Исследование пространственной организации и структурно-функциональной взаимосвязи тирозин-фенол-лиазы из ERWINIA HERBICOLA тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. A.B. ШУБНИКОВА

РГ6 0/1

? ■

На правах рукописи

ПЛЕТНЕВ Сергей Владимирович

УДК 548.737

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ВЗАИМОСВЯЗИ ТИРОЗИН-ФЕНОЛ-ЛИАЗЫ ИЗ ERWIN'¡А HERBICOLA.

01.04.18 - Кристаллография, физика кристаллов

Автореферат диссертация на соискание ученой степенн кандидата физико-математических наук

Москва 1997 г.

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знаменн Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Э.Г. Арутюнян

Официальные оппоненты: доктор химических наук, чл.-корр. РАН

С.Н. Кочетков

кандидат физико-математических наук C.B. Никонов

Ведущая организация: Институт Молекулярной Генетики РАН

Зашита диссертации состоится 1997г. в "/[ 2. " на

заседании диссертационного совета Д.002.58.01 Института кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

Автореферат разослан " f - СШТЛ/рЛ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

В.М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одну из ключевых ролей в живой природе играют белки, регулирующие основные процессы жизнедеятельности. Сюда относится осуществление разнообразных каталитических, транспортных, иммунологических, генетических и других функций.

К числу исключительно важных белковых объектов относится большая группа пиридоксаль-5'-фосфат (PLP) зависимых ферментов, регулирующих многочисленные процессы метаболизма аминокислот. В последнее время объем исследований этих ферментов постоянно растет^ Это связано прежде всего с тем, что наряду с академической ценностью этих исследований, связанной с выяснением особенностей механизма метаболизма клетки, что само по себе имеет выход в прикладную медицину и фармацевтику, они имеют и важное прикладное значение. Реакции, катализируемые пиридоксалевыми ферментами обратимы, поэтому их можно использовать в качестве высокоэффективных катализаторов для получения сверхчистых препаратов аминокислот и других соединений, являющихся субстратами этих белков. Разработка таких биотехнологий важна для химической и пищевой промышленности.

Цель работы. Основной задачей работы явилось изучение методами белковой кристаллографии пространственной организации и структурно-функциональной взаимосвязи одного из представителей пиридоксаль-5'-фосфат зависимых ферментов- тирозин-фенол-лиазы (TPL) из Erwinia herbicola.

Научная новизна работы. Впервые на атомном уровне определены пространственные структуры тирозин-фенол-лиазы из Erwinia herbicola в ano и холо форме, а также в комплексе с моделирующим кофемент-субстратный интермедиат квазисубстратом- N-(5'-фосфопиридоксил)-Ь-тирозином (РРТ) при разрешении 2.4, 2.7, 2.0 Á соответственно. Проведен детальный анализ вторичной, третичной и четвертичной структур выбранных моделей, изучены стереохимические

особенности активного центра и на основе полученных результатов предложена пространственная картина механизма катализа.

Практическая ценность работы заключается в том, что полученные результаты позволили объяснить отдельные аспекты каталитического действия фермента и составили необходимую структурную базу для более углубленного изучения молекулярных основ его биологического поведения, а также проведения белкопо-инженерных работ по созданию высокоэффективных ферментов с заданными свойствами для целей практической медицины, химической и пищевой промышленности.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, основных результатов и списка литературы. Она изложена на 120 страницах, содержит 40 рисунков и 15 таблиц.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на двух международных и одной российской конференциях. Работа получила I премию на молодежном конкурсе научных работ Института Кристаллографии РАН в 1997 г.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. В данном разделе обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи, сформулирована цель работы и кратко описана структура диссертации.

Глава 1. Структурно-функциональные отношения пиридоксаль-5'-фосфат зависимых ферментов.

В этой главе по литературным данным дана классификация РЬР-зависимых ферментов, представлено описание их пространственной организации во взаимосвязи с функциональными свойствами, а также сделан сравнительный анализ известных третичных структур.

1.1 Большинство РЬР-завнснмых ферментов может быть разделено по гомологии аминокислотных последовательностей на три различных семейства а, р и у, отличающихся локальным местом проявления каталитического действия- региоспецифичностью. Ферменты а семейства преимущественно катализируют превращения аминокислот, при которых ковалентные изменения происходят вокруг атома углерода с аминогруппой, образующей альдиминную связь с кофактором. Как правило это а-углеродный атом субстрата.

а семейство самое многочисленное. Типичными его представителями являются глицин гидроксиметилтрансфераза, катализирующая реакцию альдолыюго расщепления, большинство аминотрансфераз, аминокислотные декарбоксилазы группы II, а также триптофаназа и тирозин-фенол-лиаза, которые в основном катализируют реакцию р-элиминирования, присущую ферментам р семейства и ряд других ферментов.

Ферменты, включающие два других семейства катализируют ковалентные превращения по р и у-углеродным атомам боковой цепи. Они не столь многочисленны, р семейство включает ряд дегидратаз и синтаз, катализирующих реакции р-замещения и р-элиминироваиия. К у семейству относятся лиазы, катализирующие реакции у-замещения и у-элиминирования.

Гомология аминокислотных последовательностей ферментов внутри каждого семейства сравнительно невысока, однако все они обладают сходными структурными чертами, включая консервативное расположение активного центра и пиридоксаль-5'-фосфат связывающего остатка- лизина. В а и у семействах такой каталитически активный лизин располагается на участке 209-258, в то время как в р семействе он находится ближе к Ы-концу белковой цепи в районе 41-118. Такое различие показывает, что Р семейство эволюционно не связано ни с а, ни с у семействами. Дополнительным доказательством, подтверждающим этот вывод является полное несоответствие трехмерных структур аспартат аминотрансферазы, фермента а семейства, и Р субъединицы

триптофан синтазы, принадлежащей к Р семейству. Необходимо отметить, что не все В^-зависимые ферменты,,можно отнести к какому либо из трех семейств. Не поддаются классификации, например, алапни раце.мала, не принадлежащие к группе И декарбоксилазы и селеиоцистеин еннтаза. Эти ферменты, возможно, представляют другие неизвестные до с их пор семейства.

К настоящему времени методами белковой кристаллографии установлены пространственные структуры 12 функционально разных ферментов, использующих пиридоксаль фосфат в качестве кофактора: а семейство: аспартат аминотрансфераза (см. например [1]), ш-аминокислотная: пируват аминотрансфераза [2], фосфосерин аминотрансфераза [2], 2,2-диалкилглнцин декарбоксилаза [3], триптофаназа [4], тирозин--фенол-лиаза [5];

Сравнительный анализ показывает, что как четвертичная структура, так н доменная организация мономеров у РЬР-зависимых ферментов могут сильно отличаться. Однако топология трехмерной укладки полипептиднои цепи в кофермент-связывающем домене для всех изученных белков этого семейства отличается лишь в деталях. Р семейство: триптофан синтаза [6|;

белки, не принадлежащие какому либо семейству: глицин дегидрогеназа [7|,. гликоген фосфорилаза [8|, аминотрансфераза О-аминокислот [9], орпитин декарбоксилаза [10], 2-амино-гексано-6-лактам рацемаза [11].

Третичные структуры ферментов- членов у семейства пока еще не известны.

Глава 2. Экспериментальная часть.

В главе II представлена экспериментальная часть работы. Изложены подходы к решению поставленных биохимических и структурных задач, методики подготовки объектов, проведения биохимических и рентгеновских экспериментов.Описан способ решения фазовой проблемы и представлены результаты кристаллографического уточнения исследуемых структур.

2.1 Выращивание клеток культуры Erwinia herbicola (АТСС 21434) проводилось по методике [12]. Использованная среда дополнительно содержала 0.5% лактата калия н позволяла получать до 5.5?о целевого фермента от общего количества белка в клеточном экстракте. Разработанная многостадийная процедура выделения и очистки фермента позволила получить гомогенный высокоактивный фермент с высоким выходом и удельной активностью (3.09 ед/мг) более чем в три раза выше полученной по известной ранее схеме [13].

Кристаллизация тирозин-фенол-лиазы проводилась методом "висячей капли" путём диффузии паров растворителя через газовую фазу. Кристаллизация ano и холо форм, а таже комплекса с квазисубстратом-- Ы-(5'-фосфопиридоксил)-Ь-тирозином проводилась соответственно из растворов KCl, (NH4)2S04 и монометилового эфира ПЭГ-5000 в присутствии моновалентных катионов, являющихся активаторами фермента.

2.2 Интенсивности дифракционных отражений с кристаллов ano, холо и комплексной форм фермента были измерены на синхротронных станциях в Гамбурге, Дарсбери и на автодифрактометре R-AXIS до разрешения 2.4, 2.7, и 2.0 Á соответственно (табл. 1). Сбор данных с кристаллов апофермента и РРТ комплекса проводились при Т=120°К (-153°С).

2.3 Пространственная структура всех трех кристаллических форм тирозин-фенол-лиазы была решена методом молекулярного замещения по программе AMoRe [14]. Для определения структуры холоформы TPL из Erwinia herbicola были использованы координаты холоформы тирозин—фенол-лиазы из Citrobacter freundii. Уточненная атомная модель холо-TPL явилась исходной при последующем определении структур апофермента и РРТ-комплекса. Уточнение пространственных структур- выполнено с помощью програмного комплекса ССР4 [15] с применением интерактивных графических программ FRODO [16] и О [17] (табл. 2).

Таблица 1

Кристаллографические н экспериментальные данные

Данные Апо Холо РРТ

фермент фермент комплекс

Характеристики кристаллов:

Пространственная группа Р6322 Р6322 Р2|2|2|

Параметры элементарной ячейки:

а(А) 145.5 144.6 111.8

в(А) 145.5 ' 144.6 158.3

с(А) 171.5 176.0 202.4

а(град) 90 90 90

Р(град) 90 90 90

7(град) 120 120 ' 90

г 12 12 32

Число кристаллографически

независимых молекул

(субъединиц) 1/4 (1) 1/4 (1) 2 (8)

Условия проведения

реитгеноструктурного эксперимента:

Количество кристаллов 1 1 2

Температура эксперимента (°К) 120 293 120

Рабочая длина волны (А) 1.13 0.99 1.54

Интервал сканирования (град) 0.70 0.65 0.25

Время экспозиции одного

изображения (мин) 2 2 25

Суммарный интервал поворота

(град) 90 90 110

Характеристики наборов

экспериментальных данных:

Разрешение (А) 19.7-2.4 10.0-2.7 39.8-2.0

Число независимых отражений 40474 29406 214918

Общая полнота набора (%) 95.5 98.9 89.0

Полнота набора в последнем 0.1А

слое (%) 95.4 99.8 56.2

Ксим 7.5 9.6 6.5

Статистика экспериментального

набора (%)

1>3<у 78.3 78.3 63.9

/> сг 83.1 88.1 76.4

Таблица 2

Статистика уточнения

Статистические данные Апофермент Холофермент РРТ-комплекс

Содержание в независимой

части ячейки (остатков) 1x456 1x456 8x456

Число атомов а модели:

Неводородные атомы

белка 3602 3573 28692

атомы воды 363 203 3402

ионы 1 (К*) 1 (ЫН,+) 8 (1С)

Разрешение (А) 19.7-2.4 10,0-2.7 39.8-2.0

Число независимых

отражений 40474 29406 214918

Стандартный Д-фактор Со) 20.2 17.0 20.6

Свободный И-фактор (%)

(по 5% данных) 23.5 20.7 27.2

Среднее значение В

фактора (А2):

все атомы белка 47.0 37.6 19.3

основная цепь 46.7 35.8 17.3

боковые цени 50.0 40.3 21.3

молекулы воды 55.1 46.0 31.2

ИМБИ (А):

длин связей 0.016 0.015 0.015

растояний 1-3 0.042 0.040 0.042

растояний 1-4 0.046 0.051 0.046

плоских групп 0.013 0.015 0.014

хиральных объёмов 0.162 0.205 0.154

Статистика распределения

двугранных углов остатков

на карте Рамачандрана (%)

в разрешенных

областях 89.1 89.8 91.8

в дополнительно

разрешенных областях 10.4 9.6 8.0

в условно разрешенных

областях 0.5 0.5 0.2

Глава 3. Пространственная организация тирозин--феиол-лиазы (Erwinia herbicola).

В заключительной главе изложены структурные результаты работы. Подробно опнеаны установленные пространственные организации фермента в ano и холоформе, а также в комплексе с квазнсубстратом. Проведен анализ структурно-функциональных взаимосвязей и на основе полученных структурных данных предложена стереохнмнческая гипотеза механизма каталитического действия фермента.

3-1 Тирозин--фенол-лназа в апоформе представляет собой компактное тетрамерное образование (рис. 1) из двух каталитически активных димеров, стабилизированное системой водородных связей и гидрофобных взаимодействий в двух протяженных межсубъединичных областях. При этом в тетрамерной структуре на долю поверхности экранированной от окружающей среды приходится 28% общей площади четырех составляющих мономеров. Структура мономера (рис. 2, 3), включающая 17 ос-сниралеи н 18 р-сегментов, состоит из двух доменов, малого и большого (192 и 253 остатков соответственно), соединенных гибким нерегулярным участком 48-57 и шарнирным сочленением 311. В оспоие пространственной организации большого домена лежит семнсегментный р-слой смешанного типа, прикрытый с обеих сторон а-сниралями. В малом домене основной четырехссгментный антипараллельный р-слой заметно скручен. Он защищен а-спиралями лить с o/uioi'i стороны. Другая же сторона этого (¡-слои ограничивает эллипсоидальную полость активного центра, расположенную между доменами. Эта полость выстлана боковыми цепями аминокислотных остатков, относящихся к элементам (55, рб, Р8, р9, а4, а5 большого домена. Боковые группы Туг71 и Туг291 большого домена соседней субъединииы каталитически активного димера также входят в состав активного центра. Между субъединицами каталитически активного димера расположены два иона связанные молекулярной осью

симметрии второго порядка (рис. 4). Они координированы

Рис. 1 Стереоизображение структуры тетрамера тирозик-фенол-лиазы вдоль одной из молекулярных осей второго порядка. Две другие ос» расположены в плоскости рисунка. Вертикальная ось второго порядка связывает субъеднннцы каталитически активного димера.

Рис. 2 Стереоизображение хода полипептидной цепи в мономере тирозин—фенол-лиазы в апоформе. Участки 1-47 и 312-456 формируют малый домен структуры; 58-310- большой домен. Участок 48-57 и остаток рЗН образуют переходные участки между доменами. Активный центр фермента расположен в районе остатка К257.

Большой домен

Рис. 3 Топологическая схема пространственной укладки полипсптнлной цепи т1фозин--феиол-лиазы.

и

карбонильными группами остатков &у52 и А5п262 одной субъедшпщы, а также карбоннлыюй и карбоксильной группами остатка С1иб9 соседней субъедипины. В координационную сферу этих ионов входят также три молекулы воды, одна из которых имеет Н-связь с Ьу5256. который в свою очередь через другую молекулу воды координирует фосфатную группу кофактора.

Рис. 4 Структура координационной сферы иона К* в апоформе тирознн--фенол-лиазы.

3.2 Структура холоформы тирозин-фенол лиазы в комплексе с ионами NH4* близка к структуре апоформы фермента, но не идентична. Связывание кофактора-- пирндоксаль-З'-фосфата в холо-TPL приводит к сближению малого и большого доменов. После совмещения больших доменов амо и холо форм TPL методом наименьших квадратов среднеквадратичное отклонение Са атомов у больших доменов составило 0.74 Á, а у малых доменов 1.44 А. Молекула кофактора образует через атом С4' внутреннюю альлнминную связь с Lys257 (рис. 5, табл. 3). Пнрплшювое кольцо расположено параллельно Р1\с123. Это стэкинг-взанмодсиствне в сочетании с другими гидрофобными взаимодействиями н водородными связями (N (PLP) - Об (Asp214); ОН (PLP) - N'r| (Аг,ц217)] стабилизируют положение ароматической части молекулы

кофактора Фосфатная группа расположена вблизи Ы-конца спирали аА и образует водородные связи с атомам» азота основной цепи С1у99 и Аг^ЮО а также с боковыми цепями остатков Азп98, Arg100 и 8ег25-1. Положение и координация нона аммония в холоформе такие же, как п у нона калия и апоформе.

Рис. 5 Стереоизображение активного центра холофермента тирозин-фенол-лиазы. Остатки, связывающие PLP кофактор-- N98, G99, R100, F123, D214, R217, S254 и К257; остатки, существенные для катализа-- S51, Y71, К257, R381 и R404.

3.3 Комплекс тпрознн-фенол-лназы с квазисубстратом- N-(5'-фосфо|1прндокснл)-Ь-Т||рознном

кристаллизуется с двумя тетрамернымн молекулами в асимметрической части элементарной ячейки (ABCD и EFGH). Пространственные организации мономеров в тетрамерном квазисубстратном комплексе в целом очень близки как между собой, так и к таковым в ano и холоформе. Заметное отличие в относительной ориентации малого и

о

большого доменов обнаруживает лишь одна субъедишша (В п 10 в каждом из тетрамеров. Субъедшшиы комплекса п холофермсмта, совмещенные по Ссх атомам больших доменов, характеризуются среднеквадратичными отклонениями Са атомов больших доменов около 0.5 А. При этом, различие в положении Са атомов малых доменов в субъеднннцах В и Н составило -3.0 А и для остальных -0.6 А. Анализ карт электронной плотности в активных центрах комплекса показал, что в субъеднннцах В н Н, по сравнению с остальными субъедпницами, молекула квазнсубстрата имеет другую конформащио, отличающуюся взаимной ориентацией фенольного и пиридинового колец (рис. 6 и 7, табл. 4).

В субъединице В (Н) тетрамера плоскость фенольного кольца молекулы квазисубстрата перпендикулярна плоскости пиридинового кольца. В остальных субъединицах А, С, О (Е, Р, О плоскости этих колец находятся под углом -23°.

Окружение пиридоксаль-фосфатного фрагмента квазнсубстрата, одинакопо во всех субъеднннцах комплекса и такое же, как в холоформе тирозпн-фенол-лиазы. Окружение тнрозиновон части квазнсубстрата в двух ориентаниях отличается.

Рис. 6 Стереоизображение структуры активного центра РРТ-комплекса в субъединице В (Н) тирозин-фенол-лналы. совмещенной с синтезом электронной плотности с коэффициентами (2Ро-Рс) и срезкой 2<тр. Конформация квазисубстрата отвечает начальной стадии каталитического акта.

Рис. 7 Стереоизображение структуры активного центра РРТ-комнлекса в субъединицах А, С, D (Е, F, G) тирозин-фенол-лиазы, совмещенной с синтезом электронной плотности с коэффициентами (2Fo-Fc) и срезкой 2ар. Конформация квазисубстрата отвечает завершающей стадии каталитического акта.

Таблица 4

Водородные связи, стабилизирующие положение квазисубсграта- N-(5'-фосфопиридоксил)-[~-тирознна (РРТ) в активных центрах субъединиц В и А комплекса тнрознн-фенол-лиазы (TPL)

Атом РРТ Атом TPL Расстояние (A) Конф I (В) Конф II (A)

ОР2 (OD1) N98 3.21 -

ОР2 (NH2) RtOO 3.05 2.89

ОР2 (NZ) К257 - 3.10

ОРЗ (ODD N98 - 3.21

ОРЗ (N) G99 - 3.16

ОРЗ (N) R100 2.75 2.61

ОРЗ (NE) R100 2.93 3.01

ОР4 (NZ) K257 3.03 3.22

ОР1 (N) G99 2.60 2.67

ОР1 (OG) S254 2.71 2.61

N1 (ODD D214 3.01 -

N1 (OD2) D2I4 2.67 2.61

ОЗ (ND2) N185 2.86 2.84

ОЗ (NHD R217 3.00 -

ОН (NE) R381 - 2.60

ОН (NH2) R381 - 2.72

О (OG1) T49 2.65 2.81

ОТ (OG1) T49 - 2.96

ОТ (OG) S51 - 2.63

ОТ (NHD R404 3.06 -

В конформацин с взаимно перпендикулярной ориентацией фенольмого и пиридинового колец [конф. I; В (Н)| положение тирознновой части фиксировано водородными связями между карбоксильной группой квазпеубстрата и боковыми цепями Arg404 и Thr49 фермента. Данная конформация характеризуется также наличием гидрофобных взаимодействий фенольных колен РРТ и Туг71. Вторая конформация квазисубстрата с приблизительно параллельной ориентацией фенольного и пиридинового колец, обнаруженная в субъединицах [конф. II; А, С, D (Е, F, G)l, стабилизируется водородной связью между ОН группой его тирозинового фрагмента и NeH группой Arg381.

3.4 Обнаруженный в структуре TPL ион К+ координирован атомами кислорода карбонильных групп Gly52, Asn262 и трех молекул воды и стабилизирует петли 48-57 и 256-263, в состав которых входит ряд аминокислот, боковые группы которых взаимодействуют с молекулой квазисубстрата. Это объясняет факт снижения каталитической активности тирозин-фенол-лиазы в отсутствии ее активаторов- моновалентных катионов [18]. Учитывая высокую концентрацию ионов К4" в клетках бактерии (-200 мМ) можно считать, что функционирующий в клетке фермент всегда включает нон К*.

Установленные структуры TPL позволяют описать основные информационные изменения в молекуле фермента на последовательных стадиях его функционирования, опираясь на известный из биохимии механизм реакции [19,20,21].

Субъединицы В (Н), с квазисубстратом в конформации I характеризуются максимальной сближенностью малого и большого доменов, приводящей к изоляции активного центра фермента от внешней среды. Эта конформация квазисубстрата отвечает, по-видимому, начальной стадии каталитического акта- (реакции а,(5-элиминирования), так как планарность C4-C4'-N-Ca группы и ортогональное расположение Ca-Н связи по отношению к пиридиновому кольцу почти точно имитируют "внешний" пльдпмип. Отрыв а-протона может быть осуществлен Lys257, что приводит к изменению конфигурации Са атома из тетраэдрическои в плоскую. ОН группа Serol, участвующая в

водородной связи с Lys257 также может выступать в роли инициатора реакции а.р-элиминирования.

Изменение конфигурации Ca атома при депротонировании сопровождается движением ароматической боковой цепи субстрата к фенольному кольцу Туг71, где протон ОН группы субстрата акцептируется феиолят-анионом Туг71. При дальнейшем синхронном движении обеих цепей Tyr7t отдает ранее акцептированный протон Су атому. Интересно отметить, что II и III стадия каталитического акта-денротонирование гидроксильного протона и протонирование Су атома субстрата могут быть осуществлены при участии единственной каталитической группы ОН Туг71.

С акцептированием протона геометрия валентных связей Су атома фенольного фрагмента изменяется из плоской в тетраэдрическую, что приводит приблизительно к взаимно параллельному расположению ароматических колец кофермент-субстратного интермедиата. Данное состояние, отвечающее завершающей стадии реакции может моделировать найденная в субъедшшцах А, С, D, (Е, F, G) конформация II квазисубстрата. Наличие водородной связи между ОН группой фенольного кольца квазисубстрата и Arg381 в данной конформании может моделировать стадию репротонирования фенолят-иона, образовавшегося в результате разрыва Cß-Cy связи.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Разработаны новые условия выделения и очистки тирозин-фенол-лназы из Erwinia herbicola, позволившие по сравнению с ранее действующей схемой, увеличить удельную активность препарата белка более чем в три раза.

2. Найдены условия кристаллизации и получены пригодные для рентгепоструктурного исследования кристаллы апо и холо форм фермента, а также его комплекса с квазисубстратом N-(5'-фосфопиридоксил)-Ь-тирозином.

3. Пространственные структуры выбранных моделей установлены методом молекулярного замещения и уточнены по наборам

экспериментальных дал::-;;'. - ^ггтгсгяисм "а. " . ' А .*:• конечных значений Я-факторов 20.2, 17.0 и 20.6/1 ссс'.:гтс;;г':э.

4. Проведен детальный анализ вторичной, третичной и четвертичной структур фермента.

5. Установлено, что тирозин —фенол-лназа представляет собой тетрамерное образование из двух каталитически активных димеров, стабилизированное системой водородных связей и гидрофобных взаимодействий.

6. Показано, что структура мономера, включающая 17 а-спиралей и 18 р-сегментов, состоит из двух доменов, большого и малого (253 и 192 остатков соответственно), соединенных гибким нерегулярным участком 48-57 и остатком 311. Активный центр фермента, располагается в эллипсоидальном углублении, выстланном обращенными в междоменную область боковыми цепями обоих доменов.

7. На основе анализа полученных структурных данных сделано предположение, что остатки Бег51 и А^404, наряду с другими установленными ранее каталитически значимыми остатками, играют важную функциональную роль.

8. Выявлены две основные конформации молекулы квазисубстрата, предположительно отвечающие начальной и конечной стадиям каталитического акта.

9. Связывание молекулы кофактора- пиридоксаль-5'-фосфата сопровождается сближением малого и большого доменов в среднем на 1.4 А. Связывание молекулы квазисубстрата (и, по-видимому, субстрата) приводит к дополнительному сужению междоменной щели с соответствующим относительным смещением доменов в среднем на 3.0 А.

10. Предложена модель основных конформационных изменений в структуре фермента при катализе.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Demidkina T.V., Antson А.А., Pletnev S.V., Harutyunyan E.H. "Tyrosine phenol-lyase: crystallisation of holoenzyme and of some enzyme-inhibitor complexes." Abstracts of International Conference "Crystal Growth of Biological Macromolecules", San Diego, California, USA, 1993.

2. S.V. Pletnev & E.G. Harutyunyan, "Tyrosine Phenol-lyase from Erwinia lierbicola: crystallisation of holo enzyme in complex with different monovalent cations." The Sixth International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules, Hiroshima, Japan, Ps-13A-16, 1995.

3. S.V. Pletnev, M.N. Isupov, Z. Dauter, K.S. Wilson, N.G. Faleev, E.G. Harutyunyan, T.V. Demidkina, "Purification and crystals of tyrosine phenol-lyase from Erwinia herbicola." Biochemistry and Molecular Biology International, 38, N1, 37-42, 1996.

4. C.B. Плетнев "Тирозин-фенол-лиаза из Erwinia herbicola: трехмерная структура апо, холо и квазисубстратной форм." Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов, Дубна- Москва, Россия, 1997.

5. С. Плетнев, А. Антсон, Н. Синицына, 3. Даутер, М. Исунов, Е. Хурс, Н. Фалеев, К. Вильсон, Г. Додсон, Т. Демидкина, Э. Арутюнян. "Кристаллографическое исследование тирозин-фенол-лиазы из Erwinia herbicola." Кристаллография, 42, N5, 865-876, 1997.

I|HTH?7SMAi2 jra r.SL=ATypA

1. Kirsch J.F., Eichele G., Ford G.C., Vincent M.G., Jansen:-: J.N., Gehring H., Christen P. (1984) /. Mol. Biol. 174, 497-525.

2. Enzymes Dependent on Pvridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactor (Fukui T., Kagamiyama H., Soda IC, Wada H.) (1990) Pergamon Press, Oxford.

3. Toney M.D., Hohenester E., Keller J.W., Jansonius J.N. (1995) J. Mol. Biol. 245, 151-179.

4. Isupov N1., Dementieva I., Zakomirdina L., Wilson K.S., Dauter Z., Antson A.A., Dodson G.G., Harutyunyan E.G. (1994) In: Biochemistry of Vitamin B6 and PQQ ( Marino G., Sannia G & Bossa F., eds) Birkhauser Verlag Basel/Switzerland.

5. Antson A.A., Demidkina T.V., Gollnick P., Dauter Z.. VonTersch R.L., Long J., Berezhnoy S.N., Phillips R.S., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. (1993) Biochemistry 32, 4195-4206.

6. Hyde C.C., Ahmed S.A., Padlan E.A., Miles E.W., Davies D.R. (1988) J. Biol. Chem. 263, 17857-17871.

7. Pares S., Cohen-Addad C., Sieker L., Neuburger M., Douce R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 4850-4853.

8. Mitchell E.P., Withers S.G., Ermert P., Vasella A.T., Garman E.F., Oikonomakos N.G., Johnson L.N. (1996) Biochemistry 35, 7341-7355.

9. Sugio S., Petsko G.A., Manning J.M., Soda K., Ringe D. (1995) Biochemistry 34, 9661-9669.

10. Momany C., Ernst S., Ghosh R., Chang N-L, Hackert M.L. (1995) J. Mol. Biol. 252, 643-655.

11. Neidhart D.J., Howell P.L., Petsko G.A., Powers V.M., Li R., Kenyon G.L., Gerlt J.A. (1991) Biochemistry 30, 9264-9273.

12. Demidkina T.V., Myagkikh I.V., Faleev N.G., Belikov V.M. (1984) Biokhimiya 49, 32-37.

13. Kumagai H., Kashima N.. Torii H., Yamada H., Enei H., Okumura S. (1972) Agr. Biol. Chem. 36, 472-482.

14. Navaza J. (1994) Acta Crystallogr. A50, 157-163.

15. Collaborative Computational Project, Number 4, SERC Daresbury Laboratory (1994) Acta. Cryst. D50, 760-763.

16. Jones T. (1978) J. Appl. Crystallogr. II, 268-272.

17. Jones T., Zou Y., Cowan S., Kjeldgaard M. (1991) Acta Crystallogr. A47, 110-119.

18. Demidkina T.V., Myagkikh I.V. (1989) Biochimie 71, 565-571.

19. Faleev N.G., Ruvinov S.B., Demidkina T.V., Myagkikh I.V., Gololobov M.Yu., Bakhmutov V.l., Belikov V.M. (1988) FEBS Lett. 177, 395-401.

20. Faleev N.. Lyubarev A., Martinkova N.. Belikov V. (1983) Enzyme Microb. Techol. 5, 219-224.

21. Kiick D„ Phillips R. (1988) Biochemistry 27, 7333-7338.