Структурно-функциональное изучение пептида дельта-сна, синтез новых эффективных аналогов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

В Ой

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ М. М. ШЕМЯКИНА —Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ПРУДЧЕНКО Игорь Аркадьевич

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПЕПТИДА ДЕЛЬТА-СНА, СИНТЕЗ НОВЫХ ЭФФЕКТИВНЫХ АНАЛОГОВ

02.00.10— Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных соединений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина — 10. А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель кандидат химических наук И. И. Михалева.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Л. Д. Румш, кандидат химических наук М. П. Филатова.

Ведущая организация — НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ.

Защита состоится « /6. » . 199 V г.

в « . ^.Р » часов на заседании специализированного совета при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина— Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина — Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « Я » января 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

«5ЙШ ШЧЖТШЮТЯКА РАБОТЫ

Аитусиъность проблем. В последние года большое внимание уде-яется изучению нвйропептидов и их участию в регуляции различных истем и функциональных состояний организма. Одним из таких ней-оиентвдов является пептид дельта-сна (ДСИП). Этот пептид был вделан из крови кролика и первоначально основным его действием читалась гипногенная активность. Позже выяснилось, что ДСИП не вляется гипногенной субстанцией, но обладает широким спектром иологичэской активности. Действие этого нейропептида практически е заметно на здоровых аивотных, однако в случае функциональных арушений организма оно направлено на нормализацию втих отклоне-кй. дСКП как антистрессорная и пдаптогенная субстанция с про-раммаруадими функциями, однако, слабо изучен как в плане струк-уряо- функциональных особенностей, тате и механизма действия.

Цель работ. Целью данной работы явилось изучение взаимосвязи вжду структурой и биологической активностью пептида дзльта-сПа а основе синтеза новых аналогов и изучения их биологических войств. Результаты такого исследования позволят приблизиться к .еленаправленному выбору эффективных аналогов пептида с целью со-двния медицинских препаратов на их основе для лечения и профи-йг.тша различшх видов заболеваний.

Научная новизна и практическая ценность работ. Провел :го ¡истематИческое изучение спектра биологической активности пептида [ельт&-сна и ряда его синтэтичёских аналогов. Для этой цели син-'езировано 17 аналогов ДСИП твердофазным методом пептидного син-'е^а. Предложены оптимальные условия для синтеза и выделения жтетических аналогов ДСИП. Изучена внтиэпилептическая, антиме-'ястатическая и гипногенная активности получонных соединений. На »снСиаши полученных результатов выявлены определенные структур-то закономерности.

Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют углубить 18И0 представление о пептиде дельта-сна как о гейропоптиде с ш}ю1шм спектром Оиоактивности. В процессе исследования выявлены шплоги, активность которых превышает активность натиьного ДСИП \лл каждого вида биологического действия, причем спектры действия этих аналогов практически не перекрываются, что указ: ;ает на ¡рлнципиальную возможность создания медлпшеких препаратов н'

основе синтетических аналогов ДСИП.

Апробация работ. Материалы диссертации были представлены на и П Международных конгрессах по проблеме сна (Страссбург, 1Э9< Хельсинки, 1992). на XXII Европейском пептидном симпозиуме (Шве! цария, 1992) и на III Международном симпозиуме по твердофазно! синтезу (Англия, 1993). По теме диссертации опубликовано в ви, статей и тезисов 13 печатных работ.

Структура Оиссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего -{60 ссылок. Диссертация изложена на 442 страницах, содеркит 8 таблиц j -f 7 рисунков.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Пептид дельта-сна (ДСИП) был выделен и охарактеризован rpynnoi Монье-Шоненбергера в 1977 году из диализата венозной крови кроликов, твламическая область мозга которых была подвергнута низкочастотной элоктрост"муляции, вызывающей медленно-волновой cot (дельта-сон).

В настоящее время уже слоиилось представление о пептиде дельта-сна как о нейропептиде с широким спектром биоактивности. Помимо неоднозначного действия на сон этот пэптид уменьшает двигательную активность животных, влияет на терморегуляции и циркадные ритмы, изменяет концентрацию нейромедиаторов и нейропептидов, вызывает налоксон-чувствительную анальгезию, обладает выраженной стресс-протективной и адаптогенной активностью.

Данная работа является продолжением исследований взаимосвязи между структурой и функцией пептида дельта-сна, проводимой в Институте биоорганической химии РАН. Ранее была подробно изучена пространственная организация молекулы с помощью различных физико-химических методов на основе синтеза ряда структурных аналогов, и в результате был предложен набор квазицгаишчаских структур, вероятно отвечающих за реализацию отдельных эффектов ДСИП. Дальнейшее развитие этих исследований было связано как с расширенным исследс ванием спектра биологических свойств собственно нативного нейро-пептида, так и со сравнительным изучением свойств аналогов по целому ряду ранее неизвестных для ДСИП видов биологического действи

Согласно литературным данным известно, что молекула ДСИП неу-¡тойчива и легко дезактивируется под действием ферментов в орга-изме животных. Наиболее уязвимым местом является Ы-концевой •ртгтофан, который отщепляется в течение 10-15 мин; вторым по шасности расщепления является фрагмент А1аб-3ег7. Исследователи ¡вязнвапт отсутствие эффектов ДСИП или неоднозначность его дей-:твяя с низкой устойчивостью к протеолизу. Поэтому начз задача шключалась превде всего в синтезе аналогов, устойчивых к действию зминопептядаз и других фзрментов, способных дезактивировать ДСЩ. Ш этого ш вводили во второе положение молекулы ДСИП остатки >-аминокпслот, й-метилаланлна,/-аланина и пролина. С этой 'же делыо ш модийщировали и 6-ое полоявние Молекулы ДСИП.

Второй предпосылкой в выборе аналогов явилось следующее соображение . Молекулу ДСИП моино условно разделить на две чйсти: янпофильнуп - ДСИП(1-4) и гвдрофилыто - ДСИП (5-9), соединонныо ленду собой подвижным фрагментом ОХу^-Иу4. Для оценки важности лшюфильнооть Н-концевоЯ части молекулы нами получен ряд соединений с увеличенной липофвдьностьи во 2 положении, которые потенциально когли бы иметь большее сродство с мембраной или с гипотетическим рецептором.

123456789

ДСИП Тгр—А1а--С1у--01у—Авр—А1а—Бег—С.1у—01и

----вУа]--------------------------------

1В-3 ' ----БА1а----------------Туг------------

П>-5 Туг—Рго-----------------------------------

ХБ-Т ----0А1а-----------------Рго-------------

11>-8 Туг-Ша----------------------------------

1В-9 —1ИеА1а---------------------------------

ПМ О Тгр-0А1а—Я1у—С1у—Авр—А1а

О-12 ---бА1а------------------------------

13-13 ----БРЬе-------------------------------

СО-16 -----1еи—Рго-----------ТПг— Тйг--------

1!)-17' ----ИЗег----------------------------------

ц,-2о ----М1а-----------------------------

10-25 Ас------------------------------------------

Ю-26 ----БРг-о------------------------------------

Была такжэ исследоване возможность запет триптофана на другу] ароматическую аминокислоту - тирозин в I положении; получены болев "жесткие" молекулы за счет введения пролина во 2 и 6 полозе-ния. Получен также ацетилированный по N-концу аналог с целью определения значимости 1Г1- аминогруппы для проявляемой активности

Был проведен поиск гомологичных ДСИП последовательностей i банке белков PIR (версия 22.сентябрь 1989 г.) с использование! разработанной в ИБХ РАН программы определения локального сходства, в основу которой положен алгоритм быстрого поиска. Среда нескольких фрагментов белков с идентичностью ДСИП не менее Б6Ж (¡ остатков из 9) мы выбрали фрагмент 14- 22 из предшественник! человеческого иммуноглобулина (каппа-цепь; V-3 регион), сохранявший остатки I, 4, 5, 8, 9 в нунных позициях и имещкй гомологичный остаток треонина вместо сорика в полояешш 7. СоотвотствувдШ пептид ID-16 был такие синтезирован и исследован.

Из литературных данных известно, что ДСШ практически не вызывает заметных эффектов при введении здоровым кивотнш. Однако в случае иивотных, которых подвергали стрессовому воздействия, введение пептида вызывает нормализацию состояния животных. В связи ( этим было проведено сравнительное изучение активности аналого! ДСИП на некоторых мселях стресса, а именно, на эгшлепсш у мыше! и крыс, вызванной различными эпилептогенами, и на метастазйрова-нии карциномы Льшс у мышей.

Была исследована также гипногенная активность аналогов при центральном введении кроликам.

I. Синтез аналогов ДСШ

Синтез аналогов осуществляли методом последовательного наращивания пептидной цепи с использованием 9- флуоренилметилоксикарбо-нильной (Fmoc) и трет-бутилоксикарбонильной (Вое) схем твердофаэ ного пептидного сштеза. В случае синтеза по Вос-схеме (ТаОлЛ) для временной защиты a-аминогруппы аминокислот использовали Вос-группу. Для защиты боковых функциональных групп аминокислот использовали: бензиловые эфиры для Glu и Ser, циклогексиловый эфир дл Asp, 2-бромбензилоксикарбонильную группировку для Туг. В качестве носителя использовали аминометшшрованный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с 4-гкдрокс™етилфешы&цетамэдометильной (РАМ) якорной группировкой. Для проведения реакций конденсации испольео вали диизопрогшлкарбодиимид в присутствии 1-оксибензотриазола (HOBt '. В случае проведения конденсации с ' Ы-ьлзтилаланилполимером

Протокол твердофазного синтеза по Вос-схэмв Таблица I.

И шага растворитель объем число промывок время

(мл) (мин)

I СНСТд 30 2 0.5

EPA/CHCIg/ашзсл 30 2 I; 19 (48:50:2)

3 CHCIg 76 ' Б О.Б

4 1С0 DIPEA 3 CHCIg. 30 2 1

б CHCI., 75 5 0,Б

8 3 реактор добазляют 0.6М рэствор в диметая$юрнаквд9: 3 skb. зэдщэшой аминокислоты + 3 екв. HOBt, 3 акв, диизопротшлкарбодаимида; перемешивание 60, 120 (з случае двухкратной реакции конденсации повторяют стадии 3-7)

7 DMF/CHCIg (1:1) 30 2 I

8 CHCIg 30 2 0.5

9 отбирают б мг для нянгндринового теста

10 по окончании капдого цикла повторяют стадии 1-9. по окончании синтеза повторяют стадии 1-5.

11 втанол 45 3 0.5

Протокол твердофазного синтеза по Fmoc- схеме

Таблица 2.

Н шага растворитель

5

е

ч

объем _(«)

30

число промывок

2

время (мин)

DMF/CHCIg (1:1) ПЕлерлдин/БЫР/

толуол (30:35:35) 30 2 С; 7

DHF/Ch'CIg (1:1) 90 6 0,5

В реактор добавляют 0.4М раствор в диметюформамиде: 4 вкв. защищенной аминокислоты + 4 вкв. НОВ., 4 экв. дикзопрошикарбодаммида; поремешквэяио 60; 120 DKF/CHCIg (1:1) 30 2 0,^

отбирают 5 мг для нингидринового еста Кайзора по окончании квэдого цикла повторяют стадии I-S. по окончании синтеза повторяют стадии 1-3.' этанол 45 3 0,5

применяли гексафторфосфат бензотриазолил-Н-окситрисднметил аминофосфоний (ВОР-реагент) в присутствии HOBt. Для наиболее пол ного протекания реакции брали 3-х кратные избытки реагентов п отношению к пептидил- полимеру. Полноту протекания рэакции кон третировали с помощью качественного и количественного нингидрино вого теста. Для конечного деблокирования пептидов использовал жидкий фтористый водород в присутствии п-крезоле (9:1); в случа триптофан- содержащих пептидов в реакционную смесь добавляли 2 индола или триптофана. Данные ВЭЕХ для реакционной cite си свиде тельствовали о том, что выбранные условия деблокирования позво ляют свести к кшшыуму протекание побочных рэакции, связанных наличием в пептидах триптофана и тирозина. При этом оказэлос предпочтительнее использовать .индол, поскольку при Еыделенщ пеп тида с помощью гель- фильтрации удается легко избавиться от нег полностью.

В случав синтеза по Fttoc-схеме (Табл.2) для временной защиты a-аминогруппы аминокислот использовали Fmoc-группу; для защит боковых функциональных групп - трет-буталовые эфкры. В качеств носителя применяли п- гидроксиметилфешшоксиметилполистирол. Дл увеличения скорости протекания реакции конденсации нами примени лись 4-х кратные избытки реагентов. Для коночного деблокировали пептидов использовали три различных реагента. Первоначальное ис пользование реагента R- смесь TFA/тиоанизол/этандитиол/анизо (90:5:3:2) привело к трудноразделимой смеск продуктов с содержа нием целевого продукта не более 60% (по данным ВЭЖХ для риакцион ной смеси после гель-фильтрации; рисЛ-А). Этот реагент был выб ран исходя из литературных данных о предпочтительности пепользо вания етандитиола в смеси с другими "скевендьорам^, для подавле ния алкилирования триптофана в случае триптсфан-содержащих пепти дов. При использовании реагента К - смесь ТРА/фенол/вода/тиоан зол/атандитиол (82,5:5:5:5:2,5) результаты деблокирования оказа лись существенно лучше (рис.1-Б), однако остались трудности выделением пептидов из реакционной смеси. В этих двух случая очистка гель-фильтрацией оказалась недостаточной и пришлось ис пользовать препаративную ВЭЮС на конечной стадии очистки, с цель избежать дополнительных стадий очистки нами использован реагент - смесь TFA/хлороформ/индол (75:23:2). Доблокирование проходило течение 3 ч при 5°С. Этот реагент позволяет практически полно стью избежать протекания побочных реакций при деблокировании (л дантп.тл ВЭЖХ; рис.1-В) и выделить желаемый продукт за одну стали

чистка.

Для выделения деблокированы! пептидов, полученных по 'Вое- и тос-схемам мы использовали гель-фильтрацию на сефаденсе С-15. ля большинства аналогов этой стадии очистки оказалось доотаточ-о, чтобы получить гомогенные соединения (чистота более 9756 по анным аналитической ВЭКЗС) (Табл.3). В более словных случаях мы рименяж препаративную ВЭЗХ в качество послэдугацего этьза выдавши пептидов. Все аналоги охарактеризованы корректный! дйнными мийо1сислотиого анализа и масс-спектрометрии; сфукТурй ггодтверз-;ена данными 1 Н-ЯМР-спектрс скопни.

'аблица 3. Физико-химические свойства аналогов

Аналог И.М. Rt wj t°C I/nax

(Híffl) (c o,3s H20) (Ш)

ДСИП 849 12,47 -15,99 26 278 4770

ÍD—1 877 16,91 -11,99 26 278 4970

ID-3 941 15,71 11.99 27 277 5820

ID-4 891 18.05 21.33 27 278 4220

ID-5 852 11,18 -35.33 28 274 1050

tt>-7 875 14,35 -21.99 28 278 4460

ÍD-8 '826 11,73 5.99 28 274 1120

lb-9 863 13,78 -19.72 26 278 4890

ID-10 576 14,80 18,66 28 278 2640

ID-11 875 15,24 -45,33 28 278 4000

ID—1 íí 848 12,83 -15,99 29 278 4040

ПМЭ . 925 19.08 -8,66 29 277 5030

ID-15 941 14-41 -6,66 28 277 4642

ID-16 975 15*80 -22>66 28 279 4233

ID-I T 865 12,62 -1,99 28 278 *527

1Г-25 909 15,09 -31,70 28 279 45*3

ID-26 875 14,80 26,55 28 279 4497

Анализируя индивидуальность полученных аналогов методом ,1МР, мы столкнулись с неоднородными спектрами дл* пептидов, содержащих продан и 1{-метилаланин во втором положении (1Б-5, ТВ-9, 10-11, 1В -2(:), что могло бы быть связано с явл! нием пространственной , цио-транс изомерии. Для доказательства нашего предположения о

Рас Л Эффективность конечного деблокирований кри cssress по йпое-схеыо (для аналога П>-12). B32S целевого продукте шххве гель фвльгращш рзащнонной сне он при деблокировании:

A. раагентш R.- сиесь TFA/тиоанизол/атандатсай/анизол (30:Б:3:2) Б. раагентом к. - сиесь ТРА/фенаЕ/вода/таоавнзол/атандзтааа

(82,5:5:5:5:2,5)

B. реагентом А. - гаась ТРА/хлорофоры/нндол (75:23:2)

Uw_iL

3,0

г. о

;о

Рис.2 1Н-Ш> спектр аналога [НЫеА1а2]ДСИП прк 30°С (А) ы 90°С (S]

цис-транс изомерии в лаборатории ЯМР Института были сняты спектр этих аналогов при разных тешературах (30°С и 90°С). Действительно, при повышении температуры происходит уширение и слияние сигналов, принадлежащих разным контрмерам (рис.2), что свидетельствует о пространственной цис-транс изомерии и об отсутствии примесей в этих пептидах.

В рэзультато синтеза по Вое- и Fmoo-схемам мы имели возможность сравнить эти способы твердофазного синтеза, выявить их достоинства и недостатки применительно к аналогам пептида дельта-сна. Оба способа при правильном выборе условий синтеза позволяют получить делаемый продукт с хорошим выходом. Однако при использовании Fmoc-схемы расходуются существенно меньшие объемы растворителей к уменьшается время, необходимое для получения конечного продукта. Тагам образом, при наличии необходимых аминокислотных производных использование Fmoc-схекы оказалось предпочтительнее, чем Вос-схены.

2. Аптнэпгязптггеес.поа действие

Основываясь на литературных данных об актиэпилептической активности ДСИП на различных моделях генерализованных судорог, было прэдпринято изучение антиэпилептической активности аналогов ДСИП совместно с Одесским медицинским институтом им.Н.И.Пирогова. Исследования проводили на модели генерализованной эпилептической активности, вызываемой внутрибрюшшным введением пикротоксинг у крыс. При вяутринигральном введении пептидов сравнимая с ДСИП или более высокая эффективность обнаружена у аналогов ID-5, ID-8, ID-12; при этом ID-5 полностью предотвращал развитие генерализованных клонико-тоничоских судорог (Рис.3). При этом, если ДСИП только приводил к удлинению латентного периода первых судорог, перечисленные аналоги вызывали существенное снижение тяжести судорог. Аналог ID-4 облэгчал развитие эпилептической активности, что выражалось в увеличении тяжести пикротоксин-вызванных судорог. Подобные данные были получены также и в случав bhvтригиппокам-сального введения аналогов. Введение аналогов ID-1 и ID-10 практически не влияло на тяжесть суд^чог; в экспериментах о этими аналогами тяаость судорог как в коктроло, так и в опыте не достигли уровня, при которой развиваются клонико-тонические судороги.

Синтезированные аналоги были также исследованы н,а модели генерализованной эпилептической активности, вызываемой внутрибрюшии-ным применением коразола (60 мг/кг) у мышей. Внутрибришшное вве-

110 100 00 м *0 to о -го

*а

К и

*о

го

о

-го

Г.

О т

т i

Н г А т <¡1 - f

X ¥ 1 т т 1 1 1 1 1 1 1 I I 1 I I

osiP la-i iD-s is-1 io-f 13-7 ja-* to-t ю-м to-n io-тв-и

ТЖ

t

ко %

CO

to

10

to о -io

т 0

.......—..........

Т т Т

IJLL * J>

У t ■ 1 t 1 i ' ! ■ * ... 1 _1___i Ii.

aar id-i u>-i io-i u-s rn-j им its ¡o-toio-vic-it lo-tt

РПс.З Влияние ДСИП п его аналогов на эшыватечвскув ищшзость при внутреаиггральноа введении (50 шг/кг) крысам. Судороапа< активность вызвана Бнутрпбршиннш прананегагы шгкротокспшг (2. С

ИГ/КГ).

A. Увалнченив латентного периода nepuas судорог d S к коптрода. Б. Увашчениа латентного периода хлонако-тоштеесках судорог

в8к контролю.

B. Сннавнаа ТЯИ9СТН судорог в % к кончролз. в отсутстзЕЭ клонико-тоннческнх судорог

т ж св сз +0 к в •га

■а !

1

А и 1 Й 1т у

1 1 А П П Ж

¥ ! 1 1 1 III 1 1 1 1 1 1 .

1

I т 1 !

1 А 1 т А ■! (I Г ( и

ш А , . 1 1 г 1-1 1---1--1

и

X <9

го

М1Р !В-> ИМ 13-7 1В-* 1»-» ч-п 19-4 16-и

о

г

¡_Пц

_{ь

ж

-и

3313 а-1 и-г 1В-4 ¡3-1 13-7 1В-» 10-3 ¡В-Ю 13-11 13-и 13-и

.4 Швдшю ДШШ г его елзлогоз на впияелтическуэ пятнвлссть шутрпбретинноы введения (I нг/кг) шиш. Судорезва* еятав-ть швгаана ЕнутрнбршяЕшы прямананаем коразола (60 ыг/кг). »зелпение латентного периоде первых судорог в К к контроля». Увеличавве латентного периода клоыою-тошпесказ судорог в Я к контролю. !

Сжшзнае ¥явести судорог п % к контролю. « отсутствие взаекекай в тявести судорог

ЛА

дение аналогов ID-5, ID-8, ID-12 (1,0 кг/кг) оказывало дэстовер-* ное снижение судорокных проявлений, вызванных коразолом (рпс.4).

В результате анализа полученных данных ¡ювно заключить, что замена триптофана на тирозин в I полове;гии молекулы ДСИП с одновременным увеличением устойчивости к протеолизу.за счет введения во 2 положение пролина ш D-аланина приводит к значительному повышению антиэпилептической активности. К подобны?.! результатам приводит также замена аланина во 2 положении на б-аланин.

Проявление антиэпилептической активности аналогами ID-5, ID-8 и ID-12 как при их внутримозговом, так л внутрибршинном вводоеип моено объяснить вероятной способностью этих пептидов преодолевать гемато-энцефалический барьер, подобно нативному ДСИП.

3. Антнкатастатическое действие

Ранее уже публиковались данные об антиметастатическом действии ДСИП. Было показано, что сам ДСИП и его циклическое производное цикло(Gly-DSIP) предупревдают вызванное стрессом снижение активности нормальных киллеров. Отмечалось такте повышение противоопухолевой устойчивости с помощью ДСИП в условиях инокуляции лейкоз-ных клеток на фоне чрезмерной,стрессорной реакции.

Было продемонстрировано также, что ДСИП (60 мкг/кг; в/в) существенно тормозит ме-астазирование карциномы Лызпс у мышей при хирургическом удалении опухоли в условиях эмоционально-болевого стресса. Полученные данные свидетельствовали о том, что действие нептида затрагивает квк центральные, так н периферические стресс-ре ализущие механизмы. Его действие предотвращало истощение и срыв медиаторных систем головного мозга, эндокринной и симпато-адреналовой систем.

Данная часть работы по изучению антиметастатического действия аналогов ДСИП выполнялась совместно с Институтом экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Кавецкого АН Украины. В качестве модели наш была выбрана метастазирупцая карцинома Лысис у мышей и был проведен поиск наиболее эффективной дозы и способа введения ДСИП мышам с метастазируадей карциномой Льюис. Было установлено, что наибольший антиметастатический эффект достигается при внутривенном или внутрибршинном введении препарата в дозе 50 мкг/кг в период с 7 по 14 сутки после перевивки опухоли. Поэтому в наших экспериментах пептида вводились внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг 6 раз в период с 7 по 12 сутки после перевивки опухоли. Антиметастатическсе действие оценивалось

i 28 сутки после перевивки опухоли по уменьшению общего объема и юла метастазов по сравнению с контролем (рис.5). В качестве >нтроля брали мышей с карциномой Льюис. Найдено, что антимета-'атическим эффектом обладают сам ДСИП и ряд его аналогов, кото-ге, основываясь на данных по уменьшению общего объема метаста-)в, можно расположить в следующей последовательности по уменьшено их актизности: ID-10, ДСИП, ID-16, ID-T, ID-13, ID-3, ID-1. > влиянию на общее число метастазов можно построить несколько эугой ряд: ID-10, ID- 3, ДСИП. Аналоги последнего ряда уменьшают 5 только общий объем метастазов, но и тормозят инвазию опухоле-íx клеток. Аналог ID-25 (ацетилированннй ДСИП) значительно уве-гшвал как общий объем, так и число метастазов по сравнению с энтрольшми животными, проявляя эффект, противоположный действию ативяого пептида.

Известно, что макрофаги являются важным звеном в системе про-ИЕСопухолввой устойчивости организма. Поэтому следующей» серией кспериментоз было исследовано действие ДСИП и ряда аналогов на ктивность макрофагов. Была показана способность ДСИП увеличивать n vivo функциональную активность перитонеальных, альвеолярных и элезеночных макрофагов интактных мышей. В качестве • показателей ктивации макрофагов использозали активность ферментов аденозин-эзаминазы (АДА) и 5-нуклеотидазы (5-Н) в клеточном лизате. Эти эрменты, регулирующие уровень метаболизма аденозина, играют вак-айшую роль в функционировании и дифференцировке макрофагов. В лучае мышей с карциномой Льюис внутривенное 6-кратное введение СИП в дозе 50 г,з<г/кг на 7-12 сутки после перевивки опухоли при-одило к полной нормализации функциональной активности макрофа-

0Б.

Изучение влияния аналогов ДСИП на функциональное соотг чие львеолярных и поритонеальных макрофагов при метастазировании арциномы Льюис показало, что аналоги, проявляющие антиметастати-ескую активность (ДСИП, ID-1, ID-3, ID-T), вызывают также и нор-ализацию активности макрофагов (рис.7).

Макрофаги селезенки обладают супрессорными по отношению к эф-екторным Т-клеткзм функциями при метастазировании, и их количест о и функциональная активность при этом резко возрастает. Так, в аших экспериментах активность селезеночных макрофагов у мышей с арщшоыой Льюис увеличивалась в 7 раз по сравнению с интактными ивотными. После внутривенного введения ДСИП и аналогов интактным ивотным активность селезеночных макрофагов несколько повышалась

и

50

О

-50

■т

дсип и-м 1С-и ю-»

ю-1 1в-г 1в-и :о-15 1В-1Т ю-г»

•л

ео

*о го о -го -10 -ео

дсип 18-3 18-10 18-» 10-1« 1В-Н

15-1 18-1 18-11 18-15 18-17 15-и

« •

11 • Д 0 В 1 я • •

1 И

* 1

_1 _1 1. 1_. 1 . -1 .1 1 1 1 1

«Г

- • /г <0,05

а СП /

1 и ! В „ 1 • И

И "

1

1111 1 1 .1 1 1 1

Рис.Б Антниетастатическоа действие аналогов ДСИП при вну трибрахии ном введении кышаы с карциномой Льпис. Введение аналогоБ (50 ыкг. проводилось 6-кратно с 7 по 12 сутки после перевавки опугояи, : метастазов произвг тли на 28 сутки после перевивки олуха Показано уменьшение (е)-общего объема в (б)-сбщзго числа нечаста; в (X) к контрольным животным.

\Ц

а 3 сутки в 2-3 раза). Б случав внутривенного введения ДСШТ и алогов животным с карциномой Льюис (6- кратно с 7 то 12 сутки еле перевивки опухоли) активность селезеночных макрофагов нор-лизовалась практически до уровня активности для интактных житных. По способности нормализовать функциональную активность крофагов аналоги можно расположить следующим образом: ДСИП, -7, 11Ы, И-З.

Ранее было показано стимулирующее влияние стресса на возникно-ние и рост метастазов. Поэтому нами было также исследовано вли-ие аналогов на нейроэндокринный статус организма. Для этой цели

использовали внутривенное введение аналогов мышам с карциномой гас в дозе 50 мкг/кг 6 раз в период с 7 по 12 сутки после пере-вки опухоли. Нейроэндокринныо показатели - уровейь кортикосте-на, инсулина, тироксина и тестостерона в плазме крови, оценива-сь на 28 сутки после перевивки опухоли. О влиянии на перифери-скую нервную систему судили по показателям состояния симпато-реналовой системы. Для этого в падпочечниках исследовали уро-пь ДОФА, дофамине, адреналина и норадреналина. Было показано, о на 28 сутки после перевивки опухоли происходит существешое патента тироопдпой функции и активности инсулярного аппарата, ракащееся в снижении уровня тироксина и инсулина, и резкое нетение секреции тестостерона. При этом значительно возрастало держание кортикостерона в крови. Наблюдалось также существенное яетение сишато- адреналовой системы, которое проявлялось в ааении продукции ДОФА и катехоламинов з мозговом слое надгточеч-ков.

Проведенные эксперименты показали, что в ряде случаев введение алогов предотвращало угнетение эндокринного статуса и изменения якционального состояния симпато-адреналовой системы, препят-зовало развитии состояния гиперкортицизма. Наибольший эффект эявлялся аналогами П)-Ю и 1Б-7. Аналоги 1Б-13 и 11Мб также зли тенденцию к нормализации уровня кортикостерона, которая эродировала с нормализующим действием этих аналогов на симпато-иналовую систему.

Выявленная корреляция мезду антиметастатической активностью элогов и их нормализующим действием на активность макрофагов азывает, по-видимому, на то, что эти аналоги проявляют антиме-зтатическую активность, действуя на иммунологическую систему шстентностк организма. " На основании получен:.их результатов шо предположить, что в значительной мере этот эффект опосреду-

ется влиянием аналогов на нейрогуморальные механизмы регулящ антиметастатической резистентности - эндокринные и симпак адреналовые.

4. Гипногенное действие

Изучение пшногенной активности аналогов ДСИП проводилось goi местно с Институтом эволюционной морфологии и экологии югоотга им.А.Н.Северцова в хронических опытах на 1сроликах с предварител! но вживленными электродами для регистрации биоэлектрической акт! вности коры мозга, обонятельной луковицы, глаз и мышц шеи, также с канюлями (по одной) в боковом желудочке мозга. Во врек опытов животные находились в условиях свободного повод^ния экспериментальных камерах, к которым они была заранее здяпть рованы.

Из литературных данных, известно, что сам ДСИП практически i обладает пшногенным действием. Однако небольшие изменения структуре молекулы приводят к значительным изменениям в ramoref ной активности: Так, замена Ala на NMeAla во втором солоней (ID-9) приводит к появлению мощного гипногенного эффекта во все протяжении 12-часовой записи, а замена на ^Ala (ID—12) привода к значительному подавлению медленно-волнового сна, причем "проф. ли" гипногенного воздействия двух структурно близких аналог* почти зеркально симметричны (рис.6 а,б).

Рис.6 Почасовая представленность медленного и парадоксального а у крыс после в/ж вьодения пептидов в дозе 7 нмоль/кг по сравнен] с контролем. Абсцисса - время после введения. Ордината - разнос, между пептидом и контролем. Щ§( -медленный сон, , -парадоксальный сен. * р<0,05 (N=7)

Увеличение устойчивости к протеолизу за счет введения 1-иашокислот во второе положение (ID-20, ID-17, ID-4) не приво-лт к существенным изменениям гипногенной активности, хотя укоро-:енный на три аминокислоты с G-конца аналог ID-10 с D-Ala во вто-юм положении вызывает гипногенные эффекты в первый (медленный :он), третий (парадоксальный сон) и пятый (медленный сон) часы 6-lacoBQñ записи при сохранении общей продолжительности сна.

Увеличение липофильности молекулы с одновременным увеличением гстойчивости к протеолизу (за счет введения D-аминокислот во вто-юе положение ID-1, ID-4, IL-13) только для одного аналога ID-1 зривело к увеличению гипногенной активности.

Таким образом, характер гипногенной активности аналогов ДСИП зависит прэцде всего от конформационных возможностей молекулы и je связан напрямую с точечными заменами в первичной структуре ЦСШ. Таким образом, небольшие замены в структуре эндогенного пептида могут приводить к значительным изменениям представленности различных фаз сна.

5. Сравнительные анализ биологических эффектов для аналогов ДСИП

Возвращаясь к описанным ранее предпосылкам в выборе аналогов, могшо сказать следующее. Увеличение устойчивости молекулы ДСИП к протеолизу действительно увеличивало для некоторых аналогов (ID-12, ID-5, ID-8) антиэпилептическую активность, но не явилось основным фактором усиления эффекта, поскольку для других аналогов с повышенной устойчивостью к протеолизу не наблюдалось увеличения активности (ID-1), а в некоторых случаях эффект пропадал (ID-10) или становился отрицательным (ID-4).

Изучение серии произвол ных с различной природой D-остатка во втором положении выявило значительную зависимость антиметастатической активности от природы Сокового радикала. Так, аналог с D-Val (ID-1), уступая ДСИП, все же сохраняет значительную активность, аналог с D-Phe (ID-13) уступает ID-1, аналог с D-Ser (ID-17) вообще не активен, а аналог с D-Pro (ID-26) проявляет противо полоаную активность. Таким образом, ограничение протеолитического отщепления N-концввого остатка триптофана с помощью введения различных D-остатков в положение 2 не приводит к существенному поло-зкитэльному сдвигу в их активности по сравнению с нативным ДСИП, что свидетельствует о значительной роли конформа: лонных факторов для реализации антиметастатического действия. К такому же выводу

приводит и сравнение активности ДСИП и СЬ-Тут^ДСИП (ID-15), который практически лишен активности вследствие замены L-Ala на L-Туг во втором положении.

Учитывая.тот факт, что наряду с наиболее уязвимым для протэо-лиза N-концевым остатком триптофана следующим участком, подвержен ным протеолизу, хотя и в меньшей степени, является участок Ala6-SerT, нами синтезированы и исследованы 2,6-диз8мещеннне аналоги ДСИП (ID-3, ID-7, ID-11). Аналог ID-11, содержащий пролин вс 2-ом и 6-ом положениях, практически лишен антиметастатическоЁ активности, а из сравнения аналогов ID-3 и ID-7, обладающих близкой активностью, можно видеть, что присутствие тирозина или про-лина в 6-ом положении практически равнозначно для антиметастатической активности. В случае антиэпилептической активности мн видам несколько иную картину. Аналоги ID-7 и ID-11, отличаэдкася остатками пролина и D-аланина во втором полокении, обладают одинаковой активностью, а аналог ID-3, отличающийся от аналога ID-7 наличием тирозина в шестом положении вместо пролина, проявляет совсем иной спектр антиэпилептической активности (Рис.3,4). .

Далее интересно отметить, что ацетилированный по -аминогруппе триптофана аналог вызывает стимуляцию метастазирования, проявляя тем самым эффект, обратный нативному ДСИП. Такое ингиби-руицее действие этого аналога свидетельствует о важности N-koh-цевой аминогруппы для проявляемой активности. Можно предположить, что в данном случае значимой является роль Н-концеЕой аминогруппа в поддержании необходимой пространственной организации молекулы, например, квазициклических структур; в то время как эозмоаное участие N -аминогруппы триптофана в связывании с гипотетически?; рецептором представляется менее вероятным, если учесть, что упо-мяйутый выше цикло[С1у-Ш1Р] обладает способностью увеличивав устойчивость к опухолевому росту.

Анализируя приведенные выше структурные закономерности, (аояшс сделать вывод, что необходимым условием проявления аналогами активности является прежде всего сохранение конформационных возможностей молекулы. Это предположение подтверждается также тем, что фрагмент иммуноглобулина (ID-16), довольно сильно отличаяс! своей первичной последовательностью от ДСИП заменами в положения! 2, 3, 6 и 7, тем не менее проявляет антиметастатическую активность. Этот аналог отличается от ДСИП повышенной липофильностью у несколько более жесткой структурой в N-концевоЯ части молекулы зе счет введения лейцина во второе положение и пролина в третье по-

\Ь

локение. Являясь фрагментом иммуноглобулина, аналог ID-16 проявля в? значительную антиметастатическую активность, хотя и уступает нативному ДСИП.

Если сравнить два вида биоактивности ДСИП (антиэпилептическую и анткметастатическую), можно обнаружить некоторое сходство в структурных закономерностях, проявляемых аналогами ДСИП. Увеличение липофильяости с одновременным увеличением устойчивости к про-теолизу за счет введения остатков D-аминокислот во второе положение несколько снижает активность аналогов (ID-1, ID-í3) в обоих тостах. По-видимому, энзиматическая деградация не является критичной для проявления этих видов Оиоактивности. Однако существует и несоответствие в структурных закономерностях - это важность С-концевого участка молекулы ДСИП для проявления антиэпилептической активности. Так, антиметастатическая активность укороченного с С-конца аналога ID-IO превышала активность нативного ДСИП, а антиэпилептическая активность, полностью отсутствовала.

Таким образом, описанные данные, полученные на ограниченном круге соединений, оставляют открытыми многие аспекты структурно-функциональной зависимости в ряду ДСИП и его аналогов. Тем не менее, выявленные и упомянутые выше особенности являются частью более полного анализа и могут быть полезны в направленном поиске эффективных ентиметастатичаских средств.

шведы

1. Твердофазным методом пептидного синтеза получено 17 аналогов пептида дельта-сна.

2. Проведена оптимизация условий синтеза аналогов нейропептида и сравнителышй анализ эффективности использования Вое- и Fmoc-^хем твердофазного синтеза. Выявлены отдельные преимущества применения Угаос-схемы синтеза аналогов.

3. Проведено изучение антиэпилептических, антиметастатических и гипногенных свойств полученных аналогов. Для каждого вида активности найдены аналоги, активность которых превышает актиЕ эсть нативного ДСИП: ID-5, ID-8, ID-12 для антиэпилептического, ID-1Q для антиметастатического и ID-10, ID-12 для гипногенного видов активности.

4. Проведено сравнительное структурно-функциональное изучение ДСИП для каждого вида биоактивности. Обнаружен шд структурно-фужционамышх закономерностей.

■ííj

Результаты диссертации иалояены в следуюзих публикации;

t. V.M.Kovalzon, F.Obal Jr., P.Alfoldl, S.Inoue, tl.Klmura-Takeuchl, V-Kalikhevich, I.Mlkhaleva, I.Prudchenko. Hypnogenii effects oi DSIP analogs: an unknom mechanism of sleep? In: 10t! Congr. Europ. Sleep Hes. Soc. Strasbourg, 1990, p.345.

2. V.M.Kovalzon, M.V.Kuntsevlch, F.0bal(Jr.), P.Alfoldl, S.Inoue Ы. Kimura-Takeuchl, I. I.Mlkhaleva, I.A.Prudchenko, V.N.Kalikhe vich, S.I.Churklna (1991), Modulatory action of metabolicall; stable DSIP analogs on subsequent sleep In rodents. In: Founding Congress of WFSRS, Cannes, 1991. Sleep Research. 20a, p.112.

3. I.A.Prudchenko, I.I.Mlkhaleva, A.A.Shandra, L.S.Godlevsk; (1992), DSIP and analogs: extra sleep actions, J.Sleep Res. 1 supplement 1, p.372.

4. V.Kovalzon, M.Kuntsevlch, I.I.Mlkhaleva, I.A.Prudchenko (1992), Novel DSIP analogs: hypnogenlc activity In rabbits J.Sleep Res. 1; supplement 1, p.239.

5. И.А. Прудченко, Л.В. Сташевская, И.И. Михалева, В.Т. Иванов, А.А. Шандра, Л.С. Годлевский, A.M. Мазарати. Синтез и биологи ческие свойства ряда новыханалогов пептида дельта-сна. I. Анти эпилептическое действие. Биоорган, хим., 1993, т.19, Л I, стр.43

6. I.I.Mlkhaleva, I.A.Prudchenko, V.T.Ivanov. Delta Sleep-Inducing Peptide: Novel Data in Biology and Chemistry. In : Structur & Function of Regulatory Polypeptides. Abstracts, 1992, p.48.

7. I.Mlkhaleva, I.Prudchenko and V.Ivanov. Delta- sleep Inducing Peptide (DSIP) and its Analogues: Sleep and Extra sleep actions Peptides 1992 (Proceedings or the 22nd EPS; editors: C.H.Schneider, A.N.Eberle), ESCOM, Leiden, 1993, P.663-664.

8. Ш.Иноуэ, М.Кимура-Такеучи, В.М.Ковальзон, И.И.Михалева, И.А.Прудченко, В.И.Свиряев, В.Н.Калихевич, С.И.Чуркина/ Соыноген ные аффекты структурных аналогов пептида дельта-сна. 1992, Журна высшей нервной деятельности, т.42, вып.З, стр.600-603.

9. V.M.Kovaleon, M.V.Kuntsevlch, Y.G.Gershovich, D.T.Luyn, I.I.Mlkhaleva, I.A.Prudchenko. Peptidergic medianIsms of sleep. 1993. Sleep Research, v.22, p.481.

10. В.М.Ковальзон, Ф.Обал (мл.), П.Алфелди, Ш.Иноуэ, М.Кшург Такеучи, И.И.Михалева, И.А.Прудченко, В.Н.Калихевич. Гигаюгеннь

го

Еффакты аналогов дальта-сояиндуцирущего пептида (DSIP): сравнительное изучении у кроликов н крыс. 1992. Журнал эволюционной биожамки и физиологии, т.28, N4, стр.467-471.

11. В.Ы.Ковальзоя, И.В.Купцебич, П.Ал$влдаг Л.Енет, И.И.Михалева, И.А.Прудаевко. Содаогевнне аффэтъ аналога пептида дельта-сна с повшзеяяой устойчивостью к протеолизу. 1993. Доклады Академии наук, т.ЗЙ9, N1, стр.103-105.

12. И.А. Прудченко, Л.В. Сташевская, Е.Н.Шзпель, И.И. Михалева, В.Т. Иванов, Ю.П.Шалько , А.П.Чалнй . В.Ю.Уманский , С.Н.Грш-певская . Синтез v биологические свойства аналогов пептида дельта-сна (ДСИй). II. Антимэтастатичвскоэ действие... Биоорган, хим., 1993, Т.19, й 12, стр.1177-1190.

13. I.A.Pridchenlco, I.I.Mllchaleva. Comparative study oí Boc- end пюс-approaehes In solid phase syntheses of DSIP analogues. Innovation and perspectives in Solid phase synthesis and complementary technologies. Abstracts of 3th International symposium, Oxford. UK, 1993 p.73.

2 Г