Тирозин-фенол-лиаза из Citrobacter Freundii: вклад кофермент-связывающих остатков активного центра ASP214, SER254 и ARG100 в катализ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

направахрукописи

Паписова Анастасия Ивановна

тирозин - фенол-лиаза из отеовлстее гелимои-. ВКЛАД

КОФЕРМЕНТ-СВЯЗЫВАЮЩИХ ОСТАТКОВ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ASP214, SER254 И ARG100 В КАТАЛИЗ

02.00.15-катализ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ

БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в лаборатории химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им. ВА Энгельгардта РАН.

Научный руководитель: доктор химических наук

Т.В. Демидкина

Официальные оппоненты: профессор, доктор химических наук

Е.С. Громова

профессор, доктор биологических наук АВ. Максимеико

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «_»_2004 г. в «_» часов на заседании диссертационного

совета Д 501.001.51 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Ос

И.К. Сакодынская

Актуальность проблемы. Ферменты, которые используют пиридоксаль-5 '-фосфат (пиридоксаль-Р) в качестве кофермента, катализируют самые разнообразные реакции метаболизма аминокислот, проистекающие в клетке: трансаминирование, а,Р- и а,у-элиминирование, Р- и у-замещение, декарбоксилирование, альдольное расщепление, рацемизацию. Ни один из известных коферментов не участвует в катализе столь разнообразных реакций, имеющих физиологическое значение. Реакционная и субстратная специфичность конкретного пиридоксаль-Р-зависимого фермента определяется его белковой частью. Поэтому исследование аминокислотных остатков, обеспечивающих катализ химически разнообразных реакций в семействе пиридоксаль-Р-зависимых ферментов, вносит существенный вклад в решение основной проблемы энзимологии -понимание закономерностей, обеспечивающих эффективность и специфичность ферментативного катализа. Физиологическая важность пиридоксаль-Р-зависимых ферментов предполагает большую практическую ценность результатов подобных исследований для биотехнологии и медицины.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось исследование вклада аминокислотных остатков Аф214, 8ег254 и АщЮО тирозин - фенол-лиазы (КФ 4.1.99.2, ТФЛ) в связывание кофермента и в катализ.

Научная новизна и практическая ценность работы. Установлена роль остатков Ар214, 8ег254 и АщЮО в обеспечении каталитической эффективности фермента. Показано, что остаток аспарагиновой кислоты 214 обеспечивает электронные предпосылки для эффективного протекания одной из ключевых стадий реакции р-элиминирования. Установлено, что водородная связь между остатком серина 254 и атомом ОРг кофермента вносит решающий вклад в поддержании каталитически компетентной конформации активного центра ТФЛ. Взаимодействие остатка АщЮО с фосфатной группой кофермента обеспечивает оптимальные для катализа конформации внутреннего, внешнего альдиминов ТФЛ и хиноидного интермедиата.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Биокатализ-2000: фундаментальные исследования и применение» (Москва, Россия, 2000), на Школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, Россия, 2000), на X Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов - 2003» (Москва, Россия, 2003).

Объем диссертации. Материал диссертации изложен на_страницах машинописного

текста и содержит 19 таблиц и 20 рисунков. Список цитированной литературы включает ссылок.

1 иос. национальная I библиотека /

Результаты и обсуждение 1. Введение

Тирозин - фенол-лиаза - пиридоксаль-Р-зависимый фермент, катализирующий реакцию Р-элиминировакия L-Tyr с образованием фенола, пирувата и иона аммония. Фермент катализирует также реакции Р-замещения, рацемизации Ь(Б)-алапина, побочного трансаминирования. ТФЛ была найдена во многих бактериях, принадлежащих семейству Enterobacteriaceae. Объектом данного исследования является ТФЛ из Citrobacterfreundii. Молекула фермента состоит из четырех идентичных субъединиц, молекулярный вес каждой субъединицы составляет около 51 кДа. В каждой субъединице Е-аминогруппа Lys257 активного центра > образует альдиминную связь («внутренний» альдимин) с альдегидной группой кофермента. Для функционирования фермента необходимы моновалентные катионы, являются активаторами, в присутствии фермент проявляет

незначительную активность. Механизм реакции р-элимипирования L-Tyr, представленный на схеме 1, включает в себя три основные стадии: отрыв С-а-протона субстрата, таутомеризацию фенольного кольца и его р-элиминирование.

Установление трехмерной структуры ТФЛ и фермент-ингибиторного комплекса позволило идентифицировать остатки активного центра и открыло путь к применению метода сайт-направленного мутагенеза для изучения механизма действия фермента. В данной работе исследованы мутантные формы, содержащие замены остатков аспарагиновой кислоты 214, серина 254 и аргинина 100, принимающих участие в связывании пиридоксаль-Р. Плазмиды, содержащие ген ТФЛ с замепами Asp214Ala и Asp214Asn были получены д.х.н. Т.В. Демидкиной (ИМБ им. ВА. Энгельгардта РАН); Ser254Ala, Ser254Cys - к.х.н. М.В. Барболиной (ИМБ им. В.А, Энгельгардта РАН); плазмида ArglOOThr любезно предоставлена профессором Ф. Кристеном (Университет г. Цюриха, Швейцария). Фермент дикого типа и мутантные формы, использованные в работе, выделены и очищены автором. З-(о-нитрофенил)-L-цистеин и З-фтор-Ь-тирозин были синтезированы к.х.н. Н.Г. Фалеевым (ИНЭОС им. Несмеянова РАН).

Диссертация выполнена в ИМБ им. В А Энгельгардта РАН в сотрудничестве с ИНЭОС РАН при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 02-04-48010) и фонда независимых гражданских исследований и развития (США, грант RN1-430). Автор приносит благодарность всем коллегам, участвовавшим в выполнении работы и обсуждении ее результатов.

2. Исследование мутантных ферментов тирозин - фенол-лиазы, содержащих замену

остатка Asp214

В трехмерной структуре ТФЛ боковая группа остатка АБр214 находится на расстоянии водородной связи от атома азота пиридинового кольца кофермента. За счет водородной связи/солевого мостика, образуемыми боковой группой остатка Азр214 с атомом азота пиридинового кольца пиридоксаль-Р, обеспечивается смещение электронной плотности от

Н аминоакрилат

Схема 1. Механизм реакции Р-элиминирования L-Tyr.

С-сс-атома внешнего альдимина и достигается понижение энергетического барьера для отрыва одного из заместителей в субстрате. Данный остаток является структурно консервативным для многих пиридоксаль-5'-фосфат зависимых ферментов. В настоящей работе были выделены и

исследованы мугантные формы фермента ТФЛ, содержащие замены Asp214 на Ala и на Asn (ферменты D214A и D214N).

Определение констант диссоциации пиридоксаль-Р Величина константы диссоциации для ТФЛ дикого типа составляет 5.8х10"7 М (литературные данные). Определение констант диссоциации мугантных форм D214A и D214N показало, что данные ферменты теряют сродство по отношению к коферменту примерно на четыре порядка по сравнению с ферментом дикого типа: М,

KdiEEMN^S-OxlO4 М. Понижение величин свободной энергии связывания для мугантных форм по сравнению с величиной свободной энергии связывания для дикого типа составляет около 4.3 юсал/моль, что соответствует потере энергии одной водородной связи.

Спектральные исследования На схеме 2 приведены возможные ионные и таутомерные формы модельных альдиминов пиридоксаль-Р в интервале рН 6-9. В данном интервале рН альдимины могут существовать в двух ионных формах: катионной (А, таутомеры I, П) и нейтральной (Б, таутомеры III, IV, V). Переход между этими формами сопровождается изменением в спектрах поглощения, перехода составляет ~62. Спектры поглощения и КД холофермента ТФЛ дикого типа в присутствии нова К*" оказались типичны для альдиминов пиридоксаль-Р с аминокислотами с доминирующим максимумом в районе 420-430 нм. Спектр холофермента оставался практически неизменным в диапазоне рН 6.5-8.7. Небольшие изменения были связаны, с некоторым изменением соотношения полос с максимумами 420-430 нм и 320-340 нм. Для определения ионной формы «внутреннего» альдимина фермента дикого типа в присутствии катионов было проведепо разложение спектров поглощения и КД па полосы,

соответствующие отдельным электронным переходам таутомеров как катионной (А), так и нейтральной (Б) форм альдиминов. Установлено, что для ТФЛ дикого типа в присутствии иона К* основные полосы в спектрах принадлежат катионной ионной форме внутреннего альдимина - кетоенамину (II) и еноламину (I) (рисунок 1). Таким образом, величина атома N1 кофермента во внутреннем альдимине ТФЛ оказалась значительно выше чем в

модельных соединениях В присутствии иона фермепт находится в нейтральной

ионной форме (V) (рис. 1). Таким образом, при замене К* на Na+ изменяется ионное состояние внутреннего альдимина фермента, т.е., замена катиона приводит к заметному уменьшению величины рК. атома азота пиридинового кольца кофермента. Аминокислотные остатки, координирующие катион были установлены при рештеноструктурном анализе ТФЛ. Катион К♦ через молекулу воды связан с остатком Lys256, соседним с кофермент-

связывающим остатком Ьу§257, и координируется остатком 01иб9, соседним с остатком Туг71, участвующим в связывании фосфатной группы кофермента. Замена катиона К* на имеющий меньший ионный радиус, вероятно, приводит к изменению конформации остатков Ьув256, Ьу8257, Туг71 и, как следствие, к потере существующей в ферменте дикого типа взаимной ориентации пиридоксаль-Р и боковой группы остатка Аф214, удерживающей протон на атоме азота пиридинового кольца кофермента.

Катионные формы (А) Нейтральные формы (Б) Производные РМР (В)

СХема 2. Кислотно-основные и таутомерные равновесия альдиминов пиридоксаль-Р с аминокислотами в растворах

Для холоферментов мутантных форм Б214А и Б214К ТФЛ было найдепо, что их альдимины следует описывать с помощью нейтральной модели (схема 2, Б). Параметры доминирующих полос для обеих мутантных форм оказались близки к таковым для таутомера V, как в случае холофермента дикого типа с ионами (рис. 2). Следует заметить, что как константы

диссоциации кофермента двух мутантных форм, так и факторы анизотропии полосы кетоенамина этих форм (Ae/8D214A=1,1*10"3 и Де/е D214N=l,3xlO"3) близки. Это, скорее всего, говорит о том, что боковая группа аспарагина 214 не образует водородной связи с пиридиновым атомом азота кофермента, как это можно было ожидать. Полученные результаты показывают, что замены остатка Asp214 как на Ala, так и на Asn, приводят к понижению величины рК, атома азота пиридинового кольца пиридоксаль-Р. В таблице 1 приведено процентное содержание ионных форм для фермента дикого типа и мутантных ферментов.

1ИШШМШШ4ИЮ44«Ш«1!М Ш Я1 I» Ш М» Ш 4*4*441 4М Ш Ж

Рисунок 1. Спектры поглощения (А,В) и кругового дихроизма (Б,Г) холофермента ТФЛ дикого типа в присутствии иона К* (А,Б) и Ка+ (В,Г) разложенные на полосы, соответствующие индивидуальным электронным переходам катионной ионной формы. (......) - Экспериментальные кривые

(-) - Спектры индивидуальных электронных переходов

Рисунок 2. Спектры поглощения (а) и кругового дихроизма (А) холофермента (1) и комплекса с Ь-РИе (2) мутантной формы тирозин - фенол-лиазы Б214А при рН 8.0, разложенные на полосы, соответствующие индивидуальным электронным переходам нейтральной формы

(..........) - Экспериментальные кривые

- Спектры индивидуальных электронных переходов

Помимо полос кетоенамина и енолимина, в спектрах поглощения и КД как холофермента дикого типа так и холоферментов мутантных форм найдены полосы, спектральные параметры которых совпадают с параметрами полос поглощения производных пиридоксаминфосфата (РМР) (схема 1, структуры VI-VIII). Эти полосы следует отнести к конформерам внутреннего альдимина, в которых альдиминная связь полностью выведена из плоскости пиридинового кольца кофермента.

Таблица 1. Процентное содержание ионных/таутомерных форм и копформеров альдимина пиридоксаль-Р в ТФЛ дикого типа и мутантных формах Б214А и Б214К.

Струюуры Аодд» нм Содержание, %

Дикий тип Ш14А 0214Ы

I 342 13±5 - -

II 426 70+13 - -

Ш 350 - 6±2 4±2

IV 332 - 17±5 1б±4

V 416 - 62±7 67±2

РМР*(\Т) 327 17±6 - -

РМР"(УШ) 314 - 12±4 10+3

РК'(УП) 335 - 3±2 3±2

Спектры поглощения и КД комплексов мутантных форм фермента с Ь-РЬе Ь-Мй заметно отличались от спектра комплекса фермента дикого типа отсутствием в комплексах мутантных ферментов полосы с максимумом в области 500 пм, характерной для хиыоцдных комплексов пиридоксаль-Р-зависимых ферментов. На рисунке 2 в качестве примера приведены спектры комплексов с Ь-РЬе. Разложение спектров комплексов показало, они описываются теми же структурами, что и внутренние альдимины мутантных форм Б214А и Б214К. Факторы анизотропии полосы кетоенамина комплексов обеих мутантных форм для Ь-РЬе (Де/е=0.45х10"3) значительно отличались от факторов анизотропии полос кетоенамина соответствующих холоферментов (Д£/е=1.2бх10"3). Это указывает на то, что мутантные ферменты, скорее всего, образуют внешний альдимин при взаимодействии с изученными ингибиторами и что образование внешнего альдимина сопровождается изменением микроокружения кофермента. Действительно, ренгеноструктурные данные фермент-ингибиторного комплекса ТФЛ показали, что образование внешнего альдимина сопровождается поворотом кофермента. Полученные данные свидетельствуют, что для мутантных ферментов реакция тормозится на стадии отрыва С-о> протона из внешнего альдимина.

Стационарная кинетика Обе мутантные формы полностью теряют активность при взаимодействии с природным субстратом Ь-Туг и его синтетическим аналогом З-Б-Ь-Туг. Величины констант скорости реакции Р-элимшшрования для неприродных субстратов кем уменьшаются на 1-2 порядка по сравнению с таковыми для фермента дикого типа (табл. 2). По сравнению с ТФЛ дикого типа для обеих

мутантных форм величина Кщ для реагирующих субстратов увеличивается приблизительно па порядок.

Поскольку скорость разложения Ь-Туг и его синтетического аналога мутантными ферментами определить не удалось, для выяснения влияния замен остатка Ар214 на связывание аминокислот мы исследовали ингибирование реакции р-элиминирования, используя в качестве субстрата 80РС как для фермента дикого типа, так и для мутантных форм. Константы ингибирования реакции разложения 80РС для фермента дикого типа оказались близки к соответствующим константам ингибирования реакции разложения Ь-Туг (табл. 3). При взаимодействии мутантных форм с аминокислотами-ингибиторами величины К увеличиваются примерно на порядок по сравнению с аналогичными величинами для фермента дикого типа. Исключение составляет взаимодействие с Ь-Аф; в данном случае величина К, для обеих мутантных форм по сравнению с диким типом не меняется. В случае Ь-Мй величина К, не изменилась для фермента Б214К и несколько увеличилась для фермента Б214А.

Взаимодействие конкурентных ингибиторов с ферментом дикого типа описывается кинетической схемой (3):

^ схема (3)

и отсюда следует, что величина К) определяется уравнением К! = КДНК,,)

где К, = к(/к, - константа равновесия депротонирования внешнего альдимина, а К,) - константа диссоциации внешнего альдимина. При отсутствии хиноидного интермедиата, т.е. при сильном уменьшении значения величины для аминокислот-ингибиторов должны увеличиваться, что и было найдено большинства ингибиторов. Для фермента дикого типа модельные эксперименты по связыванию аспарагиновой кислоты в трехмерной структуре холофермента показали, что боковая нуклеофильная группа аминокислоты взаимодействует с электрофильной боковой группой остатка Аге100 на стадии хиноидного интермедиата. Поскольку замены остатка Ар214 привели, как обсуждалось выше, к изменению конформации активного центра мутантных ферментов, для Ь-Аф, вероятно, стало возможно взаимодействие с остатком Аге100 на стадии внешнего альдимина. Этим можно объяснить сохранение величины К, аспарагиновой кислоты в мутаптпых ферментах, незначительное изменение величины также может быть

связано с взаимодействием атома серы метионина с боковой группой остатка Аге100 во внешнем альдимине.

Таблица 2. Параметры стационарной кинетики мутантных форм тирозин — фенол-лиазы Б214А и Б214М.

Субстрат ТФЛ дикого типа 0214АТФЛ И214Ы ТФЛ

к-(с1) К»(тМ) к^К. (М 'с ') к« (с1) К.(гаМ) кся/К«(М 'с') к«« (с') К»(гаМ) (М 'с')

Ь-тирозин 3.5* 0.2" 1.8x10" - - - - - -

З-фтор-Ь-тирозия 1.4' 0.1* 1.4Х104 - - - • - -

Б-о-нитрофенил-Ь- 5.1* 0.1' 4.6x10' 2.4x10-' 1.3 1.8x101 4.1x10' 1.9 2.2x10'

цистеин

в-метил-Ь-цнсгеин 0.9* 3.4' 5.1x10* 5.2x10"' 50 1x10'' 1.6x10-' 13.4 1.2x10"'

в-бешил-Ь-дистеин 0.52* од* 2.7x10' 2x10' 7 2.9 6.7x10! 5.1 13

($-хлор-Ь-аланин 0./ 2.0б 3.5x10* 2x10-' 13.3 1.5 6.5x10-' 11.4 5.7x10-'

Погрешности определения не превышали 10%; а, б - литературные данные - реакция а,р-элиминирования не катализируется

Таблица 3. Ингибирование реакции разложения 80РС ТФЛ дикого типа и мутантными формами Б214А и Б214К.

К^мМ

Ингибитор ТФЛ дикого типа 0214А ТФЛ 021414 ТФЛ

4.5х10"'±0.03 11.0+0.12 4.2±0.33

Ь-РЬе 2.9+0.14 22.0±1.76 17.0Ю.85

Ы31и 9.0±0.27 1.0x10*16.03 66.0+3.96

Ь-Аяр 2.5±0.1 3.0±0.24 3.6+0.07

Ь- гомо-Бег 4.5+0.27 82.0±9.02 66.0±8.73

Скорости изотопного обмена в ^Н^О

Поскольку в спектрах поглощения и кругового дихроизма мутантных форм ТФЛ с ингибиторами отсутствует характерный для фермента дикого типа максимум при длине волны 502 нм, соответствующий хиноидному интермедиату, можно было бы заключить, что мутация остатка Ар214 приводит к потере способности фермента осуществлять отрыв С-сс-протона внутреннего альдимина. Однако из данных стационарной кинетики следует, что полная потеря активности наблюдается лишь, с природным субстратом и его синтетическим аналогом. Следовательно, мутантные формы сохраняют способность катализировать отрыв С-а-протона. Чтобы выяснить, как замены остатка Б214 повлияли на стадию отрыва С-а-протона, нами было проведено исследование скорости обмена. С-а-протона субстрата мутантными. формами фермента с использованием в качестве модельных субстратов Ь-РИе, Ь-Ме^ Ь-Азр и Ь-01и. Скорости обмена определяли методом ПМР. Для всех аминокислот обмен протона имеет место. Таким образом, спектральные характеристики комплексов мутантных ферментов, как предполагалось ранее, относятся к внешнему альдимину. Исключением является отсутствие изотопного обмена для глутаминовой кислоты в комплексе с Б214К. Интересно, что в некоторых случаях изотопный обмен с мутантными белками идет даже несколько быстрее, чем с ТФЛ дикого типа. Этот факт, очевидно, является следствием смены лимитирующей стадии обмена при переходе к мутантным формам ТФЛ. Если для ТФЛ дикого типа изотопный обмен в большинстве случаев лимитируется стадией репротонорования хиноидного интермедиата, то для мутантных ферментов, когда И намного меньше, чем к, (на что указывает отсутствие хиноидного интермедиата в спектрах комплексов), лимитирующей стадией должна быть стадия депротонирования. Для Ь-фенилаланиа, скорость отрыва С-а-протона замедляется в среднем в 1000 раз.

Таблица 4. Кинетические параметры реакции обмена С-а-протона в аминокислотах под действием ТФЛ дикого типа и мугантных форм Б214А и Б214К.

Аминокислота ТФЛ дикого типа 0214А 0214К

ксс 8' кг з-1 к. к« к« в"1

Ь-РЬе 0.241" 16.2й' 6.4'"> 0.0096 0.018

Ь-Мй 0.078(" 1.4»*» 0.03(,) 0.076 0.13

Ь-Авр 0.13 0.25 0.038

Ы31и 0.048 0.148 X

Погрешности определения не превышали 10%; а - литературные данные х - Обмен отсутствует

Для Ь-Ме1 и Ь-Лзр замедление И, обусловленное заменами Б214, оказался значительно меньше. Вероятно, эти различия в скоростях обмена являются следствием конформационных изменений в активных центрах мугантных ферментов, приводящими к тому, что относительная ориентация С-а-протона и основания-акцептора в комплексах с Ь-Ме1 и Ь-Лф более благоприятна для передачи С-а-протона, чем в комплексах с ароматическими аминокислотами. В общем случае снижение СН-кислотности внешнего альдимина (обусловленное отсутствием положительного заряда на N(1) атоме азота кофермента в мугантных ферментах) должно приводить, с одной стороны, к снижению скоростей ферментативных реакций вследствие снижения концентраций хиноидных интермедиатов в стационарном состоянии, а с другой - к увеличению реакционной способности хиноидных интермедиатов в реакциях р-элиминирования. В предельном случае скорость отрыва С-а-протона может стать скорость-лимитирующей стадией реакции Р-элиминирования, в то время как для фермента дикого типа такой стадией является элиминирование ароматического фрагмента субстрата. Можно думать, что в случае мугантных ферментов ситуация приближается к этому предельному случаю, поскольку скорости обмена С-а-протона (лимитируемые стадией отрыва протона) достаточно близки величинам к<й для реагирующих субстратов. Отсутствие активности мугантных фермептов в отношении Ь-Туг и 3-Р-Ь-Туг, по всей вероятности, связано со значительным замедлением и стадии активации уходящей группы, что может быть следствием конформационных изменений в активных центрах мугантных форм, приводящих к нарушению оптимальной ориентации фенольного фрагмента субстрата относительно функциональных групп, участвующих в его таугомеризации.

3. Исследование мутантных ферментов тирозин - фенол-лиазы, содержащих замену остатка 8ег254

В пиридоксаль-Р-связывающем центре тирозин фенол-лиазы один из атомов кислорода фосфатной группы образует водородную связь с атомом водорода гндроксильной группой остатка 8ег254. В данной работе были очищены и изучены мутантные ферменты, содержащие замены остатка 8ег254 на аланин и цистеин (ферменты 8254А, 8254С).

Определение константы диссоциации Определение константы диссоциации пиридоксаль-Р для мутантной формы 8254А показало, что замена приводит к потере сродства апофермента к коферменту примерно на 4 порядка по сравнению с ферментом дикого типа. Величина Ка мутантной формы 8254А составила 1.5x1 О*3 М. Нам не удалось определить величину для мутантной формы 8254С из-за более низкого, чем у мутантной 8254А сродства кофермента к апоферменту. Понижение свободной энергии связывания пиридоксаль-Р ферментом 8254А составляет 4.6 ккал/моль.

Спектральные исследования Спектры поглощения фермента дикого типа и мутантных форм приведены на рисунке 3. Видно, что замены остатка 8254 приводят к изменению соотношения полос поглощения с максимумами в области 330-340 нм и 410-420 нм, принадлежащим двум таутомерным формам внутреннего альдимина. Разложение спектров показало, что замена не приводит к изменению ионной формы внутреннего альдимина мутантных ферментов. Помимо конформера, присутствующего в ферменте дикого типа (Хцщ^З27 нм, схема 2, структура VI), в котором альдиминная связь перпендикулярна плоскости пиридинового кольца пиридоксаль-Р (табл. 5), для мутантных форм 8254А и 8254С был обнаружен конформер с максимумами поглощения при 381 и 376 нм, соответственно (обозначенный в таблице 5 как П^), в котором альдиминная связь частично выведена из сопряжения с тс-электронами пиридинового кольца, но водородная связь между атомом азота альдиминной связи и водородом группы кофермента сохраняется. В таблице 5 приведено процентное содержание таутомеров и конформеров внутреннего альдимина мутантных форм в сравнении с данными для фермента дикого типа. Преобладающей структурой альдиминов мутантных форм, как и в случае фермента дикого типа, является кетоенамин, однако замена остатка 8ег254 в обоих случаях привела к некоторому изменению таутомерного состава внутреннего альдимина мутантных ферментов.

Полосы поглощения таутомерных форм внутреннего альдимина фермента дикого типа обладают круговым дихроизмом (рис. 1), для мутантных ферментов полосы поглощения были не

Рисунок 3. Спектры поглощения холоферментов (I) и спектры поглощения (А) и КД (Б) комплекса с Ь-РЬе (П) фермента дикого типа (1) и мутантных форм 8254Л (2) и 8254С (3) при рН 8.0. Спектры снимали при концентрации белков 4х10'5М, Ь-РЬе 0.2 М.

дихроичны. Следовательно, замены остатка 8ег254 приводят к значительному изменению микроокружения кофермента. Для мутантных ферментов были получены спектры поглощения и КД с Ь-РЬе и Ь-Ме1 На рисунке 3 (II) приведены спектры комплексов с Ь-РЬе. В спектрах комплексов отсутствует полоса поглощения хиноидного интермедиата с максимумом в районе 500 нм (как для Ь-РЬе, так и для Ь-Ме^), а полосе поглощения с максимумом в области 410-420 нм соответствует отрицательная полоса кругового дихроизма. Поскольку полоса поглощения внутреннего альдимина мутантных форм в области 410-420 нм не обладает круговым дихроизмом, полосы поглощения и кругового дихроизма в этой спектральной области в спектрах комплексов следует отнести к внешнему альдимину, образуемому мутантными ферментами с Ь-РЬе. Разложение спектров комплексов показало, что внешние альдимины мутантных форм 8254Л и 8254С существуют в той же ионной форме и практически в том же таутомерном составе, что и их внутренние альдимины. Как правило, полосы поглощения внешних альдиминов были сдвинуты в длинноволновую область на 2-5 нм по сравнению с положением полос поглощения внутренних альдиминов мутантных Полученные данные показывают, что ферменты

8254Л и 8254С связывают Ь-РЬе и Ь-Мй, но, в отличие от фермента дикого типа, не образуют заметного количества хиноидного промежуточного комплекса. Таким образом, спектры поглощения показывают, что замены остатка 8ег254 приводят к существенному торможению ферментативной реакции на стадии образования хиноидного интермедиата из внешнего альдимина. Следует отметить, что в отличие от мутантных ферментов Э214Л и Э214М, полоса поглощения внешних альдиминов мутантных форм 8254Л и 8254С обладала отрицательным дихроизмом.

Таблица 5. Содержание таутомеров и конформеров внутреннего и внешнего альдиминов в ТФЛ дикого типа и мутантных формах 8254Л и 8254С.

Содержание, %

Фермент П II ^ I VI

ТФЛ, дикий тип 70 ±13 - 13 ±5 17 + 6

Б254А(С) 41 ±2 15 ±4 28 ±2 16 ± 5

Б254А(С) + Ь-РЬе 59 ±6 6±2 23 ±2 12 + 2

8254А(С) + Ь-Мй 56 ±6 7±2 25 ±2 12±2

Стационарная кинетика В таблице 6 представлены полученные нами кинетические параметры мутантных ферментов в сравнении с параметрами фермента дикого типа. Активность мутантных ферментов в реакциях со всеми субстратами была значительно ниже, чем активность фермента дикого типа. Наиболее заметное влияние замена остатка 8ег254 оказала на активность мутантных ферментов в реакции с природным субстратом, Ь-Туг. Величины кс этой реакции уменьшились на 4 порядка по сравнению с таковыми для фермента дикого типа. Для З-Б-Ь-Туг скорость расщепления уменьшилась более чем на три порядка. При взаимодействии мутантных ферментов с нефизиологическими субстратами величина уменьшается в среднем на один-два порядка. Следует отметить, что для З-Б-Ь-Туг величина Кп, увеличилась почти на порядок, в то время как для Ь-тирозина данная величина близка к таковой для фермента дикого типа. Такое увеличение позволяет предположить, что конформационные изменения активного центра, вызванные заменами остатка 8ег254, приводят к тому, что мутантные ферменты, в отличие от фермента дикого типа, становятся чувствительны к введению заместителя в положение 3 фенольного кольца.

Скорости изотопного обмена в г1ЬО

Для оценки влияния рассматриваемых замен на эффективность связывания субстрата и стадию отрыва протона из внешнего альдимина мы определили константы ингибирования Ь-РИе реакции разложения 80РС для мутантных ферментов и скорость обмена С-а-протона Ь-фенилаланина под действием мутантных форм. Константы конкурентного ингибирования реакции разложения 80РС для ферментов 8254А и 8254С (табл. 8) увеличилась в 3-4 раза (Ь-РИе) и более, чем на порядок (Ь-Ме^ по сравнению с ферментом дикого типа.

В соответствии с кинетической схемой 3 отсутствие хиноидного интермедиата свидетельствует о сильном уменьшении значения поэтому величины К, для аминокислот-ингибиторов должны увеличиваться, что и было найдено для мутантных ферментов. Скорости обмена С-а-протона Ь-фенилаланина под действием мутантных ферментов 8254А и 8254С были определены методом ПМР. Для фермента 8254С а пробах после длительной (10 часов) инкубации не обнаруживалось заметного количества тогда как для фермента 8254А полученная

константа составила (табл. 8). Отсутствие хиноидного интермедиата в спектрах

комплексов мутантных ферментов с Ь-РИе говорит о том, что для мутантных форм, в отличие от фермента дикого типа, скорость возврата должна быть во много раз выше, чем

скорость его отрыва. Следовательно, полученная величина к« для Ь-РИе характеризует скорость отрыва С-а-протона (к|) из внешнего альдимина, образуемого ферментом 8254А с Ь-РИе. Сравнение величин

к« (0.04 с1) д ля мутантного фермента с вели л я фермента

дикого типа (табл. 4) позволяет заключить, что замена 8ег254 на аланип приводит к замедлению стадии отрыва С-а-протона в реакции с Ь-РИе в 400 раз. Можно предположить, что в реакции мутантпой формы 8254С с Ь-РИе, где не удалось обнаружить изотопный обмен, имеет место еще более сильное замедление стадии отрыва С-а-протона из внешнего альдимина. Торможение ферментативной активности для мутантных ферментов на стадии отрыва вероятно,

объясняется тем, что во внешних альдиминах, образуемых мутантными ферментами с аминокислотами (субстратами или ингибиторами), нарушается оптимальная ориентация между атомом водорода С-а-атома внешнего альдимина и боковой группы остатка Ьув257. Последняя, по данным рентгеноструктурного анализа комплекса, моделирующего внешний альдимин, является основанием, отрывающим субстрата.

Найденное замедлепие скорости реакции р-элиминирования для природного субстрата, Ь-Туг на два порядка превышает замедление для стадии отрыва С-а-протона, оцененное по величине к„ для Ь-РЬе. Замедление скорости реакции Р-элиминирования для 80РС, содержащего хорошую уходящую группу и не требующего катализа на стадии элиминирования о-нитрофенилтиольной группы, также превышает замедлепие, найденное для стадии отрыва С-а-протона, в то время как

Таблица 6. Параметры стационарной кинетики мутантных форм тирозин - фенол-лиазы 8254Л и 8254С.

ТФЛ дикого типа 8254А ТФЛ в254С ТФЛ

Субстрат

к« (с') К„ (тМ) ко/К» (М 'с"') Ьш (с') К« (тМ) к^/К.СМ'с') коСс1) К« (тМ) ква/Ко, (М-'с'1)

Ь-тирозин 3.5" 0.2* 1.8x10* 5.2x10"* 0.20 2,6 2.8x10"* 0.45 6,2x10''

З-фтор-Ь-тирозин 1.4' 0.1* МхЮ4 8.9x10** 0.94 9,4x10-' 4.6x10^ 0.72 6,3x10-'

в-о-нитрофенил-Ь- 5.1* 0.1* 4.6x104 1.6x10® 0.15 1,1x10' 1.7x10-' 0.15 1,1x10'

цистеив

5-метнл-Ь-цистеин 0.9" 3.4' 5.1x10* 1.9x10 2 2.27 8,4 1.8х10'2 18.2 9,9x10'

Б-бензил-Ь-дистеин 0.52* 0.2' 2.7x103 7.7x102 0.14 5,5x102 1.5x10-' 0.36 4,2

Р-хлор-Ь-алашш 0.7® 2,0® 3.3х102 5.8х10'2 7.26 8,0 8.8x10"' 11.4 7,7x10-'

Погрешности определения не превышали 10%; а, б - литературные данные.

замедление для ß-Cl-L-Ala, также содержащего хорошую уходящую группу, сопоставимо с замедлением стадии отрыва С-а-протона. Отсюда можно заключить, что в активных центрах мутантных ферментов нарушается оптимальная ориентация кофермент-субстратных интермедиатов и функциональных групп активного центра как на стадии отрыва С-а-протона из внешнего альдимина, так и на стадиях активации уходящей группы и, возможно, на стадии вывода продуктов реакции расщепления субстратов, содержащих объемные заместители.

Совокупность полученных результатов показывает, что водородная связь между гидроксильной группой Ser254 и фосфатной группой пиридоксаль-Р необходима для обеспечения оптимальной конформации активного центра ТФЛ на ключевых стадиях реакции р-элиминирования - стадии отрыва С-а-протона и стадии элиминирования ароматического фрагмента.

4. Исследование мутантных ферментов тирозин - фенол-лиазы, содержащих замену

ArglOOThr

Боковая группа ArglOO и атом азота основной цепи образуют три водородные связи с фосфатной группой кофермента. Мутантная форма с заменой аргинина 100 на треонин получена проф. Ф. Кристеном и им было показало, что мутантный фермент сохранял около 15% активности в реакции с L-Tyr. Для сравнения вклада остатков Ser254 и ArglOO в связывание кофермента и механизм р-элиминирования мы провели исследования некоторых свойств мутантной формы R100T.

Определение константы диссоциации Определение константы диссоциации пиридоксаль-Р для мутантной формы R100T показало, что замена приводит к потере сродства апофермента к коферменту примерно на 4 порядка по сравнению с ферментом дикого типа. Величина Kj для мутантной формы R100T составила 1.0x1 О*3 М. Потеря свободпой энергии связывания кофермента мутантной формой R100T (4.4 ккал/моль) сопоставима с потерей свободной энергии связывания пиридоксаль-Р ферментом S254A (4.6 ккал/моль), хотя при замене аргинина возможна потеря трех водородных связей, а при замене Ser254 - потеря одной водородной связи. Вероятно, боковая группа и/или атом азота основной цепи остатка ThrlOO могут образовывать одну или две водородных связи с атомами кислорода фосфатной группы кофермента.

Спектральные исследования На рисунке 4 приведены спектры поглощения и КД мутаптпого фермента и ТФ Л. В спектре поглощения холофермента присутствуют две полосы поглощения с максимумами в области

Рисунок 4. Спектры поглощения (А) и КД (Б) холофермента (I) и комплексов с L-Phe (П) ТФЛ дикого типа (—) и мутантной формы ШООТ (•••—) при рН 8,0. Спектры снимали при концентрации белков 4х10"5М, Ь-РЬе 0.2 М.

415-422 нм и 330-340 нм. Разложение спектров показало, что преобладающей структурой в мутантной форме, как и в ферменте дикого типа, является кетоенамин (схема 2, структура II). Замена остатка AIgЮO не привела к изменению ионного состояния внутреннего альдимина мутантного фермента, наблюдался некоторый сдвиг таутомерного равновесия в сторону енолимипа (табл. 7). Полоса поглощения кетоенамина обладает положительным знаком КД, замена приводит к значительному изменению фактора анизотропии полосы кетоенамина (Де/е\цгг=1-26х10"5, Де/ещоог'О-З^Ю*3). Как обсуждалось выше, полосы КД внутреннего альдимина мутантных форм S254A и S254C не дихроичны, в то время как в случае замены R100T положительный знак дихроизма сохраняется. Следовательно, замена остатка AIgЮO на 1Ъг приводит к изменению микроокружения кофермента, однако менее существенному, чем в случае замены Seг254.

Таблица 7. Процентное содержание таутомеров и конформеров внутреннего альдимина в ТФЛ дикого типа и мугантной форме И 00Т.

ТФ Л, дикий тип 70 ± 13 13 + 5 17 ±6

Скорости изотопного обмена в 2Н;0

Мутантная форма конкурентно ингибировалась аминокислотами - ингибиторами фермента дикого типа, величины К, Ь-РЬе и Ь-Ме1 в реакции Р-элиминирования 80РС составили 3.7 и 0.8 мМ, соответственно. Эти величины незначительно отличались от соответствующих величин для фермента дикого типа (табл. 8). На рисунке 4 приведены спектры поглощения и КД комплексов мутантного фермента с Ь-РЬе. Согласно спектральным данным, взаимодействие мутантной формы как с Ь-РЬе, так и с Ь-Ме1 приводило к равновесной смеси внешнего альдимина и хиноидного интермедиата, т.е., фермент Я100Т, в отличие от фермента 8254Л, образовывал хиноидный интермедиат при взаимодействии с аминокислотами. Следует отметить, что формы полосы КД хиноидного интермедиата мутантного фермента в комплексах с Ь-РЬе и с Ь-Ме1 значительно отличались от формы полос КД комплексов фермента дикого типа, т.е., для мутантной формы микроокружение кофермента в хиноидных комплексах, так же, как и во внутреннем альдимине, отличается от такового для фермента дикого типа.

Таблица 8. Ингибирование реакции разложения 80РС и кинетические параметры реакции обмена С-а-протона в аминокислотах под действием ТФЛ дикого типа и мутантных форм

8 2 54Л,8254СИЯ100Т.

ТФЛ дикого типа Б254А ТФЛ Б254СТФЛ Ю00ТТФЛ

Ингибитор К,(мМ) Мс"1) К,(мМ) Мс"1) К,(мМ) Мс1) К,<мМ) к^с')

Ь-РЬе 2.9 0.247(,) 13.1 0.04 4.2 3.7 ж

Ь-Мй 0.45 0.078 6.7 х 10.1 0.8 0.12

Погрешности определения не превышали 10%; а - литературные данные, * - обмен отсутствует - реакция обмена не исследовалась

Замена А^100 па ТИг повлияла па скорость обмена С-а-протона в фермеит-ингибиторных комплексах. В случае взаимодействия с Ь-РИе - ингибитором, который наиболее близок по строению к природному субстрату ТФЛ, отрыв С-а-протона происходит очень медленно, поэтому измерить скорость данной реакции нам не удалось. В случае же Ь-Ме1 константа скорости реакции обмена С-а-протона увеличивается примерно вдвое по сравнению с ферментом дикого типа. Это, скорее всего, говорит о том, что конформация внешнего альдимина в мутантном ферменте отличается от таковой в ферменте дикого типа, что согласуется со спектральными данными.

Исследование реакции побочного трацсаминирования ТФЛ катализирует побочную реакцию трансаминирования субстратов и ингибиторов, скорость которой зависит от распределения отрицательного заряда в хиноидном интермедиате между С-а-углеродным атомом аминокислоты и С4'-атомом кофермента. Это распределение определяется белковым окружением. Мы исследовали влияние замены А^100 на ТИг на способность фермента катализировать побочное трансаминирование. Результаты, представленные в таблице 9, показывают, что замена остатка Аг;*Ю0 на ТИг приводит к падению величины кш трансаминирования как Ь-РИе, так и Ь-Ме1 на порядок, в то время как с Ь-Ар реакция нами не была обнаружена, т.е., скорость ее очень мала. Полученные данные, также как и спектральные данные, приведенные выше, указывают на различное микроокружение хиноидного интермедиата в ферменте дикого типа и в мутантном ферменте.

Таблица 9. Каталитические параметры реакции побочного трансаминирования для мутантпой

формы ШООТ ТФЛ.

Ингибитор кит (с*1) ТФЛ дикого типа (с"') ШООТ

Ь-РЬе 8.0x104 4.9x10"5

ь-ма 3.7x10"3 1.4x10-4

Ь-АБР 1.8x10"4 -

Период полупревращения Ь-РИе - 3.9 ч., Ь-Ме1 -1.4 ч. Погрешности определения не превышали 10%

Замечательно, что при замене остатка 8ег254 отсутствие лишь одной водородной связи приводит к значительно большему изменению микроокружения кофермента и понижению активности мутантных ферментов в реакции с природным субстратом на четыре порядка. В то же время замена А^100, образующего три водородные связи с фосфатной ручкой кофермента,

мутаитный фермент, по литературным данным, сохраняет около 15% активности в реакции с L-

Туг. Понимание такого различия требует ренгеноструктурных исследований мутантных

ферментов и их комплексов с субстратами и/или ингибиторами.

Выводы:

1. Мутантные формы тирозин - фенол-лиазы, содержащие замены Asp214Ala, Asp214Asn, Ser254Ala, Ser254Cys и ArglOOThr, получены в гомогенном виде. Исследованы кинетические и спектральные характеристики мутантных ферментов.

2. Показано, что ионной формой внутреннего альдимина холофермента дикого типа в присутствии катиона-активатора К* является катионная форма. Установлено, что замена катиона К* на Na+ приводит к понижению величины рК, внутреннего альдимина.

3. Замена остатка аспарагиновой кислоты 214 на аспарагин или аланин приводит к понижению величины рК» N1 атома азота кофермента и, как следствие, к торможению ферментативной реакции в основном на стадии отрыва С-а-протона из внешнего адьдимина.

4. Водородная связь между гидроксильной группой серина 254 и фосфатной группой пиридоксаль-Р необходима для обеспечения оптимальной конформации активного центра тирозин - фенол-лиазы на ключевых стадиях реакции р-элиминирования - стадии отрыва С-а-протона и стадии элиминирования ароматического фрагмента.

5. Водородные связи, образуемые боковой группой и атомом азота основной цепи остатка аргинина 100 с атомами кислорода фосфатной группы кофермента, вносят вклад в поддержание реакционноспособных конформации внутреннего и внешнего альдиминов тирозин - фенол-лиазы и хиноидного интермедиата.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Bazhulina N.P., Morozov Y.V., Papisova АЛ., Demidkina T.V. Pyridoxal 5'-phosphate Schiffbase in Citrobacter freundii tyrosine phenol-lyase. Ionic and tautomeric equilibria. Enr. J. Biochem., 2000, v. 267,p.1830-1836.

2. Паписова А.И., Бажулина Н.П., Фалеев Н.Г., Демидкина Т.В. Тирозин — фенол-лиаза: роль кофермент-связывающего остатка Ser254 в катализе. Доклады Академии Наук, 2003, т. 391, с.225-228.

3. Паписова А.И., Бажулина Н.П., Фалеев«. Н.Г., Демидкина Т.В. Изучение кофермент-связывающего аминокислотного остатка Asp214 активного центра тирозин - фенол-лиазы

методом сайт-направленного мутагенеза. Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии» Тезисы стендовых сообщений, 2000, с.135.28 мая-2 июня, г. Пущино, Россия.

4. Papisova АЛ., Bazhulina N.P., Faleev N.G., and Demidkina T.V. The role ofAsp214 and Ser254 in the pyridoxal 5'-phosphate-dependent tyrosine phenol-ryase. International conference Biocatalysis-2000: fundamentals and applications. Book of abstracts, p. 139-140, June 10-15, 2000, Moscow, Russia.

5. А.И. Паписова, Н.П. Бажулина, Т.В. Демидкина. Тирозин - фенол-лиаза: роль остатка активного центра ArglOO в катализе. X Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов - 2003», тезисы доклада, т.1, с. 134, Апрель 15-18,2003, Москва, Россия.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 21.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 90 экз. Заказ 456. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Актуальность проблемы.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Пиридоксаль-5'-фосфат как кофермент.

Глава 2. Классификация пиридоксаль-Р-зависимых ферментов.

2.1 Классификация пиридоксаль-Р-зависимых ферментов на а, р и у семейства.

2.2 Классификация на основе сравнения пространственных структур.

2.3 Классификация по типу укладки полипептидной цепи.

Глава 3. Исследование аминокислотных остатков активного центра, ответственных за связывание и функционирование пиридоксаль-Р методом сайт-направленного мутагенеза.

3.1 Остатки активного центра, взаимодействующие с альдегидной группой пиридоксаль-Р.

3.2 Остатки активного центра, взаимодействующие с N(1) атомом азота пиридоксаль-Р.

3.3 Остатки активного центра, взаимодействующие с З'-гидроксильной группой кофермента.

3.4 Остатки активного центра, взаимодействующие с фосфатной группой кофермента.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Объекты и методы исследования.

4.1 Материалы.

4.2 Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Исследование мутантных ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Asp214.

Глава 6. Характеристика мутантных ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Ser254.

Глава 7. Характеристика мутантного фермента ТФЛ, содержащего в активном центре замену ArglOOThr.

ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы.

Ферменты, которые используют пиридоксаль-5'-фосфат в качестве кофермента, катализируют самые разнообразные реакции метаболизма аминокислот, протекающие в клетке: трансаминирование, а,Р- и а,у-элиминирование, (3- и у-замещение, декарбоксилирование, альдольное расщепление, рацемизацию. Ни один из известных коферментов не участвует в катализе столь разнообразных реакций, имеющих физиологическое значение. Реакционная и субстратная специфичность конкретного пиридоксаль-Р-зависимого фермента определяется его белковой частью. В последние годы особое внимание уделяется изучению структурных основ механизма действия этих ферментов с целью вьиснения взаимосвязи структура- функция. Для исследования данного вопроса применяются самые различные методы: рентгеноструктурный анализ, сайт-направленный мутагенез, ЯМР, изучение взаимодействия белковой части фермента с аналогами кофермента и субстратов и т.д. Физиологическая важность пиридоксаль-Р-зависимых ферментов предполагает большую практическую ценность результатов исследований закономерностей их действия для биотехнологии и медицины.

Научная новизна и практическая значимость работы.

На основании рентгеноструктурных данных о пространственной структуре тирозин - фенол-лиазы проводилось изучение кофермент-связывающих остатков активного центра фермента методом сайт-направленного мутагенеза. Установлена роль консервативных остатков Asp214, Ser254 и ArglOO в механизме действия фермента и связывании пиридоксаль-Р. Следует отметить, что исследование остатка Ser, имеющего структурно консервативное расположение в активных центрах многих пиридоксаль-Р-зависимых ферментов, ранее не изучалось. Показано, что исследованные точечные нарушения кофермент-связывающего центра сильно сказывается как на связывании пиридоксаль-Р с белковой частью фермента, так и на взаимодействии с субстратами. Полученные данные имеют большое значение для понимания участия кофермент-связывающих остатков активного центра в механизме реакции (5-элиминирования, катализируемой тирозин — фенол-лиазой.

Список сокращений

ТФЛ - тирозин - фенол-лиаза

DTT - дитиотрейтол

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

PLP, пиридоксаль-Р - пиридоксаль-5 '-фосфат

Пиридоксамин-Р - пиридоксамин-5 '-фосфат

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

КД - круговой дихроизм

СоА - кофермент А

NADH - никотинамидадениндинуклеотид

LB-среда - среда Лурье-Бертрана

BSA - бычий сывороточный альбумин

PS - протаминсульфат

SDS - додецилсульфат натрия

SOPC - 8-(о-нитрофенил)-Ь-цистеин

СоА - кофермент А

НК - нуклеиновые кислоты

Введение

Тирозин - фенол-лиаза (ЕС 4.1.99.2) - это пиридоксаль-5'-фосфат (пиридоксаль-Р) зависимый фермент, катализирующий реакцию Р-элиминирования L-Tyr с образованием фенола, пирувата и иона аммония [1] (схема 1) схема 1.

В качестве субстратов в данной реакции in vitro могут также выступать другие природные и синтетические аминокислоты: L-Ser, L-Cys, S-Memn-Cys, Р-С1-Ala (1), Б-бензил-Сув, 8-(о-нитрофенил)-Ь-Суз [2]. Кроме того, тирозин-фенол лиаза катализирует реакции р-замещения [3,4], рацемизацию ЦО)-аланина [5,6], а также реакцию побочного трансаминирования L-Tyr, L-Ser и конкурентных ингибиторов фермента L-Ala, L-Phe и L-m-Tyr [7].

Молекула фермента состоит из четырех идентичных субъединиц, молекулярный вес каждой субъединицы составляет около 51 кДа. Молекула ТФЛ связывает 4 молекулы кофермента на тетрамер. В каждой субъединице е-аминогруппа Lys257 активного центра образует альдиминную связь («внутренний» альдимин) с альдегидной группой кофермента [8].

Механизм реакции p-элиминирования был предложен в работе [9]. На первой стадии любой реакции с участием пиридоксаль-Р-зависимых ферментов (схема 2) происходит взаимодействие «внутреннего» альдимина (I) и аминогруппы субстрата с освобождением е-аминогруппы лизина и образованием альдиминной связи («внешнего» альдимина II) между коферментом и аминогруппой субстрата. Далее образуется хиноидное промежуточное соединение (ШЬ) посредством отрыва С-а-протона субстрата основной каталитической группой. На следующей стадии происходит таутомеризация фенольного фрагмента в циклогексадиеноновый (111с) с последующим элиминированием фенола (IV). В активном центре тирозин - фенол-лиазы внутренний альдимин холофермента образован остатком Lys257. Наиболее вероятно, что основанием В1, отрывающим С-а-протон (II), является е-аминогруппа Lys257 [10]. Общий кислотный катализ на стадиях IIIb-»IIIc-»IV осуществляется гидроксильной группой остатка Туг71, которая переносит протон в СГ-положение фенольного фрагмента [И]. Остаток Arg381 способствует отрыву протона от гидроксильной группы фенола, выполняя, таким образом, роль основной группы [10], а остаток Thrl24, находящийся на расстоянии водородной связи от фенольной группы субстрата, скорее всего, служит для сохранения выгодной ориентации фенольного кольца для успешного протекания реакции р-элиминирования [12].

В 1994 г. была решена трехмерная структура холофермента ТФЛ из Citrobacter intermedins с разрешением 2.7 А [13], позволившая выявить аминокислотные остатки активного центра, которые играют важную роль в связывании кофермента. Некоторые из них представлены на рисунке 1.

В целях детального выяснения роли остатков Asp214 (взаимодействует с атомом N(1) пиридинового кольца пиридоксаль-Р), Ser254 (взаимодействует с одним из атомов кислорода фосфатной группы пиридоксаль-Р) и ArglOO (образует две водородные связи с фосфатной группой кофермента) [8] в связывании кофермента и механизме каталитического превращения, осуществляемого тирозин -фенол-лиазой, в данной работе были изучены свойства их мутантных форм: Asp214Ala, Asp214Asn, Ser254Ala, Ser254Cys и ArglOOThr.

PLP

Рисунок 1. Схема расположения некоторых ключевых остатков кофермент-связывающего центра тирозин - фенол-лиазы относительно пиридоксаль-Р.

NHArg381

NHArg381

I I

-HOThrl24 bi:h

CH^ ^COO"

- пируват

- ИОН аммония

H внутренний альдимин, Я.=420 нм

NHArg381 внешний альдимин, Х=420 нм

Lys257NH

00

Н аминоакрилат кето-хиноидныи интермедиат хиноидныи интермедиат, к=500 нм

Схема 2. Механизм реакции р-элиминирования L-тирозина.

Обзор литературы

Выводы

Мутантные формы тирозин - фенол-лиазы, содержащие замены Asp214Ala, Asp214Asn, Ser254Ala, Ser254Cys и ArglOOThr, получены в гомогенном виде. Исследованы кинетические и спектральные характеристики мутантных ферментов.

Показано, что ионной формой внутреннего альдимина холофермента дикого типа в присутствии катиона-активатора К+ является катионная форма. Установлено, что замена катиона К+ на Na+ приводит к понижению величины рКа внутреннего альдимина.

Замена остатка аспарагиновой кислоты 214 на аспарагин или аланин приводит к понижению величины рКа N1 атома азота кофермента и, как следствие, к торможению ферментативной реакции в основном на стадии отрыва С-а-протона из внешнего адьдимина.

Водородная связь между гидроксильной группой серина 254 и фосфатной группой пиридоксаль-Р необходима для обеспечения оптимальной конформации активного центра тирозин - фенол-лиазы на ключевых стадиях реакции p-элиминирования - стадии отрыва С-а-протона и стадии элиминирования ароматического фрагмента. Водородные связи, образуемые боковой группой и атомом азота основной цепи остатка аргинина 100 с атомами кислорода фосфатной группы кофермента, вносят вклад в поддержание реакционноспособных конформаций внутреннего и внешнего альдиминов тирозин - фенол-лиазы и хиноидного интермедиата.

1. Birkhauser Verlag, Basel/Switzerland. 14 15 Мецлер Д. Биохимия. М., «Мир», 1

2. Браунштейн, А. Е., Шемякин, М.М. (1953). Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. Биохимия, т. 18, с. 393-411. 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Metzler D.E., Ikawa М., Snell, Е.Е. (1954). А general mechanism for vitamin Вбcatalysed reactions. J. Am. Chem. Soc, v. 76, p. 648-

3. Christen P., Metzler D.E. (1985) in Transaminases, John Wiley Sons. New York. Futuki Т., Kagamiyama H., Soda K., Wada H. (1990) in Compounds as Cofactor, Pergamon Press, Oxford. Marino G., Sannia G., Bossa F. (1994) in Biochemistry of Vitamin B6 and PPQ, Birkhauser Verlag Basel, Switzerland. Hayashi H., Wada H., Yoshimura Т., Esaki N., Soda K. (1990) Recent topics in pyridoxal 5-phosphate enzyme studies. Annu. Rev. Biochem. 59, 87-

4. John R.A. (1995) Pyridoxal phosphate-dependent enzymes Biochem. Biophys. Acta 1248, 81-

5. Dietrich J. (1992) Tyrosine aminotransferase: a transaminase among others? Cell. Mol. Biol. 38,95-

6. Hayashi H. "Pyridoxal enzymes: mechanistic diversity and uniformity" (1995 J. Biochem. 118,463-

7. Jansonius J.N. (1998) Structure, evolution and action of vitamin B6-dependent enzymes. Curr. Opin. Struct. Biol, 8, 759-769. 109

8. Parsot С (1987) A common origin for enzymes involved in the terminal step of the threonine and tryptophan biosynthetic pathways. Proc. Nat.I Acad Sci. USA 84, 5207-5210. Ill

9. Adams M.J., Ford G.C., Koekoek R., Lentz P.J., McPherson A, Rossmann M.G., Smiley I.E., Schevitz R.W., Wonacott A.J. (1970) Structure of lactate dehydrogenase at 2.8 A resolution. Nature, 227, 1098-1103. 67 Okamoto A., Higuchi Т., Hirotsu K., Kuramitsu S., Kagamiyama H. (1994) X-ray crystallographic study of pyridoxal 5-phosphate-type aspartate aminotransferases from Escherichia coli in open and closed form. JBiochem (Tokyo), 116,95-107. 113

10. Ziak M., Jaussi R., Gehring H., Christen P. (1990) Aspartate aminotransferase with the pyridoxal-5-phosphate-binding lysine residue replaced by histidine retains partial catalytic competence. Eur. J. Biochem., 187,329-333. 87 Malashkevich V.N., Jager J., Ziak M., Sauder U., Gehring H., Christen P., Jansonius J.N. (1995) Structural basis for the catalytic activity of aspartate aminotransferase K258H lacking the pyridoxal 5-phosphate-binding lysine residue. Biochemistry, 34,405-414. 115

11. Biochemistry, 37, 1065310659. 137 Sun S., Toney M.D. (1999) Evidence for a two-base mechanism involving tyrosine-265 from arginine-219 mutants of alanine racemase. Biochemistry, 38, 4058-4065. 138 Furbish F.S., Fonda M., Metzler D.E. (1969) Reaction of apoaspartate aminotransferase with analogs of pyridoxal phosphate. Biochemistry, 8, 51695180. 139 140 Fonda M.L., Auerbach S.B. (1976) The interaction of pyridoxal phosphate with aspartate apoaminotransferase. Biochim. Biophys. Acta., 422,38-

12. Smith D.L., Almo S.C, Toney M.D., Ringe D. (1989) 2.8-A-resolution crystal structure of an active-site mutant of aspartate aminotransferase from Escherichia coli. Biochemistry, 28, 8161-8167. 156 Tunnicliff G. (1980) Essential arginine residues at the pyridoxal phosphate binding site of brain gamma-aminobutyrate aminotransferase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 97, 1024-1030. 122

13. Tanizawa K., Miles E.W. (1983) L-serine binds to arginine-148 of the beta 2 subunit of Escherichia coli tryptophan synthase. Biochemistry. 22, 3594-3

14. Kazarinoff M.N., Snell E.E. (1976) D-Serine dehydratase from Escherichia coli. Essential arginine residue at the pyridoxal 5-phosphate binding site. J. Biol. Chem.. 251, 6179-61S2.. 164 Schnackerz K.D., Feldmann K., Hull W.E. (1979) Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance study of D-serine dehydratase: pryridoxal phosphate binding site. Biochemistry. 18, 1536-1539. 165 166 Schnackerz K.D., Feldmann K. (1980) Biochem. Biophys. Res. Commun.. 95, 1832-1

15. Swindells M.B. (1993) Classification of doubly wound nucleotide binding topologies using automated loop searches. Protein Sci., 2, 2146-2

16. Muro Т., Nakatani H., Hiromi K., Kumagai H., Yamada H. (1978) Elementary processes in the interaction of tyrosine phenol lyase with inhibitors and substrate J. Biochem. (Tokyo), 84, 633-640. 185 186 187 188 189 Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T

18. Peterson E.A., Sober H.A. (1954) Preparation of crystalline phosphorylated derivatives of vitamin B6. J. Amer. Chem. Soc. 16, 169-

19. Scatchard G. (1950) Ann. N. Y. Acad. Sci. 51,

20. Siano D.B., Metzler D.E. (1969) Band shapes of the electronic spectra of complex mo\QCM\QS.J.Chem.Phys., 51, 1856-1

21. Metzler D.E., Harris СМ., Johnson R.J., Siano, D.B. (1973) Spectra of 3hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria Biochemistry, 12,5377-5392. 190 Metzler СМ., Metzler D.E. (1987) Quantitative description of absorption spectra of a pyridoxal phosphate-dependent enzyme using lognormal distribution curves Anal. Biochem., 166,313-327. 191 192 193 Morino Y., Snell E.E (1970) Tryptophanase {Escherichia coli B). Methods Enzymol. 17A, 439-

22. Березин И.В., Клесов A.A., (1976) Практический курс химической и ферментативной кинетики.. Изд. Московского университета, Москва. Faleev N.G., Ruvinov S.B., Demidkina T.V„ Myagkih I.V., Gololobov M.Yu., Bachmutov V.I., Belikov V.M. (1988) Tyrosine phenol-lyase from Citrobacter 125

23. Wiley-Interscience, NY, USA. 205 Фалеев Н.Г., Рувинов СБ., Демидкина Т.Н., Мягких И.О., Гололобов М.Ю. (1988) Взаимодействие тирозин фенол-лиазы из Citrobacter intermedius с аминокислотами 206 и их производными: факторы определяющие эффективность связывания. Молек. Биол., 22,249-