специфические свойства поверхности играют существенную роль. Отмечено, что в настоящее время нет единой теории объясняющей все особенности явления ГКР даже качественно.

Среди экспериментальных систем, известных в настоящее время, основное внимание уделено анализу достоинств и недостатков таких как анодированные серебряные электроды в электрохимической ячейке, гидрозоли серебра и серебряные островковые пленки. Рассмотрены основные технологические приемы их получения и методы адсорбции молекул. Анализ литературных данных показал явный недостаток работ, посвященных связи экспериментальных условий получения ГКР-активных поверхностей, характера и размеров шероховатостей, с одной стороны, и их оптических свойств, с другой.

При рассмотрении работ, посвященных особенностям флуоресценции молекул, адсорбированных на ГКР-активных поверхностях серебра обращено внимание, что для молекул с низким квантовым выходом теоретически возможно усиление свечения поверхностью. Вместе с тем в экспериментальном плане этот вопрос практически не. разработан.

Анализ многочисленных работ о биологических приложениях ГКР показал, что основное внимание в литературе уделяется исследованию отдельных аминокислот, белковых систем, нуклеиновых кислот, лекарственных препаратов, их комплексов с биологическими структурами на молекулярном и клеточном уровнях. Основной трудностью, с которой сталкиваются исследователи при интерпретации экспериментальных результатов является то, что не решен вопрос о методах контроля нативности биосистемы в адсорбированном на шероховатых поверхностях серебра состоянии. По этой причине противоречивы многие результаты, полученные для одних и тех же биомолекулярных структур, но в различных условиях.

Во второй главе изложены разработанные и использованные методики получения ГКР-активных поверхностей серебра и проведения экспериментов с регитрацией спектров ГКР и спектрально-кинетических характеристик люминесценции молекул и

надмолекулярных комплексов, описаны обьеты исследования и обоснован их выбор.

В качестве экспериментальных систем для получения ГКР использованы электрохимическая ячейка, гидрозоли серебра, серебряные островковые пленки. Электрохимическая ячейка с серебряным рабочим электродом, заполненная 0,1 М раствором NaCl, подключалась к обычной схеме потенциостатирования. Анодирование электрода производилось путем проведения окислительно-восстановительного цикла (ОВЦ) при изменении потенциала электрода от - 0,65 В, соответствующего потенциалу нулевого заряда серебра, до +0,2 В и обратно. Исследуемые вещества добавлялись в электролит до или после ОВЦ. Контроль за степенью анодирования осуществляли по вольт-амперограмме, а также с помощью атомно-силовой и туннельной микроскопии (АСМ). Боргидридные и цитратные гидрозоли серебра готовили по стандартным методикам. Серебряные островковые пленки получали в вакуумном посте ВУП-5 с термическим испарителем при давлении остаточных газов 10"5 Тор на стеклянных или кварцевых подложках. Варьирование толщиной пленок осуществлялось за счет изменения массы испаряемого серебра. Контроль за толщиной и оптическими свойствами пленок осуществляли с помощью АСМ-метода и спектрофотометрически. Для получения пленок с различным положением полосы плазмонного поглащения в интервале 300-800 нм была разработана специальная процедура отжига при 350°С.

Измерения спектров KP производили на спектрометре ДФС-52 (J10M0, Россия). В качестве источника возбуждения использовали ионный аргоновый лазер ILA-120 (Karl Zeiss, Германия). Спектрометр CDL-2 (ЛОМО, Россия) использовали для измерения спектральных и поляризационных характеристик стационарной флуоресценции образцов. Кривые затухания интенсивности флуоресценции исследовали с помощью созданного в лаборатории импульсного спектрофлуориметра с одноквантовой статистической регистрацией кривых высвечивания. Для обращения экспериментальных сверток были разработаны программы с использованием алгоритмов Пауэлла и Марквордта, основанные на аналитическом представлении истинных кривых затухания флуоресценции в виде суммы экспонент или непрерывного распределения излучателей по длительностям. Описан также пакет полуэмпирических квантовохимических расчетов частот и форм колебаний МОРАС, в котором реализовано приближение ПДДП (пренебрежение двухатомным дифференциальным перекрыванием).

Использованные для исследования обьекты разделены на три группы/ Первую группу образуют соединения, которые были специально подобраны для выяснения физических аспектов явлений ГКР и люминесценции адсорбированных молекул. Среди них ароматические молекулы, неспособные к хемосорбции и молекулы, содержащие гетероатомы и полярные группы, играющие определяющую роль в адсорбции молекул. Длинноволновые полосы поглощения исследованных соединений (всего 31) образованы п-мг*, п—>% или 71[—мг* переходами; они перекрывают спектральный интервал от 250 до 700 нм. Вторую группу образуют различной степени сложности соединения, которые использованы для изучения спектральных проявлений комплексообразования в одсорбционном слое. Сюда входят спиропираны, гемин, производные тиамина, имидазол и некоторые другие молекулы, комплексообразование которых в растворах либо уже изучкно, либо интересно с практической точки зрения. Третью группу составляют белки пируватдекарбоксилаза, тиаминкиназа, алкогольоксидаза, гемоглобины и клетки эритроцитов.

Третья глава посвящена исследованию механизмов усиления ГКР молекул, адсорбированных на тонких серебряных пленках (ТСП).

Шероховатость поверхности тонких серебряных пленок варьировали путем отжига при 350°С. Обнаружено, что в результате отжига формируются серебряные пленки, профиль которых напоминает синусоидальную форму, а отдельные островки имеют вид полуэллипсоида с размерами 100x100x8 нм. На рис. 1а,б показаны топография поверхности и спектр поглощения о-ТСП, а на рис.2а,б - н-ТСП. Структурные изменения пленки приводят к смещению полосы поглощения, связанной с возбуждением продольных поверхностных плазмонов, от 600; 700 нм до 450 нм и ее сужению до 90 нм на полувысоте. Исследования показали, .что о-ТСП обладают значительно большим дальнодействием усиления резонансного ГКР (ГРКР). Из рис. 1в и 2в следует, что если между молекулами родамина 6Ж (Р6Ж) и пленкой находится 5 монослоев стеориновой кислоты, то в случае н-ТСП сигнал ГРКР не регистрируется, а в случае о-ТСП является достаточно интенсивным. Зависимость интенсивности сигнала ГРКР от числа монослоев может быть оппроксимирована экспонентой. Данная зависимость отражает характер изменения коэффициента усиления ГРКР при увеличении расстояния между молекулами и поверхностью. Важная роль специфических взамодействий молекул с поверхностью в формировании спектров ГРКР вытекает из результатов исследования

Рис.1. Микроскопические и оптические характеристики о-ТСП и Р6Ж: АСМ-изображение поверхности (а) и спектры поглощения (б) о-ТСП; спектры ГРКР Р6Ж (в), адсорбированного из ацетонитрильного раствора на о-ТСП, непокрытой (1) и покрытой 1 (2) и 5 (3) монослоями СК. Я.в =514,5 нм. На вставке зависимость интенсивности полосы 1650см"1 от числа монослоев СК и ее аппроксимация экспонентой.

родамина 6Ж, адсорбированного на ТСП из водно-солевого раствора. Была обнаружена активация ГРКР родамина 6Ж (увеличение интенсивности сигнала примерно в 5 раз для н-ТСП) ионами С1\ Анализ особенностей спектров ГРКР Р6Ж, флуоресцеина Ыа и рибофлавина, полученных с помощью н-ТСП и о-ТСП, показал, что отожженные пленки избирательно усиливают интенсивность ГКР положительно заряженных и незаряженных органических молекул.

Рис.2. Микроскопические и оптические характеристики н-ТСП и адсорбированного на ней Р6Ж. Обозначения как на рис.1.

Для оценки вкладов электромагнитных и химических механизмов в усиление ГКР молекул неокрашенных веществ были получены спектры ГКР пирена, 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГТ), имидазола и 1,3,5-трифенилпиразолина (ТФП), адсорбированных на н-

ТСП и о-ТСП, при А=514,5 и 457,9 нм. Во всех случаях за исключением имидазола наиболее интенсивными являются полосы в области 1600 см-1, что свидетельствует об особой важности для усиления ГКР взаимодействий поверхностных плазмонов с л-электронной системой молекул. В ГКР спектре имидазола активны деформационные колебания 1М-Н-связи, указывающие на важную роль гетероатомов в адсорбции молекул.

В результате исследования спектров ГКР стирилпроизводных фталилия и ' тиофталилиевых производных пиразолина, адсорбированных на серебряных островковых пленках, установлено, что поверхностно активные заместители (ОН, N02, ОСН3) влияют на интенсивность полос спектров главным образом за счет формирования определенной геометрии адсорбции молекул на поверхности. Колебания этих заместителей активны в спектрах ГРКР. Кроме того, как показали наши исследования, высокой интенсивностью отличаются колебания метальных и толильных заместителей, которые контактируют с поверхностью, но не могут обеспечивать хемосорбцию молекул. Сделан вывод о том, что активность колебаний заместителей в спектрах ГКР определяется тем, в какой степени эти колебания влияют на взаимодействие поверхностных плазмонов с я-электронной системой молекул.

В четвертой главе на примере производных тиамина (рис.3) и флавинадениндинуклеотида (рис.4) исследуется роль химических и электромагнитных механизмов в усилении КР молекул, адсорбированных на анодированных серебряных электродах.

и, - 1ЧН2 , 1?2 - С2Н4ОН -Тиамин (Т) 1?1 - Н, п2 - С2Н4ОН - 4'-дезамино-Т 1*1 - ОН , Е2 - С2Н4ОН - 4'-окси-Т

1*1 - ш3, щ - С2Р2О7Н7 -ТДФ.

Рис.3. Структурные формулы исследованных производных Т.

Представлены результаты исследования степени шероховатости поверхности анодированного электрода и зависимость ГКР сигнала тиамина и ФАД от условий анодирования, а также зависимость спектров ГКР пиримидинового аналога тиамина от длины волны возбуждения. Анализ полученных результатов показал, что увеличение

Ч-з -О" 1} I ©// ч\

н сн,

суммарного заряда (3 приводит к изменению сигнала ГКР адсорбируемых молекул и не сопровождается изменением относительных интенсивностей отдельных полос в спектрах. Исследование поверхности электрода с помощью атомно-силового микроскопа до и после анодирования показало, что проведения ОВЦ в режиме ((3=12 мКл), который соответствует максимальному сигналу ГКР, на поверхности рабочего электрода образуются случайные шероховатости, средние геометрические размеры которых (5«150 нм) могут обеспечить усиление КР за счет возбуждения продольных локализованных плазмов.

о

Рис.4. Структурная формула изоаллоксазинового цикла флавинадениндинуклеотида (ФАД).

С целью оценки вкладов электромагнитных и химических механизмов в усилении ГКР тиамина было изучено влияние длины волны возбуждения на спектры ГКР для молекул структурного аналога его пиримидинового компонента при различных длинах волн возбуждения. Зарегистрирован резонансный рост интенсивности полос 220 и 765 см-1, связанных с колебаниями связи молекула-металл и гетероциклического кольца, при переходе к возбуждению в красную область спектра. Данный результат указывает на химический механизм усиления интенсивности ГКР этих полос, связанного с образованием комплекса с переносом заряда молекула-металл. В то же время слабая зависимость интенсивности полос 782 и 1380 см*1 от длины волны возбуждения свидетельствует в пользу дальнодействующего механизма усиления их интенсивности. Существенно, что соотношение вкладов короткодействующих и дальнодействующих механизмов усиления нечувствительно к степени анодирования. Исследования, выполненные нами на ферментных системах, показывают, что для того, чтобы зарегистрировать ГКР сигнал тиамина или ФАД, встроенных в сложную белковую глобулу, необходим непосредственный контакт последних с поверхностью. Это означает, что включение электромагнитного механизма является необходимым, но не

и

достаточным условием для регистрации спектров ГКР указанных молекулярных систем.

Разделение вкладов колебаний тиазолового и пиримидинового компонентов в образование полос в области 600-700 см-1 произведено на основании сравнения спектров ГКР 4-метил-5-оксиэтилтиазола в цитратном и 2-метил-4-амино-5-зтоксиметил-П в боргидридном гидрозолях серебра. Показано, что полосы с частотами около 750, 1218, 1280 и 1600 см-1 соответствуют усиленным поверхностью колебаниям пиримидинового компонента тиамина, а смещены полосы 1600 см-1 к положению 1640 см1 однозначно свидетельствует о состоянии протонирования пиримидинового компонента адсорбированного тиамина. Полосы с частотами 660 и 680 см-1 принадлежат усиленным поверхностью колебаниям тиазолового компонента тиамина. Соотношение "интенсивностей полос 1218, 1280 см-1, а также 680 и 750 см-1 является спектральным критерием оценки геометрии адсорбции молекул тиамина и его производных.

На основании анализа зависимости относительных интенсивностей полос 240, 668 и 1639 см-1 от потенциала электрода при рН электролита 3,5 показана активная роль ионов хлора в адсорбции протонированных молекул тиамина. Константа скорости реакции протонирования в адсорбционном слое имеет значение, по крайней мере, меньшее или равное 3,1, что существенно отличается от рК для раствора (4,9).

Исходя из представлений о возможных конформациях молекул производных тиамина в растворах и кристаллах и рассмотренных выше спектров ГКР, предложены модели комплекса молекула-металл для различных потенциалов электрода.

В пятой главе методом ГКР исследуются спектральные проявления специфических межмолекулярных взаимодействий в приповерхностном молекулярном слое.

Обнаружено, что вследствии адсорбции молекул спиропиранов происходит раскрытие ССШ!ро - О-связи. В спектре ГКР отсутствует полоса около 1640 см"1, наиболее характеристичная для циклических форм пиранов. Анализ спектров ГКР показал, что при нанесении на поверхность этанольного раствора преимущественно образуются открытые формы молекул спиропирана в транс-конфигурации, а в случае толуольного раствора в цис-конфигурации. Важную роль в диссоциации спиропирана на шероховатой поверхности серебра играют специфические взаимодействия гетероатома О с металлом и молекулами растворителя, находящимися в адсорбционном слое.

Интенсивность сигнала ГКР убывает в последовательности использованных растворителей: этанол, ацетонитрил, бутанол, толуол, гептан.

Важнейшая роль растворителя в формировании спектров ГКР органических молекул, адсорбированных на серебряных островковых пленках из растворов, проявилась при исследовании имидазола. Было обнаружено, что при переходе от этанольного раствора к водно-этанольному изменяется относительная интенсивность полос 1160, 1140 и 1260 см-1, вклад в образование которых вносят деформационные колебания N-H-связи. Активность в спектрах ГКР колебаний данной связи зависит также от наличия пировиноградной кислоты (ПК) или пирувата в исходном растворе имидазола. Интерпретация экспериментальных данных дана в рамках модели, учитывающей короткодействующий характер усиления ГКР и исходя из способности имидазола. образовывать специфические комплексы с ПК и пируватом. На основании экспериментальных данных предложены модели комплексов имидазол+ПК и имидазол+пируват.

Исследованы особенности проявления в спектрах ГРКР структуры комплекса гемина с имидазолом, нанесенных на серебряные островковые пленки. При добавлении имидазола в исходный раствор гемина обнаружены изменения в спектре ГРКР последнего. Уменьшается интенсивность полос 1623 и 1568 см-1 и появляются новые полосы при 1639, 1591 и 677 см"1. Эти изменения свидетельствуют о том, что молекулы гемина и имидазола, адсорбированные на поверхности, находятся в виде комплекса. Данный комплекс можно охарактеризовать как планарный шестикоординатный с низкоспиновым состоянием иона Fe(ll). Исходя из температурной зависимости спектров ГРКР, определена энергия активации Еа комплекса. Полученное значение Еа (60 кДж/моль) больше, чем в растворах (45 кДж/моль).

Изучено влияние триптофана, гистидина, пирувата и ионов Мп2+ на спектры ГКР производных тиамина, адсорбированных на анодированных электродах в электрохимической ячейке. При добавлении в электрохимическую ячейку, содержащую 0,1 моль/л NaCl и ICH моль/л тиаминдифосфата, соли МпС12 (10"3-10"2 моль/л) в 5-7 раз увеличивается интенсивность и смещаются полосы спектра ГКР тиаминдифосфата (749-»754, 1210-»1216, 1632^-1646 см1); в 2-3 раза возрастает относительная интенсивность полосы 680 см"1. Сделан вывод, что в результате комплексообразования уменьшается угол между пиримидиновым и тиазоловым циклами тиаминдифосфата и

изменяется геометрия адсорбции молекул на поверхности. Комплексообразование между тиамином и триптофаном вблизи поверхности электрода проявляется в смещении на 5-10 см1 ряда полос спектров ГКР как тиамина, так и триптофана. Обнаружено комплексообразование вблизи поверхности электрода тиамина с пируватом и тимина с гистидином. Комплексообразование тиамина с пируватом проявляется в увеличении относительной интенсивности полосы 0(С-5) 680 см'1 и изменении характера ее зависимости от потенциала электрода. Комплексообразование тиамина с гистидином сопровождается появлением полосы 1640 см'1, которая указывает на протонирование молекул витамина.

Шестая глава посвящена изучению возможностей методов ГКР и флуоресценции в решении вопросов о структурно-функциональных состояниях сложных биомолекулярных ансамблей, адсорбированных на поверхности.

С использованием электрохимической ячейки получены спектры ГКР фракций тиаминкиназы с различной ферментативной активностью. В результате биохимических и люминесцентных исследований установлено, что эти фракции отличаются четвертичной структурой молекул белка (тетрамер и октамер). Установлена корреляция значений параметров собственной флуоресценции и ферментативной активности при изменении соотношения концентраций данных форм в растворе. Подобраны режимы ОВЦ и специальные методики адсорбции, позволившие зарегистрировать в составе тиаминкиназы низкомолекулярный лиганд. Сделан вывод, что обнаруженный лиганд является функционально важным структурным элементом белка, выполняющим роль кофактора.

Спектры ГКР пируватдекарбоксилазы удалось получить в условиях частичной диссоциации холофермента в процессе проведения ОВЦ в электрохимической ячейке. В результате спектрально-кинетических исследований собственной флуоресценции белка и с использованием зонда 2-п-толуидиннафталинсульфоната и флуоресцентной метки тиахромдифосфата установлено, что активный центр пируватдекарбоксилазы представляет собой гидрофобную полость, в которой ТДФ зафиксирован как минимум двумя центрами: фосфатной группой и атомом N(1). Близость конформации ТДФ в составе пируватдекарбоксилазы и в модельной системе ТДФ+Л^2++Ад-электрод подтверждается одинаковым характером зависимости спектров ГКР от потенциала электрода в обоих случаях.

С использованием специальной методики получены спектры ГКР адсорбированной алкогольоксидазы. Установлено, что сигнал ГКР принадлежит окисленной форме ФАД. При адсорбции алкогольоксидазы имеет место частичная диссоциация белка. Исследования зависимости ГКР-спектров от потенциала электрода показали, что при изменении потенциала от -0,65В до -0,1В происходят обратимые процессы окисления - восстановления связанного с бел ком ФАД. Иммобилизованная на анодированных электродах алкогольоксидаза сохраняет способность к связыванию этанола, а в случае иммобилизации на серебряных островковых пленках сохраняется активность фермента. Параметром спектра ГКР, наиболее чувствительным к структурным превращениям микроокружения активного центра белка, является полоса около 1260 см"1. Обнаружено, что эффективность связывания с белком изоаллоксазинового компонента ФАД зависит от четвертичной структуры глобулы; они различны для алкогольоксидазы из Pichia Pastoris и Candida Boidinii. Эффективность связывания ФАД с белком повышается при добавлении в раствор NaN3-

Получены спектры ГРКР различных форм гемоглобина и клеток эритроцитов, осажденных на ТСП. Показано, что при данных условиях адсорбции спиновое состояние иона Fe гема не изменяется. Анализируются причины спектральных отличий гемоглобина и эритроцитов с точки зрения различия вкладов электромагнитных и химических механизмов усиления ГКР. Относительная интенсивность полос Ую, и Узд (~1600 и 1580 см-1) является наиболее чувствительным параметром в этом плане. Она последовательно увеличивается в серии спектров: комплекс гемин+имидазол, гемоглобин, эритроциты. Колебаниями, чувствительными к изменению формы гемоглобина в эритроцитах являются Ую, V2, V3, 5S(C=C), V4 и v6. При этом окси-форма НЬ имеет значения частот данных колебаний: 1634, 1555, 1491, 1441, 1373 и 990 см1; мет-форма: 1633, 1569, 1493, 1432, 1369 и 996 см1; карбокси-форма: 1635, 1557, 1490, 1433, 1373 и 995 см1; дезокси-форма: 1622, 1553, 1499, 1440, 1364 и 1004 см1. Отмечено, что разработанные в спектроскопии РКР критерии оценки структурно-функционального состояния гема в гемоглобинах, для спектроскопии ГРКР эритроцитов не применимы.

На примере нейротоксина II, 2-п-толуидиннафталинсульфоната (ТНС), связанного с сывороточным альбумином человека, и трифенилпиразолина (ТФП) исследованы некоторые закономерности изменения параметров флуоресценции при адсорбции

флуорофорсодержащих систем на различных поверхностях. Зарегистрировано тушение флуоресценции находящегося у поверхности триптофанового остатка нейротоксина II и связанного с альбумином ТНС после их адсорбции на ТСП. Усиление флуоресценции ТНС обнаружено в случае использования в качестве сорбента ТСП, покрытой монослоем альбумина, а также в случае нанесения ТФП на отожженную ТСП и последующего фотооблучения.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ

1.На основании анализа зависимости спектров от длины волны возбуждения и расстояния между молекулами и ГКР-активной поверхностью серебра выявлена роль дальнодействующих электромагнитных и короткодействующих химических механизмов в усилении интенсивности ГКР. Установлено, что в случае ароматических молекул, одсорбированных на ТСП, усиление определяется взаимодействием поверхностных плазмонов с к-электронной системой; в случае гетероциклических молекул, адсорбированных на ТСП или Ад-электродах специфические особенности спектров ГКР обусловлены образованием комплекса с переносом заряда между молекулой и металлом. Установлена и обоснована взаимосвязь между шероховатостью исследованных ГКР-активных поверхностей и проявлением короткодействующих и дальнодействующих механизмов усиления. Наибольшее дальнодействие усиления обнаружено для 0-ТСГ1, имеющих близкую к периодической островковую структуру.

2. Базируясь на выполненных полуэмпирических расчетах методом ПДДП частот и форм нормальных колебаний структурных аналогов пиримидинового и тиазолового компонентов тиамина, проведено отнесение спектральных полос тиамина и его производных, адсорбированных на анодированных А£-электродах при потенциалах -0,65 - -0,1В и рН электролита 2,0-8,0. Сделан вывод об определяющей роли короткодействующих механизмов усиления ГКР, выработаны спектральные критерии оценки структурно-конформационных состояний адсорбированных молекул производных тиамина. В качестве таких критериев предложены относительные интенсивности полос, связанных с валентными и деформационными колебаниями с участием атома 5 (-680см"1), МН2-группы (~1215 и 1640см"1) и пиримидинового кольца в целом (~750 и 1280см'1).

3. На основании изучения влияния на спектры ГКР поверхностноактивных группировок в адсорбированных на ТСП и серебряных электродах молекулах производных пиразолина, фталилия и тиамина сделано заключение, что относительная интенсивность полос спектров ГКР определяется прежде всего их влиянием на эффективность взаимодействия поверхностных плазмонов' с тс-электронной системой 'молекул. Установлено, что в результате самосборки серебра в ТСП, нагретых до 350°С, в островки полуэлипсоидальной формы с характерными размерами 100x100x8 нм,

. формируется узкая полоса плазмонного возбуждения с максимумом около 450 нм.

4. Установлены причины зависимости спектров ГКР производных тиамина и ФАД от потенциала серебряного электрода. Показано, что это связано с потерей слабосвязанных протонов при адсорбции молекул (для протонированной формы тиамина), с восстановлением молекул ФАД и наличием у молекул тиамина двух основных адсорбционных центров (ЫНг-группа и гетероцикл) с различным потенциалом взаимодействия с поверхностью. Определены значения потенциалов электрода, при которых проявляется та или иная форма молекул данных соединений и предложены модели комплексов молекула-металл для тиамина и 4'-окси-Т.

5. Изучено влияние специфических межмолекулярных взаимодействий в приповерхностном адсорбционном молекулярном слое на спектры ГКР. Показано, что в результате этих взаимодействий в молекулах спиропирана фталанового ряда с поверхностью и растворителем происходит раскрытие пиранового кольца. Выявлена ассоциация вблизи серебряного электрода тиамина с гистидином, ионами Мп2+ и пируватом, а вблизи поверхности ТСП комплексообразование пирувата с ймидазолом и имидазола с гемином. На основании анализа спектров ГКР предложены модели структуры указанных комплексов, а также сделано заключение, что шероховатые поверхности серебра играют важную роль как активные компоненты, влияющие на межмолекулярные взаимодействия и структурно организующие адсорбционный молекулярный слой.

6. Установлена взаимосвязь характеристик ГКР и флуоресценции с функциональным состоянием ферментных комплексов. С использованием метода ГКР на примере пируватдекарбоксилазы и алкогольоксидазы разработана методика определения в составе белковых комплексов низкомолекулярных лигандов и характера их

связи с белком. Показано, что параметры спектров ГКР (относительная интенсивность полос в интервале 600-1400 см-1 ) и флуоресценции (положение максимума спектра и кинетика затухания) алкогольоксидазы и тиаминкиназы, так же как и их функциональные . свойства, определяются четвертичной структурой белковых молекул и присутствием эффекторов. При этом алкогольоксидаза, адсорбированная на анодированных электродах, сохраняет способность к связыванию субстратов, а адсорбированная на ТСП сохраняет ферментативную активность. Определены спектральные особенности ГРКР гемсодержащих молекулярных комплексов (от гемива до эритроцитов крови), связанные с присутствием того или иного лиганда (02, Н20, СО).

7. На основании анализа влияния адсорбции на параметры флуоресценции белковых хромофоров, зонда 2-н-тоуидиннафталин-6-сульфоната, а также производной пиразолина показано, что при непосредственном взаимодействии флуоресцирующих молекул с поверхностью серебра происходит тушение свечения, а в случае отдаленности флуорофоров от поверхности на' расстояния порядка одного мономолекулярного слоя возможно усиление интенсивности их свечения поверхностью. Предложен конкретный путь поиска поверхностей, способных обеспечивать усиление флуоресценции адсорбатов, и перспективных для этого молекулярных систем.

8. Путем высокотемпературного отжига ТСП получены новые ГКР-активные субстраты. Они имеют по сравнению с неотожженными ТСП положительные качества за счет дальнодействия и селективнасти усиления ГКР органических катионов, а также большего срока годности и устойчивости к действию органических растворителей.

Содержание диссертации отражено в следующих основных работах:

1. Гачко Г.А., Маскевич A.A., Маскевич С.А., Кивач J1.H. О природе полос поглощения аминопиримидинов //Докл. АН БССР.- 1979.-Т.23, № 10,- С.925-928.

2. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Коява В.Т., Маскевич С.А., Островский Ю.М., Саржевский A.M. Исследование низкотемпературной люминесценции производных тиамина в водных растворах //ЖПС.- 1983.- Т.38, № 3,- С.396-402.

3. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Подтынченко С.Г., Островский Ю.М. Изучение гидратации пировиноградной кислоты

методом комбинационного рассеяния света / / Докл. АН БССР. -1983,-Т.27, №10.- С.946-949.

4. Гачко Г.А., Кивач JI.H., Маскевич С.А., Островский Ю.М. Температурное тушение флуоресценции растворов тиамина //ЖПС,- 1984,- Т.41, №6.-.С.933-937.

5. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Подтынченко СТ., Островский Ю.М. Изучение спектров комбинационного рассеяния водных растворов пировиноградной кислоты //ЖПС.- 1984.- Т.41, №5,- С.757-763.

6. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. О спектральной неоднородности излучающих центров водных растворов производных тиамина //ЖПС.- 1984,- Т.40, № 5,- С.851-853.

7. Воронин В.Е., Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Маскевич A.A., Островский Ю.М.. Особенности межмолекулярного переноса энергии электронного возбуждения между тиамином и пировиноградной кислотой в растворах / /ЖПС. -1984!- Т.41, №1.-С. 159-162.

8. Степуро И.И., Заводник И.Б., Мороз А.Р., Маскевич С.А., Островский Ю.М., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. Структура и люминесцентные свойства пировиноградной кислоты в водных растворах/ / Ж. физ. химии,- 1984,- Т.58, № 4,- С.929-932.

9. Воронич В.Е., Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Маскевич A.A., Островский Ю.М. Влияние ионов Мп2+ и Zn2+ на низкотемпературную люминесценцию водно-солевых растворов производных тиамина //Докл. АН БССР. -1985. -Т.29, № 6,-С.561-564.

10. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Островский Ю.М., Подтынченко С.Г. Влияние ионов двухвалентных металлов на фосфоресценцию растворов пировиноградной кислоты //ЖПС. -1985. -Т.42, № 2,- С.282-285.

11. Гачко Г.А., Зубко И.Л., Зыбельт В. К., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Маскевич A.A. Тушение флуоресценции водных растворов пируватом// ЖПС,- 1987. -Т.47, №.5,- С.748-753.

12. Гачко Г.А., Зыбельт В.К., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Маскевич A.A. Автоматизированный импульсный спектрофлуориметр //ЖПС,- 1987,- Т.47, №2,- С.335-339.

13. Гачко Г.А., Зыбельт В.К., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Подтынченко С.Г. Автоматизированный спектрометр комбинационного рассеяния //ЖПС. -1988,- Т.49, №4,- С.692-695.

14. Гачко Г.А., Кивач JI.H., Маскевич С.А., Подтынченко С.Г. Исследование специфических взаимодействий в модельных системах, содержащих пируват //Тез. докл. XX Всесоюзн. съезда по спектроскопии.- Киев, 1988. -Ч.1.- С.361.

15. Башарин С.К., Гачко Г.А., Кивач JI.H., Маскевич С.А., Маскевич

A.А., Удовыдченко В.Р. Разложение свертки кривых затухания флуоресценции / /ЖПС.- 1989.- Т.52, №1.- С.48-52.

16. Воронич В.Е., Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Подтынченко С.Г., Соколов В.К. Спектроскопические исследования металлорганических комплексов производных тиамина //Тез. докл. XII Всесоюзн. сов. "Применение колебательных спектров к исследованию неорганических и координационных соединений".-Минск, 1989.- С. 138.

17. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Подтынченко С.Г., Соколов

B.К., Стрекаль Н.Д. Структура, спектры КР и ГКР пирувата натрия //Там же.- С.184.

18. Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Маскевич А.А., Гачко Г.А., Кондаков В.И. Применение методов кинетической флуориметрии для исследования динамики и структуры токсинов //Becui АН БССР -1989. -№6.- С.56-60.

19. Воронич В.Е., Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А. и др. Автоматизированный спектрофлуориметр с лазерным возбуждением в стандарте КАМАК// Весщ АН БССР. Сер. ф!з.-мат. навук.-1989.- № 6,- С.60-63.

20. Черникевич И.П., Маскевич А.А., Наумов А.В., Маскевич С.А., Кивач Л.Н. Физико-химические свойства тиаминкиназы дрожжей saccharomyces carlsbergensis //Укр. биохим. журн.- 1989.- Т.61, №5,- С. 34-42.

21. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Подтынченко С.Г. Спектральная неоднородность излучающих центров замороженных водных растворов пирувата // ЖПС,- 1990.- Т.52, № А,- С.575-581.

22. Маскевич А.А., Башарин С.К., Маскевич С.А., Гачко Г.А., Кивач Л.Н. Анализ затухания флуоресценции при наличии непрерывного распределения излучателей по длительности// ЖПС,- 1990.- Т.53, №4.- С.520-527.

23. Chernikevich I.P., Gachko G.A., Maskevich S.A., Maskevich A.A., Kivach L.N. Investigation of structure and dynamics of thiamine kinase irom brewer-s yeast by means stready and time-resolved flujrimetry //Proc. FEBS.- Boloton (Hungarian), 1990,- P. 130.

24. Маскевич А.А., Черникевич И.П., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Гачко Г.А. Флуоресцентные исследования внутримолекулярной подвижности тиаминкиназы из пивных дрожжей / / Журн. физ. химии,- 1990,- Т.64, № 8,- С.2167-2168.

25. Маскевич СА., Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Соколов К.В., Подтынченко С.Г, Спектроскопические исследования специфических взаимодействий пировиноградной кислоты в модельных системах //ЖПС.- 1990,- Т.52, № 5,- С.818-824.

26. Кивач JI.H., Маскевич С.А., Соколов К.В., Подтынченко С.Г., Стрекаль Н.Д., Ходорченко П.В. Спектры гигантского комбинационного рассеяния и структура адсорбированных на поверхности серебра тиамина, тиаминдифосфата и пирувата / / Биоорг. химия.- 1990,- Т.16, № 11,- С.1552-1562.

27. Maskevich S.A., Kivach L.N., Sokolov K.V., Chumarov G.D., Strekal N.D., Nabiev T.R. Surface enhanced Raman spectroscopy of cocarboxylase and pyruvate complexes / / Proc. XII Int. Conf. Raman Spectr, eds. Durig J.- New York: Jon Wiley & Sons.- 1990,- P.300-301.

28. Strekal N.D., Gachko G.A., Kivach L.N., Maskevich S.A., Podtynchenko S.G. SERS study of the thiamine derivatives with pyruvate // Abstr. XXth Eur. Congr. Mol. Spectr.- Zagreb (Jugoslavija), 1991.-P.385

29. Кивач JI.H., Маскевич A.A., Маскевич C.A., Черникевич И.П., Стрекаль Н.Д., Коротаева И.Л. Исследование структуры и динамики активного центра пируватдекарбоксилазы из пивных дрожжей методом спектроскопии ГКР .и импульсной флуориметрии / / Тез. докл. VII конф. по спектроскопии биополимеров.- Харьков, 1991.-С.164.

30. Chemikevich I.P., Basharin S.K., Maskevich S.A., Kivach L.N., Strekal N.D., Voronich V.E. The study of structure and dynamics of active center of pyruvate decarboxilase from brewers yeast / / Spec. Publ. R. Soc. Chem.- 1991,- V.94.- P.255-256.

31. Опарин Д.А., Вакула B.H., Маскевич C.A. Синтез и свойства тиофталилиевых производных трифенилпиразолина / / Тез. докл. V Всесоюзн. конф. по химии азот содержащих гетероциклических соединен,- Черноголовка, 1991.- С.167.

32. Черникевич И.П., Маскевич А.А., Маскевич С.А., Гачко Г.А., Заводник И.Б., Кивач JI.H. Влияние субстратов, кофакторов и эффекторов на структуру и динамику тиаминкиназы из пивных дрожжей // Биоорг. химия.- 1992.- Т.18, № 4,- С.509-530.

33. Maskevich S.A., Chernikevich I.P., Gachko G.A., Kivach L.N., Podtynchenko S.G., Strekal N.D. The study of pyruvate decarboxilase from brewers yeast by Raman spectroscopy / / Abstr. XXIth Eur. Congr. Mol. Spectr.- Viena (Austria), 1992.- P.200.

34. Maskevich S.A., Gachko G.A., Koiava V.T., Podtynchenko S.G., • Oparin D.A., Vasiliuk G.T. Raman and luminescence investigation of 3', 3' - dimethylspiro [2H-l-benzopyrane-2, Г-2-benzofurane] // Там же,- P.204.

35. Strekal N.D., Maskevich S.A., Gachko G.A., Kivach L.N. SERS study of the complexes of thiamine derivatives with pyruvate //J. Mol. Str.- 1992,- V.267.- P.287-296

36. Опарин Д.А., Гелла И.М., Маскев1ч C.A., Вакула В.Н., Шульга Н.Н. Тиофталиевые производные 1,3,5-трифенил-2-пиразолина // Ж. орг. химии.- 1992,- Т.28, № 3,- С.549-554.

37. Podtynchenko S.G., Maskevich S.A., Zavodnik I.B. Surfase-enhanced resonanse Raman study of hemin and hemoglobin adsorbed on silver island films // Abstr. 4th Int. Conf. Laser Appl. Life Scienses.-Jyvaskyla (Finland), 1992 -P. 163.

38. Maskevich S.A., Kivach L.N., Podtynchenko S.G., Zanevsky G.V. SERS study of interactions of imidazole with pyruvic acid and pyruvate on silver island films / /Там же. - P. 162

39. Maskevich S.A., Kivach L.N., Podtynchenko S.G., Zanevsky G.V. Influence of solvent and pyruvate on SER spectra of imidazole adsorbed on silver island films / / Proc. Xlllth Int. Conf. of Raman Spectr, eds. Kifier R.- New York: Jon Wiley & Sons.- 1992.- P. A110-A11I.

40. Strekal N.D., Maskevich S.A., Gachko G.A., Kivach L.N. The study of active center of pyryvate decarboxylase from brevers yeast by SERS // Там же,- P.A120-A121.

41. Kivach L.N., Maskevich S.A., Chernikevich I.P., Gachko G.A., Strekal N.D. Study of pyruvate decarboxylase and thiamine kinase from brewers yeast by SERS //Laser Spectr. Biomol.- SPIE, 1993.-V.I921.- P.315-321.

42. Maskevich A.A., Chernikevich LP., Maskevich S.A., Strekal N.D. Application of fluorescence and SERS spectroskopy to Control Functional State of thiamine kinase // Proc. Pittsburg Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectr.- Atlanta (USA), 1993.- P.135.

43.Маскевич A.A., Черникевич Н.П., Кивач JI.H., Маскевич С.А., Забродск'ая С.В., Опарин Д.А. Спектроскопические исследования структуры" и внутримолекулярной подвижности дрожжевой

пируватдекарбоксилазы //Биоорг. хим.- 1993.- Т. 19, №1,- С.1148-1157.

44. Podtynchenko S.G., Zavodnik LB. Maskevich S.A. Surface-enhanced resonance Raman spectra of erythrocytes adsorbed on silver films / / Spectr. of Biol. Mol.- Kluwer Academic Publishers, 1993.- P:235-236.

45. Маскевич A.A., Черникевич И.П., Кивач Л.Н., Маскев1ч С.А., Забродская С.И., Опарин Д.А. Спектроскопические исследования структуры и внутримолекулярной подвижности дрожжевой пируватдекарбоксилазы //Биорг. Химия,- 1993,- Т. 19, №12.-С.1148-1157.

46.Strekal N.D., Artsukevich I.M., Maskevich S.A., Maskevich A.A., Goulyai I.E., Kivach L.N. SERS and fluorescence investigatiooooon of Alcohol Oxidase / / Proc. Pittsburg Conf. Anal. Chem. and Appl Spectr.- Chicago (USA), 1994,- P. 122.

47. Strekal N.D., Artsukevich I.M., Maskevich S.A., Kivach L.N., Chernikevich I.P. Study of structure and functions states of Alcohol Oxidase by SERS method //Abst. 5th Int. Conf. Laser Appl. Life Scien.- Minsk (Belarus), 1994,- P.121.

48. Maskevich S.A., Gachko G.A., Maskevich A.A., Strekal N.D. Fluorescence features of proteins, adsorbed on rough silver surface //Там же.- P.ИЗ.

49. Maskevich S.A., Gachko G.A., Maskevich A.A., Strekal N.D. Fluorescence features of some organic compounds and proteins adsorbed on rough silver surfaces //Laser Spectr. of Biomol. - SPIE.-1994.- V.2370.-P.190-193.

50. Strekal N.D., Arrsukevich I.M., Maskevich S.A., Kivach L.N., Chernikevich I.P. Study of structure and functional states of Alcohol Oxidase by surfase-enhanced Raman Spectroscopy/ / Laser Spectr. of Biomol.- SPIE.- 1994,- V.2370.- P.131-135.

51. Maskevich S.A., Gachko G.A., Zanevsky G.V., Podtynchenko S.G. Using of heat treament silver island films to get the SERS spectra of adsorbed molecules //Proc. XIV Int. Conf. Raman Spectr., eds. Nai-Teng Yu.- New York: Jon Wiley & Sons.- , 1994. - P.644-645.

52. Strekal N.D., Artsukevich I.M., Maskevich S.A., Kivach L.N., Chernikevich LP. The SERS study of separation of coenzymes from Pyruvate Decarboxilase and Alcohol Oxidase //Там же,- P.A199-A200.

53. Maskevich S.A., Gachko G.A., Kivach L.N., Sveklo I.F. Peculiarities of SERS spectra of organic molecules adsorbed on silver island films with

different optical properties //Abstr. XXIIth Eur. Congr. Mol. Spectr.-Essen (Germany).- 1994.- P.475.

54. Maskevich S.A., Gachko G.A., Vasiliuk V.T., Oparin D.A. SERS spectra and structure of 3>, 3- -dimetylphthalan - l-spiro-2 [2H-I-benzopyrane] adsor-bed on the silver islahd films from different solutions //Там же,- P. 197.

55. Strekal N.D., Artsukevich I.M., Maskevich S.A., Kivach L.N. SERS and flluorescence investigation of structure of the protein-bounded FAD //Там же,- P.291.

56. Маскевич C.A., Василюк Г.Т., Гачко Г.А., Опарин Д.А. Использование спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния для изучения геометрии адсорбции органических молекул на поверхности металла. Тиофталилиевые производные пиразолина //Тезисы докладов I-научно-технической конференции Уральского государственного технического университета.- Екатеринбург, 1994,-С.83-84.

57. Maskevich S.A., Strekal N.D., Artsukevich I.M., Kivach L.N. Surface enhanced Raman scattering investigation of protein-bound flavin adenine dinucleotide structure.//J. Mot. Str.-1995.- V.349.- P.5-8.

58. Maskevich S., Sveklo I., Feofanov A. et al. Annealing of glass-deposited silver island films lead to creation of regular SERS-active surfaces. Comparative scaning tunnel microscopy and SERS study//Spectr. of Biol. Mol., eds. J.C. Merlin et al.- Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.- 1995,- P.27-28.

59. Artsukevich I.M., Strekal N.D., Maskevich S.A. et al. The peculiarities of structure and functional state of alcohol oxidase adsorbed on roughened silver surface//Spectr. of Biol. Mol., eds. J.C. Merlin et al.- Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.- 1995.-P. 143-144.

60. N.D. Strekal, S.A. Maskevich, G.A. Gachko The influence of environmental and conditions of adsorbtion on SERS spectra of vitamin B^/Spectr. of Biol. Mol., eds. J.C. Merlin et al.- Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.- 1995.-P.561-562.

61. Маскевич С.А., Василюк Г.Т., Гачко Г.А. и др. Спектры гигантского комбинационного рассеяния и структура 3',3'-диметилфталан-Г-спиро-2[2Н-1-бензопирана], адсорбированного на серебряных островковых пленках из различных растворов// ЖПС.- 1996.-Т.64, М> 1.-С.86-92.

РЕЗЮМЕ

Маскевич Сергей Александрович СПЕКТРОСКОПИЯ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ АДСОРБИРОВАННЫХ НА МЕТАЛЛИЧЕСКОЙ ПОВЕРХНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМ

Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР) света, флуоресценция, тонкие серебряные пленки (ТСП), Ag-злектрод, механизмы усиления ГКР, ароматические и гетероциклические молекулы, комплексообразование и структурная организация молекулярных систем, тиамин-, флавин- и гемсодержащие биомолекулярные комплексы.

Предмет исследования: спектры ГКР света ароматических и гетероциклических молекул и их комплексов; микроструктура и оптические свойства поверхности ГКР-активных субстратов; спектральные проявления структурной организации в молекулярных слоях на границе раздела фаз.

Цель работы: исследование механизмов усиления ГКР света адсорбированных молекул тонкими пленками серебра и серебряными электродами, а также особенностей проявления в спектрах ГКР и люминесценции структурной организации находящихся в адсорбционном слое молекулярных систем (от простых органических молекул до сложных биомолекулярных комплексов).

Методы исследования и аппаратура спонтанное и гигантское KP, атомно-силовая микроскопия, кинетическая и стационарная флуориметрия, фотометрия. Спектрометр ДФС-52М, сопряженный с ПЭВМ PC/AT 386; атомно-силовой микроскоп; спектрометр СДЛ-2; флуориметр с субнаносекундным разрешением; спектрофотометр Specord-UVVIS (Karl Zeiss), вакуумный пост ВУП-5, полярографический анализатор РА-2 (ЧССР).

Результаты, их новизна и применение: выявлены вклады и спектральные проявления электромагнитных и химических механизмов усиления ГКР ряда ароматических и гетероциклических молекул, адсорбированных на серебряных островковых пленках и анодированных электродах и установлена функциональная взаимосвязь между спектрами ГКР и микроструктурой поверхности; сформулирован единый подход к объяснению спектральных особенностей ГКР сложных органических молекул, который основан на взаимодействии поверхностных плазмонов с тс-электронами молекул и влиянии внутримолекулярных колебаний на эффективность этих взаимодействий, что может служить базовым положением при построении новых теоретических моделей ГКР. Разработаны спектральные критерии оценки структурно-конформационных состояний адсорбированных тиамин-, флавин- и гемсодержащих молекулярных ансамблей, которые можно использовать в аналитических целях, в частности, при разработке биосенсоров с ГКР-регистрацией. С применением вакуумного напыления и отжига разработана технология получения ТСП островкового типа с регулярной структурой и большим дальнодействием усиления ГКР, которые могут служить эффективными субстратами при исследовании различных пигментов в составе белков и биомембран. Показано, что в случае использования ТСП можно добиться усиления интенсивности флуоресценции поверхностью и сохранения нативности иммобилизованных белковых комплексов, что может быть использовано в иммуноферментном флуоресцентном анализе.

РЭЗЮМЭ

Маскеш'ч Сяргей Аляксандрав1ч СПЕКТРАСКАШЯ Г1ГАНЦКАГА КАМБ1НАЦЫЙНАГА РАССЕЙВАННЯ СВЯТЛА I СТРУКТУРНАЯ АРГАН13АЦЫЯ АДСАРБ1РАВАНЫХ НА МЕТАЛ 1ЧНАЙ ПАВЕРХН1 МАЛЕКУЛЯРНЫХ С1СТЭМ

Пганцкае камбшацыйнае рассейванне (ГКР), флюарэсцэнцыя, тоншя сярэбраныя плени (ТСП), Ag-электрод, мехашзмы узмацнення ГКР, араматычныя i гетэрацышичныя малекулы, комплексаутварэнне i структурная аргашзацыя малекулярных сгстэм, тыямш-, флавш- i гемзмяшчальныя 01ямалекулярные астэмы.

Прадмет даследаванняу: спектры ГКР святла араматычных i гетэрацьпшчных малекул i ix комплексау; мшраструктура i аптычныя уласщвасщ паверхш ГКР-актыуных субстратау; спектральныя праяулепш структурнай аргашзацьп у малекулярных слаях на мяжы падзелу фаз.

Мэта работы: даследавашге мехашзмау узмацнення ГКР святла адсарб1раваных малекул паверхняй ToiiKix плёнак серабра и сярэбраны электродау, а таксама асабл[васцей праяулення у спектрах ГКР i люмшесцэнцьп структурнай аргашзацьп прыпаверхневых малекулярных сютэм (ад простых аргашчных злучэнняу да складаных б1ямалекулярных комплексау).

Метады даследаванняу i апаратура: слантаннае i пганцкае КР, атамна-сшавая мшраскашя, кшетычная i стацыянарная флюарыметрыя, фотаметрыя. Спектрометр ДФС-52М у комплексе з ПЭВМ PC/AT 386; атамна-еиавы мкрлскол; спектрометр СДЛ-2; субнанасекупдны флюарыметр; спектрафатометр Specord-UWIS (Karl Zeiss), вакуумны пост ВУП-5, паляраграф1чны анал1затар РА-2 (ЧССР).

Bbinixi, ix патпзна i выкарыстанне: высветлены уклады i спектральныя праяуленш электрамагнггных i х1мйшых мехашзмау узмацнення ГКР шэрагу араматычных i гетэрацыюичных малекул, адсарб!рашн-шх на сярзбраных астрауковых пленках i ападзфаваных электродах; установлена функцыянальная узаемасувязь пам^ж спектрам! ГКР i мшраструктурай паверхш; сфармуляваны адзшы падыход да тлумачэння спектральных ,асабл1васцей ГКР складаных аргашчных малекул, яш аснаваны на узаемадзеянш паверхневых ллазмоиау з л-электронам1 малекул i уплыву унутрымалекулярных ваганняу на ix эфектыунасць, што можа быць базазым палажэннем пры пабудове новых тэарэтычиых мадэляу ГКР. Распрацаваны спектральныя крытэрьп ацэпк! структурна-канфармацыйных станау адсарб1раваных тыямш-, флавш- i гемзмяшчальных малекулярных ансамбляу, яюя можна выкарыстоуваць у анал!тычных мэтах, у прыватнасщ, пры распрацоуцы б1ясзнсзрау з ГКР-рэпстрацыяй. 3 выкарыстаннем вакуумнага напыления i тэрм!чнай апрацоум раснрацавана тэхналопя атрыманкя ТСП астрауковага тыпу з рэгуляркай структурай i плвял^чаным далёкадзеяннем узмацнення ГКР, як'ш могуць служыць эфсктыуным! субстратам! пры даследаванш розных шгментау у склздзе бялкоу i б1ямембраи. Паказана, што у выпадку выкарыстання ТСП можна дабщца узмацнення штэнаунасщ флюарэсцэнцьп паверхняй i захавання натыунасщ ¡мабшзаваных бялковых комплексау, што можна выкарыстаць у ¡мунаферментным флюарэсцэнтным анал1зе.

ABSTRACT

Maskevich Sergei Alexandrovich SURFACE ENHANCED RAMAN SPECTROSCOPY AND A STRACTURE OF MOLECULAR SYSTEMS ADSORBED ON METAL SURFACE

Surface Enhanced Raman Scattering (SERS), fluorescence,, thin silver films (TSF), Ag-electrode, mechanisms of enhancement of SERS, aromatic and heterocyclic molecules, organizing of complexes and structure of molecular systems, biomolecular complexes containing thiamin, flavin, and heme.

The objcct of investigation: SERS spectra of aromatic and heterocyclic molecules and their complexes, microstracture and optical features of the surface of SERS-active substrates, spectral development of the structure of molecular layers on the phase boundary.

The aim of work: the investigation of mechanisms of the enhancement by thin silver films and by silver electrodes of SERS of molecules adsorbed as well as a specific display in SERS and luminescence spectra of the structure of molecular systems inside the adsorption layer (from simple organic molecules to compound biomolecular complexes).

Methods and equipment: spontaneous and surface-enhanced Raman scattering, the atomic-force microscopy, the time-resolved and steady state fluorimetry, photometry. The Raman spectrometer DFS-52 (LOMO) controlled by the computer PC AT 386, the atomic-force microscope, spectrometer SDL-2 (LOMO), fiuorimeter with subnanosccond resolution, spectrophotometer Specord-UVVIS (Karl Zeiss), the vacuum unit VUP-5, polarographic analyzer PA-2 (Czech Republic).

Results and innovation: the influence and spectral development of electromagnetic and chemical mechanisms of the SERS enhancement for a number of the aromatic and heterocyclic molecules adsorbed on silver island films and on anodized electrodes were discovered. The function interaction between SERS spectra and the surface microstracture was founded. An unified approach to a explanation for spectral features of SERS of compound organic molecules was developed. The approach is based on the interaction of surface plasmons with ^-electrons of molecules and on intermolecular vibration effect on an efficiency of this interaction. It could be put in the base of novel theories of SERS.

Spectral criteria for estimation of structure-conformation states of adsorbed molecular complexes containing thiamin, flavin, and heme were developed. Those criteria can be used for analytical purposes particularly at development of biosensors with SERS-registration. Using vacuum evaporation and annealing the technology for making island-type TSF with a regular structure and with a very long-range action for the SERS enhancement was developed. Those TSF could be used as effective substrates at investigation of different pigments, which are parts of proteins and biomembrancs. It was shown that using TSF it was possible to enhance the fluorescence intensity by the surface and to conserve a nativity of immobilized protein complexes and as a result it could be used in immunofemient fluorescence analyses.