Стоксов сдвиг хромофора как индикатор реорганизационной способности полярных сред - растворителей и белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Гч.

О-,

От.

гс

СО

Ом

На правах рукописи

МЕРТЦ Эдуард Леонидович

СТОКСОВ СДВИГ ХРОМОФОРА КАК ИНДИКАТОР

РЕОРГАНИЗАЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ПОЛЯРНЫХ СРЕД - РАСТВОРИТЕЛЕЙ И БЕЛКОВ

специальность: 02.00,04 • физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1997

Работа выполнена а Институте электрохимии им. А.II. Фрумкина Российской Академии Наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Л.И. Кришталик Официальные оипопснты:

доктор физико-математических наук, профессор В.И. Ролдупш

доктор физико-математических паук, профессор К.В. Шайтан

Ведущая организация: Государственный научный центр Российской Федерации Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я. Карпова

Защита диссертации состоится "_ 1997 г. с № часов на

заседании Диссертационного совета Д.002.95.01 в Институте физической химии РАН по адресу: г. Москва, Ленинский пр. 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физической химии РАН по адресу: г. Москва, Ленинский пр. 31.

Автореферат разослан " ^ " С&и/Т 1997 г>

Учений секретарь • Диссертационного совета кандидат химических наук

О.А. Жильцова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Большое количество процессов, протекающих в полярных средах, сопровождается быстрым переносом заряда (электрона или протона). Взаимодействие переносимого заряда с полярным окружением определяет кинетические параметры переноса. Тяжелая подсистема не успевает отслеживать движение переносимой частицы н формирует энергетический активационный барьер на пути реакции переноса. Динамические, в частности, реорганизационные, свойства тяжелой подсистемы определяют энергию активации переноса. Энергетика процесса переноса определяются также и статическими поляризационными свойствами системы. Изучение кинетических свойств термическою переноса заряда обычно не позволяет разделять эта два существенно ратных свойства полярной среды.

Те же динамические и статические свойства среды проявляются в специфическом классе процессов - процессах быстрого переноса заряда с участием кванюв света. При оптическом возбуждении электронов происходит перераспределение электронной плотности н, следовательно, плотности заряда. Это изменение распределения заряда взаимодействует с окружающей средой. Спектральные. характеристики (распределение по энергиям квантов) таких процессов даюг более детальную информацию об энергетических состояний системы. Изучение этих характеристик позволяет разделить влияние двух свойств среды, а потому является независимым от кинетических методов и более тонким инструментом для исследования полярных свойств среды. Исследованию и разработке спеюрального подхода к количественному изучению одного из этих свойств - реор1ани1:шионного - и посвящена данная работа. Такой подход дает возможность экспериментальной проверки различных положений теории переноса заряда.

1а последние десятилетия открыто большое число жизненно важных процессов с переносом заряда в живых системах. Все эти процессы протекают в особой полярной среде - белке обладающей весьма специфическими свойствами. Поиск закономерностей переноса заряда в таких системах представляет несомненный интерес. Спектральный метод открывает возможность изучения реорганизационных свойств этих сложных полярных сред.

Актуальность спектральных методов заключается не только в определении реорганизационных свойств белков. Полный (статический) диэлектрический отклик системы складывается из отклика тяжелой и легкой подсистем. Отклик тяжелой подсистемы напрямую связан с реорганизационной способностью среды. Комбинируя данные спектральных методов с данными о свойствах быстрой подсистемы, мы получаем возможность судить о полном диэлектрическом отклике системы. Это даст нам независимый метод изучения статических диэлектрических свойств белка.

Цели н задачи исследования - разработать общий спектроскопический метод для изучения энергии реорганизации среды, пригодный в том числе для белков, и определить реорганизационные параметры белка.

[У1етоды исследования, В диссертации используются континуальная теория диэлектриков, теория переноса заряда в полярных средах и' спектроскопия спектров поглощения и стационарных спектров флуоресценции.

Научная новизна. Удалось количественно определить "энергию реорганизации среды по спектральным данным. Экспериментально определены реорганизационные свойства белка. Разработан корректный подход к континуальному описанию структурированных диэлектриков.

Достоверность полученных результатов. Полученные экспериментальные данные о наличии корреляции между спектральными свойствами хромофора и полярными свойствами растворителя согласуются с литературными данными и. современной теорией переноса заряда в полярных средах.' Результаты по нзученто реорганизационной способности белка согласуются с независимыми экспериментальными данными и теоретическими оценками. ,

Практическая значимость рабрты, Разработанный спектральный метод позволяет экспериментально определять реорганизационные характеристики различных полярных сред. Полученные диэлектрические соотношения для белков позволяют' проводить корректные электростатические расчеты для ■ белков. Оценки диэлектрической постоянной белка дают экспериментальное обоснование выбора параметров для таких расчетов.

ПМОЖеШИ вьптаМЬ^тШШПЪ : •

1. Аппроксимация Положения максимума бесструктурной электронной спектральной полосы, учитывающая квантовый характер нормальных колебаний и позволяющая, в отличие от применявшейся ранее-аппроксимации, правильно описать зависимость максимума от энергии реорганизации среды.

2. Описание экспериментально наблюдаемой .зависимости энергии реорганизации среды от диэлектрических свойств растворителя в рамках континуальной модели при учете двух эффектов: эффекта неоднородности диэлектрической среды, вызванной растворенной молекулой, и влияния полярности растворителя.на перераспределение заряда.

3. Диэлектрические соотношения для структурированных диэлектриков (белков). Обшее выражение для энергии реорганизации среды для белков совпадает с таковым для обычных диэлектриков. ' ' ' "

4. Реорганизационная способность плотной части белка много ниже, чем у воды и других полярных растворителей. Реорганизационные характеристики белка в растворе • промежуточные между характеристиками белка и воды.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались «а Международном Фрумкинском симпозиуме (Москва, 1995), на Конференции молодых ученых им." А.Н. Фрумкина в 1994, 1995, 1996 гг,, на собрании Биофизического общества в 1996,1997 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Днчное участие автора. Вся работа выполнена либо лично диссертантом, либо при сю непосредственном активном участии.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, Литературного обзора, Материалов и методов, и Результатов и обсуждения. Последний раздел состоит из двух частей: в первой разрабатывается спектральный метод и изучается реорганизация обычных растворителей; во второй разработанный нами спектральный метод используется для изучения реорганизации белка.

2. КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Обзор литературы.

Здесь даются основные понятия общей теории переноса заряда и рассматриваются проблемы, связанные с реорганизацией полярных сред. Обсуждаются подходы к расчетам диэлектрических свойств белков и природа связи спектральных свойств хромофора с реорганизационными свойствами среды.

В случае однородных сред эта связь выражена в пропорциональности энергии реорганизации среды Е, параметру Пекара

Си(|/еор- Не«) (I)

(Е0р и е,| - макроскопические высокочастотная и статическая диэлектрические проницаемости среды). Внесение объемной молекулы хромофора в растворитель приводит к возмущению однородных диэлектрических свойств растворителя. В этом случае связь существенно меняется. Подход "фиксированной плотности заряда" позволяет учесть эту связь для хромофора с фиксированным распределением электронной плотности в основном и возбужденном состояниях

Е, = | ргФоДДр(г))Др(г)-1 рг(р„(Др(г))Др(г) (2)

У У

где ф,,р - потенциал, создаваемый перераспределением заряда hp (г) в эффективной среде (с диэлектрической проницаемостью е0РГгЛ, ч>« • потенциал, создаваемый перераспределением заряда Apfrj в реальной среде (с диэлектрической проницаемостью r.„frj>, диэлектрические постоянные EopfrJ, г„(г) являются функциями координат.

Материалы и методы.

В этом разделе описываются использованные реактивы и приборы; методики приготовления образцов; параметры приборов, использованные при регистрации спектров; метод изучения растворов хромофора с образованием ионных пар; применявшиеся методы определения времени жизни возбужденного состояния хромофора; методы квантово-химических и электростатических расчетов.

Результаты и обсуждение. Часть I. Энергия реорганизации в обычных растворителях.

1.1. Аппроксимация максимума спектральной полосы.

В этом разделе получена аппроксимация положения максимума бесструктурной спектральной полосы хромофора в полярной среде. Вывод основан на представлении функции формы полосы ¿'(у) в пределах ее полуширины в приближенном виде

- 5(\„)ехр

2А ^ А /

где V- частота света в энергетических единицах.

Параметры а, Д и Ип находятся, если приравнять между собой центральные моменты Мп распределения 5( И и его аппроксимации (ур. 3)

И» » - М)/2М2, Д1 * Мг, а - Му/бМ?1 (4)

Моменты распределений определятся уравнениями

Моменты можно связать с параметрами нормальных колебаний системы в двух состояниях. Когда мет перепутывания нормальных координат растворенной молекулы и растворителя и кет перепутывания нормальных координат при переходе в возбужденное состояние, моменты распадаются на суммы моментов, обусловленных отдельными нормальными модами системы. В частности, вклады от внутримолекулярных мод и мод растворителя (обозначенные индексом к и а) аддитивны

т = Д£о ± Е, ± Ей, М2 = Ми+Мьг, М\ = Ми. + Мл, (6)

£* = !ПкМ = ±Шк> ук1 (7)

где нижний знак берется для спектра испускания, верхний - для поглощения, £. -энергия реорганизации растворителя (среды), £. • внутрисферная энергия реорганизации.

В линейном диэлектрическом приближении для растворителя с малый вкладом квантовых мод в спектр диэлектрических потерь второй момент может быть выражен через £., а третий момент мод растворителя мал по сравнению с внутрисферной частью Ми. Поэтому

Ми*2кТЕ„ М\*Мх, (8)

а выражения для максимумов спектров поглощения и флуоресценции принимают вид и-ДЛ+ (£(.+ &)-;-

г<М2а + 2кТЕ,Г _Им_

2(Мг„ + 2 кТЕ,)

Разность двух максимумов, называемая Стоксовым сдвигом, есть

И,Д(9,

Из этих формул видно, что зависимость Стоксова сдвига и максимумов П01 лощения и испускания от энергии реорганизации среды носит нелинейный характер. При повышении температуры величина второго момента растет, а третий момент не меняется, и поэтому член убывает. С повышением

температуры теряется асимметрич полос. Последняя обусловлена квантовым характером нормальных колебаний системы. Именно квантовый характер колебаний ответственен за нелинейную зависимость максимумов от £,. В классическом приближении формулы для Стоксова сдвига и максимумов полос поглощения и испускания сводятся к хорошо известным выражениям

ц = АГо +£"., + £■ к = ДЛ - - £, 1/2(у, - ц) = Д, + Е, (И)

Большинство хромофоров имеют оптически активные колебания с квантовыми частотами. Поэтому не учитывающее квантового характера нормальных колебаний системы ур. 11 является весьма грубым и неверно отражает зависимость максимума полосы от энергии реорганизации среды.

1.2. Определение энергии реорганизации среды по спектральным данным.

Здесь дается обоснование выбора Стоксова сдвига в качестве спектральной характеристики, связанной с диэлектрическими свойствами среды, Основу метода определения Е% составляет изучение спектральных свойств хромофора (ур. 10) в ряде сред с отличающимися диэлектрическими свойствами. Требуется также знание связи между свойствами среды и Е,. По зависимости Стоксова сдвига в ряде раствори!елей от свойств среды можно определить Е,. Для этого нужны значения второю и третьего моментов, которые рассчитывались путем обработки экспериментальных спектров в соответствии с ур. 3 (с соотношениями 4). Для тою, чтобы были справедливы ур. 3 и 10 и экспериментальная система была лршолна для изучения А'., необходимо выполнение ряда условий, перечисленных в данном разделе.

1.3. Модель переходных орвиталей для расчета энергии реорганизации среды.

В данном разделе рассматривается модель, позволяющая рассчитывать энергию реорганизации среды в зависимости от диэлектрических постоянных растворителя, основываясь на данных квантово-химическнх расчетов реагентов, проведенных в равновесном самосогласованном реакционном поле полярной среды. Эта модель позволяет использовать формализм "фиксированной плотности заряда" для расчета Е, (ур. 2) для систем с модуляцией волновых функций средой в модели диэлектрической полости.

Модель переходных молекулярных орбиталей (ПМО) основана на разделении всех МО на переходные и непереходные. Переходные МО дают основной оклад в перераспределение заряда и учитываются явным образом в расчете энергии реорганизации среды. Непереходные МО описываются неявно как поляризуемый электронный континуум, заполняющей полость в растворителе. Именно модель ПМО мы использовали в работе для вычислен»«

ноо

С

юоо

еоо

700

29

• ■ ■

21

• 1'

З^чГ

11

1Т

Но

перераспределения заряда при расчете энергии реорганизации среды в рамках модели диэлектрической полости.

1.4. Энергия реорганизации среды в модельных растворителях.

Здесь даются результаты применения разработанного спектрального метода для дикатионного красителя профлавина (П1Ф, Схема 1), выбранного в качестве хромофора-метки. Изучались длинноволновые полосы поглощения.и испускания, соответствующие переходам между основным и нижним возбужденным синглет-ными состояниями.

Ур. 10 предсказывает, что Стоксов сдвиг - монотонная однозначная функция. энергии реорганизации растворителя. Если Е, является линейной функцией параметра Пекара, Стоксов сдвиг также должен быть монотонной однозначной функцией этого параметра. Изображенная на Рис. 1 зависимость Стоксова сдвига ПФ- от параметра Пекара растворителя показывает, что это не так. Для большинства точек полярных апротониых растворителей статическая диэлектрическая постоянная растворителя практически одинакова (в диапазоне 37-45), И они лежат на прямой линии. Четыре точки (б, 3, 12, 13), которые отклоняются от этой линии, имеют заметно отличающиеся £«, равное 65, 21, 10 и 9, соответственно. Наклоны линий для спиртов

0.64

ор м

Рисунок 1. Половина Стоксова сдвига флуоресценции растворов профлавина 1/2 (Ау, —Лу< ) в зависимости от параметра Пекара С растворителя. В качестве растворителей были использованы следующие жидкости: I, аце-тонитрил; 2, смесь у-бутнролактон <25% об.)-ацетонит-рил; 3, ацетон; 4, смесь пропилен карбонат (62%)-1щетон; 5, смесь ацетонитрил (1У/«>-7-бутиролактон; 6, пропилен карбонат; 7, смесь тг-бутиролактон (86%>-ацетон; 8, М.Ы-диыетилформампд; 9, у-бутиролактон; 10, смесь ди-метилсульфохсид (7Т%)-ацетон; И, диметилсульфоксид; 12, 1,2-дихлорэтан; 13, дихлорметан; 14, метанол; 15, этанол; 16, 1-пропанол; 17, 2-пропамол; II, 1-бутанол; 19, Сензонитрил; 20, смесь ацетонитрил (50%У'И.Ы-дииетил-формация; 21, смесь 1,4-диоксан (10%)-у-бутиролактон; 22, смесь ацетонитрил (3$%Ь 1,2-дихлорэтан; 23, смесь ацетон ($0%)-1.2-дихлорэтан.

Схема 1. Дмкатнониий краситель профлавни (ПФ).

и полярных апротонных растворителей разные.

Отсутствие монотонной зависимости от С вызвано тем, что дня диэлектрически неоднородной среды Е, не пропорциональна параметру Пекара. Однако, этот эффект . неоднородности не достаточен, чтобы количественно' объяснить экспериментальные данные (Рис. 2).

- 1100

6 юоо

»00

<00

700

«00

*Г

% / / / '*!«

"» / • Лргтми БоКепц о А1соНо1»

Несмотря на лучшую, чем на Рис. I, корреляцию между наблюдаемым Стоксовым сдвигом и расчетной энергией реорганизации £'«(0=37) (Рис. 2), все еще имеется некоторое несоответствие между экспериментом и' расчетами: точки 3, 12, 13 с отличным й1 отклоняются от прямой линии для апротонных растворителей, имеется зазор между линиями для полярных апротонных растворителей и спиртов. Отклонения точек (с отличным е«) для апротонных растворителей мы приписываем зависимости перераспределения заряда от статической диэлектрической проницаемости растворителя.

Чтобы проанализировать влияние диэлектрической проницаемости среды О на перераспределение заряда П<1>, были проведены квантопо-химические полуэмпирнческне расчеты (схема РМЗ) ПФ в раоновесном самосогласованном реакционном .

поле внешней среды с разными £>, Оказалось, что перераспределение заряда в целом ослабляется с увеличением />.

Рис. 3 покатывает, что может быть достигнута хорошая корреляция между экспериментальными данными по Стоксову сдвигу и расчетами энергии реорганизации растворителя (£к), принимающими во внимание одновременно эффект диэлектрической неоднородности я влияние растворителя на перераспределении заряда.

Данных только по Стоксову сдвигу и моментам недостаточно, чтобы найти истинные величины энергии реорганизации растворителя. Нужно знать оценки из спектральных данных моментов и связь между £"« н диэлектрическими свойствами растворителя. В нашем подходе мы предполагаем, что эта связь может быть выражена неким интегральным параметром, который ми называем расчетной энергией реорганизации среды Ек

Е,=рЕк (12)

220 240 260 210 300 320 340 3(0 ЕкФ-37), ст-1

Рисунок 2. Половина Стоксова сдвига флуоресценции растворов профлавина 1/2(Ьу.-Ьу() в зависимости от расчетной величины энергии реорганизации среды Екф-37). Последняя была рассчитана, принимая во внимание только эффект неоднородности, вызванной внесением крупной молекулы красителя в однородный растворитель. Функция перераспределения заряда получена на основе квантово-химических расчетов красителя в диэлектрическом окружении с проницаемостью О * 37, Для всех точек перераспределение заряда одно и то же. Оптическая и статическая диэлектрические постоянные, использованные а расчете Ё«(0=37) для данного перераспределения заряда, совпадают с постоянными растворителей, использованных в эксперименте. Нумерация растворителей дана в подписи к Рис. I.

1100

ё 1000

£ «00

1' аоо

ТОО

1У

ж* да уп

уЛ с*! С ^15

и. /У 11{/ • а АргуИс Чо|успи

2в0 290

Л' , СШ 1

340

Рисунок 3. Половина Стоксова сдвига флуоресценции растворов лрофлавина в чависи-мосги от энергии реортанитации среды /;'„, рассчитанной с учетом эффекта неоднородности, вызванного внесением крупной молекулы красителя в однородный растворитель, и влияния полярности среды на перераспределение заряда. Функция перераспределения заряда получена на основе квантово-химических расчетов красителя в диэлектрическом окружении с проницаемостью £>, которая была в данном случае ратной дпн всех точек и равной статической диэлектрической постоянной растворителя О = Оптическая и статическая диэлектрические постоянные, использованные при расчете для конкретного перераспределения заряда, совпадают с постоянными растворителей, использованных в эксперименте. Пунктирная кривая демонстрирует нелинейную зависимость Стоксова сдвига от энергии реорганизации среды ' для апротонных растворителей, рассчитанную из ур. 10 на основе оцененных но спектрам моментов. Нумерация растворителей дана в подписи к Рис. I.

где р - некий масштабный коэффициент, величину которого получаем из наклона линий на Рис. 3 и значений моментов.

Значения масштабного множителя найдены равными 4.1 и 3.0 для апротонных растворителей и спиртов, соответственно. Истинные значения Е, определяются из ур. 12. Для двух групп растворителей были получены оценки внутрисфераой энергии реорганизации £„, равные 455 ±200 и 715 ± 200 см I для апротонных растворителей и спиртов. Для обеих групп эта характеристика существенно положительна в соответствии с физическим смыслом £.,.

Ур. 11 предполагает линейную зависимость Стоксова сдвига от энергии реорганизации среды. Экстраполировав эту зависимость к нулевой величине £,, мы должны получить, Что половина Стоксова сдвига равняется £» при Е, = 0. Экстраполяция прямых линий на Рис. 3 к Еи= Е,1р-0 даст отрицательные величины Я. (-7801100) и (-460 ± 110) см-' для апротонных растворителей и спиртов. Виут-по определению, положительная величина.

рисферная энергия реорганизации, Эффективные отрицательные величины Еи говорят о том, что выражение для Стоксова сдвига (ур. 11) в данном случае неверно.

Далее в разделе обсуждается специфическое влияние некоторых растворителей и смесей на энергию реорганизации среды (точки 19-23 на Рис.)). Аномально высокая реорганизация в смесях растворителей с заметно отличающимися полярностью или доиорными числами обусловлена реорганизацией состава смеси вблизи красителя при возбуждении.

После того как мы разработали и опробовали на модельных растворителях спектроскопический метод количественного определения энергии реорганизации среды, мы приступили к изучению свойств белковых объектов.

Результаты и обсуждение. Часть II. Энергия реорганизации а белках.

11.1. Энергия реорганизации среды в белках в рамках континуального подхода.

Полностью континуальное описание применимо только к изменениям поляризации структурированною диэлектрика (белка) под действием внешних источников электрических нолей. Соответственно, континуально могут быть описаны изменения электрическою поля в белке, складывающегося из поля внешнею источника и поля наведенной поляризации. Изменение электрического поля происходит на фоне "прсдсущссгвуюшего" поля, т.е. поля невозмущенной внешними полями снекмм белок-вола. Для белка с известной из эксперимента структурой мродсущестумшее электрическое ноле Е«, может быть рассчитано с помощью иолуконгинуа.чыкмо подхода.

1го иоле создается предсущесгвукицими парциальными или полными зарядами атомов; дру| ими произвольно расположенными источниками полей, которые существовали до приложения поля; электронной поляризацией белка (характеризуемой оптической диэлектрической постоянной, &(г)) и всеми видами поляризации волы (характеризуемыми статической диэлектрической постоянной, Awfr)). Аюмная поляризация белка при этом не должна учитываться, т.к. равновесные положения атомов в данной структуре белка фиксированы. Мы можем формально ввести предсуществуюшее диэлектрическое смещение Do, которое связано с электрическим полем эффективной диэлектрической проницаемостью ¿i(r). Источник полей Ео и Do распределение предсуществуюших зарядов рч(г), создаваемое парциальными зарядами атомов белка и друз ими зарядами системы. Решение электростатической задачи (ур. 13) для распределения (нК»-) даст искомое значение потенциала предсуществующего

ПОЛЯ ф(1.

Ео = -*««А<Р»). divtk = 4*p(r), De в etO-JEo, e»(r) = (13)

Рассчитаем изменения в системе, вызванные ее заряжением зарядом Др(г), и работу, которую необходимо дня этого совершить. По завершении процесса в системе изменится электрическое поле на величину £. и наведется дополнительная поляризация. Вектор Е. и соответствующее ему изменению электрической индукции D„ связаны статической диэлектрической постоянной

(й(г) - статическая диэлектрическая постоянная белка). Для этих изменений полей справедливы обычные диэлектрические соотношения (ур. 14)

Е, = -graiHy,), ,/iiD, = 4nA(Xr), Di«£2(r)Et. (14)

В процессе заряжения поля Е> и Е изменятся со значений Юо и Ео до Do + Di н Ео + Е,, т.е. l) = ÍX. + D., Е = Ео Е,.

Подставляя соотношения между векторами из ур. 13 и 14, мы получаем соотношение между О и Е для структурированного диэлектрика

й = е|(г)ЕО + е2(г)Ь

Поскольку б|(г) ф ег(г), это соотношение отличается от связи Б = еЕ для обычного диэлектрика, что говорит о неприменимости обычного континуального подхода к электростатике белков.

Чтобы получить правильное выражение для работы заряжения, нужно воспользоваться формулой для элементарной работы, в интегральном представлении имеющей вид интеграла вдоль произвольной траектории, соединяющей начальные н конечные состояния процесса

В качестве пути интегрирования выбирается постепенное квазиравновесное заряжение, в котором к играет роль параметра заряжения. Вектора И и Е линейно связаны с параметром заряжения и в ходе такого процесса принимают значения

0(Х) = Юо+Х01, Е(Х) = Ео + ХЕ( (16)

Интегрируя и переходя от векторного представления к потенциальному, находим искомую работу

IV = I <Ро' ДрОЖ + ^ 9, • Ар(г)с{У (17)

Смысл этого выражения заключается в том, что энергия заряжения в структурированном диэлектрике состоит из двух компонентов: энергии взаимодействия внешнего поля (заряда Др(г)) с предсуществующим электрическим полем; энергии собственно диэлектрического отклика, т.е. энергии взаимодействия внешнего поля с наведенной поляризацией плюс собственная энергия наведенной поляризации. Этот подход может быть обобщен и на случай процесса быстрого заряжения.

Энергию реорганизации можно найти как разницу между энергиями конечных состояний, полученных в ходе быстрого и медленного переноса заряда из того одного и того же равновесного начального состояния. Эта разность может быть вычислена как разность работ быстрого и медленного процессов перезаряжения, начатых из одного и того же раоносссного начального состояния. Конечная формула для энергии реорганизации структурированного диэлектрика совпадает с формулой для обычного диэлектрика (в подходе "фиксированной плотности заряда", ур. 2).

/12. Связывание красителей с балиами.

Задачей данного раздела било нахождение объекта (белка н хромофора-метки) и оптимальных условий для спектроскопического изучения диэлектрических свойств белковой среды.

Были исследованы три пары систем фермент-конкурентный ингибитор: трипсин - профлавии (ПФ); химотрипсин (ХТ) - ПФ; ХТ - бриллиантовый

зеленый. Оба ингибитора являются катиоиными красителями и связываются вблизи активных центров ферментов. Ферменты, и в частности их активные центры, также могут нести различный заряд, в зависимости от внешних условий. Изучение зависимости связывания красителей.с ферментами от рН и ионной силы водного раствора показало, что взаимодействие катионных красителей с ферментами существенно зависит от электростатического взаимодействия иоиогснных групп активного центра фермента с зарядом ингибитора. На основе проведенных исследований был отобран объект - комплекс ПФ-ХТ, характеризующийся наличием хорошо флуоресцирующего красителя и возможностью подобрать условия, при которых ПФ практически полностью связан с белком и данный комплекс находится в одной форме.

113. Диэлектрическая релаксация а белке.

Благодаря тому, что в обычных растворителях время диэлектрической релаксации много короче времени жизни возбужденного состояния, излучение ПФ в растворителях происходит из равновесного возбужденного состояния. Сложная иерархия структуры в белках предполагает наличие релаксационных процессов в широком интервале времен. Сравнение же спектральных свойств в модельных растворителях и в комплексе ПФ-ХТ следует проводить с учетом степени релаксации системы. В данном разделе изучается диэлектрическая релаксация в комплексе.

Присутствие релаксационных процессов в комплексе подтверждает наличие зависимости энергии испускания комплекса от времени жизни возбужденного состояния г(, которые варьировались путем добавления тушителя флуоресценции нодида (Рис. 4). Разная кривизна кривых говорит. о различии времен релаксации г, комплекса при рН 8.5 и 6.2, по нашим оценкам составляющих 0.14±0.1 и 1.611.1нс, соответственно. Анализ кривых позволяет определить амплитуду релаксации, т.е. часть энергии реорганизации, обусловленную наблюдаемыми релаксационными модами. При двух рН амплитуда составляет около 100 см1.

20.00

19.98

8 19.96

о

19,94

19.92.

19.90

0.0 ОД 0.2 0.3

0.4

0.5

Рисунок 4. Зависимость максимума спектра флуоресценции ют времени жизни возбужденного состояния г, для дикатнонного красителя профлавина, связанного ■ активном центре хнмотрипенна, в водном растворе при двух рН. Содержание солей К.С1 и К! варьируете* так. что ионная сила растворов постоянна и равна 0.5 М. Сплошные линии - результат подгонки методом наименьших квадратов параметров уравнения, описывающего процесс диэлектрической релак-

сации, к экспериментальным данным.

Наличие упомянутых релаксационных процессов проявляется также в зависимости энергии испускания -от энергии возбуждения ц, (Рис. 5), которая в обычных растворителях отсутствует. Различный наклон зависимостей в длинноволновой части кривых подтверждает тот факт, что время релаксации т,

комплекса при рН6.2 выше. Мы можем утверждать, что времена релаксации нашей системы при двух рН отличаются в 4 или более раз. Данный эффект рН может быть приписан изменению конформааи-ониого состояния комплекса при изменении pli. Анализ этой зависимости для комплекса при рН8.5 позволяет также получить верхнюю и нижнюю опенки энергии испускания, соответствующей моменту, коша все релаксационные процессы, вызванные переходом в возбужденное состояние, завершены.

11.4. Стоксов сдвиг красителя a комплексе с белком.

О реорганизационной способности полярной среды можно судить по С'токсову сдвигу красителя, помешенного в среду. В этом разделе рассматривается влияние различных факторов на Стоксов сдвиг комплекса ПФ-ХТ в водном растворе.

При переходе ПФ из чисто водного окружения в комплекс с ХТ в водном растворе наблюдается резкое снижение величины половины Стоксова сдвиг а с 1725 см1 до 1036 см1. Однако, такое сильное снижение полной энергии реорганизации отнюдь не означает, что снижение происходит за счет резкого изменения диэлскфичсских свойств среды при переходе Г1Ф из раствора в комплекс. По нашим оценкам, половина Стоксова сдвига ПФ в шпотетичсском апротонном раствори icjic с диэлектрическими постоянными, равными таковым воды, была бы равна 12X5 см1. Откуда мы заключаем, что большая часть изменения полной энергии реорганизации обусловлена специфическими свойствами воды, в частости, сеткой водородных связей. Это заключение подтверждается наличием изотопною эффекта для ПФ в тяжелой воде. Для комплекса ПФ-ХТ в водном растворе изотопный эффект отсутствует, что указывает на отсутствие протяженной области контакта ПФ, связанного в белке, с водой.

Рисунок 5. Зависимость максимума спектра флуоресценции уот inepi ии возбуждения Ик для дикатмонно! п красителя профлавина. связанного в активном центре химотрипсина, в водном растворе при двух рН (верхняя часть рисунка). На вставке - левая часть кривых * увеличении. На нижней части рисунка спектр moi лощения и исправленный спектр флуоресценции ПФ в комплексе с ХТ при рН8.5. При рН 6 2 и 8.5 спектры отличаются слабо. Ценная сила растворов одинакова и равна 0.5 M КП.

Исход* из значений параметра Пекара ял* воды и белка (0.55 и -0.2) можно было бы ожидать более сильною снижения энерти реор|анизации среды при переходе в белковую среду. Однако центр связывания с ХТ в растворе лежи1 близко к поверхности белковой 1лобулы. При гаком расположении 11Ф знершя реор-|ани1акии должна заменю зависеть от свойств внешней, но отношению к белку, среды. Чтобы проверить зто утверждение, мы исследовали спектральные свойства комплекса в смесях димешл-сульфоксид (ДМС'О)-вода, коюрая хараюеризуется практически неизменной сташческой дизлекфичес-кой постоянной вплоть до •соннсшрации -50"« об. ДМСО и существенно зависящей от состава смеси отической диэлектрической постоянной. В таких смесях повышение концентрации ДМСО должно слабо сказываться на перераспределении заряда, но заметно снижать реорганизационную способность среды, окружающей белок. Эксперимент подтверждает это предположение (Рис.6). Наши спектральные данные качественно согласуются с независимыми кинетическими данными по ферментативному гидролизу амидов: знершя активации ферментативной реакции переноса заряда в смесях ДМСО-вода существенно снижается с ростом концентрации ДМСО, что объясняется снижением терши реорганизации среды.

Чтобы избавиться от влияния внешней, по отношению к белку, среды, имеющей высокую реорганизационную способность, и выделить реорганизацию собственно белка, мы изучали спектральные свойства комплекса ПФ-ХТ, находящегося в высушенной белковой пленке (образованной тем же самым белком - химотрипсином). При переходе комплекса из водного раствора в высушенн>ю белковую пленку наблюдается резкое снижение половины Стоксова сдвига до величины порядка 600 см '. Это означает, что реорганизационная способность собственно белка намного ниже, чем для комплекса в растворе.

UMSO. ".vol.

Рисунок в. Половина Стоксова сдвига флуоресценции l/2(hv.-hvi) в зависимости от концентрации ДМСО ,гт« дика тионного красителя профла-внна, связанною в активном центре химотрипси-■I». в смеси» ДМСО-вола Во всех растворах рН соответствует максимуму (в области высоких значений рН) на кривых рН-тависимости связывания при каждом заданном содержании ДМСО. В чисто водном растворе зто рН8.5. При всех изученных концентрациях ДМСО рН-зависимо-сти схожи с зависимостью в чисто водном растворе.

Для того, чтобы проследить постепенную эволюцию свойств окружения при переходе от раствора к пленке, мы изучали Стоксов сдвиг комплекса в зависимости от содержания воды в пленке, т.е. в зависимости от влажности, при которой высушивались пленка (Рис. 7). Снижение количества воды, казалось бы, должно монотонно снижать энергию реорганизации. Немонотонный характер этой зависимости мы приписываем роли полярных поверхностных групп белка, обладающих высокой подвижностью и дающих существенный вклад в диэлектрический отклик белка. Молекулы воды гидратнруют эти группы. Гидратация снижает подвижность групп и поле их диполей, что должно понижать диэлектрический отклик, вызванный группами. Это объясняет немонотонный характер зависимости на Рис. 7.

Чтобы подавитъ реорганизационную способность поверхностных групп мы пропитывали высушенные при заданной влажности пленки малополярным растворителем хлороформом (й! = 4.8). Как видно из Рис.7, это приводит к дополнительному снижению реорганизационной способности пленки, которое мы приписываем главным образом подавлению подвижности поверхностных групп.

40 60

Humidity, %

Рисунок 7. Половина Стоксова сдвига флуоресценции l/2(hv,-hvf) для дикатионного красителя профлавина в комплексе с химо-трипсином в белковой пленке в зависимости от влажности, при которой высушивалась пленка. После высушивания пленки пропитывались малополярным растворителем хлороформом. Приведены данные для пленок до и после пропитывания.

11.5. Соответствие между свойствами комплекса и жидких растворителей.

Количественный анализ реорганизационной способности белка требует сопоставления данных для белков с модельными растворителями. Данный раздел посвящен выяснению того, к растворам в какой группе растворителей ближе всего свойства ПФ в комплексе с ХТ, и насколько вообще возможно такое сравнение.

Изучение структуры комплекса метолом молекулярной динамики показало, что три четверти поверхности молекулы ПФ в комплексе с белком защищено от прямого контакта с водой, и Г1Ф не участвует (как донор) в образовании водородной связи. Наши данные по влиянию изотопного замещения Н-Э на спектральные свойства ПФ в ацетонитрнле, этаноле, воде и комплексе с ХТ также говорят в пользу этого вывода. Эти факты и близость формы спектров ПФ в комплексе и в апротонных растворителях говорят о том, что свойства окружения красителя в месте его связывания ближе всего к свойствам апротонных растворителей.

Изучение спектров кругового дихроизма показало, что внутрибелковые поля возмущают электронную плотность ПФ в комплексе, причем эти поля меняются с изменением рН. Часть энергии реорганизации, обусловленная модами с релаксационными временами меньше 0.1 не, а, следовательно, и

перераспределение заряда мало меняются при существенном изменении внутрнбелкового поля. Мы можем предположить, что, по-видимому, перераспределение заряда ПФ слабо меняется при переходе от растворителей к комплексу. При анализе реорганизационной, способное™ мы можем учесть наблюдавшуюся в маносекундном диапазоне релаксацию, пводя поправку.

Вывод - о реорганизационной способности окружения ПФ в месте связывания мы можем судить, сравнивая спектральные свойства ПФ в комплексе и в апротонных растворителях.

II. в. Количественные оценки реорганизационной способности белка.

Оценки энергии реорганизации среды £, для ПФ в различных изученных средах (равные 1380, 1325, 970 и 810 см'1 в ацетоннтриле, комплексе в воде, дихлорметане и комплексе в пленке при 85% влажности, пропитанной хлороформом) говорят о том, что реорганизационная способность окружения красителя в белковом комплексе в воде ниже, чем у ацетонитрнла. При переходе комплекса из раствора в белковую пленку реорганизационная способность резко падает. Сравнение показывает, что реорганизационная способность плотной части белка ниже, чем у наименее полярного из использовавшихся! растворителей - дихлорметана.

Оценка статической диэлектрической проницаемости плотной части белка, сделанная по данным для высушенной. при влажности 85% и пропитанной хлороформом белковой пленки, составляет б» < 6.9. Эта оценки являются оценкой сверху благодаря наличию молекул воды в пленке и благодаря некоторому вкладу в диэлектрический отклик поверхностных групп белка, время релаксации которых хоть и больше времени жизни возбужденного состояния, но все же конечно.

3. Основные результаты и оьшоды.

1. Получена аппроксимация положения Максимума бесструктурной электронной спектральной полосы, учитывающая квантовый характер.нормальных колебаний системы хромофор-растворитель.

2. Разработана модель переходных орбиталей для расчета энергии реорганизации среды в модели диэлектрической полости. Модель учитывает модуляцию волновых функций реагентов инерционной поляризацией среды.

3. Экспериментальное изучение Стоксова сдвига флуоресценции профлавина в модельных растворителях показало,. что континуальная модель растворителя способна описать экспериментально наблюдаемую, зависимость энергии реорганизации среды от диэлектрических свойств растворителя при учете двух эффектов: эффекта неоднородности диэлектрической среды, вызванной растворенной молекулой; . влияния полярности растворителя на перераспределение заряда.

4. Показано, что применявшаяся ранее формула для максимума электронной полосы, не учитывающая квантового характера нормальных колебаний системы, противоречит экспериментальным данным, а более строгая формула, полученная в данной рабою, находи кн в согласии с экспериментом.

5. Получены соотношения между векторами индукции, электрического поля и поляризации для структурированных диэлектриков (белков). Получено выражение для энерши заряжения для структурированных диэлектриков.

6. Показано, что общее выражение для энергии реорганизации среды для белков совпадает с таковым для обычных диэлектриков.

7. Экспериментально показано, что реоргащпациониая способность плотной части белка мною ниже, чем у воды и друтих полярных растворителей.

8. Экспериментально показано, что энергия реор) аниэации среды для комплекса профлавина с химотрипсином в растворе является промежуточной между таковыми для чистых белка и воды.

9. Экспериментально показано, что подвижные полярные поверхностные группы белка дают существенный вклад в диэлектрический отклик и энергию реорганизации переноса заряда вблизи поверхности белка.

10. Получена верхняя оценка статической диэлектрической проницаемости плотной части белка.

4. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мерпщ ЭЛ., Криштатк Л.И. Связывание конкурентных ишибиторовс химотрипсином и трипсином в зависимости от рН и ионной силы раствора. Биофишка. 41:320-325, 1996.

2. Mem E.L. On the dependence of the electron band maximum on the solvent reorganization energy. Chem.Phys.lMt. 262:27-32, 1996.

3. Mertz E.L. Germun E.D.. Kuznetxnv A.M. Calculation Of The Solvent Reorganization Free Energy In The Dielectric Cavity Model. ( 'hem I'hys. 215:355370, 1997.

4. Mertz E.L, Tikhomirov У.А., Krishlalik LI. Stokes shift as a tool for probing the solvent reorganization energy. J. Phys. Chem. A 101:3433-3442. 1997.

5. Krishlalik L.I., Kuznetsnv A.M., Mem E.L. Electrostatics of proteins: description in terms oftwo dielectric constants simultaneously. Proteins. 28:174-182, 1997.

6. Krishlalik LI., Mertz E.L, Topolev V. V. Proteins as specific media for charge transfer reactions in Electron and ion transfer in condensed media. Proceedings of the Adriatico Research Conference at Intl.Centre for Theor. Phys., Knrnyshev A.A.,Tosi M., Ulstrup J., eds., World Scientific Publishing Co.. 423-452. 1997.

7. Krishlalik LI., Kuznetsnv A.M.. Mem E L. Electrostatics of proteins: description in terms oftwo dielectric constants simultaneously. Abstract at 40th Annual Meeting of the Biophysical Society. Biophys. J. 70:A225. 1996.

8. Krishlalik LI., Men: E.L, Topvlev V. V. Proteins as low-reorganization-energy media for charge transfer reactions. Abstract at 41 th Annual Meeting of the Biophysical Society. Biophys. J. 72:A237,1997.

qM '