Таутомерия и кислотно-основное равновесие 5-глагеноурацилов в воде и диметилсульфоксиде тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ
|
Абдрахимова, Гульназ Салаватовна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Уфа
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2014
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.04
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
АБДР АХИМОВА ГУЛЬНАЗ САЛАВАТОВНА
ТАУТОМЕРИЯ И КИСЛОТНО-ОСНОВНОЕ РАВНОВЕСИЕ 5-ГАЛОГЕНОУРАЦИЛОВ В ВОДЕ И ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДЕ
02.00.04 - Физическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
г г МАЙ 2014
Уфа-2014
005548394
005548394
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук.
Научный руководитель: Иванов Сергей Петрович
кандидат химических наук, старший научный сотрудник
Официальные оппоненты: Зимин Юрий Степанович
доктор химических наук, профессор, профессор кафедры физической химии и химической экологии Федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»
Терехова Ирина Владимировна
доктор химических наук, доцент, старший научный сотрудник лаборатории «Химия гибридных материалов и супрамолекулярных систем» Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химии растворов им. Г.А. Крестова Российской академии наук
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук.
Защита диссертации состоится «20» июня 2014 г. в 14— часов на заседании диссертационного совета Д 002.004.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук по адресу: 450054, Башкортостан, г. Уфа, проспект Октября, 71, зал заседаний. Тел./факс: +7(347) 2356066. E-mail: chemorg@anrb.ru
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра Российской академии наук и на сайте организации: http: // w3.chem.anrb.ru
Автореферат разослан «19» мая 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета //) /
доктор химических наук, профессор Валеев Ф.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. 5-Галогеноурацилы проявляют широкую фармакологическую активность и находят применение в качестве противоопухолевых, антибактериальных и противовирусных препаратов. 5-Хлор- и 5-бромурацил, могут образовываться эндогенно при воспалительных процессах и способны внедряться в ДНК и РНК, где образуют «ложные» пары оснований с аденином или, находясь в редкой таутомерной или ионной форме, с гуанином. Литературные данные свидетельствуют о том, что факторы, влияющие на механизм кислотно-основного и таутомерного равновесий, имеют решающее значение при возникновении ошибок в репликации ДНК пли РНК. В связи с этим важно понимание закономерностей распределения молекулярных и анионных форм 5-галогеноурацилов в конденсированной фазе. Литературные данные о возможных таутомерных формах урацилов в растворах являются противоречивыми. Вопрос о направлении ионизации в молекуле урацилов является спорным из-за наличия нескольких донорных атомов, потенциально способных к протонированию или депротонированию. Поэтому, исследование таутомерного и кислотно-основного равновесия галогеипроизводных урацилов в растворах является актуальным.
Настоящая работа выполнена в рамках приоритетного направления «Живые системы», в соответствии с планом научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук по темам «Гомо- и гетерофункциональные соединения в комплексообразовании с металлами и фармаконами» (№ гос. регистрации 0120.0 801446), «Реакционная способность гомо- и гетерофункциональных соединений в комплексообразовании с металлами и фармаконами» (№ гос. регистрации 01201152187) при финансовой поддержке Программы №1 ОХНМ РАН «Теоретическое и экспериментальное изучение природы химической связи и механизмов важнейших химических реакций и процессов» и Программы №6 ОХНМ РАН «Химия и физико-химия супрамолекулярных систем и атомных кластеров».
Цель работы. Изучение кислотно-основного и таутомерного равновесия 5-галогеноурацилов в водных растворах и диметилсульфоксиде (ДМСО).
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- Квантово-химическое изучение относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе, воде и диметилсульфоксиде.
- Получение и идентификация солей 5-галогеноурацилов.
- Установление донорных атомов в молекулах 5-галогеноурацилов, участвующих в протонировании и депротонировании
- Определение количественного соотношения анионов в щелочных растворах 5-галогеноурацилов в воде и ДМСО.
Научная новизна и практическая ценность.
Впервые методом TPSSTPSS/6-311+G(d,p) рассчитана относительная устойчивость 5-фторурацила с учётом специфической и неспецифической сольватации в ДМСО. Определена относительная устойчивость 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацилов в водных растворах и ДМСО с учётом неспецифической сольватации. Проведена оценка влияния сольватации на относительную устойчивость таутомеров 5-галогеноурацилов.
Показано, что 5-галогеноурацнлы в водных растворах в кислой среде в диапазоне рН = 1.8 - 5.6 находятся в дикетоформе, в щелочной среде в диапазоне рН = 5.6-10.2 - в виде смеси двух анионов с депротонированием по N(1) и N(3) положениям пиримидинового кольца, а в щелочных растворах в ДМСО - в виде аниона с депротонированием по N(1) положению пиримидинового кольца. На основании данных УФ и ЯМР спектроскопии, и квантово-химических расчётов предложена схема депротонирования 5-галогеноурацилов в водных растворах и ДМСО. Определено соотношение депротонированных форм 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацилов при N(1) и N(3) положениях в щелочной среде в воде и ДМСО.
Впервые определены константы диссоциации 1-(тетрагидрофуранил-2)- и З-метил-5-фторурацилов в водном растворе.
На клеточных культурах НЕК293 проведены сравнительные исследования цитотоксических свойств 5-фтор-, 5-хлор-, 5-бром и 5-йодурацилов и их солей*. Предложен возможный механизм, определяющий цитотоксические свойства калиевой соли 5-фторурацила.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на X Международной конференции по проблемам сольватации и комплексообразования в растворах (Суздаль, 2007), на XIV и XV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» и «Ломоносов-2008» (Москва, 2007, 2008), на IX Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2008), на XI Молодежной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2008), на Международной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Кисловодск, 2009), на XVII Международной конференции по химической термодинамике (Казань, 2009), на Vm Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010), на П1 Международной конференции «Химия гетероциклических соединений» (Москва, 2010), на I Республиканской конференции молодых ученых «Химия в интересах человека» (Уфа, 2011), на XV Молодежной школе-конференции по органической химии (Уфа, 2012), на
* Результаты получены б Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук. Благодарим сотрудников Салимгарееву М.Х., Фарафоптову Е.И. и Вахитову Ю.В. за определение цитотоксической активности 5-галогеноурацилов и их солей
IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, 2013), на кластере конференций по органической химии «ОргХим-2013» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По результатам исследований опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и тезисы 13 докладов.
Структура и объём диссертации. Работа изложена на 132 страницах, содержит 33 рисунка, 28 таблиц, библиографию из 147 наименований. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Теоретическое изучение относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в воде и ДМСО
Методом ТР88ТР88/6-311+С(с1,р) рассчитана* относительная устойчивость таутомеров 5-фторурацила (Би) с учётом специфической сольватации и 5-хлор-(СШ), 5-бромурацила (ВгХ1) с учётом неспецифической сольватации в воде и ДМСО. Выбор растворителей обусловлен тем, что в воде и ДМСО 5-галогеноурацилы хорошо растворимы. Специфическую сольватацию моделировали в приближении пятиводной кластерной модели и сольватного комплекса, включающего две молекулы ДМСО (рис. 1).
Рисунок 1 - Сольватные оболочки 5-галогеноурацилов на примере Г и. Р11 + 5Н20 -пятиводный кластер, Би + 2ДМСО - сольватный комплекс с двумя молекулами ДМСО
Установлено, что самой устойчивой для Би, СШ и ВгЧ является дикетоформа А. В газовой фазе относительная устойчивость таутомеров убывает в ряду: А » В > I) > Е > С » Б (рис. 2). При учёте сольватации в воде и ДМСО наблюдаются заметные изменения в энтальпиях" таутомеров. В водной среде таутомерные формы Ри становятся более стабильными, чем
* Все квантово-химнческие расчеты выполнены на кластерном суперкомпьютере ЦКП «Химия» ИОХ УНЦ РАН.
**При установлении рядов устойчивости таутомеров 5-галогенурацилов по абсолютной энтальпии в качестве реперного соединения выбран таугомер А
РТГ+5П20 ГСГ+2ДМСО
в газовой фазе, при этом второй по устойчивости становится форма Б (рис. За).
ООО
Рисунок 2 - Таутомеры
Ek J^,HaI
, 3 'Т
I
н
A
OH
Jtr
О N
I
H
Hal
Л
no'
в
OH
N*
л
HO N'
ПОГ N^
I
H
с
OH
N'
X
5-галогеноурацилов
Неспецифическая сольватация в ДМСО стабилизирует формы С и Б, а специфическая - только форму В, при этом остальные таутомеры ри становятся менее выгодными (рис. 36).
АН,
кДж/моль
□ Газовая фаза 0PCM
■ РСМ+кластер
а)
Рисунок 3 — Диаграммы относительной устойчивости таутомеров FU в газовой фазе и с учётом
неспецифической (РСМ) и специфической б) (РСМ+кластер) сольватации в воде (а) и ДМСО (б)
С
Таутомеры
Для СШ и Вги при учёте неспецифической и специфической сольватации в воде и ДМСО после дикето-формы далее по устойчивости следуют таутомеры Б и В, причем их энтальпии в обоих растворителях отличаются незначительно (табл. 1).
Ввиду большой энергетической разницы между таутомером А и остальными таутомерами, в данных условиях содержание минорных форм незначительно, т.е. образованием таутомерных форм можно пренебречь.
Таблица 1 - Относительные энергии (ДН, кДж/моль) таутомеров СШ и Вги с учётом неспецифической сольватации в воде и ДМСО
Урацил ДН, кДж/моль
А В с 1> Е
Вода
аи 0.0 50.5 62.5 49.3 72.5
ВШ 0.0 50.5 63.0 48.5 72.3
ДМСО
сю 0.0 50.2 62.8 49.2 72.0
Вги 0.0 50.4 63.2 48.5 72.0
2. Кпслотно-осповное равповесие 5-галогеноурацилов в кислой водной среде
В молекулах 5-галогеноурацилов имеются несколько участков, которые могут участвовать в образовании донорно-акцепторной связи с протоном^ -два карбонильных кислорода и два азота амидных групп. Методами УФ-, Н и 13С ЯМР спектроскопии была изучена возможность протонирования 5-галогеноурацилов в водной среде в диапазоне рН = 1.8- 5.6.
В УФ-спектре водного раствора Ри (рН = 5.6) наблюдается полоса поглощения в области 266 нм с молярным коэффициентом поглощения £ = 7.0-103 л-моль'-см"1 (рис. 4), что свидетельствует о дикето-структуре исследуемого соединения.
Рисунок 4 - УФ-спектр водных растворов Ри (25 °С, с0 = 5-Ю"4 М, / = 0.2 см). 1 - рН = 5.60, 2 - рН ~ 3.98, 3-рН= 1.84
Как видно из рис. 4, при уменьшении рН водного раствора 5-фторурацила не наблюдается изменений в спектрах поглощения. Аналогично, в УФ-спектре водного раствора Вги (рН = 5.5) наблюдается
полоса поглощения в области 276 нм (е = 6.4-103 л-моль"'-см"1), СШ - 275 нм с молярным коэффициентом поглощения е=7.3-103 л-моль" -см", 5-иодурацила (Ш) - 283 нм (е = 6.0-103 л-моль"1-см"1). Спектры данных урацилов при уменьшении рН в диапазоне рН = 1.8 - 5.6 аналогичны спектрам поглощения П! Отсутствие изменений в УФ спектрах 5-галогеноурацилов при уменьшении рН свидетельствует, вероятно, о сохранении нейтральной дикето-формы исследуемых соединений.
Для установления места возможного протонирования при уменьшении рН были зарегистрированы ЯМР 13С спектры солянокислых водных растворов 5-галогеноурацилов (рН (5-НаШ) = 5.6; рН (5-НаШ:НС1) = 1.8) (табл. 2).
Таблица 2 - Экспериментальные значения величин химических сдвигов
5-галогеноурацилов в водных растворах
Соединение б, м.д, 020
С(2) С(4) С(5) С(6) 'н
ги 151.62 160.32 140.62 126.88 7.62
Ри:НС1=1:1 151.45 160.32 140.58 126.88 7.55
СШ 152.30 162.84 107.87 140.35 7.77
СШ:НС1=1:1 152.27 162.85 107.88 140.38 7.77
Вги 152.71 163.08 95.41 143.30 7.94
Вги:НС1=1:1 152.53 163.00 95.23 143.30 7.65
ГО 153.36 164.54 66.38 148.27 7.96
ГО:НС1=1:1 153.00 164.21 66.40 148.37 7.95
Как видно из табл. 2, в кислой среде не наблюдается изменений в величинах химических сдвигов 5-галогеноурацилов. Это свидетельствует о сохранении непротонированной дикетоформы данных соединений.
Таким образом, методами УФ и 13С ЯМР спектроскопии показано, что в области рН = 1.8 - 5.6 в водных растворах 5-галогеноурацилов протонирование не происходит.
3. Кислотно-основное равновесие 5-галогеноурацилов в щелочной среде 3.1. УФ спектроскопия
При увеличении рН нейтральных водных растворов ПГ (рН = 5.6) наблюдается уменьшение интенсивности полосы поглощения в области 266 нм и появление новой полосы поглощения с максимумом при 310 нм (рис. 5). Для СШ, Вги и Ш при увеличении рН наблюдается батохромное смещение полос поглощения в УФ-спектрах на 22-23 нм (рис. 5). Две изобестические
точки свидетельствуют о равновесии трёх форм в растворе. Мы предположили, что наблюдаемые изменения УФ спектров обусловлены депротонированием 5-галогеноурацилов. При этом возможно образование двух анионных форм - АШ и АКЗ, а также дианиона.
Рисунок 5 - УФ-спектры водных растворов ри (а), СШ (б), Вг1) (в) и Ш (г) при увеличении рН (25 °С, с0= 5-Ю"4 М, 1 = 0.2 см). 1 -рН = 5.2, 2 -рН = 7.0, 3 - рН = 7.5, 4 - рН = 8.5, 5 - рН = 10.5
Для определения энергетически наиболее выгодного аниона 5-галогеноурацилов методом ТР58ТР55/6-311+0(с1,р) рассчитаны энергии (ДН, кДж моль') анионных форм ТО, СШ и Вги в воде и ДМСО с учетом специфической сольватации:
ам аю а02 а04
Среди них в ДМСО наиболее устойчивым анионом Щ является АШ, а в водном растворе - анион АЫЗ (табл. 3). Для СШ и Вг11 в обеих средах более устойчив анион ЛКЗ.
Согласно литературным данным величина рКа 5-галогеноурацилов по первой ступени наблюдается в диапазоне рН = 7.9-8.3, по второй - рН = 12.014.0. В наших условиях рН растворов не превышает рН = 10.5, поэтому образованием дианиона 5-галогеноурацилов можно пренебречь.
Таблица 3 — Относительные энергии (ДН, кДж/моль) анионных форм FU, C1U и BrU (TPSSTPSS/6-311+G(d,p)) в воде и ДМСО
Урадил AN1 AN3 AO2 A04
Вода
FU 0 -2.2 33.3 35.6
C1U 0 6.2 - -
BrU 0 8.0 - -
ДМСО
FU 0 10.7 76.3 47.2
C1U 0 13.0 - -
BrU 0 13.6 - -
Мы предполагаем, что спектры поглощения 5-галогеноурацилов в водных растворах при увеличении рН представляют собой суперпозицию спектров поглощения исходной и анионных форм. Об этом свидетельствуют УФ-спектры модельных соединений анионов FU и BrU. В качестве модельного соединения аниона AN3 FU мы использовали 1-(тетрагидрофуранил-2)-5-фторурацил (TF), в котором протон по N(1) положению замещен на тетрагидрофуранильную группу, а аниона AN1 - 3-метил-5-фторурацил (З-Me-FU), синтезированный нами по известной методике*. В качестве модельного соединения аниона AN3 BrU использован 5-бромуридин (BrUrd), в котором протон по N(1) положению замещен на сахарный остаток:
TF 3-Me-FU BrUrd
В УФ-спектре BrUrd в нейтральных водных растворах наблюдается полоса поглощения при 279 нм (s = 8.5103 л-моль"1-см"1), TF - 271 нм (s = л-моль"1см"'), 3-Me-FU - 267 нм (s = 6.9103 л-моль"'-см"'). При увеличении рН водных растворов BrUrd и TF наблюдается уменьшение интенсивности полос поглощения, не происходит появления новой полосы поглощения в области 300-310 нм, как в случае с BrU и FU (рис. 6). При увеличении рН водных растворов З-Me-FU в УФ-спектре появляется новая полоса поглощения с максимумом при 293 нм, соответствующая поглощению аниона AN1 (рис. 6).
* Wierzchowski K.L., Litonska Е., Shugar D. // J. Am. Chem. Soc. - 1965. - V. 83, № 20. - P. 4621-4629.
Рисунок 6 - УФ-спектры водных растворов TF (a), BrUrd (б) и З-Ме-FU (в) при увеличении рН (25 °С, с0= 5-10"4 M, 1 = 0.2 см). 1 - рН = 5.5, 2 -рН = 7.5,3 - рН = 8.3,4 - рН = 6.72,5 - рН = 9.0, 6 - рН = 10.4
В спектрах поглощения 5-галогеноурацилов при различных соотношениях с гидроксидом калия (5-галогеноурацил: КОН = 4:1, 2:1, 1:1, 1:2), а также их солей в ДМСО наблюдается появление новой полосы поглощения с максимумом при 310 нм (рис. 7).
Рисунок 7 - УФ-спектры Ги (а) и Вг11 (б) при различных соотношениях с гидроксидом калия в ДМСО (25 °С, с0= 5-КГ* М, 1 = 0.2 см). 1 - Вги Ри, 2 - П] (Вги): КОН = 4:1, 3 - Ри (Вги): КОН = 2:1, 4 - Ри (Вги): КОН = 1:1, 5 - Ри (Вги): КОН = 1:2, 6 - ри-К, Вг1НЧа (с0= МО" М)
Монозамещенные натриевые и калиевые соли были получены взаимодействием эквимолярных количеств 5-галогеноурацилов и
соответствующих гидроксндов в водных растворах. Структура выделенных солей была установлена методами ЯМР и ИК спектроскопии.
Сравнивая спектры поглощения щелочных растворов Ки и ВгБ и их солей (Ш-К и ВгЬ-Ха, соответственно) в ДМ СО, эту полосу поглощения можно отнести к поглощению анионной формы АШ.
Таким образом, на основании полученных методом УФ-спекгроскопии данных предполагается, что при увеличении рН водных растворов 5-галогеноурацилов происходит депротонированис с образованием анионных форм АШ и АЮ, а в ДМСО - с преимущественным образованием аниона
аш.
3.2. ЯМР спектроскопия
Для установления места депротонирования в молекуле Ш были зарегистрированы 'Н, 13С и 19Р ЯМР спектры* в нейтральной и щелочной средах путем добавления в ампулу с раствором гидроксида калия в соотношении 1:1, 2:1 и 4:1, а также его монозамещенной калиевой соли, растворенной в Б20 и ДМСО-г/« (табл. 4).
Таблица 4 - Экспериментальные и теоретические (ТРЗБТРБЗ/б-311+С(<1,р)) значения химических сдвигов (м.д.) Ш, его щелочных растворов и калиевой соли (Ш-К) в ДМСО и Б20
Атом d2o
Эксперимент Расчёт
FU FU/KOH FU-K FU-A FU-AN1 FU-AN3
4/1 2/1 1/1 (рН=8.46)
С(2) 151.62 154.13 154.85 157.78 158.98 150.27 156.28 154.69
СС4) 160.32 162.52 163.06 165.54 166.78 155.40 154.87 162.64
С(5) 140.62 141,07 141.20 141.80 141.94 142.17 142.61 142.86
С(6) 126.88 127.84 128.08 129.24 129.34 126.32 137.59 122.74
Hf6) 7.62 7.57 7.55 7.62 7.46 6.34 6.48 5.98
F -169.31 -169.43 -169.38 -169.33 -169.20 -193.07 -205.64 -197.67
ДМСО-î/S
Атом Эксперимент Расчёт
FU ГО/КОН FU-K FU-A FU-AN1 FU-AN3
4/1 2/1 1/1
02) 150.19 151.90 153.54 156.81 159.04 149.20 157.22 156.81
СГ4) 158.05 158.24 158.46 158.96 157.89 156.33 156.01 164.01
С(5) 139.94 140.08 140.26 140.70 140.67 141.17 142.35 142.94
С(6) 126.42 129.35 132.10 137.64 139.43 125.31 138.62 121.01
НС6) 7.76 7.70 7.64 7.46 7.40 6.05 6.47 5.71
F -171.40 -173.36 -175.17 -178.72 -180.80 -199.87 -215.30 -202.75
* Спектры ЯМР были записаны на спектрометре Bruker Avance-III 500 MHz ЦКП "Химия» ИОХ УНЦ РАН.
Как видно из спектральных данных, щелочные растворы ТО отличаются от нейтральных смещением значений химических сдвигов всех сигналов углерода в слабое поле. При этом в водно-щелочном растворе ри сигналы С(2) и С(4) более деэкранированы, чем в щелочном растворе в ДМСО-Л«, в то время как для сигнала С(6) деэкранирование сильнее проявляется в щелочном ДМСО-</б. Сигнал С(5) в обоих растворителях мало чувствителен к изменениию рН раствора.
Для локализации области в молекуле Ри, претерпевающей наиболее значительные структурные изменения в щелочной среде, были определены константы спин-спинового взаимодействия Ри (рис. 8) в ВгО и ДМСО-^й. дмсо-с16 в2о
Рисунок 8 - Константы спин-спинового взаимодействия (Гц) ТО в В20 и ДМСО-^б (.молекула в щелочных растворах изображена схематически, без учёта изменений, которые она претерпевает)
Согласно экспериментальным данным, при добавлении гидроксида калия в ДМСО структурные изменения в молекуле Ри затрагивают область С(2)-Ы(1)-С(6), а в растворе Э20 - область С(2)-Х(3)-С(4) (рис. 8). Характер изменения констант спин-спинового взаимодействия и величин химических сдвигов в щелочных растворах свидетельствует о депротонировании Ри.
С целью выяснения структуры анионов Ри в 020 и ДМСО-</6 были зарегистрированы 13С и 'Н ЯМР спектры растворов Ри-К, а также растворов с различным соотношением гидроксида калия и ТО (табл. 4). Спектр ЯМР 13С оказался практически идентичен спектру раствора с эквимолярным соотношением компонентов (КОН, Ри) в соответствующих растворителях.
Постепенное увеличение содержания КОН в растворе характеризуется аналогичным РС-К слабопольным смещением сигналов, которое тем больше, чем значительнее количество гидроксида калия (табл. 4).
Для установления места депротонирования ВгХ] были зарегистрированы *Н и 13С ЯМР спектры в нейтральной и щелочной среде и его монозамещённой натриевой соли (Вг11-1Ча) (табл. 5) в ДМСО-й?л и Б20.
Таблица 5 - Экспериментальные и теоретические (ТР88ТР88/6-311+С(с1,р)) значения химических сдвигов (м.д.) Вги, его щелочных растворов и Вг1ИЧа в Б20 и ДМСО-й?«
Атом б2о
Эксперимент Расчёт
Вги ВгШЧаОН=1/1 (рН=8.76) Вги-Ма Вги-А Вги-АШ Вги-АГО
С(2) 152.71 159.61 160.16 151.52 158.41 155.87
С(4) 163.08 166.51 166.74 158.83 158.84 165.78
С(5) 95.41 94.87 95.63 111.96 107.38 111.73
С(6) 143.30 151.21 151.75 140.14 152.41 137.11
Н(6) 7.94 7.84 7.85 6.21 6.28 5.90
Атом дмсо-л
Эксперимент Расчёт
ВШ Вги/№ОН=1/1 Вги-Иа Вги-А Вг11-АМ1 Вги-АШ
С(2) 150.95 159.00 159.61 150.43 157.92 150.43
С(4) 160.23 161.93 161.65 159.13 166.07 159.13
С(5) 94.54 91.12 90.38 108.86 110.79 108.86
С(6) 142.31 155.91 157.05 139.57 135.93 139.57
Н(6) 7.90 7.66 7.63 5.93 6.21 5.64
Из спектральных данных видно, что при увеличении рН в Б20 наблюдается смещение химических сдвигов сигналов С(2), С(4) и С(6) в слабое поле, а в ДМСО-с/б - слабопольный сдвиг сигналов С(2) и С(6), при этом сигнал С(4) смещается незначительно.
Спектр ЯМР 13С ВгТМЧа (табл. 5) в обоих растворителях тождественен сигналам щелочных растворов Вги. Согласно полученным данным при увеличении рН в Э20 структурные изменения в молекуле Вги происходят в области С(4)-М(3)-С(2)-Ы(1)-С(6), а ДМСО-^ - в области С(2)-Т«[(1)-С(6). Наблюдаемые различия химических сдвигов углеродных атомов, особенно С(6), в спектрах Р1Г и Вги в водно-щелочных растворах, по-видимому, происходят вследствие большего вклада в резонансный спектр щелочного раствора Вг11 структуры ВгТ_1-АШ.
Аналогичные параметры 'Н и |3С ЯМР спектров СШ и ГО в нейтральной и щелочной среде и их солей наблюдаются в ДМС0-й?6 и П20 (табл. 6-7). Изменения величин химических сдвигов щелочных растворов СГО и ГО тождественны спектрам щелочных растворов Вги в обоих растворителях.
Таблица 6 — Экспериментальные и теоретические (ТР88ТР88/6-311+С(с1,р)) значения химических сдвигов (м.д.) СШ, его щелочных растворов и монозамещённой соли (СШ-К) в ДМСО-й?^ и Б20
Атом в2о
Эксперимент Расчёт
С1и С1и/КОН=1/1 (рН=9.68) аи-к СШ-А СИГ-АЖ СГи-АЮ
С(2) 152.30 159.34 160.33 151.11 157.18 155.52
С(4) 162.84 166.79 167.29 158.10 158.30 164.92
С(5) 107.87 106.89 106.80 115.62 111.94 115.25
С(б) 140.35 147.85 148.55 137.43 149.32 134.48
Н(6) 7.77 7.72 7.69 6.25 6.24 5.92
Атом дмсо-а6
Эксперимент Расчёт
С1и СЮ/КОН=1/1 С1и-К С1и-А сли-лтс1 аи-лга
С(2) 150.74 158.53 159.91 150.03 158.74 157.47
С(4) 160.12 161.48 161.94 158.55 159.04 165.59
С(5) 106.11 101.65 101.27 112.98 109.11 114.60
С(6) 139.83 153.45 155.60 136.68 150.30 133.06
Н(6) 7.84 7.58 7.54 5.96 6.26 5.67
Таблица 7 - Экспериментальные значения химических сдвигов (м.д.) Ш, его щелочных растворов и монозамещённой соли 11МЧа в ДМСО-^ и Б20
Урацил 5, м.д.
С(2) | С(4) | С(5) | С(6) | Н(6)
о2о
ш 153.36 164.54 66.38 148.27 7.96
1итаОН=1/1 159.85 167.38 66.11 157.39 7.97
Ш-Ыа 159.72 167.10 65.74 157.26 7.93
ДМСО-^
ш 151.41 1 161.70 67.76 147.14 7.90
ШЛЧаОН=1/1 (рН=10.29) 158.21 162.63 63.63 159.19 7.78
[и-Ка 159.48 1 162.78 63.06 161.19 7.75
Таким образом, мы предполагаем, что в щелочном растворе в ДМСО-^ происходит депротонирование 5-галогеноурацилов с преимущественным образованием аниона АШ, а в щелочном растворе в 020 - с образованием анионов А1Ч1 и АЫЗ.
Изменение структуры молекул Ри и Вг11 при добавлении эквимолярного количества гидроксида калия было изучено на модельных соединениях - ТР (табл. 8), З-Ме-Щ (табл. 9) и ВгУгс! (табл. 10).
Таблица 8 - Экспериментальные и теоретические (ТРБЗТРБЗ/б-311+С(с1,р)) значения химических сдвигов ТР и его щелочных растворов _в ДМСО-</д и Р20_
и2о
Атом Эксперимент Расчёт
ТР ТР/КОН =1/1 (рН=8.32) ТР-АЮ
С(2) 149.92 155.79 147.76 151.75
С(4) 159.59 166.52 155.24 162.07
С(5) 140.52 141.70 140.88 143.63
С(6) 125.86 124.36 124.40 121.95
С(7) 87.54 87.23 95.50 92.49
С(8) 31.62 31.76 36.10 36.37
С(9) 23.15 23.30 25.44 25.90
С(10) 70.47 70.10 76.30 74.82
Н(6) 7.84 7.65 6.66 6.40
Р -167.45 -165.33 -194.71 -194.33
БМЗО-^
Атом Эксперимент Расчёт
ТБ ТР/КОН=1/1 ТР ТР-АЮ
С(2) 148.95 154.44 146.64 153.42
С(4) 157.23 163.70 155.98 163.94
С(5) 139.96 141.55 140.44 142.19
С(6) 125.00 121.86 123.21 119.50
С(7) 86.35 85.62 94.38 92.83
С(8) 31.47 31.47 36.09 35.96
С(9) 23.67 24.07 25.59 25.58
С(Ю) 69.34 68.49 75.97 74.82
Н(6) 7.87 7.37 6.50 6.10
Б -168.05 -165.69 -201.64 -198.64
В спектрах щелочных растворов ТТ, для которого возможно образование только аниона АЫЗ, наблюдается слабополъный сдвиг углеродных сигналов пиримидинового кольца, кроме сигнала С(6). Спектры щелочных растворов ТР в ДМСО-^ и БгО близки к химическим сдвигам щелочного водного раствора Ри.
Спектры щелочного раствора З-Ме-ри, для которого возможно образование только аниона А№, характеризуются слабопольным смещением сигналов С(2) и С(6) (табл. 9). Подобный характер смещения сигналов наблюдался в щелочных растворах Ри в ДМСО-с/6.
Таблица 9 - Экспериментальные значения химических сдвигов З-Ме-ри и его щелочного раствора в 020
Соединение 5, м.д
С(2) С(4) С(5) С(6) С(7) Н Б
З-Ме-ри 152.72 160.14 143.22 127.10 27.75 7.63 -168.27
3-Ме-ри:КОН=1:1 157.74 160.42 141.46 138.04 28.22 7.66 -172.20
В спектрах щелочных растворов Вг1)гс1, для которого возможно образование только аниона АЮ, наблюдается слабопольный сдвиг углеродных сигналов, кроме сигнала С(6) (табл. 10). Спектры щелочных растворов Вгигс! отличаются от спектров щелочных растворов Вг11, а именно в ДМСО-с4 - большим деэкранированием сигнала С(4), в 020 -большим экранированием сигнала С(б), что свидетельствует о существенном содержании аниона АШ в щелочном растворе Вг11.
Таблица 10 — Экспериментальные значения химических сдвигов Вгигс! и его щелочных растворов в ДМСО-б?б и П20
Атом 5, м.д.
ДМСО-А Б2О
Вгип! Вгиг<1:КОН=1:1 Вгигс! Вг1Ггс1:КОН=1:1
С(2) 150.01 155.66 150.86 156.36
С(4) 159.18 165.91 161.82 168.59
С(5) 95.73 98.23 96.34 97.77
С(6) 140.40 138.46 141.00 140.15
С(7) 88.52 88.86 89.60 89.80
С(8) 73.99 73.91 73.94 73.88
С(9) 69.28 69.55 68.73 68.95
С(10) 84.69 84.20 83.95 83.67
С(11) 60.13 60.64 60.00 60.31
С(6)-Н 8.49 8.03 8.33 8.16
Данные, полученные для этих модельных соединений, подтверждают наши предположения о структуре анионов 5-галогеноурацилов в водной среде и ДМСО.
Таким образом, обобщая данные, полученные методами УФ- и ЯМР спектроскопии, для 5-галогеноурацилов в ДМСО при добавлении гидроксида калия мы предполагаем образование аниона АШ, а в водных растворах в диапазоне рН = 5.0-10.6 - депротонирование с образованием двух анионов АШ и АЮ:
3.3. Установление состава анионных и молекулярных форм в щелочных растворах 5-галогеноурацилов
Мы предположили, что наблюдаемые сигналы в спектрах ЯМР 5-галогеноурацилов являются усреднением химических сдвигов отдельных структур. Эффективные химические сдвиги в спектрах ЯМР С для произвольного состава раствора можно вычислить, используя закон мольных соотношений:
где г5, - эффективный
химическии сдвиг у-атома углерода, ^,согг скорректированный химический сдвиг у'-атома углерода в /-компоненте раствора, х,• - мольная доля /-компонента раствора и расчётные химические сдвиги отдельных компонентов.
Величины мольных долей форм А, АШ и АШ для ИГ, СШ и Вг11 были рассчитаны (табл. 11), минимизируя функционал:
М N . ■-
М-1
где р и ¿у,согг- массивы экспериментальных и теоретических значений химических сдвигов компонентов раствора, соответственно; ЛГ— число компонентов раствора; М- количество С-атомов в замещенных урацилах.
Значение энергии АН (Д# =#А№-ДамО, вычисленное на основании полученных мольных долей анионов 5-фторурацила по распределению Больцмана (табл. 11), находится в хорошем соответствии с теоретическими данными (ТР88ТР88/6-311+С(<1,р)) для эквимолярных водных растворов (табл. 3) 5-фторурацила.
При переходе от воды к ДМСО наблюдается инверсия распределения двух анионных форм Би. Мы предполагаем, что это обусловлено большей стабильностью аниона Би-АЮ в водных растворах вследствие большего по сравнению с ГО-АШ дипольного момента (7.76 Д и 2.35 Д для анионов ри-АИЗ и ГО-АШ, соответственно, ТР88ТР88/6-311+С((1,р)). Из табл. 11 видно, что в водных щелочных растворах СШ и Вги наблюдается большее
содержание аниона АШ. Мы связываем это с большей устойчивостью анионов СШ-АШ и Вги-АШ (табл. 3) в водных растворах по сравнению с соответствующими А№ анионами.
Таблица 11 - Отношение мольных долей форм А, АШ и АЫЗ 5-галогеноурацилов (х на1и-А/л"шш-А№/-Х1ыи-Аго), а также разность энтальпий образования анионных форм ДН (значение в скобках, кДж/моль)
Hal HalU-K HalU/KOH=
1/1 2/1 4/1
Вода
0.00/0.35/0.65 0.00/0.38/0.62 0.36/0.24/0.40 0.49/0.19/0.32
(-2.60) (-2.40) (-2.45) (-2.43)
С1 0.00/0.68/0.32 0.00/0.65/0.35 - -
Вг 0.13/0.33/0.54 0.18/0.29/0.53 - -
ДМСО
0.00/0.98/0.02 0.00/0.88/0.12 0.56/0.42/0.02 0.77/0.22/0.01
(9.65) (9.65) (7.55) (7.66)
С1 0.00/1.00/0.00 0.00/1.00/0.00 - -
Вг 0.00/0.99/0.01 0.00/0.92/0.08 - -
Рассчитано по распределению Больцмана.
Содержание анионных форм 5-галогеноурацилов может быть вычислено по уравнению:
РКа = jei-pK. (N(1)) + х2 РКа (N(3», * (1)
где х\ и х2 - соответственно мольные доли анионных форм AN1 и AN3, если известны pKa(N(l)) и pKa(N(3)) урацилов, которые можно определить с использованием модельных соединений. Относительное содержание анионных форм AN1 и AN3 для FU, вычисленное по уравнению 1 с использованием pKa(FU)=7.98** и рКа определенных нами для модельных соединений TF и З-Me-FU (табл. 12), составило соответственно 0.30 и 0.70.
Таблица 12 — Константы и термодинамические характеристики депротонирования ТР и З-Ме-ТО в водных растворах (0.1 М ЮЧОз), определенные методом потенциометрического титрования
Соединение т, °с рКа AGa98, кДж/моль ДН, кДж/моль AS298, Дж/моль-К
TF 20 25 35 45 7.96±0.15 7.93±0.07 7.80±0.07 7.69±0.02 45.2±0.4 19.9±0.5 -84.8±1.4
20 8.23±0.05
3-Me-FU 25 35 45 8.10±0.04 8.06±0.04 7.89±0.08 46.4±0.2 22.6±0.7 -79.6±2.8
* Bernett М.Т., Rodgers М.Т., Hebert A.S., Ruslander L.E., Eisele L., Drohat, A.C. II J. Am. Chem. Soc.-2006.-V. 128, № 38. -P. 12510-12519.
** Усредненное значение pK получено из литературных данных для температуры 25 "С.
Как видно из табл. 12, величины рКа ТТ и З-Ме-Щ близки к рКа Ш. Изучение влияния температуры на константы депротонирования позволило установить, что процессы кислотно-основного равновесия ТР и З-Ме-Ри эндотермичны. Величины изменений энергий Гиббса свидетельствуют об энергетической невыгодности образования анионных форм в нейтральной среде.
Таким образом, полученное соотношение анионных форм 5-галогеноурацилов подтверждают наши предположения о составе щелочных растворов и доминантных анионных формах.
4. Цитотоксические свойства 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей
Был проведён анализ действия 5-галогеноурацилов, а также их монозамещённых натриевых и калиевых солей на метаболическую активность клеток эмбриональной почки человека НЕК293 с целью изучения цитотоксических свойств данных соединений (табл. 13).
Результаты анализа метаболической активности клеток показали, что среди всех изученных 5-галогеноурацилов и их солей только Ш и ПГ-К цитотоксичны в отношении клеточной линии НЕК293.
Таблица 13 — Цитотоксичность 5-галогеноурацилов и их солей
FU C1U BrU IU FU-K СЮ-К BrU-Na lU-Na
14.82 мкМ >1 mM >1 MM >1 mM 14.60 мкМ >1 mM >1 MM >1 mM
Далее был проведен in vitro анализ влияния этих солей на ДНК-связывающую активность биомишеней — транскрипционных факторов -CREB, NF-кВ, р53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIFI а. Исследование эффекта FU-K в отношении данных биомишеней показало выраженное увеличение ДНК-связывающей способности транскрипционного фактора р53 (на 38%) и снижение для HIFI а (на 26%) (рис. 10).
Рисунок 10 - Влияние FU-K (10 мкМ, 24 ч) на ДНК-связывающую активность различных транскрипционных факторов: NFkB, NFAT, STAT1, HIFI, p53, CREB, GAS, VDR и HSF1
* p< 0.05
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что среди солей 5-галогеноурацилов только FU-K проявляет высокую цитотоксическую активность. Предполагается, что основным механизмом
готово-604020-
"ЙП
В
NFkB NFAT STAT1 HIF1a р53 CREB GAS VDR HSP
регуляции цитотоксических свойств FU-K является активация
транскрипционного фактора р53 и ингибирование транскрипционного
фактора H1F 1а.
ВЫВОДЫ
1. На основании данных квантово-химическнх расчётов с учётом неспецифической и специфической сольватации в воде и с учётом неспецифической сольватации в диметилсульфоксиде (ДМСО) получены ряды относительной устойчивости таутомеров 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацила. Показано, что наиболее устойчивым для всех изученных 5-галогеноурацилов является дикето-таутомер. Впервые методом TPSSTPSS/6-311+G(d,p) рассчитана относительная устойчивость таутомеров 5-фторурацила с учётом специфической сольватации в ДМСО. Показано влияние растворителя (воды и ДМСО) на относительные энергии таутомеров 5-фторурацила.
2. Методами УФ и ЯМР спектроскопии и кванто-химических расчётов с использованием модельных соединений показано, что в водных растворах в диапазоне рН = 1.8 — 5.6 5-галогеноурацилы находятся в дикетоформе, в диапазоне рН = 5.6-10.2 - в виде смеси двух анионов с депротонированием по N(1) и N(3) положениям пиримидинового кольца, а в щелочных растворах в ДМСО - в виде аниона с депротонированием по N(1) положению пиримидинового кольца.
3. На основании данных УФ и ЯМР спектроскопии и квантово-химическнх расчётов предложена схема депротонирования 5-галогеноурацилов в водных растворах и ДМСО.
4. Методами ЯМР спектроскопии и квантово-химических расчётов определено количественное соотношение анионов 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацила в щелочной среде в воде и ДМСО.
5. Впервые методом потенциометрического титрования определены рКа 1-(тетрагидрофуранил-2)- и З-метил-5-фторурацила в водной среде (25 °С, 0.1 MKN03):
рК0(1-(тетрагидрофуранил-2)-5-фторурацила) = 7.93±0.07, рКа(3-метил-5-фторурацила) = 8.10±0.04.
СПИСОК НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ
1. Лукманов Т.П., Абдрахимова Г.С.. Хамитов Э.М., Иванов С.П. Теоретическое исследование относительной устойчивости кето-енольных таутомеров 5-хлорурацила. // Журнал физ. хим. - 2012. - Т. 86, № 7. - С. 1221-1225.
2. Салимгареева М.Х., Фарафонтова Е.И., Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П., Вахитова Ю.В. Синтез, биологическая активность и механизмы действия монозамещенных солей 5-галогеноурацилов // Хим. фарм. журнал. - 2014. -Т. 48, №4.-С. 14-16.
3. Иванов С.П., Абдрахимова Г.С.. Даугова И.Ф., Спирихин JI.B., Хурсан C.JI., Муринов Ю. И. Изучение депротонирования 5-фторурацила // Башк. хим. журнал - 2010. - Т. 17, №1. - С. 42-45.
4. Салимгареева М.Х., Вахитова Ю.В, Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П. Механизмы цитотоксического действия 5-фторурацила // Тезисы докладов IX Всероссийской конференции «Химия и медицина». - 2013. - Уфа (Абзаково). - С. 273.
5. Лобов А.Н., Абдрахимова Г.С.. Спирихин Л.В., Иванов С.П. Исследование таутомерного и кислотно-основного равновесий 5-хлор-, 5-бром- и 5-иодоурацила в водных растворах и ДМСО // Тезисы докладов кластера конференций по органической химии «ОргХим-2013». - 2013. - Санкт-Петербург (Репино). - С.447-448.
6. Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П., Хамитов Э.М., Лобов А.Н., Спирихин Л.В. Исследование таутомерного и кислотно-основного равновесия 5-фторурацила в водных растворах и ДМСО // Тезисы докладов XV молодежной школы-конференции по органической химии. - 2012. - Уфа. -С. 21-22.
7. Буранбаева Р.С., Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П., Лобов А.Н., Муринов Ю.И. Взаимодействие 5-бромурацила с гидроксидом натрия // Тезисы докладов I республиканской конференции молодых ученых «Химия в интересах человека». - 2011. - Уфа. - С. 53-54.
8. Лукманов Т.И., Абдрахимова Г.С.. Хамитов Э.М., Иванов С.П. Теоретическое исследование относительной устойчивости кето-енольных таутомеров 5-хлорурацила // Тезисы докладов VIII всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина». - 2010. -Уфа. - С. 229-230.
9. Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П., Муринов Ю.И. Термодинамические характеристики кето-енольного равновесия 5-галогеноурацилов в водных растворах // Тезисы докладов III Международной конференции «Химия гетероциклических соединений». - 2010. - Москва. - С. У-1.
10. Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П., Спирихин Л.В., Муринов Ю.И. Изучение взаимодействия 5-фторурацила с гидроксидом натрия // Тезисы докладов международной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений». - 2009. - Кисловодск. - С. 234.
11. Abdrakhimova G. S.. Ivanov S.P., Spirichin L. V., Fayzrakhmanov I.S., Murinov Yu.I. Tautomeric equilibrium of 5-chlorouracil in water solutions // Abstract of XVII International Conference on Chemical Thermodynamics in Russia. - 2009. - Kazan. - P. 245.
12. Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П., Спирихин Л.В., Муринов Ю.И. Получение N1-замещенной натриевой соли 5-фторурацила // Тезисы докладов международной конференции по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века». - 2009. - Санкт-Петербург. - С.318.
13. Абдрахимова Г.С.. Иванов С.П., Спирихин Л.В., Муринов Ю.И. Исследование таутомерной перегруппировки 5-фторурацила методом ЯМР |3С спектроскопии // Тезисы докладов XI Молодежной школы-
конференции по органической химии. - 2008. - Екатеринбург. - С. 243244.
14. Муксимова (АбдрахимоваЧ Г.С.. Иванов С.П., Файзрахманов И.С., Муринов Ю.И. Изучение таутомерного равновесия 5-иодоурацила в водных растворах // Тезисы докладов XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». - 2008. — Москва. - С. 654.
15. Муксимова (Абдрахимова! Г.С.. Иванов С.П., Файзрахманов И.С., Муринов Ю.И. Изучение кето-енольной таутомерии 5-бром-З-метил-урацила в водных растворах // Тезисы докладов XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007». - 2007. - Москва. - С.372.
16. Muksimova (Abdrakhimoval G.S., Ivanov S.P., Fayzrakhmanov I.S., Murinov Yu.I. Study of the mechanism and thermodynamic characteristics of lactim-lactimic equilibrium of 5-bromouracil in aqueous solutions II Abstract of X International Conference on The problems of solvatation and complex formation in solutions. - 2007. - Suzdal. - P. 3/S-339.
Автор выражает глубокую благодарность д.х.н., профессору Муринову Ю.И., д.х.н., профессору Хурсану СЛ., к.х.н., с.н.с. Спирихину Л.В., к.х.н., н.с. Лобову А.Н., к.х.н., н.с. Овчинникову М.Ю., к.х.н. Хамитову Э.М. за научные консультации, помощь и поддержку, оказанные при выполнении работы.
Лицензия №0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 25.04.2014 г. Бумага офсетная. Отпечатано методом ризографии. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Уч.-изд.л.1,5. Тираж 130 экз. Заказ №107
Типография ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА» 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЯЙ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
абдрахимова гульназ салаватовна
таутомерия и кислотно-основное равновесие 5-галогеноурацилов в воде и диметилсуль<г|бксиде ;
На правах рукописи
04201459401
02.00.04 - Физическая химия
диссертация
на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель: кандидат химических наук С.П. Иванов
Уфа-2014
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................5
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР....................................................................................9
1.1 Биологические свойства 5-галогеноурацилов................................................................9
1.2 Кето-енольная таутомерия и кислотно-основное равновесие
5-галогеноурацилов....................................................................................................................................13
1.2.1 Теоретическое изучение относительной устойчивости таутомеров
5-галогеноурацилов в газовой фазе............................................................................................................................16
1.3 Исследование кето-енольного и кислотно-основного равновесия 5-галогеноурацилов в растворах......................................................................................................20
1.3.1 Теоретическое изучение таутомерного равновесия
5-галогеноурацилов в растворах..............................................................................................................21
1.3.2 Теоретическое исследование депротонирования производных урацила в водньрс растворах..................................................................................................................27
1.3.3 Экспериментальное исследование таутомерии и кислотно-основного равновесия 5-галогеноурацилов в растворах................................................30
1.3.3.1 Электронная и колебательная спектроскопия......................................................................30
1.3.3.2 ЯМР спектроскопия........................................................................................................................................38
1.4 Константы депротонирования 5-галогеноурацилов..................................................43
1.5 Исследование 5-галогеноурацилов в твёрдой фазе....................................................45
ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................51
2.1 Используемые реагенты............................................................................................................................51
2.2 Квантово-химические расчёты....................................................................................................52
2.3 Методы анализа..........................................................................................................................................56
2.3.1 ИК спектроскопия................................................................................................................................56
2.3.2 Электронная спектроскопия................................................................................................................56
2.3.3 ЯМР спектроскопия............................................................................................................................56
2.3.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография..................................................57
2.4 Методы проведения эксперимента.............................................. 57
2.4.1 Приготовление растворов 5-галогеноурацилов для электронной спектроскопии................................................................................ 57
2.4.2 Приготовление растворов 5-галогеноурацилов для ЯМР спектроскопии........................................................................... 58
2.4.3 Получение монозамещенных калиевых солей
5-галогеноурацилов..................................................................... 59
2.4.4 Синтез З-метил-5-фторурацила................................................ 61
2.4.5 Определение констант депротонирования 1-(тетрагидрофуранил-2)-
и З-метил-5-фторурацила в водных растворах................................... 62
2.4.6 Определение цитотоксической активности 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей................................................................ 62
глава iii. обсуждение результатов................................. 65
3.1 Теоретическое исследование относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе и в растворах............ 65
3.2 Кислотно-основное равновесие 5-галогеноурацилов в кислой водной среде....................................................................................... 72
3.3 Кислотно-основное равновесие 5-галогеноурацилов в щелочной среде....................................................................................... 75
3.3.1 Идентификация структуры монозамещённых калиевых и натриевых солей 5-галогеноурацилов в твёрдой фазе......................................... 76
3.3.2 УФ спектроскопия.................................................................... 78
3.3.3 ЯМР спектроскопия.............................................................. 93
3.4 Установление количественного соотношения анионных и молекулярных форм в щелочных растворах 5-галогеноурацилов......... 105
3.5 Определение констант депротонирования N(1)- и N(3)- замещённых производных 5-фторурацила.......................................................... 109
3.6 Цитотоксические свойства 5-галогеноурацилов и их монозамещённых солей............................................................... 111
выводы
литература
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. 5-Галогеноурацилы проявляют широкую фармакологическую активность и находят применение в качестве противоопухолевых, антибактериальных и противовирусных препаратов. 5-Хлор- и 5-бромурацил, могут образовываться эндогенно при воспалительных процессах и способны внедряться в ДНК и РНК, где образуют «ложные» пары оснований с аденином или, находясь в редкой таутомерной или ионной форме, с гуанином. Литературные данные свидетельствуют о том, что факторы, влияющие на механизм кислотно-основного и таутомерного равновесий, имеют решающее значение при возникновении ошибок в репликации ДНК или РНК. В связи с этим важно понимание закономерностей распределения молекулярных и анионных форм 5-галогеноурацилов в конденсированной фазе. Литературные данные о возможных таутомерных формах урацилов в растворах являются противоречивыми. Вопрос о направлении ионизации в молекуле урацилов является спорным из-за наличия нескольких донорных атомов, потенциально способных к протонированию или депротонированию. Поэтому, исследование таутомерного и кислотно-основного равновесия галогенпроизводных урацилов в растворах является актуальным.
Настоящая работа выполнена в рамках приоритетного направления «Живые системы», в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук по темам «Гомо- и гетерофункциональные соединения в комплексообразовании с металлами и фармаконами» (№ гос. регистрации 0120.0 801446), «Реакционная способность гомо- и гетерофункциональных соединений комплексообразовании металлами и фармаконами» (№ гос. регистрации 01201152187) при финансовой поддержке Программы №1 ОХНМ РАН «Теоретическое и экспериментальное изучение природы химической связи и механизмов важнейших химических реакций и
процессов» и Программы №6 ОХНМ РАН «Химия и физико-химия супрамолекулярных систем и атомных кластеров».
Цель работы. Изучение кислотно-основного равновесия и кето-енольной таутомерии 5-галогеноурацилов в водных растворах и диметилсульфоксиде (ДМСО).
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- Квантово-химическое изучение относительной устойчивости таутомеров 5-галогеноурацилов в газовой фазе, воде и ДМСО.
- Получение и идентификация солей 5-галогеноурацилов.
- Установление донорных атомов в молекулах 5-галогеноурацилов, участвующих в протонировании и депротонировании
- Определение количественного соотношения анионов в щелочных растворах 5-галогеноурацилов в воде и ДМСО.
Научная новизна и практическая ценность.
Впервые методом TPSSTPSS/6-311+G(d,p) рассчитана относительная устойчивость 5-фторурацила с учётом специфической и неспецифической сольватации в ДМСО. Определена относительная устойчивость 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацилов в водных растворах и ДМСО с учётом неспецифической сольватации. Проведена оценка влияния сольватации на относительную устойчивость таутомеров 5-галогеноурацилов.
Показано, что 5-галогеноурацилы в водных растворах в кислой среде в диапазоне рН = 1.8 - 5.6 находятся в дикетоформе, в щелочной среде в диапазоне рН = 5.6-10.2 - в виде смеси двух анионов с депротонированием по N(1) и N(3) положениям пиримидинового кольца, а в щелочных растворах в ДМСО — в виде аниона с депротонированием по N(1) положению пиримидинового кольца. На основании данных УФ и ЯМР спектроскопии, и квантово-химических расчётов предложена схема депротонирования 5-галогеноурацилов в водных растворах и ДМСО. Определено соотношение депротонированных форм 5-фтор-, 5-хлор- и 5-бромурацилов при N(1) и N(3)
положениях в щелочной среде в воде и ДМСО.
6
Впервые определены константы диссоциации 1-(тетрагидрофуранил-2)- и З-метил-5-фторурацилов в водном растворе.
На клеточных культурах НЕК293 проведены сравнительные исследования цитотоксических свойств 5-фтор-, 5-хлор-, 5-бром и 5-йодурацилов и их солей. Предложен возможный механизм, определяющий цитотоксические свойства калиевой соли 5-фторурацила.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на X Международной конференции по проблемам сольватации и комплексообразования в растворах (Суздаль, 2007), на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), на IX Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2008), на XI Молодежной школе-конференции по органической химии (Екатеринбург, 2008), на Международной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Кисловодск, 2009), на XVII Международной конференции по химической термодинамике (Казань, 2009), на VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010), на III Международной конференции «Химия гетероциклических соединений» (Москва, 2010), на I Республиканской конференции молодых ученых «Химия в интересах человека» (Уфа, 2011), на XV Молодежной школе-конференции по органической химии (Уфа, 2012), на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, 2013), на кластере конференций по органической химии «ОргХим-2013» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По результатам исследований опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и тезисы 13 докладов.
Структура и объём диссертации. Работа изложена на 132 страницах,
содержит 33 рисунка, 28 таблиц, библиографию из 147 наименований.
7
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.
Автор выражает глубокую благодарность д.х.н., профессору Муринову Ю.И., д.х.н., профессору Хурсану С.Л., д.б.н. Вахитовой Ю.В., К.Х.Н., см. с. Спирихину Л.В., ы* 9 ы, с. Лобову А.Н., К.ХМ., н, с. Овчинникову М.Ю., к.х.н. Хамитову Э.М., к.б.н. Салимгареевой М.Х. за научные консультации, помощь и поддержку, оказанные при выполнении работы.
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Биологические свойства 5-галогеноурацилов
5-галогеноурацилы являются аналогами оснований нуклеиновых кислот урацила и тимина. В ряде работ [1,2] было показано, что 5-хлор- и 5-бромурацил могут образоваться in vitro и in vivo в результате деятельности ферментов миелопероксидазы [3] и эозинофилпероксидазы [4] в воспаленных тканях. Анализ образцов тканей, взятых у пациентов, страдающих различными инфекционными заболеваниями, с использованием обращённо-фазовой ВЭЖХ, газовой хроматомасс-спектрометрии и ЯМР спектроскопии показал, что в образцах содержалось 0.7 - 36 мкмоль 5-хлорурацила/моль урацила и 3.9 - 59 мкмоль 5-бромурацила/моль урацила [1].
Внедрение 5-галогеноурацилов в ДНК было показано в исследованиях [5-9] в различных системах (растениях, бактериях, бактериофагах, клетках млекопитающих). 5-Галогеноурацилы, являясь аналогами тимина, образуют пару с аденином (Hal - галоген):
Электроноакцепторный заместитель (фтор, хлор, бром, йод) в 5-м положении урацильного кольца увеличивает вероятность образования редкой таутомерной или анионной формы. В результате 5-галогеноурацилы, как и тимин, могут образовывать пару не только с аденином (А), но и с гуанином (Г). Олигонуклеотиды, содержащие пары 5-галогеноурацил-А и 5-галогеноурацил-Г оказались нестабильны [10-16]. Повышение рН в растворах олигонуклеотидных цепочек, содержащих 5-хлор- и 5-бромурацил, приводило к повышенному образованию пар 5-хлорурацил-Г и 5-бромурацил-Г [14, 17].
Нарушение принципа комплементарности при образовании «ложных» пар 5-галогеноурацилов с гуанином приводят к возникновению точечных
9
мутаций, появляющихся в результате ошибки включения во время редупликации и ошибки редупликации [18, 19].
Существуют различные модели, объясняющие образование «ложных» пар оснований с участием 5-галогеноурацилов. Согласно модели, впервые предложенной Уотсоном и Криком [20] и разработанной далее в работе [21], наличие галогена в пятом положении увеличивает содержание редкой енольной формы, которая может образовывать «неправильную» пару с Г без искажения геометрии Уотсона-Крика (рис. 1.1).
На1
I Я
Н
Рисунок 1.1- Таутомерная модель образования ошибочных пар
оснований
Теоретические [22-26] исследования процесса таутомеризации согласуются с данным механизмом мутагенности 5-галогеноурацилов.
Другая модель была предложена в работе [27]. Используя спектроскопические методы, авторами было определено, что при нейтральном рН 7.4% 5-бромуридина будет находиться в анионной форме, в то время как тимидин будет ионизирован лишь на 0.16%. Авторы предположили модель образования «ложных» пар оснований, согласно которой анионная форма 5-галогеноурацила образует две водородные связи с Г без нарушения геометрии Уотсона-Крика (рис. 1.2). Результаты исследований пар 5-бромурацила и 5-фторурацила с А и с Г методами 'Н и ЯМР спектроскопии [28-30] подтвердили, что галогеноурацил в данных парах находится в ионной (анионной) форме. Однако данный механизм вызывает сомнения, так как при тех расстояниях между основаниями,
которые обычно имеют место в структуре ДНК, эти пары существуют в виде непланарной структуры, что препятствует внедрению оснований в ДНК [31].
На1
Третья модель образования «ошибочных» пар [31] оснований предполагает, что пара 5-галогеноурацил-Г находится в равновесной конформации (рис. 1.3) и является более стабильной, чем пара Т-Г, т.к. происходит усиление стэкингового взаимодействия оснований вследствие присутствия галогена в пятом положении пиримидинового кольца. Данная модель удовлетворительно согласуется с данными РСА [32] дуплексов, содержащих галогеноурацилы. Однако образование водородных связей не должно зависеть от присутствия или отсутствия галогена. Поэтому этот механизм является спорным.
I я
н
Рисунок 1.2 - Ионизационная модель образования ошибочных пар
оснований
На1
О. О
I К
Н
Рисунок 1.3 - Равновесная модель образования ошибочных пар
оснований
Внедрение 5-фторурацила и 5-йодурацила в ДНК приводит к ингибированию синтеза ДНК и к появлению одноцепочечных и двуцепочечных разрывов. [7, 33], которые являются одними из наиболее частых и летальных повреждений ДНК. Внедрение 5-хлорурацила индуцирует процессы старения и увеличивает частоту обмена сестринских хроматид [34]. Присутствие 5-бромурацила приводит к появлению так называемых «ломких» сайтов и хромосомных аберраций [6] с летальными последствиями для клетки.
5-Фторурацил, в отличие от других 5-галогеноурацилов, активно внедряется во все типы РНК, что может приводить к таким последствиям, как ингибирование превращения высокомолекулярных РНК в низкомолекулярные ядерные РНК, изменение вторичной структуры РНК [7] и ингибирование ферментов [5, 7].
Вышеперечисленные свойства 5-галогеноурацилов находят широкое применение в медицине. 5-Фторурацил и его производные используются при лечении рака толстой и прямой кишки, молочной железы, пищевода, желудка, поджелудочной железы, яичников, шейки матки, мочевого пузыря, предстательной железы, надпочечников, кожи, злокачественных опухолей головы и шеи, первичного рака печени, карциноид [35].
5-Йодурацил и его производные обладают противоопухолевой активностью. Недавние клинические исследования 5-йоддезоксиуридина дали положительные результаты на некоторых опухолях в I и II фазах испытаний [33, 36]. Противоопухолевой активностью обладают и многие N(1)- и К(3)-замещенные производные 5-йодурацила [37] и его комплексы с Al(III), Cr(III), Fe(III) [38], Mn(II), Co(II), Cu(II), Zn(II) и Cd(II) [39].
Кроме того, 5-йодурацил широко используется для получения противовирусных и противомикробных лекарственных препаратов. Его производное, 5-йод-2'-дезоксиуридин оказался особенно активен против вирусов псевдобешенства, осповакцины и простого герпеса (Herpes Simplex) [40]. Недавно были синтезированы производные 5-йоддезоксиуридина,
12
обладающие высокой активностью против цитомегаловируса [41]. Высокую селективность по отношению к вирусу простого герпеса показали нуклеозидные аналоги 5-йодурацила [42, 43], а 1-(2'-дезокси-2'-фтор-р-0-арабинофуранозил)-5-йодурацил используется при лечении заболеваний, вызванных вирусом гепатита В [44].
Таким образом, 5-галогеноурацилы обладают широким спектром биологических свойств, основанных на их спос
