Теоретическое и экспериментальное исследование оптического захвата биологических микрообъектов в лазерных пучках, сформированных дифракционными оптическими элементами тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

На правах рукописи

Рыков Михаил Александрович

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКОГО ЗАХВАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРООБЪЕКТОВ^В ЛАЗЕРНЫХ ПУЧКАХ, СФОРМИРОВАННЫХ ДИФРАКЦИОННЫМИ ОПТИЧЕСКИМИ ЭЛЕМЕНТАМИ

01.04.05 - Оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

3 О ОКТ 2014

005553848 Самара-2014

005553848

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С. П. Королёва (национальный исследовательский университет)» на кафедре технической кибернетики и Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте систем обработки изображений Российской академии наук.

Научный руководитель: Скиданов Роман Васильевич, доктор

физико-математических наук, доцент.

Официальные оппоненты:

Ежов Евгений Григорьевич, доктор физико-математических наук, доцент, профессор кафедры «Информационно-вычислительные системы» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пензенского государственного университета архитектуры и строительства»;

Майорова Александра Михайловна, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории моделирования и автоматизации лазерных систем Самарского филиала федерального государственного бюджетного учреждения науки Физического института имени П. Н. Лебедева Российской Академии Наук.

Ведущая организация:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный университет», г. Самара.

Защита состоится 28 ноября 2014 г. в 10:00 заседании диссертационного совета Д 212.215.01, созданного на базе федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С. П. Королёва (национальный исследовательский университет)»1 (СГАУ) по адресу: 443086, г. Самара, Московское шоссе, д.34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://ssau.ru/resources/dis_protection/Rykov/CrAy.

Автореферат разослан «. {(К О&Г&ЬрА-_2014 г.

Ученый секретарь д//?

^СГпр~соОрС0ВеТа' в. Г. Шахов

1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С. П. Королёва (национальный исследовательский университет)» переименовано в федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С. П. Королёва (национальный исследовательский университет)»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Оптические лову шки (также оптический пинцет) — бесконтактный инструмент, позволяющий использовать воздействие одного или нескольких лазерных пучков на частицу для генерации пиконьютонных сил. Оптический пинцет с момента его изобретения Ашкиным в 1986 году [Ashkin, Dziedzic, Bjorkholm, Chu, 1986] стал весьма полезным инструментом для манипулирования отдельными биологическими клетками (начиная с [Ashkin, Dziedzic, 1987]) и проведения сложных биофизических исследований. Особыми преимуществами оптических ловушек является отсутствие механического контакта при манипулировании.

Оптические повреждения биологических микрообъектов — фактор, ограничивающий использование оптического пинцета в биологии. В литературе предлагается несколько основных стратегий, позволяющих минимизировать это повреждение. Одна из них — выбор правильной длины волны рабочего излучения [König, H. Liang, Berns, Tromberg, 1996, Peterman, Gittes, Schmidt, 2003, Ng, Zhou, Ngan, 2013]. Следующая — сокращение времени экспозиции и мощности используемого лазера [Ayano, Wakamoto, Yamashita, Yasuda, 2006]. Важно максимально оптимизировать перемещения в ловушке захватываемой частицы и использование ловушки модифицированной формы, что создаст условия для эффективного отвода энергии от захваченной клетки (ловушки, облучающие только периферию) или исключающие поглощение в принципе (непрямой захват с использованием дополнительных силиконовых шариков [Wang, Chowdhury, Gupta, Losert, 2013]).

В литературе так же широко представлены методы модификации оптического пучка для решения прикладных задач. В качестве примера можно привести работы [Hesseling, Woerdemann, Hermerschmidt, Denz, 2011, Rodrigo, Alieva, Abramochkin, Castro, 2013, Yevnin, Kasimov, Gluckman, Ebenstein, Roichman, 2013]. Особые свойства захватывающего пучка тоже имеют различные назначения.

В работах [Морозов, Скиданов, 2013] описан метод формирования суперпозиции вихревых световых пучков для вращения микрообъектов, за счет использования составных ДОЭ, в которых формирование вихревых пучков с разным топологическим зарядом осуществляется за счет пространственного разделения его участков, отвечающих за их формирование, на площади ДОЭ. Полученные в этих работах распределения используются в дальнейшем для вращения микротурбин. Для задач цитологии, однако, более важным является возможность контролируемого перемещения. В работе предлагаются распределения, оптимизированные для перемещения объекта вдоль одной оси. В этом случае кольцевое распределение обеспечивает меньшую оптическую силу, действующую на объект. С другой стороны, суперпозиция вихревых пучков позволяет формировать асимметричные пучки, близкие по форме к полумесяцам, и предназначенные для удержания захваченного объекта и перемещения его вдоль одной из осей.

В работах [Порфирьев, Скиданов, 2012, Porfirev, Skidanov, 2013] описывается метод создания оптических бутылок при помощи суперпозиции бесселевых пучков нулевого порядка, а также показана возможность захвата и перемещения объектов такими пучками. Однако областью применения таких пучков являются непрозрачные объекты и объекты с довольно большим относительным показателем преломления (> 1,1). Живые клетки имеют показатель преломления и « 1,03 - 1,04 [X. Liang, Liu, Lim, Ay i. Yap, 2007], поэтому для обеспечения таких условий захвата требуется обеспечить угол падения на мембрану клетки > 89°, что технически непросто. Вместо этого предлагается контролировать прохождение света таким образом, чтобы центральные области клетки не попадали под длительное излучение лазера.

Для модификации оптической ловушки для биологических микрообъектов необходим метод оптических силы, действующих в ловушке на биологический микрообъект. Также нужно учесть наличие внутренней структуры в таких объектах. Исходя из анализа

научной литературы по теме диссертации, следует предположить, что оптимальным приближением для теоретических построений является приближение геометрической оптики. В [Новотный, Хехт, 2011] приводятся данные, позволяющие считать геометрическое приближение удовлетворительным, начиная с характерного размера 1 мкм. Изучение источников также показывает актуальность проблемы оптических повреждений и подсказывает метод решения этой проблемы — модификацию распределения интенсивности лазерного пучка. При этом следует отметить, что в работах по уменьшению повреждающего действия оптического пинцета не рассмотрена возможность такого уменьшения при помощи распределения излучения по большей области захватываемого объекта и формирования пучков, не облучающих центральные области клетки при перемещении и удержании, а в работах по моделированию оптического захвата не производится учёт внутренней структуры объекта [Nieminen, Loke, Stilgoe, Knöner, Brañczyk, Heckenberg, Rubinsztein-Dunlop, 2007, Simpson, Hanna, 2011] и вдобавок эти методы требуют большого объёма вычислений. В существующих же работах, моделирующих методами геометрической оптики оптические силы, действующие на шарообразные объекты, не производится оценка повреждающего действия пучков [Swartzlander, Peterson, Artusio-Glimpse, Raisanen, 2011, S. В. Kim, Lee, S. S. Kim, Sung, 2012].

Описанные выше проблемы делают актуальной тему диссертационного исследования, ее цель и основные задачи.

Цель диссертационной работы: разработать новый тип световых ловушек с большей удерживающей силой и меньшей вероятностью повреждения для захвата биологических микрообъектов и экспериментально продемонстрировать возможность захвата биологических микрообъектов такой ловушкой и ее преимущество по сравнению с обычным гауссовым пучком.

В соответствии с поставленной целью определены основные задачи диссертации:

1. Разработать метод расчета сил, действующих на биологический микрообъект с учетом его внутренней структуры и величины поглощенной энергии.

2. Используя разработанный метод расчета силы, определить форму светового пучка для захвата биологических микрообъектов, минимизирующую тепловой нагрев микрообъекта, и рассчитать дифракционный оптический элемент, формирующий световой пучок нужной формы распределения интенсивности для создания максимальной силы захвата при минимальном уровне нагрева клетки.

3. Экспериментально подтвердить преимущество разработанной световой ловушки перед классической световой ловушкой в форме гауссового пучка.

Научная новизна.

1. Вид световых пучков для перемещения биологических микрообъектов с распределением интенсивности в виде полумесяца, которое формируется дифракционным оптическим элементом, в таких пучках за счет их формы свет не попадает в наиболее важные области микрообъекта, что уменьшает риск повреждения по сравнению с пучком Гаусса.

2. Способ формирования световых ловушек для оптимального перемещения биоло-

гических микрообъектов с распределением интенсивности в виде полумесяца за

счет дифракционных оптических элементов, формирующих суперпозицию двух вихревых световых пучков с разностью топологических зарядов 1 или 2.

3. Проведены эксперименты по захвату и перемещению биологических микрообъектов (клеток дрожжей и клеток К562), которые подтверждают преимущество ловушек нового типа перед ловушкой в виде гауссового пучка, заключаеющееся в том, что при равных интенсивностях ловушка в форме полумесяца развивает силу захвата в 2-3 раза большую.

Положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

1. Световые пучки в форме полумесяца, проходящего через граничные области перемещаемого биологического микрообъекта, и размером совпадающим с размером клетки, не нагревают жизненно важные структурные элементы, например органел-лы, расположенные в центральной области клетки, и вследствии этого являются более безопасными для перемещения биологических микрообъектов, чем пучок Гаусса.

2. Пучок в форме полумесяца, сформированный дифракционным оптическим элементом с эффективностью 0,29 и согласованный по размеру с перемещаемым биологическим микрообъектом, в эксперименте позволяет развививать силу захвата 2-3 раза большую по сравнению с гауссовым пучком с равной мощностью и равной средней интенсивностью.

3. Световой пучок с распределением интенсивности в форме полумесяца можно также сформировать с помощью дифракционных оптических элементов, формирующих суперпозицию двух вихревых световых пучков с разностью топологических зарядов I или 2. Такой пучок также позволяет развивать силу захвата примерно 2 раза большую по сравнению с пучком Гаусса, что подтверждается результатами эксперимента по захвату клеток К562.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается соответствием экспериментальных данных и результатов расчета.

Апробация результатов

Основные результаты диссертации докладывались на следующих конференциях:

1. Международная конференция с элементами научной школы для молодежи "Перспективные информационные технологии для авиации и космоса" (ПИТ-2010),

г. Самара, 29 сентября - 1 октября 2010 г.;

2. Молодёжная научная школа по нанофотонике, Nanostructures: Physics and Technology, г. Самара, 30 июня 2012 г.;

3. Международная конференция "Фундаментальные проблемы оптики — 2012", г. Санкт-Петербург, 15-19 октября 2012 г.;

4. X Всероссийский молодежный Самарский конкурс-конференция научных работ по оптике и лазерной физике, посвященный 90-летию со дня рождения Н.Г. Басова, г. Самара, 7-11 ноября 2012 г.;

5. XIV Школа молодых ученых "Актуальные проблемы физики", г. Звенигород, 11-15 ноября 2012 г.;

6. Optical Trapping and Optical Manipulation X, SPIE, г. Сан-Диего, Калифорния, США, 25-29 августа 2013г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 4 статьи в рецензируемых журналах, 6 статей в сборниках трудов Международных и Всероссийских конференций.

Личный вклад автора. Все результаты, изложенные в диссертации, получены автором лично, либо при его определяющем личном участии.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, заключения, библиографии и приложения. Общий объем диссертации 103 страницы, из них 74 страница текста, включая 30 рисунков и 3 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы ее цель и задачи, дан краткий обзор работ по теме исследования, показана научная новизна, практическая значимость полученных результатов, приводятся положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлена математическая модель, использующаяся в работе для моделирования процессов оптического захвата. Для моделирования использовался программный комплекс позволяющий, в отличие от аналогов, расчёт оптических сил с учётом сложной внутренней структуры объекта и оценку повреждающего действия лазерного пучка. Моделирование основано на законах геометрической оптики, обеспечивает эффективность вычислений, позволяет быстро оценить механические свойства оптической ловушки.

Лазерный пучок, падающий на объект, разделяется на (1 - 3) • 105 лучей. Расчёт хода лучей через модель клетки является алгоритмом прямой трассировки. Данный подход хорошо разработан, однако на текущий момент не существует программных комплексов, которые можно было бы использовать для вычисления оптических сил этим методом с учётом внутренней структуры объекта. Метод также позволяет рассчитывать движение клетки внутри ловушки.

В работе показано, что световые повреждения от одного луча в элементарном объёме клетки AxAyAz прямо пропорционально мощности световой энергии, протекающей через площадку АхАу и коэффициенту поглощения среды (постоянной характеристике среды, специфичной для каждого типа органелл). Рассмотрим сечения микрообъекта плоскостями перпендикулярными оси с, расположенными на расстоянии Az = Ах -Ау. На каждой такой плоскости, исходя из направления распространения лучей и их мощности, можно рассчитать распределение интенсивности. Тогда тепловая мощность, выделяемая в элементарном объеме ДхДуДг, будет определяться по формуле

Q = кГ(х,у)АхАу. (1)

Эта модель используется в данной работе для численных оценок теплового повреждения биологических микрообъектов в световых пучках. Будем считать в дальнейшем, что попадание прямых проходящих лучей на органеллы недопустимо. Моделирование прохождения через биологический микрообъект пучка Гаусса (наиболее часто используемой ловушки) показало, что как при его захвате, так и при перемещении органеллы оказываются в области почти максимальной интенсивности. Следовательно, с точки зрения минимизации тепловых повреждений пучок Гаусса совершенно неподходящий объект. Расположение в большинстве случаев органелл вблизи геометрического центра биологического микрообъекта наводит на мысль, что пучок должен проходить только через граничные области. То есть, его форма должна напоминать полумесяц.

I Во второй главе предлагается ранее не использовавшееся распределение интен-

сивности пучка в виде полумесяца. Предлагаемый тип лазерного пучка обеспечивает улучшенные силовые характеристики по сравнению с гауссовым, что показано в теоретических расчётах и подтверждено экспериментами. Кроме того, при захвате и манипуляциях в области наибольшей интенсивности оказывается периферия объекта, что предположительно позволит минимизировать повреждения от поглощения лазерного излучения.

Способ формирования интенсивности пучка, состоит в том, чтобы деформировать пучок специальным образом.

Пусть исходный гауссов пучок имеет радиус а. Модифицируем пучок таким образом, как показано на рисунке 1. Такое распределение амплитуды может быть описано формулами:

Рисунок 1 - Модификация гауссова пучка.

А(х,у) с(х)

/-Х2) I (>'-си))2\ = Уг2-*2 - г +

- НЧ*\

(2)

Параметры Г] и Гг определяют особенности формы пучка. На рисунке 2 можно видеть, как изменение ?] и ?2 влияет на распределение.

Основываясь на распределении интенсивности, описываемом уравнениями (2), можно смоделировать силы, которые будут действовать на объект, освещенный таким пучком. Для нахождения /] и ?2 использовался алгоритм наибыстрейшего градиентного поиска. Алгоритм был видоизменён, чтобы гарантировать сходимость. Численные эксперименты показывают, что максимальная сила достигается при воздействии на определённую точку распределением в виде дельта-функции (точка определяется формой и показателем преломления объекта). Учёт дифракционных ограничений приводит к значениям параметров Г] = 0,94, Гт = 0,04. Распределение интенсивности светового пучка с такими параметрами изображено на рисунке 3.

Получены расчётные значения сил, действующих на сферический объект радиусом 5 мкм при освещении его гауссовым пучком радиуса Я = 5 мкм, пучком-полумесяцем с параметрами /] = 0,94, = 0,04, а = 5 мкм и пучком-дельта-функцией, направленным в точку, отстоящую на 0,69Л от центра объекта. Численные эксперименты показывают, что оптимизированное распределение в виде полумесяца обеспечивает 0,88 теоретически достижимого максимума силы, а гауссово — только 0,31.

Для захвата эллипсоидальных частиц пучок-полумесяц был несколько видоизменён: путём подстановки х —> хт,^ = кх внешняя дуга из круговой превращалась в эллиптическую, где к — отношение большой и малой полуосей эллипса. Для ЗассИаготусея сегеУ151ае£ ~ 1.5.

Промоделируем, как будут отличаться повреждения от поглощения клеткой лазерного излучения в случае обычного гауссова пучка и рассматриваемой в данной работе модификации.

В качестве модели была выбрана композиция из эллипсоида /?: х /?2 х /?з = 3 х 2x3 мкм и сферы г3 = 1 х 1 х 1 мкм с общим центром (рисунок 4). Показатель преломления клетки относительно внешней среды — 1,03, показатель преломления ядра

^=0,65; 12=0,05

^=0,95; Ь=0,05

Ъ=0,95; ^=0,05 ^=0,95; ^=0,35

Рисунок 2 - Распределение интенсивности с различными значениями параметров 1\

относительно внутриклеточной среды — 1,0035, суммарная мощность лазерного пучка в обоих случаях — для пучка Гаусса и для пучка-полумесяца — 166 мВт.

^=0,80; ^=0,05

^=0,95; ^=0,20

Рисунок 3 - Оптимизированноераспреде- Р ок 4 _ Схематическое изображение ление интенсивности с параметрами модеш кмтки с я9ром

Результаты моделирования приведены на рисунках 5 и 6. Сплошной линией изображена величина (2 для ядра клетки, а пунктирной — сила оптического захвата. Для наглядности обе величины нормированы на собственный максимум.

Для формирования описанного выше распределения интенсивности был рассчитан по алгоритму, описанному в работе, и изготовлен методом фотолитографии бинарный ДОЭ. Разрешение элемента 1 мкм, глубина травления 480 ± 50 нм. На рисунке 7 изображена фазовая функция изготовленного ДОЭ, а на рисунке 8 — его микрорельеф.

Рисунок 5 - Нормированный график изменения силы действующей на клетку, и фотоповреждений 2 в её ядре при освещении её пучком-полумесяцем в зависимости от расстояния между осью клетки и максимумом пучка.

Рисунок 6 - Нормированный график изменения силы /% действующей на клетку, и фотоповреждений <2 в её ядре при освещении её гауссовым пучком в зависимости от расстояния между осью клетки и максимумом пучка.

Рисунок 7 - Фазовая функция ДОЭ, поз- ДОЭ. Изображение получено на интер-воляющая сформировать распределение ферометре белого света New View 5000. интенсивности в виде полумесяца.

Была измерена дифракционная эффективность изготовленного ДОЭ. Она составила 0,31 от эффективности оптической системы без ДОЭ.

Были проведены эксперименты по захвату и перемещению клеток дрожжей Бас-сНаготусех се^1з1ае. Схема экспериментальной установки изображена на рисунке 9. Для захвата и манипулирования клеткой использовался лазер с длиной волны Л = 532пт и переменной мощностью от 200 до 2000 мВт.

Луч лазера при помощи зеркала направлялся сквозь ДОЭ-пластинку и фокусировался в капле взвеси Басс/гаготусез сеге\тае иммерсионным микрообъективом 40-кратного увеличения. Дальше свет от диодной лампы и лазерное излучение фокусировались при помощи 16-кратного объектива и ещё одного зеркала на матрицу ССБ-камеры. Изображение с камеры проецировалось на монитор ПК, позволяя наблюдать процесс и управлять им при помощи микровинтов предметного столика микроскопа.

Сила захвата оценивалась методом отрыва, полагая, что движение клетки подчиняется закону Стокса. При перемещении основная доля облучения приходилась на периферию клетки.

Рисунки 11 иллюстрируют произведённые эксперименты. Имея зависимость координаты от времени, легко найти скорость передвижения клетки во время эксперимента,

Лазер

ССР камера

* я.»

Рисунок 10 - Значения максимальной Ртах и средней Рагя силы. Рисунок 9 - Схема экспериментальной уста- полученные в эксперименте для новки. М1, М2 —зеркала, Ь — лампа подсвет- гауссова пучка и для пучка-ки, 01 — 40х-иммерсионный объектив, 02 — полумесяца (Рс). 1бх микрообъектив, М5 — предметное стекло, 5 — капля взвеси БассИаготусез сет1Б1ае в воде, — светофильтр, отсеивающий зелёную часть спектра.

и вычислить на основании этих данных силу захвата.

Аналогичные эксперименты были произведены с гауссовым пучком шириной н> и 2 мкм. Несколько кадров, снятых камерой в ходе эксперимента по манипулированию гауссовым пучком представлены на рисунке 12.

На графике 10 представлены все результаты одновременно в осях "средняя сила"! - "максимальная сила", что создаёт облако возможностей для обоих пучков. С учётом энергетической эффективности пучков, суммарная мощность излучения, выходящего из объектива и попадающего во взвесь клеток дрожжей для гауссова пучка составила 618 мВт, а для пучков-полумесяцев — 402 мВт.

Экспериментальные данные находятся в соответствии с численными экспериментами. Если взять в качестве метрики соотношение

а = Т

(3)

где р — максимальная сила захвата, а / — мощность лазера в фокусе пучка, численный эксперимент показывает, что

0~сге*с о, 88(Гд

0,31сгд

= 2,8,

(4)

где сгд — отношение захватывающих сил пучка, с распределением бесконечно близким к дельта-функции, к мощности этого пучка. С другой стороны, экспериментальные результаты дают следующее значение

ста

Кап.1;*

4,21 • 10-"|:

10

2,6.

(5)

Рисунок 11 - а,б, в - захват двух клеток дрожжей пучком-полумесяцем. Чёрная точка отмечает положение неподвижной относительно предметного столика клетки. Промежуток времени между снимками — 0,55 с.

Рисунок 12 — а,б,в — захват одной клетки дрожжей гауссовым пучком. Чёрная точка отмечает положение неподвижной относительно предметного столика клетки. Промежуток времени между снимками — 0.55 с.

20 мкм

г

В третьей главе представлен новый тип оптических ловушек для захвата и удержания биологических микрообъектов на основе суперпозиции вихревых световых пучков с топологическими зарядами с разностью 1 и 2. Суперпозиция пучков с разностью зарядов 1 напоминает по виду пучок, рассмотренный во второй главе и может быть использован в тех же целях. Суперпозиция с разностью зарядов 2 образует в дальней зоне два полумесяца, повёрнутых друг к друг}' вогнутой стороной. Она может быть использована для перемещения микрообъектов вдоль одной из осей, а также для удержания микрообъектов.

Численное моделирование показывает, что при композиции двух сонаправленных вихрей с разницей в порядках 1, получается амплитудно-фазовое распределение, представленное на рис.13: линейное изменение фазы в зависимости от угла вращения ф и' распределение интенсивности в виде кольца с чётко выраженным минимумом в <р= Ц.

(а) (6) (в)

Рисунок 13 - Суперпозиция вихревых пучков с топологическими зарядами 2 и 3. (а) фаза DOE, которая дает в дальнем поле распределение интенсивности (6) и распределение фазы (в).

При дальнейшем увеличении абсолютного значения топологических зарядов первого и второго пучка т\, пь полумесяц становится все более вытянутым и похожим на, распределение, формируемое фокусатором во второй главе.

Еще один случай суперпозиции может быть полезен при захвате биологических! микрообъектов. Его можно наблюдать при соблюдении условия \тг - т\| = 2. Как видно! из рис. 14 в результате дифракции на таком ДОЭ образуется распределение интенсивности в виде двух полумесяцев с нулевой интенсивностью в центре. Такое распределение удобно для задачи удерживания на месте биологического микрообъекта по одной координате.

1а) (б) (в)

Рисунок 14 - Суперпозиция вихревых пучков с топологическими зарядами 2 и 4. (а) фаза DOE, которая дает в дальнем поле распределение интенсивности (б) и распределение фазы (в).

Порядок вихря регулирует размер двойного полумесяца. Полезно иметь возможность масштабировать размер ловушки без изменения изображающего микрообъектива.

На рис. 14 показано распределение интенсивности и фазы пучка, являющегося композицией вихревых пучков с топологическими зарядами /щ = 2 и пъ = 4, а также многоуровневый ДОЭ, который сформирует такое распределение. Эти изображения были получены при помощи свёртки функции плоского пучка с изображением ДОЭ.

Рисунок 15 - Нормированный график Fx и Рисунок 16 - Fx и Fy внутри суперпозиции Q, действующих на клетку внутри супер- вихревых пучков с топологическими заря-позиции вихревых пучков с топологически- дами 1 и 3 как функция смещения от цен-ми зарядами 1 и 3, как функции смещения тРа луча вдоль х или у оси соответствен-от центра луча вдоль оси х. но.

Теоретические расчёты показывают, что образуемый суперпозицией вихревых пучков с разностью топологических зарядов \тг - т\\ = 2 двойной полумесяц имеет такую область равновесия, что клетки будут удерживаться обеими половинами луча. Для проверки этого предположения была проведена серия численного моделирования, выполнен расчет оптической силы для каждого положения модели клетки, и промоделировано движение клетки, в предположении, что сила не меняется в течение шага интервала моделирования(т = 0,001 с). Размер клетки — 2 х 2,5 х 1,5 мкм, показатель преломления клетки относительно внешней среды — 1,03, размер ядра 1 х 1,2 х 0,5 мкм, показатель преломления ядра относительно внутриклеточной среды — 1,0035, суммарная мощность лазерного пучка — 166 мВт.

Проведённая теоретическая оценка повреждающей способности таких пучков предполагает, что при использовании таких пучков для задач удержания и перемещения на небольших скоростях (при малом смещении из центра пучка) повреждения для расположенных в центре клетки органелл будут ниже, чем если бы использовался пучок Гаусса. Результаты численного эксперимента представлены на рисунках 15 и 16.

Проведён эксперимент по перемещению в таких пучках биологических микрообъектов для суперпозиции пучков с топологическими зарядами 7 и 9.

Для экспериментов фаза предложенных ДОЭ была была приведена к бинарному виду, и был изготовлен методом фотолитографии ДОЭ с mi = 7 и /иг = 9, аналогичный по качеству изготовления ДОЭ, описанному во второй главе. На рисунке 17а изображен рельеф, который был нанесён на подложку, а на рисунке 176 — распределение интенсивности в дальней зоне дифракции в сформированном пучке.

Оптическая схема экспериментальной установки была собрана на основе инвертированного микроскопа Zeiss Axio Observer Z1, её принципиальная схема приведена на рис.18. В качестве источника лазерного излучения использовался лазер с длиной волны 532 им и переменной мощностью (200 — 2000 мВт). Предметная плоскость подсвечивалась белым светом от лампы накаливания. Фиксация изображения в предметной плоскости осуществлялась с помощью CCD-камеры AxioCam ERc (~ 10 кадров/с, 2560 х 1920

(а) (б)

Рисунок 17 - Фаза ДОЭ, использованного

в эксперименте (а), распределение интен-Рисунок 18 - Принципиальная оптиче-сивности в дальней зоне дифракции для екая схема экспериментальной установ-такого ДОЭ (б) (численное моделирова- ки. Ь — лампа подсветки, 5 — предмет-ние). ный столик с кюветой с клетками К562,

О — 20х объектив, НМ — полупрозрачное зеркало, М1, М2, МЗ — зеркала, С — коллиматор.

пикселей). Фильтр перед ССБ камерой отсеивал большую часть лазерного излучения, чтобы не засвечивать изображение захваченных частиц.

Для экспериментального изучения характера образуемой ловушки были проведены опыты по перемещению клеток К562 при помощи суперпозиции вихревых пучков с топологическими зарядами пц = 7 и т2 = 9. Средняя скорость передвижения клетки составила 5 мкм/с, максимальная — порядка 10 мкм/с. На приведённых кадрах экс-| периментальной съёмки (рис. 19) правая часть первого порядка, даваемого бинарным элементом, захватывает одиночную клетку К562 и тянет её вниз по изображению — к наблюдателю в реальности.

камера

(а) (б)

Рисунок 19 - а), б), в) - кадры эксперимента по передвижению клетки К562 при помощи суперпозиции вихревых пучков с топологическими зарядами т\ = 7 и пъ = 9. Кадры разделены промежутком времени в 4 с.

По результатам измерения скорости движения перемещаемой клетки была вычислена сила. Для этого использовалась формула Стокса, как и в прошлой главе. Оптические силы составили порядка 20 пН при мощности лазера на входе в микрообъектив

коло 200 мВт. Если принять за метрику отношение (3), то для данной серии экспери-ентов, с учётом эффективности ДОЭ 30%, имеем <т = 3,3- Ю-" Для сравнения,

я Гауссова пучка это соотношение составляет <rg = 1,6 • 10"11

В заключении перечислены основные результаты, полученные при выполнении анной диссертационной работы:

1. При помощи геометрооптического метода расчета, который позволяет учитывать внутреннюю структуру и поглощение света, приводящее к нагреву биологического микрообъекта, была предложена форма светового пучка в виде полумесяца, проходящего через граничные области перемещаемого микрообъекта, что обеспечивает меньшее тепловое повреждение жизненно важных структурных элементов микрообъекта (органелл) по сравнению с гауссовым пучком.

2. Экспериментально показано, что световой пучок в форме полумесяца, согласованной по форме и размеру с биологическим микрообъектом (клетка дрожжей) размером 8 мкм и сформированной дифракционным оптическим элементом, позволяет достигнуть в одном направлении силы захвата в 2-3 раза большей по сравнению с гауссовым пучком равной мощности и средней интенсивности.

3. Экспериментально показано, что световой пучок в форме полумесяца, может быть сформирован с помощью дифракционного оптического элемента, формирующего суперпозицию вихревых световых пучков с разностью топологических зарядов 1 или 2. При этом суперпозиция вихревых световых пучков с разностью топологических зарядов 2 дает пучок в форме двойного полумесяца, что позволяет осуществлять перемещение вдоль одной координатной оси как в положительном, так и в отрицательном направлении. В экспериментах с оптическим захватом и перемещением клетки К562 размером около 20мкм пучком в форме полумесяца, который был сформирован как суперпозиция вихревых световых пучков с топологическими зарядами 7 и 9, была достигнута сила захвата примерно в 2 раза большая по сравнению с силой захвата такой же клетки гауссовым пучком равной мощности и средней интенсивности.

Основные результаты опубликованы в следущих изданиях. В журналах, рекомендованных ВАК:

1. Скиданов Р. В. Моделирование движения биологических микрообъектов в световых пучках / Р. В. Скиданов, М. А. Рыков // Компьютерная оптика. — 2010. — Т. 34, № 3. — С. 308—314.

2. Скиданов Р. В. Модификация распределения интенсивности лазерного пучка для оптимизации силовых характеристик оптической ловушки / Р. В. Скиданов, М. А. Рыков, Г. С. Инначионе, С. Г. Кривошлыков // Компьютерная оптика. — 2012.— Т. 36, №3. — С. 377—386.

3. Скиданов Р. В. Суперпозиция вихревых световых пучков для захвата и перемещения биологических микрообъектов / Р. В. Скиданов, М. А. Рыков // Компьютерная оптика,— 2013,—Т. 37, № 4. _ с. 431--135.

4. Rykov М. A. Modifying the laser beam intensity distribution for obtaining improved

strength characteristics of an optical trap /М. A. Rykov, R. V. Skidanov // Applied

Optics.— 2014. — T. 53, № 2. — C. 156—164.

В прочих изданиях:

5. Рыков М. А. Численное моделирование движения объектов в задачах оптического захвата. // Труды международной конференции с элементами научной школы для молодежи «Перспективные информационные технологии для авиации и космоса»,

— Самара, СГАУ, 2010. — С. 939-943

6. Рыков М. А. Силовые характеристики и повреждающее действие пучков-полумесяцев: теория и эксперимент // Сборник докладов Молодежной научной школы по нанофотонике (30 июня 2012 г.) 20-го международного конгресса Nanostructures: Physics and Technology. — Самара, июнь 2012. — С. 38-40.

7. Рыков М. А. Изучение силовых характеристик лазерного пучка с распределением интенсивности в виде полумесяца. // Международная конференция «Фундаментальные проблемы оптики - 2012».— Санкт-Петербург, 2012. —. С. 488-491

8. Рыков М. А. Методология исследования свойств пучков сформированных ДОЭ для целей оптического захвата биологических микрообъектов. // Сборник трудов X Всероссийского молодежного Самарского конкурса-конференции научных работ по оптике и лазерной физике. — Самара, 2012. — С. 186-192.

9. Рыков М. А., Скиданов Р. В. Применение сформированных доэ лазерных пучков-«полумесяцев» для задач оптического манипулирования биологическими объектами. // XIV Школа молодых ученых «Актуальные проблемы физики»,— Звенигород, 2012.

— С. 205-206.

10. Rykov М. A., Skidanov R. V. Manipulation of yeast cells with DOE-modulated crescent-shaped and optical bottle laser beams // Optical Trapping and Optical Manipulation X. T. 8810. — SPIE, 2013. — 88102Z-1 - 88102Z-11.

Подписано в печать 19.09.2014 Формат 60 х 84/16. Бумага ксероксная. Печать оперативная. Объем - 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Заказ №51. Отпечатано в типографии ООО «Инсома-пресс» 443080, г. Самара, ул. Санфировой, 1ЮА; тел.:222-92-40