Термодинамика сорбции паров органических соединений твердыми белками тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ГЛАВА 1. Литературный обзор.'.

1.1. Сорбция газов и паров воды на твердых белках.

1.2. Кооперативное влияние воды на свойства твердых белков.

1.3. Связь между физическими и структурными параметрами органических растворителей и их влиянием на свойства белков.

1.4. Структурные исследования белков, помещенных в органические растворители и водно-органические смеси.

1.5. Модельные представления о межмолекулярных взаимодействиях в белках.

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть;.л.

2.1. Объекты исследования. . Л.

2.2. Определение изотерм сорбции паров органических соединений на высушенных препаратах белков.

2.3. Определение изотерм сорбции паров органических соединений на препаратах белков в присутствии третьего компонента: воды или органического соединения.

2.4. Проверка равновесности сорбции в изученных системах.

ГЛАВА 3. Обсуждение результатов;.г.

3.1. Сорбция паров органических соединений на высушенных препаратах белков.

3.1.1. Глобулярные белки.

3.1.2. Фибриллярный белок - коллаген.

3.2. Изотермы сорбции паров органических соединений на твердых белках в присутствии третьего компонента: воды или ,. органического соединения.

3.3. Молекулярная интерпретация влияния третьего компонента на ; сорбцию паров органических соединений твердыми белками.

Результаты и выводы работы.

Актуальность исследования.

Проблема влияния органических растворителей на свойства белковых препаратов в последние десятилетия стала актуальной в связи с активным использованием в биотехнологии ферментативных реакций в неводных средах, позволяющих управлять химическими реакциями посредством варьирования природы органического растворителя. Как было обнаружено, растворитель способен оказывать существенное влияние на скорость ферментативной реакции (сольватация субстрата; десорбция воды с молекулы фермента в органический растворитель; конкуренция с субстратом за активные центры фермента) и ее селективность. Кроме того, в неводном окружении белковые катализаторы проявляют повышенную термостабильность, функционируя десятки часов при температурах 100-120° С, высокие регио- и энантиоселективность, достигающие 95-100 %.

Проблема межмолекулярных" взаимодействий белков с органическими растворителями имеет и более общий характер, в связи с тем, что многие органические соединения способны быть не только средой для ферментативных реакций, но и выступать в качестве субстратов или ингибиторов различных реакций ферментативного катализа, субстратов транспортных белков, связываться антителами в качестве антигенов. Кроме того, вопрос о прогнозировании состояния белков в различных средах непосредственно связан с проблемой стандартизации белковых препаратов на основе данных о термодинамике межмолекулярных взаимодействий белков с органическими соединениями. Решение этой проблемы весьма важно для биотехнологии, поскольку предоставит новую возможность оценки сходства и различий во взаимодействии разных белковых препаратов со средой независимо от их функционального назначения. Изучение сорбции органических соединений из газовой фазы на твердых белках дает 5 непосредственную информацию о термодинамике взаимодействия белков с органическими молекулами. j

Цель работы. Настоящая работа посвящена выяснению критериев связывания белками паров органических соединений, различающихся, по групповому составу, размеру и форме молекул. Цель исследования состоит в изучении влияния особенностей молекулярной структуры твердых белковых препаратов, влияния воды или второго органического компонента на селективность и прочность связывания паров органических соединений.

Научная новизна и выносимые на защиту положения. Впервые определены изотермы сорбции паров органических соединений, применяемых в качестве растворителей в биотехнологии, твердыми белками. На основании

4 1 . ' > . полученных экспериментальных данных сДелан вывод о влиянии размера, структуры органической молекулы и типа функциональной группы на сорбцию органических соединений изученными белками. Впервые охарактеризована фрактальность высушенных белков: сывороточного альбумина,, человека, коллагена из бычьих сухожилий, казеина из козьего молока и инвертазы из пекарских дрожжей по данным о сорбции алифатических спиртов, принадлежащих одному гомологическому ря^у. Сделан вывод о том, что места связывания органических соединений в изученных белковых препаратах раскрываются лишь при непосредственном контакте с молекулами органического компонента, а не существуют заранее в виде готовых полостей или поверхности раздела фаз.

I,

Изучено влияние третичной структуры белка, гидратации и второго органического компонента на характер связывания паров органических соединений перечисленными выше белками.

Впервые получены сигмоидальные изотермы сорбции паров органических соединений на твердом препарате трипсина из поджелудочной железы свиньи, свидетельствующие о наличии кооперативного перехода в твердом белке при связывании органического компонента. Это позволило 6 предположить, что твердый препарат трипсина образует с парами изученных органических соединений твердые комплексы включения или клатраты.

Практическая значимость работы. Полученные результаты представляются полезными для прогнфзирования влияния неводных растворителей на свойства белков в биотехнологических процессах, осуществляемых в отсутствие или при низком содержании воды. Кроме того, полученные данные можно использовать в качестве основы для стандартизации белковых продуктов по их сорбционным свойствам.

Объем и структура работы.

- Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и сбдержит 52 рисунка и 17 таблиц. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы из 111 наименований и приложения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ РАБОТЫ ,

1. Анализ эффективной фрактальной размерности поверхности изученных белков по полученным данным об изотермах сорбции гомологического ряда алифатических спиртов дает основание полагать, что сорбция изученных органических соединений происходит в объем твердой фазы белка.

2. Впервые для твердого препарата белка (трипсина) обнаружен гомотропный кооперативный эффект при связывании паров органических соединений. В этих системах зафиксировано образование устойчивых соединений 1

включения.

3. Показано, что форма изотерм сорбции в системах: твердый белок ff вода + органический сорбат, существенно зависит от размера молекулы сорбата.

4. С ростом гидратации изученных белков наблюдается кооперативное повышение сорбционного сродства глобулярных белков к парам относительно гидрофобных органических соединений (1-пропа.нол, 2-пропанол, этилацетат, диоксан и бензол), что позволило сделать вывод об образовании клатратов ''твердый белок + вода + органический сорбат" в изученных системах.

5. С ростом молекулярных размеров сорбатов имеет место падение сорбции на глобулярных белках (альбумине, инвертазе, казеине и трипсине). Для фибриллярного коллагена эта зависимость имеет более сложную нелинейную форму.

Ill

1. Brunauer S., Emmett P.H., Teller E. Adsorption of gapes in multimolecular layers // J. Am. Chem. Soc. 1938.- V.60.-P.309-319. i

2. Benson S.W., Ellis D.A. Surface areas of proteins. II. Adsorption of non-polar gases // J. Am. Chem. Soc. 1950. - V.72. - P.2095-2102.

3. Boki K., Kawasaki N., Minami K., Takanashi H. Structural analysis of collagen fibers by nitrogen adsorption method // J. Colloid. Interface Sci. 1993. - V.157. -P.55-59. >

4. Bull H.B. Adsorption of water vapor by proteins // Ji Am. Chem. Soc. 1944. -V.66, N9. - P. 1499-15 07.

5. Boki K., Kawasaki N., Takahashi H. Moisture sorption properties of collagen varied in polarity and porous structure by alkali-treatment //. J. Colloid Interface Sci. 1993. - V.161. - P.148-154.

6. Gregory R.B. Protein hydration and glass transition behavior, in: Gregory R.B. (Ed.), Protein-solvent interactions. New York: Marcel Dekker, 1995. — V.264 -P. 191-264.

7. Zettlemoyer A.C., Chand A., Gamble E. Sorption by organic substances. I. Krypton and nitrogen on polyethylene, nylon and collagen II J. Am. Chem. Soc. -1950. V.72. - P.2752-2757.

8. Hnojewyj W.S., Reyerson L.H. Further studies on the sorption of H20 and D20 vapors by lysozyme and the deuterium-hydrogen exchange effect // J. Phys. Chem. 1961. - V.65.-P.1694-1698.112

9. Brausse G., Mayer A., Nedetzka Т., Schlect P., Vogel H. Water adsorption and dielectric properties of lyophilized hemoglobin // J. Phys. Chem. 1968. У.12. -P.3098-3105.

10. Liischer M., Riiegg M. Thermodynamic studies of the interaction of a-chymotrypsin with water. I. Determination of the isosteric enthalpies and entropies of water binding to the native enzyme // Biochim. Biophys. Acta 1978.1. V.533. P.428-439.

11. Yang F., Russell A.J. The role of hydration in enzyme activity and stability: 1. Water adsorption by alcohol dehydrogenase in continuous gas phase reactor // Biotech. Bioeng. 1996. - V.49. - P.700-708.

12. Вода в полимерах: Пер. с англ. / Под ред. С. Роуленда. М.: Мир, 1984. -555 е., ил.

13. Monod J., Wyman J., Changeux J.-P. On the nature of allosteric transitions; a plausible model // J. Mol. Biol. ^ 1965. V.12. - P.88-118.

14. Эдсолл Дж., Гатфренд X. Биотемодинамика. М.: Мир, .1986. - 296 с.

15. Perutz M.F., Wilkinson A.J4 Paoli М., Dodson G.G. Mechanism of the cooperative effects in hemoglobin revisited // Annu. Rev. Biophys. BiomoL Struct.-1998.-V.27.-P.1-34.

16. Bettati S., Mozzarelli A. T state hemoglobin binds oxygen noncooperatively with allosteric effects of protons, inositol hexaphosphate, and cloride // J. Biol. Chem. -1997. V.272, N51. - P.32050-32055.

17. Mozzarelli A., Bettati S., Rivetti C., Rossi G.L., Colotti G., Chiancone Emilia. Cooperative oxygen binding to Scapharca inaequivahis hemoglobin in the crystal

18. J. Biol. Chem. 1996. - V.271, N7. - P.3627-3632.

19. Abundo M., Accardi L., Agro A.F., Mei G., Rosato N. A stochastic model for the sigmoidal behaviour of cooperative biological systems. // Biophys. Chem. 1996.- V.58. P.313-323.

20. Bell G., Janssen A.E.M., Hailing P.J. Water activity fails to predict critical hydration level for enzyme activity in polar organic solvents: Interconversion of113water concentrations and activities // Enzyme Microb. Technol. 1997. - V.2(h -P.471-477.

21. Partridge J., Dennison P.R., Moore B.D., Hailing P.J. Activity and mobility pf subtilisin in low water organic media: hydration is more important than solvent dielectric // Biochem. Biophys. Acta 1998. - V. 1386. - P.79-89.

22. Yang F., Russell A.J. The role of hydration in ептуте activity and stability: 2. Alcohol dehydrogenase activity and stability in a continuous gas phase reactor // Biotechnol. Bioeng. 1996. - V.49. - P.709-716.

23. Barzana E., Klibanov A.M., Karel M. Enzyme-catalyzed, gas-phase reaction? // Apll. Biochem. Biotechnol. 1987. - V. 15. - P.25-34.

24. Jonsson A., van Breukelen W., Wehtje E., Adlercreutz P., Mattiasson В., The influence of water activity on the enantioselectivity in the enzyme-catalyzed reduction of 2-pentanone // J. Mol. Catal. B: Enzymatic 1998. - V.5. - P.273-276.

25. Xu K., Klibanov A.M. pH Control of the catalytic activity of cross-linked enzyme crystals in organic solvents // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V.l 18. - P.9815-9819.

26. Mishra «P., Griebenow K., Klibanov A.M. Structural basis for the molecular memory of imprinted proteins in anhydrous media // Biotechnol. Bioeng. 1996. - V.52. - P.609-614.

27. Yang Z., Zacherl D., Russell A.J. pH dependence of subtilisin dispersed in organic solvents // J. Am. Chem. Soc. 1993. - V.l 15. - P.12251-12257.

28. Ke Т., Klibanov A.M. On enzymatic activity in organic solvents as a function of enzyme history // Biotechnol. Bioeng. 1998. - V.57, N6. - P.746-750.114

29. Parker M.C.^ Moore B.D., Blacker A J. In situ hydration of enzymes in non-polar organic media can increase the catalytic rate // Biocataly^is 1994. - Y.10. -P.269-277. :

30. Roziewski R., Russell A.J. Effect of hydration on the morphology of enzyme powder // Biotechnol. Bioeng. 1992. - V.39. - РД171-1175.

31. Hailing PJ. High-affinity binding of water by proteins is similar in air and in organic solvents // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - V. 1040. - P.225-228.

32. Borisover M.D., Sirotkin V.A., Solomonov B.N, Isotherm of water sorption by human serum albumin in dioxane: comparison with caloribetric data // J. Phys. Org. Chem. 1995. - V.8. - P.84-88.

33. Sirotkin V.A., Borisover M.D., Solomonov B.N. Effect of chain length on interactions of aliphatic alcohols with suspended human serum albumin // Biophys. Chem. 1997. - V.69.-P.239-248.

34. Borisover M.D., Sirotkin V.A., Solomonov B.N. Interactions of human serum albumin suspended in water-organic mixtures // TKermochim. Acta. 1996. -V.284. - P.263-277. 5

35. Borisover M.D., Sirotkin V.A., Solomonov B.N. Thermodynamics of water binding by human serum albumin suspended in acetonitrile // Thermochim.- Acta.- 1995. V.254. -P.47-53.

36. McMinn J.H., Sowa M.J., Charnic S.B., Paulaitis M.E. The hydration of proteins in nearly anhydrous organic solvents // Biopolymers 1993. - V.33. - P.1213-1224.

37. McMinn J.H., Sowa M.J., Charnick S.B., Paulaitis M.E. The hydration of proteins in nearly anhydrous organic solvent suspensions // Biopolymers. 1993.- V.33. — P.1213-1224. *

38. Parker M.C., Moore B.D., Blacker A.J. Measuring enzyme hydration in nonpolar organic solvents usingNMR// Biotechnol. Bioeng. 1995. - V.46. - P.452-458.

39. Wehtje E., Adlercreutz P. Water activity and substrate concentration effects on lipase activity // Biotechnol. Bioeng. 1997. - V.55, N5. -P.798-806.115

40. Wehtje E., Costes D., Adlercreutz P. Enantioselectivity of lipases: effectg ofwater activity // J. Mol. Catal. B: Enzymatic 1997. - V.3. - P.221 -230. э1.1

41. Orrenius C., Norin Т., Hult K., Carrea G. The Candida antarctica lipase В catalysed kinetic resolution of seudenol in non-aqueous media of controlled water activity//Tetrahedron: Asymmetry 1995. - V.6, N12. - P.3023-3030.

42. Hailing P.J. Thermodynamic predictions for biocatalysis in nonconventional media: Theory, tests, and recommendations for experimental design and analysis // Enzyme Microb. Technol. 1994. - V. 16. - P. 178-206.

43. Wescott C.R., Klibanov A.M. The solvent dependence of enzyme specificity // Biochem. Biophys. Acta-1994. V.1206.-P.l-9.116

44. Ке Т., Klibanov A.M. Markedly enhancing enzymatic en^ntioselectivity in organic solvents by forming substrate salts // J. Am. Chem. Soc.>- 1999. V.121, N14. - P.3334-3340. '

45. Klibanov A.M. Why are enzymes less active in organic solvents than in water? // Trends. Biotech. 1997. - V.15.-P.97-101.

46. Kvittingen L. Some aspects of biocatalysis in organic solvents // Tetrahedron -1994. V.50. -P.8253-8274

47. Bell G., Hailing P.J., Moore B.D., Partridge J., Rees D.G. Biocatalysis behaviour in low-water systems // Tibtech -1995. V.13. -P.468-473. ,

48. Almarsson 6., Klibanov A.M. Remarkable activation of enzymes in nonaqueous media by denaturing organic cosolvents // Biotechnol. Bioeng. 1996. - V.49. -P.87-92.

49. Adlercreutz P. Activation of enzymes in organic media at low water activity by polyols and saccharides II Biocheni. Biophys. Acta 1:993. - V. 1163. - P. 144148.

50. Setford S.J. Immunosensing in organic and mixed aqueous-organic phase environments // Trends Anal. Chem. 2000. - V.19, N5; - p.330-339.;

51. Russell A.J., Trudel L.J., Skipper P.L., Groopman J.D., Tannenbaum S.R., Klibanov A.M. Antibody-antigen binding in organic solvents // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1989. V.158,N1.-P.80-85.

52. Giraudi G., Baggiani C. Solvent effect testosterone-antitestosterone interaction // Biochim. Biophys. Acta 1993. - V. 1157. - P.211-216.

53. Babine R.E., Bender S.L. Molecular recognition of protein-ligand complexes: applications to drug design // Chem. Rev. 1997. - V.9,7. - 1359-1472.

54. Aki H., Goto M., Yamamoto M. Thermodynamic aspects of the molecular recognition of drugs by human serum albumin // Thermochim. Acta. 1995. -V.251. - P.379-388.

55. Gilli P., Ferr'etti V., Gilli G., Borea P.A. Enthalpy-entropy compensation in dryg-receptor binding//J. Phys. Chem.- 1994. -V.98. -P.1515-1518.117

56. Xing В., McGill W.B., Dudas M.J. Sorption of benzene, toluene, and o-xylene by collagen compared with non-protein organic sor^rents // Canadian J. Soil. Sci. -1994. V. 74. - P.465-469. ' с .

57. Sherman S.R., Trampe D.B., Bush D.M., Schiller, M., Eckert C.A., Dallas A.J., Li J., Carr P.W. Compilation and correlation of limiting activity coefficients of nonelectrolytes in water//Ind. Eng. Chem. Res. 1996. -V.3 5. - P. 1044-1058.

58. Mohammadzadeh-K.A., Feeney R.E., Smith L.M. Hydrophobic binding of hydrocarbons by proteins. I. Relationship of hydrocarbon structure // Biochim. Biophys. Acta 1969. - V.194. - P.246-255.

59. Kang Y., Marangoni A.G., Yada R.Y. Effect of two polar organic-aqueous solvent systems on the structure-function relationships of proteases III. Papain and trypsin // J. Food Biochem. 1994. - V. 17. - P.389-405.

60. Wangikar P.P., Michels P.C., Douglas S.C., and Dordick J.S. Structure and i function of subtilisin BPN' solubilized in organic solvents // J. Am. Chem. Soc. -® 1997. V.119. -P.70-76. ,

61. Griebenow K., Klibanov A.M. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? // Biotechnol. Bioeng. -1997. V.53, N4. - P.351-362.

62. Liepinsh.E.,,Otting G. Organic solvents identify specific ligand binding sites on protein surfaces // Nature Biotechnology. 1997. - V.15. -P.264-268.

63. Kuznetsova N., Rau D.C., Parsegian V.A., Leikin S. Solvent Hydrogen-bond network in protein self-assembly: solvation of collagen triple helices in nonaqueous solvents // Biophys. J. 1997. - V.72. - P.353-362.

64. Schmitke J.L., Stern L.J., Klibanov A.M. Comparison of x-ray crystal structures of an acyl-enzyme intermediate of subtilisin Carlsberg formed in anhydrous118acetonitrile and in water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P. 1291812923. '

65. Schmitke J.L., Stern L.J., Klibanov A.M. The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P.4250-4255.

66. Fitzpatrick P.A., Steinmetz A.C.U., Ringe D., Klibanov A.M. Enzyme crystal structure in a neat organic solvent // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90. -P.8653-8657.

67. Fitzpatrick P.A., Ringe D., Klibanov A.M. X-ray crystal structure of cross-linked subtilisin Carlsberg in water vs. acetonitrile // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1994. V.198. -P.675-681. i

68. Zhu G.,: Huang Q., Wang Z., Qian M., Jia Y., Tang Y. X-ray studies on two forms of bovine (3-trypsin crystals in neat cyclohexane II Biochim. Biophys. Acta. -1998. -V.1429.-P.142-150. \

69. Yennawar H.P., Yennawar N.H, and Farber G.K. A structural explanation for enzyme memory in nonaqueous solvents // J. Am. Chem. Soc. 1995. - V.l 17. -P.577-585. "

70. Wang Z., Zhu G., Qian M., Shao M., Jia Y., Tang Y. X-ray studies on cross-linked lysozyme crystals in acetonitrile-water mixtures // Bichim. Biophys. Acta -1998. V.13&4. - P.335-344.

71. Yennawar N.H., Yennawar H.P., Farber G.K. X-ray crystal structure of y-chymotrypsin inlhexane // Biochemistry 1994. -V.33, N23. - P.7326-7336.

72. Otting G., Liepinsh E.s Halle В., Frey U. NMR identification of hydrophobic cavities with low water occupancies in protein structures using small gas molecules // Nature Structural Biology. 1997. - V.4, N5. - P.396-404. }

73. Биополимеры: Пер. с япон. / Оои Т., Ицука Э., Онари С. и др.; Под ред. Ю. Иманиси. М.: Мир. 1988. - С.544, ил.119

74. Griebenow К., Klibanov AM. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure organic solvents // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V.^ 18, N47.-P.11695-11700.

75. Khmelnitsky Y.L., Mozhaev; V.V., Belova A.B., Sergeeva M.Y., Martinek K. Denaturation capacity: a new quantitative criterion foe selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis // Eur. J. Biochem. 1991.-V. 198.-P.31-41.

76. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. A molecular dynamic study of the effect of carbon tetrachloride on enzyme structure and dynamics: subtilisin // Protein Eng. 1996. - V.9. - P.485-492.

77. Perrin D.D.,. Armarego W.L.F and. Perrin D.R. Purification of Laboratory Chemicals. -Oxford: Pergamon Press, 1980. 568 p.

78. Горбачук В. В., Смирнов С; А., Вишняков И. М. и др. Устройство отбора и ввода проб равновесного пара в газовый хроматограф: А. с. 1567973 СССР // Б. И. 1990. N20, * ,

79. Boublik Т., Hala V.* Fried Е. The Vapour Pressures of Pure Substances. — Amsterdam: Elsevier, 1973. 636 p.

80. Lencka M., Szafranski A., Maczynski A. Verified vapor pressure data. Warszawa: PWN, 1984. V.l. - 403p.

81. Hussam A., Carr P.W. Rapid and precise method for the measurement of vapor/liquid equilibria by headspace gas chromatography // Anal. Chem. 1985. -V.57. - P.793-801.

82. Горбачук В.В., Соломонов Б.Н. Определение изотерм адсорбции органических соединений на человеческом сывороточном альбумине120статическим методом парофазного газохроматографинеского анализа // Ж. физ. хим. -i 1996. Т.70, N4. - С.723-727.

83. Valvani S.C., Yalkowsky S.H., Amidon G.L. Solubility of nonelectrolytes in polar solvents. VI. Refinements in molecular surface area'computations // J. Phys. Chem. 1976.-V.80.-P.829-835.

84. Kuznetsova N., Rau D.C., Parsegian V.A., Leikin S. Solvent hydrogen-bond network in protein self-assembly: solvation of collagen triple helices in nonaqueous solvents // Biophys. J. 1997. - V.72. - P.353-362.

85. Mi Z., Zhbu S., Stern S.A. Representation of gas solubility in glassy polymers by a concentration-temperature superposition principle II Macromolecules 1991. -V.24. -P.2361-2367. >

86. Ramachandran S., Udgaonkar J.B. Stabilization of. barstar by chemical modification of the buried cysteines U Biochemistry 1996. - V.35. - P.8776-8785. i*

87. Levitt M.j Gerstein M., Huang E., Subbiah S.<, Tsai J. Protein folding: the endgame // Annu! Rev. Biochem. 1997. — V.66. •*■ P.549-579. '

88. Горбачук B.B., Смирнов С.А., Соломонов Б.Н., Коновалов А.И. Влияние поляризуемости и полярности молекул растворенного вещертва на свободную энергию сольватации // ЖОХ 1990. - Т.60 - С. 1200-1205.

89. Соломонов Б.Н., Коновалов А.И. Термохимия сольватации органических неэлектролитов // Успехи химии 1991. - Т.60. - С.45-68.

90. Федер Е. Фракталы. М.: Мир, 1991. С.232 - 240.

91. Хургин Ю.И., Максарева Е.Ю. Изучение твердофазных ферментативных реакцйй III.* Необратимая инактивация а-химотрипсина бензилсульфонилфторидом // Биоорганическая химия. 1991. - Т. 17, N1. — С.76-80.

92. Росляков В.Я., Хургин Ю.И. Изучение твердофазного гидролиза циннамоил-а-химотрипсина // Биохимия. 1972. -Т.37, Вып.З. - С.493-497.121

93. Остоловский Е.М., Боцянский А.Д., ;Борисенко С.Н., Толкачева Н.В.

94. Молекулярная организация структуры сывороточного альбумина человека //

95. Биополимеры и клетка. 1990. - Т.6, N5. — С.59-64.

96. Partridge J., Hutcheon G.A., Moore В.p., Hailing P.J. Exploiting hydration hysteresis for high activity of cross-linked subtilisin crystals in acetonitrile // J. Am. Chem. Soc.- 1999.-V.118, N51. -P.12873-12877.

97. Hirata M., Ohe S., Nagahama K. Computer aided data book of vapor-liquid equilibria Kodansha Ltd, Tokyo, New York: Elsever, 1975.933 p.-105. Горбачук B.B., Смирнов С.А., Соломонов Б.Н., Коновалов А.И.

98. Свободная энергия комплексообразования как составляющая свободнойэнергии сольватации. // ЖОХ 1990. - Т.60. - с. 1441-1446.

99. Wescott C.R., Klibanov A.M. Thermodynamic analysis of solvent effect on substrate specificity of lyophilized enzymes suspended in organic media // Biotechnol. Bioeng. 1997. - V.67, N3. - P.340-344.

100. Соломонов Б.Н., Коновалов A.M., Новиков В.Б., Ведерников A.H., Борисовер М.Д., Горбачук В.В., Антипин И.С. Сольватация органических соединений. Молекулярная рефракция, дипольный момент и энтальпия сольватации. //ЖОХ- 1984.-Т.54. с.1622-1632. >

101. Lehn J.-M. Supramolecular chemistry : concepts and perspectives Weinheim: VCH, 1995.

102. Connors K.A. The stability of cyclodextrin complexes in solution // Chem. Rev. 1997. - V.97. - P.1325-1357.122