Электронно-микроскопический исследование пространственной структуры некоторых белков тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А.В.ШУБНИКОВА

На правах рукописи

Ш Е Р М А Н МИХАИЛ БОРИСОВИЧ

УДК 548.737:537.533.35

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ

Специальность 01.04.18 - Кристаллография,

физика кристаллов

А вгореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамена Институте кристаллографии ям. А. В. Шубникова АН СССР

Научные руководители: академик АН СССР Б. К. ВайнштеИн чл. -корр. АН СССР Н. А. Киселев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А.А. Александров

кандидат физико-математических наук Г. В. Гурская

Ведущая организация : Институт белка АН СССР

Зашита диссертации состоится 1990 Г.

в } час. на заседании Ученого совета Д. 002. 58. 01 при Институте кристаллографии ин. А. В. Шубникова АН СССР по адресу: 117333, Москва, Ленинский проспект 59, Институт кристаллографии АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии АН СССР.

Автореферат разослан С_£->с^у-^^/гуЗээо г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физико-математических наук

В.М. Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Электронная микроскопия широко приценяется в исследованиях структуры биологических макромолекул и их агрегатов. В последнее время разрешение этого метода улучшается за счет уменьшения, лоз облучения препарата в микроскопе. Поэтому изучение поведения обьекта в процессе его облучения электронами и зависимости получаемых изображений от методики препарирования чрезвычайно важно при электронно-микроскопических исследованиях. Уменьшение дозы облучения приводит к снижению контраста изображения и усложнению обработки полученных изображений. Большое число исследований оканчивается построением пространственной модели исследуемого объекта, что оказывает существенную помощь в понимании механизма его функционирования и имеет большое прикладное значение.

Цель работы состоит в исследовании механизма негативного контрастирования биологических объектов, выяснении предельных возможностей этого метода по разрешению в- условиях малых доз облучения на принере структуры тонких кристаллов сериновой протеазы ( терми-тазы), а также в исследовании пространственной структуры кристаллических монослоев Iгидрогеназа из Jhiocapsa roseopersicina) я трубчатых кристаллов (тирозин - фенол-лиаза из Citrobacter intei— midius) ферментов.

Научная новизна роботы. Получены электронограммы высокого разрешения от мккрокрксталлов теркктазы. Обнаружена специфичность обычного негативного контрастирования, проявляющаяся при малых дозах облучения электронами. Показана возможность получения микрокристаллов производных термитазы при смешанном контрастировании заствором глюкозы с добавками солей тяжелых металлов. Исследована тространственная структура двух ферментов с использованием снимков : наклоном и изображений трубчатых кристаллов.

Практическая ценность работы заключается в том, что было ис-гледовано влияние облучения электронами на биологические объекты в шектроннон микросьопе. По сериям снимков с наклоном препарата в гикроскопе определена симметрия кристаллических монослоев и иссле-ювана пространственная структура бактериальной гидрогеназы из hiocapsa roseopersicina. По изображениям трубчатых кристаллов актериальной тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermidius осстановлена ее пространственная структура.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 10 Конг-ессе по электронной микроскопии (Гаага, 1982), на 5 конференции ирмы Филипс (Визеград, 1982), на 8-ой Европейской конференции по пектронной микроскопии (Будапешт, 1984), II Всесоюзном симпозиуме

по вычислительной томографии (Куйбышев, 1985), I Международной конференции по обработке изображений (Берлин, 1985), на конференция Скандинавских стран по электронной микроскопии (Упсала, 1989), на Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Сумы, 1982, Звенигород, 1986), на научных конкурсах ИК АН СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей.

Объен работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих 15 разделов, и выводов. Ее объем 126 страниц, в которые входят 1 таблица, 30 рисунков и список литературы (191 наименование).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Введение. Обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи, сформулирована цель работы.

Глава 1. состоящая из 5 разделов, написана по литературным данный.

Глава 1.1. Рассматривается формирование изображения в электронном микроскопе (для случая светлопольных изображений).

Электронная микроскопия привлекает исследователей, поскольку де-бройпевская длина волны электронов уже при ускоряющих напряжениях порядка 100 кв составляет О,037 Л, поэтому теоретически достижимое разрешение составляет сотые доли ангстрем. Но электронно-оптические системы обладают большими аберрациями, что приводит к ухудшению реального разрешения. Тем не менее, современные электронные микроскопы способны давать разрешение 1,5 + 2 А по кристаллической решетке. С использованием электронов в качестве частиц, формирующих изображение объекта, связан и ряд неудобств. Электроны очень сильно взаимодействуют с веществом, поэтому они могут просвечивать лишь очень тонкие объекты и в электронно-оптической системе должен быть высокий вакуум, чтобы исключить паразитные столкновения электронов освещающего пучка с атомами и молекулами остаточного газа.

Объекты в биологической электронной микроскопии макромолекул обычно достаточно тонки и слабоконтрастны. Изображение в ЭМ формируется за счет упруго рассеянных на веществе объекта электронов. Неупруго рассеянные электроны плохо фокусируются оптикой микроскопа и создают фон в плоскости изображения. В тонких объектах не происходит поглощения электронов. При прохождении их через вещество меняется лишь фаза волны, такие объекты называются фазовыми. В идеальном микроскопе, свободном от аберраций, тонкие фазовые объекты на видны, поскольку детекторы излучения реагируют не на

фазу, а на амплитуду волны. Для того, чтобы сделать фазовое изображение видимым, необходимо изменить фазу рассеянного излучения на гг/2. В этом случае за счет интерференции рассеянной и нерассеянной волн информация об объекте перейдет из фазы волнового фронта в его амплитуду, и в плоскости изображения возникнет видимое изображение объекта. После прохождения фазового объекта падающая волна Фоизмеияет свою фазу: Ф - $о-ехр( ¿а). При малых а

ехр( 1а) - 1 + 1а; (1)

^ о о о т

Из формулы (1) видно, что фазы } « <р отличаются на п/2, то есть вектор р (рассеянная волна) перпендикулярен (рис. 1).

Рис. 1. Взаимное расположение рассеянного и первичного излучения для слабоконтрастных фазовых объектов.

В реальном электронном микроскопе видимое изображение возникает за счет аберраций оптической системы микроскопа, в первую очередь дефокусировки и сферической аберрации объективной линзы микроскопа. Правда они неодинаково изменяют фазы волн для различных пространственных частот, что приводи г к искажениям изображения. Интенсивность в плоскости изображения описывается функцией

|Í(?')|Z - 1 - 2(sirtK) - 2u®?~l(cosiс) (2)

H(7t) - sin/c называют передаточной функцией фазового контраста, а Н(5<) - COSK - амплитудного контраста [I]. На самом деле зависимость Н (Й) более сложная, ее можно представить в виде

Н(Й) - А(Я)- (3)

J ^

Здесь А(к) - функция прозрачности диафрагмы, расположенной в задней фокальной плоскости:

" 1 О пои а > ama*' "max " Угловой размер диафрагмы; V н пах

3 .(h) - функции, описывающие огибающую передаточной функции,

N

Знак П означает произведение таких функций. D В.(Л) приводит к

>> 3

:паду передаточной функции, ее затуханию на высоких пространствен-aix частотах и реальному ограничению разрешения микроскопа. Пос-<ольку sin и cos функции осциллирующие, Н(к) может сильно исказить :пектр объекта. Для биологических объектов механизм образования юнтраста в основном фазовый, даже для контрастированных объектов 1мплитудный контраст составляет не более ЗОХ общего.

В главе 1. 2 рассматриваются вопросы радиационной стойкости

белков. Амплитуды рассеяния для электронов в 104 раз больше, чем для рентгеновского излучения. В результате взаимодействия с объектом происходит как упругое так и неупругое рассеяние электронов. Для элементов с малыми атомными номерами неупругое рассеяние преобладает, вызывая значительные повреждения вещества. Это в полной мере справедливо для биологических объектов, состоящих в основном из водорода, углерода, азота, кислорода. В настоящее время известно, что облучение электронами биологических объектов при комнатной температуре дозой 0,5 о/к2 уже приводит к существенному изменению их строения [2].

Для оценки радиационных повреждений объекта используют понятие критической дозы. Под критической понимается доза, облучение которой приводит к определенным структурный изменениям, значения которых могут быть объективно оценены тем или иным нетодом. Типичные значения критических доз для различных биологических объектов при комнатной температуре лежат в диапазоне О, 5 + 3 е/кг. При этом нуклеиновые кислоты и липидные мембраны обычно болоо стойки к облучению, чем белки, что связано с различием в их химическом составе.

Глава 1.3. Обзор методик негативного контрастирования биологических объектов. Негативное контрастирование позволяет просто и эффективно исследовать молекулы с низким и средним разрешением. Данные ЭИ негативно контрастированных препаратов дают надежные сведения о структуре нативных объектов до разрешений 20 А.

Первоначально при контрастировании суспензия частиц смешивалась с контрастером и мелкие капли этой смеси наносились на подложку с помощью пульверизатора. Несколько позже Хаксли и Зьюби [3] предложили наносить препарат на подложку с последующим нанесением на нее же контрастирующего вещества. Слой контрастера вокруг объекта предохраняет его от разрушения при обезвоживании. Простейшее представление о контрастировании дает модель, в которой не учитывается взаимодействие контрастера с обьектом и подложкой. При этом основную роль играют свойства контрастера (его способность "обрисовывать" рельеф частиц и проникать во внутренние полости объекта, его радиационная стойкость, способность рассеивать электроны). Контрастер, по сравнению с биологическими объектами, гораздо менее чувствителен к радиационным повреждениям. Вследствие этого структура комплекса "объект-контрастер" на уровне 20 Á разрешения существенно более стабильна под пучком, чем просто незащищенный высушенный объект. При более высоких разрешениях (6 + Ю А) влияние облучения даже на такой комплекс остается серьезной проблемой. Чтобы уменьшить влияние электронного пучка, было предложено

освешать объект минимальной дозой электронов, необходимой для засветки фотоматериала, а все рабочие операции по фокусировка, стиг-мированию объективное линзы и т.д., производить по соседних участкам сетки (методика минимальных доз облучения [4]). В методике минимальных доз облучения радиационную нагрузку на объект удается уменьшить до 10 + 20 е/Аг С в 10-25 раз).

В главе 1.4 рассмотрены альтернативные негативному контрастировании методики препарирования биологических объектов.

Разрешение, получаемое при негативном контрастировании образцов, все чаше перестает удовлетворять исследователей. Поэтону разрабатываются альтернативные методики препарирования биологических объектов, которые должны иметь достоинства метода негативного контрастирования и позволить улучшить достижимое разрешение деталей объекта. К ним относятся: использование влажных камер, замещение водного окружения объекта при высушивании небольшими нелетучими гидрофильными молекулами и сверхбыстрое охлаждение объектов в их натявном окружении, приводящее к их.витрификации.

Наиболее простым и достаточно эффективным является предложенное Анвином и Хендерсоном [2] замещение водного окружения объекта на пленке-подложке матрицей небольших гидрофильных молекул, в отлична от воды нелетучих. При его использовании критические дозы облучения очень малы, они составляют 0,5 + 1 е/Аг, контраст изображения исчезающе мал (меньше IX). Увеличить контраст изображений, толучаемых при применении данной методики, пытались за счет увели-1ения средней электронной плотности матрицы, заливая объекты не в i истые сахара, а в смесь глюкозы с тиоауроглхжозой. Имеется другая ¡озможность усилить контраст подобных изображений. Добавляя нега-■явный контрастер в раствор глюкозы, используемый для "заливки" >бъекта, можно также увеличить электронную плотность заливочной [атрипы и менять ее в гораздо большем диапазоне.

Работа с изображениями, полученными при малых дозах облучения репарата, предполагает их тщательную математическую обработку, тношение сигнал/шум на них очень мало, поэтому для выделения сигала на фоне шумов необходимо усреднять несколько тысяч или даже всятков тысяч элементарных изображений, что реально приводит к еобходимости работать с упорядоченным* объектами, когда уже на дном снимке удается набрать необходимую информацию.

Глава 1.5. Обзор методов трехнерной реконструкции.

Обычно биологические образцы в ПЭМ прозрачны для электронов, эоне того глубина фокуса микроскопа больше, чем их толщина. Поэто-7 такие изображения представляет собой двумерную проекцию объекта j направлению освещающего пучка электронов. В ЭМ изображении де-

тали объекта, расположенные на разных уровнях по Z (направление оптической оси микроскопа) проектируются в одну точку, что делает невозможным в общем случае получение трехмерной информации из одного снимка.

Трехмерную структуру можно расшифровать, получив изображения различных проекций объекта к объединив полученную информацию. Впервые задача реконструкции п-мерной функции по набору ее (п-1)-мерных проекций была поставлена и решена аналитически в 1917 году Радоном [5]. Сейчас исследования в этой области ведутся широко в самых разных областях, начиная от физической диагностики состояния плазмы, дефектоскопии и кончая медицинской томографией. Разработанные в настоящее время метода реконструкции основаны на обработке данных, представляющих собой распределение интегрального поглощения обьекта вдоль просвечивающего луча.

Набор проекций часто получают, наклоняя объект вокруг фиксированной оси, тогда все проектирующие направления перпендикулярны этому направлению, и задача трехмерной реконструкции распадается на ряд двумерных, когда требуется реконструировать ряд двумерных сечений объекта, перпендикулярных некоторой оси. Экспериментальные данные по разным причинам имеют ограниченное разрешение, часто сильно зашунлены. Обычно данные имеются в ограниченном диапазоне углов и количество проекций невелико, что связано в первую очередь с радиационной стойкостью объекта. Последнее обстоятельство может накладывать дополнительные ограничения на достижимое в реконструкции разрешение.

Глава 2. Описание методик, использованных в диссертации.

Глава 2. 1 Методика электронно-микроскопических исследований и электронографии микрокристаллов, а также методы обработки точечных электронограмм. Электронные кикрофотографии получали на микроскопах ЕМ-400 и ЕН-420, при обычном режиме съемки электронная доза при съемке негативно контрастированных препаратов составляла типичную величину 200 + 500 е/Аг. При получении электронограмм в режиме малых доз облучения препарата доза его облучения не превышала 0, 1 е/Лг. В работе использовалось стандартное негативное контрастирование различными солями тяжелых металлов, а также модифицированная методика негативного контрастирования и "заливки" объектов в глюкозу [2]. Упорядоченность объекта, или качество электронограмм, оценивали визуально на люминисцентном экране микроскопа, удовлетворительные экспонировали на фотоматериал, предварительно быстро перекрыв пучок над объектом и проведя все подготовительные операции.

Качество полученных изображений вначале оценивали визуально,

отобранные микрофотографии далее проверяли на оптячесном дифракто-метре и лучшие оцифровывали на автоматических микроденситометрах PDS 1010А или HDM 6. Электронограмкы оцифровывали на мякроденсито-метре PDS 1010А. Обработка электронограмм заключается в определении интегральных кнтенсивностей рефлексов и их индексации. В данной работе для обработки электронограмм было разработано специальное программное обеспечение, позволяющее обрабатывать цифровые электронограмкы большого размера с асимметрично меняющимся по полю фоном и количеством рефлексов до нескольких тысяч. Полный набор интенсивностей рефлексов для каждого кристалла получали объединением данных трех электронограмм, полученных при уменьшающихся экспозициях с данного кристалла, поскольку динамический диапазон фотоэмульсии слишком мал для регистрации сильно различающихся по яркости рефлексов. Каждая электронограмма обрабатывалась индивидуально, а затем данные шкалировали по перекрывающимся рефлексам и объединяли в единый набор. Интегральная интенсивность и координаты рефлексов вычислялись путем совмещения усредненного эмпирического профиля рефлекса с экспериментальным пиком и моделирования фона иинейнс меняющейся функцией двух переменных. Для уточнения параметров обратной решетки служили величины - координаты i-ro

i

эефлекса (наблюдаемые, или экспериментальные координаты). Искомые траметры г^, обращают в минимум функцию М 1

f = l(r° -г"), (4)

i = l Fi Fi

де N - число наблюдаемых пиков, а Гр вычисляются по формуле

= m-hF (5)

i i

(S) [В] - искомая матрица преобразования координат рефлексов

братной решетки (Йр ) в координаты пятен на цифровом изображении i

лектронограммы. Задача уточнения параметров обратной решетки кри-талла решалась методом наименьших квадратов. При обработке кор-вктировалась нелинейность отклика фотоэмульсии при больших зас-этках электронами.

Глава 2.2. Методы обработки изображений при трехмерной реконс->укции объектов по сериям изображений с наклоном.

Обработку начинали с изображений с нулевым наклоном. Получен-ie наборы (Л, к. А, ф) приводили к единому началу координат, [нимизируя £ £ |0hk - где <t>hk - фаза рефлекса (h.k). а

'к' ' РеФлекса (h'.k'l, связанного с Сh, к) операцией симметрии иной группы симметрии. Все наборы дифракционных данных, получен-е таким образом для нулевого наклона (z -О), объединяли а еди-

ный набор. После этого в каждой серии изображений к полученному базовому набору постепенно добавляли дифракционные данные для г* * I Первыми добавляли наборы с минимальными углами наклона, постепенно пополняя его данными со все большими наклонами, пока не исчерпывали все имевшиеся данные. Полученный трехмерный набор структурных факторов (Fjjjjj) (J " "индекс" по г*) подвергали обратному фурье-преобразованию, в результате чего получали трехмерную каргу оценки распределения плотности объекта. Полученную карту визуализировали либо по сечениям на экрана графического дисплея или на графопостроителе, либо строили псевдообъемную компьютерную модель поверхности объекта.

Глава 2.3 Описание объектов со спиральной симметрией, способов их образования и математическое описание их симметрии.

Какроиолекулярные образования со спиральной симметрией представляют собой прерывные спирали, в которых частицы как бы нанизаны

на непрерывную спираль. Такую спираль можно описать элементарным

2тт р

поворотом на угол кратный а = —, где И - — (здесь р и q - целые

И q

числа), и сдвигом на величину С' вдоль оси. Период спирали вдоль оси обозначают С. Возможен случай, когда частицы "нанизаны" на N-заходную спираль, тогда дополнительно к винтовому сдвигу структура обладает ось» вращения N-ro порядка.

Структура со спиральной симметрией может быть полностью описана параметрами р, q, N и С. Спектр такого объекта описывается функцией:

2 71

F,(R,«»f-) = I EJnM(2ffr0R)-e*P[in(tf + -)j-<5(Z - (6)

1 С In 2 С

где I - nq' + mp; n и in - целые; E, ф, 1 - цилиндрические координаты в обратном пространстве, JnN - функции Бесселя порядка Н; го - радиус спирали; q' - число витков, которое приходится на все заходы на период .спирали. После определения параметров спирали реконструкцию выполняют стандартными методами трехмерной реконструкции. В работе использован метод свертки.

Глава 3. Экспериментальная часть диссертации.

Глава 3.1 Описание результатов исследования термитазы из Thermoactinomyces vulgaris.

Одной из важных протеиназ является бактериальная сериновая протеаза - термитаза (ТМ) из термофильной бактерии Thermoactinomyces vulgaris (ЕС 3.4.21.14). Она представляет собой неталлосодер-жащий белок (2 атома Са/молекулу), с молекулярной кассой 32 КDa; в молекуле ТМ 279 аминокислотных остатка, по своей первичной структуре она близка к субтилизину ВРИ', имеет 41 У. одинаковых с ним аминокислотных остатков. ТМ представляет собой сериновую протеазу.

стабильную к воздействию высоких температур. ТИ легко кристаллизуется в виде тонких (толщиной а 400 - 2000 Л) пластинок (поперечные размеры их а Ю - 20 мкм), что очень удобно для электронно-микроскопических исследований. Микрокристаллы ТИ получали высаливанием раствора белка сульфатом аммония или просто упариванием исходного раствора на воздуха. Полученную суспензию наносили на сетки с угольной или полимерной пленкой-подложкой, а затем либо контрастировали различными контрастерами, либо "фиксировали" глюкозой.

Размеры элементарной ячейки кристаллов ТН составляют: а - 72,9; Ъ - 47,53? с - 64,05 А, пространственная группа

Кристаллы ТИ дают яркую дифракционную картину, легко наблюдаемую на экране микроскопа даже при малых дозах облучения. Высушивание кристаллов ТМ в присутствии глюкозы сохраняет их упорядоченность, что подтверждается большим дифракционным полем на электроно-граммах (видны рефлексы по крайней мере до 1/2 А"1). Такие элект-ронограммы получали при дозах, не превышающих О, 1е/Аг. Прямые измерения критической дозы для ТН дали значение 0,5 е/Аг.

Изображения микрокристаллов ТН, негативно контрастированных различными веществами, приведены на рис. 2 а - в. Изображения получены в стандартных условиях при дозах облучения порядка 100 ♦ * 500 е/А2. Как сами изображения, так и их оптические спектры (рис. 2 г - е), очень похожи друг на друга, несмотря на различие использованных контрастеров. По-видимому, такое сходство является следстпас« ДсдьеоЗ поты облучая«« препарата в кяжроскот. эпачи-

Рис. 2 Пзобрасоизя проекции кристаллов Т.Ч. негативно

онтрастированных различными контрастерани. а) 1%-ный УА; ) 2Х-ная ФВК; в) 2Х-ный силиковолъфрамат калия; г - е - спектру зображений а - в, соответственно.

ельно превышающей критическую. Вследствие радиационных повреж-

дений различия в контрастированной структуре нивелируются и результат более не зависит от использованного контрастера.

Электроногракны кристаллов ТМ имеют характерное распределение интенсивностей рефлексов. При добавлении к глюкозе тяжелоатомных солей, таких как УА, ФВК. и ее соли, упорядоченность кристаллов не ухудшается (рис. 3). При этом не меняются размеры и ориентация векторов обратной решетки и ее симметрия. Существенно, что при добавлении в защитную среду тяжелоатомных солей относительные интенсивности рефлексов изменяются, причем для каждой соли картина их распределения специфична. Такая специфичность свидетельствует о

I

Ш*:. !

- >г

Рис. 3. Злектронограммы микрокристаллов ТМ, полученные при дозах облучения з 0, 1 е/А2. а - фиксация глюкозой; б - контрастирование смесью УА и глюкозы; в - контрастирование снесыо ФВК и глюкозы.

специфичности взаимодействия тяжелоатомных добавок с объектом, в данном случае с ТМ, а отсутствие изменений параметров и симметрии обратной решетки может означать наличие изоморфизма фиксированных глюкозой ("дативных") кристаллов ТМ и кристаллов, обработанных смесью глюкозы и тяжелоатомной соли.

В условиях малых доз были получены злектронограммы от кристаллов ТМ, контрастированных классическим методом негативного контрастирования. Оказалось, что при этом упорядоченность кристаллов сохраняется до уровня по крайней мере 4 - 5 А, причем и в этом случае изменение относительных интенсивностей рефлексов для каждого из использованных контрастеров носило свой закономерный характер. Существенно, что с увеличением дозы до обычной (50 + 100 е/А2) дальние рефлексы на таких электронограммах исчезали и оставались лишь типичные для метода негативного контрастирования рефлексы с полем 20 + 23 А. Таким образом, в действительности негативное контрастирование нельзя описывать как простую заливку объекта электронно-плотной матрицей, не взаимодействующей с ним; в процес-

се контрастирования происходит а-ктивное химическое взаимодействие контрастера с полипептидной цепью, которое следовало бы учитывать и использовать в ЭМ исследованиях с высоким разрешением для получения дополнительной информации.

Глава 3.2. Описание результатов исследования гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina. Гидрогеназы, относящиеся к ферментам класса оксидоредуктаз, у многих организмов участвуют в катализе реакций выделения и поглощения молекулярного водорода.

Гидрогеназа из фототрофной пурпурной серобактерии Thiocapsa roseopersicina является термостабильным белкок, быстрая инактивация ее наблюдается лишь при температурах выше 80 °С. она представляет собой слабокислый белок с pi 4, 2 и имеет нолекулярную массу 68 нОа. Кристаллизацию фермента проводили методом висячей капли из 2, 5'4 раствора белка в о, 1 и TAPS-буфере (рН 7) с 1 И сульфатом аммония и 57. MPD 1 2-метял-2, 4-пентандиол). Мнкрокристаллы формировались в течение нескольких недель. В электронном микроскопе отбирали хорошо упорядоченные слои большого (1-4-5 м:<м) размера. В исследовавшихся препаратах гидрогеназы присутствовали несколько типов микрокристаллов. Один из них (рис. 4а) характеризуется гексагональной симметрией (симметрия проекции Р5) с параметрами а » b - 122 А, у • 60 Кроме этого типа упаковки наблюдались микрокристаллы, имевшие в проекции симметрию Спда (рис. 46), с параметрами а • 200 A; Jb - 122 А, ц • 90°. Оказалось, что упаковка гипа рис. 46 представляет собой наложение монослоев типа рис. 4а. Три этом слои лежат друг над другом со сдвигом, что и приводит к <ажущемуся различию рис. 4а я 46. Результат подтвержден матомати-[оским моделированием наложения слоев с различными векторами сдви-■ов.

.•.v-V.-V/;

Рис. 4. Негативно контрастированные 2'/.-ным УА микрокристаллы дрогеназы. а - изображение монослоя; б - изображение бислоя.

г Для получения трехмерной модели молекулы были сделаны серии имков микрокристаллов гидрогеназы с различным наклоном препарата

ГЛч,

в микроскопе.' Всего использовано 22 изображения (3 независимых набора) в диапазоне углов -43 + +49°. Средняя фазовая ошибка при сведении индивидуальных изображений в' трехмерный набор составила 30°. Была определена группа симметрии слоев (Р321). В результате проведенных расчетов была получена нодель строения гексакера ГГ, приведенная на рис. 5. В ней хорошо выделяется 12 областей повышенной плотности, объединенных попарно; каждая пара пиков соответствует одной молекуле гидрогеназы. Гексаиер представляет собой двуслойную структуру диаметром а 122 А , глобулы, принадлежащие молекуле ГГ, в слоях расположены не точно друг под другом, а свернуты на угол 20 ± 3°, что приводит к существованию винтовых канавок на боковой поверхности гексамера. Расстояния между центрами тяжести глобул равны 36 ± 6 А. Молекулы в гексамере попарно сближены и образуют дякер, внутри каждого из димеров проходит кристал-лографвческая ось второго порндкж.

Рис. S. Нодвяь строевая единицы укя&дхи кристаллического

монослоя гидрогеназы. а - вид сверху; 6 - вид сбоку; в - вид в "общем" положении.

Глава 3.3 посвящена результатам исследования структуры тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermidius.

Тирозин - фенол-лказа из Citrobacter Intermidius представляет собой пиридоксальфосфат-зависикую лиазу. В силу присущей ей широкой субстратной специфичности и полифункциональной активности тирозин - фенол-лиаза представляет собой интересный объект для выяснения проблемы специфичности и эффективности ферментативного катализа, а также для биотехнология, так как обратимость реакции а, ß-элиминирования и использование реакции ^-замещения.позволяет синтезировать тирозин и его физиологически активные аналоги, такие, как 3, 4-диоксифенилаланин. Кроме упомянутых типов реакций тирозин - фенол-лиаза (TWI) из Citrobacter intermidius катализирует также реакцию траксамхнирования. Фермент представляет собой тетрамер, состоящий из четырех идентичных субъединиц, в полипептидной цепи каждой из которых содержится 409 аминокислотных остат-

Рис. 6. а - Изображение трубчатого кристалла тирозин - фенол-лиазы; б - спектр Фурье этого кристалла; в - фильтрованное изображение того же кристалла С двусторонняя фильтрация); гид- односторонние фильтрации (ближней и дальней сторон, соответственно).

ков. Субъедхняцы связаны нековалентными взаимодействиями, дисуль-фхдные мостик* между иини отсутствуют.

При упаривании на воздухе высокоочищенного препарата апо-ТФЛ с концентрацией белка 15 мг/кл в 0,1 К калий-фосфатном буфере с концентрацией сульфата аммония 20 7. от насыщения при рН 7,0 появлялись трубчатые кристаллы Т4Л. Водную суспензию труб ТФЛ наносили на предметные сетки и контрастировали 2 V. УА. На рис. 6а приведено изображение трубчатого кристалла, негативно контрастированного УА'. На рис. 6б приведен расчетный спектр Фурье этого изображения. Разрешение изображений, типичное для метода негативного контрастирования, составляло 20 + 25 А. Для того, чтобы уменьшить вклад шума в изображения, проводилась их пространственно-частотная фильтрация. Были проведены также "односторонние" фильтрации, позволившие разделить изображения "ближней" (рис. 6г) и "дальней" (рис. 6д) стенок трубы. Было обнаружено, что трубчатые кристаллы тирозин - фенол-лиазы не жесткие. Размеры ячеек на "ближней" и "дальней" стенках на многих трубах сильно различаются, что объясняется деформацией прилегающей к подложке стенки трубы. Это хорошо прослеживается на дифракционных картинах, на них отсутствует зеркальная симметрия относительно экваториальной и меридиональной линий дифрактограммы, а на профильтрованных изображениях на уплощенной стенке частицы имеют уменьшенные поперечные (в направлении, перпендикулярном оси трубы) размеры. Присутствие этих искажений сильно осложнило работу по трехмерной реконструкции, поскольку для этого необходимы изображения недефориированных труб. С помощью

Рис. 7. Модель строения молекулы тирозин - фенол-лиазы.

оптической дифракции было исследовано свыше 100 изображений, из них отобрано около 10 лучших, для которых проведены расчеты спектра Фурье и цифровые фильтрации. Для трех труб была выполнена трехмерная реконструкция. По спектру Фурье (рис. 66) были определены

параметры спирали данного типа трубчатых кристаллов: р - 62; q - 13, N ■ 1, С - 1360 А, которые затем использовали в трехмерной реконструкции ТФЛ по методу модифицированных проектирующих функций. В результате реконструкции был восстановлен элементарный диск трубчатого кристалла ТФЛ (расчеты проводились совместно с О. Н. Зог-раф и Е.В.Орловой), толщина которого равна 26,8 А. Было рассчитано четыре сечения элементарного диска с шагом 6,7 А, элементарный угол поворота равен 75,45°. 11а рис. 7 показана модель отдельной молекулы ТФЛ. В модели можно выделить Z примерно равных удлиненных домена, соответствующих, по-видимому, парам субьединкц белка. Длинные оси доменов почти параллельны оси трубы. Размеры молекулы тирозин - фенол-лиазы 80x80x50 А3, причем ее длинные оси расположены вдоль оси и по радиусу трубы. Размеры молекулы определены с точностью - 5 А.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

1. Исследовано влияние облучения электронами на биологические объекты в электронном микроскопе на примере мккрокристаллов бактериальной сериновой протеазы - термитазы. Обнаружена возможность сохранения упорядоченности биологических объектов при смешанном и обычном негативном контрастировании до деталей размером менее 4 - 5 А. Показано, что упорядоченность сохраняется лишь при малых дозах облучения (з i е/А2)

2. Получены электроногранмы от микрокристаллов термитазы с высоким (2 А) разрешением. Электроногранмы получены как от фиксированных глюкозой, так и от контрастированиях смешанными контрастерами микрокристаллов термитазы в условиях, когда влияние облучения пренебрежимо мало (доза облучения не превышала 0,1 е/А2).

i. Обнаружена специфичность обычного негативного контрастирования, проявляющаяся при малых дозах облучения препарата. Такая специфичность указывает на слишком упрощенное представление процесса негативного контрастирования, когда не учитывается химическое взаимодействие конграсгера с объектом. Специфичность взаимодействия практически исчезает при увеличении дозы до обычно используемой (50 - 100 е/А2).

. Показана возможность получения производных нативных микрокристаллов термитазы при смешанном контрастировании их раствором глюкозы с добавками солей тяжелых металлов, используемых в качестве контрастеров. Наличие таких производных может упростить получение данных высокого разрешения о структуре биологических объектов методом электронной микроскопии.

По сериям снимков с наклоном препарата в электронном микроскопе исследована пространственная структура бактериальной гидрогена-

зы кз Thiocapsa roseopersicina с разрешением 20 * 22 А. Единица укладки кристаллических слоев этого фермента представляет собой двуслойное кольцо, образованное шестью молекулами гидрогеназы. Симметрия слоев Р321. Молекулы объединены в димеры, внутри которых перпендикулярно плоскости кольца проходит ось симметрии второго порядка. В нолекуле фермента выделяются две примерно равных глобулы, повернутых друг относительно друга на угол - 20 ± ± 3°, что приводит к существованию винтовых канавок на боковой поверхности кольца. Размеры молекулы гидрогеназы равны 35x70x60 Л3 расстояние кежду центрами тяжести глобул 36 i 6 к.

6. По изображениям трубчатых кристаллов бактериальной тирозин -фенол-лиазы из citrobacter intermidius исследована ее пространственная структура с разрешением 20 t 25 А. В модели молекулы тирозин - фенол-лиазы хорошо видно разделение ее на два удлиненных домена, представляющих собой пары субъединиц. Размеры молекулы 80x80x50 А3, причем ее длинные оси расположены вдоль оси и по радиусу трубы. Полученная модель хорошо согласуется с предварительными данными рентгеновских исследований кристаллов этого фернента.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах!

1. Sherman М.В., orlova E.V. rerzyan S.S., Kleine R. and Kiselev N.A., 1981. On the negative staining of the protein crystal structure. Ultramicroscopy, 7, 131-138.

2. Sherman, И.В., Orlova, E.V., Kleine, R., Kiselev, N.A. and Vainstein, B.K., 1982. Electron diffraction patterns from thermitase crystals. In: Electron Microscopy 1982. Vol.1, Physics, 10th International Congress on Electron Microscopy, Hamburg, The Congress Organizing Committee (ed.), 517-518.

3. Sherman M.B., orlova E.V. Thermitase - negative staining and electron diffraction patterns from microcrystals. Philips, 5th Conference, Visegrad, Hungary, 1982,

4. Sherman M.B., Tagunova I.V., Orlova E.V. In: Proc. of the 8th EUREM, vol. 3, Budapest, 1984, 1489-1490.

5. Orlova E.V., Sherman M.B. Collection of programs to enhance electron microscopy, images. I International conference on image processing, Berlin, 1985.

6. Шерман И. Б. , Орлова Е.В. , Смирнова Е. А. , Зорин Н. А. , Тагунова И. В., Куранова И. П., Гоготов И.Н. , 1987. Структура микрокристаллов гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina. Доклады АН СССР, 295, 503-512.

7. Sherman М.В., Orlova E.V., Smirnova Е.А., Zorin N.A., Hovmoller S., 1989. Structure of a nickel-containing enzyme:

Hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina. Abstracts of SCANDEM-89.

a. Sherman M.B,, Orlova E.V., Smirnova E.A. , Hovmöller S., Zorin H.A., 1990. Structure of a nickel-containing enzyme: Hydrogenase fron Thiocapsa roseopersicina. J.Bacteriol., в печати.

9. Норман M. Б. , Орлова Е. В., Хофмюллер е., Смирнова Е. А. , Зорин H.A., Гоготов H.H. , 1989. Пространственная структура гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina. Доклады АН СССР, 308, 1489-1493.

10. Оерн&и К. В., Рысккн А.И., 1989. Обработка эяектронограмн белковых кристаллов. Кристаллография, 34, 481-483.

11. Шерман М. Б. , Антсон A.A., Орлова Е.В. , Зограф О. Н., Домидкина Т. В., 1990. Электронио-кхкроскопическов исследование структуры тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermidius. Доклады АН СССР, в печати.

Цитированная литература.

1. Hisell D.C., 1978. Image analysis, enhancement and interpretation. In: Practical Methods in Electron Microscopy (ed. A.-M. Glauert), Vol. 7, 1-305. Worth-Holland Publishing Co.

2. Henderson R. and Unwin P.N.T., 1975. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy. Nature, 257, 26-32.

3. Huxley H.E. and Zubay G., I960. Electron microscope observations on the structure of microsomal particles from Escherichia Coli. J. Holec. Biol. , 2, 10-18.

4. Williams R.C. and Fisher H.W., 1970, Electron microscopy of TMW under conditions of minimal beam exposure. J. Holec.Biol., 52, 121-123.

5. Radon J., 1917. Uber die Bestimmung von Funktionen durch ihre Integralwerte Langs gewisser Mannigfaltigkeiten (On the determination of functions from their integrals along certain manifolds). Ber.Satchs. Acad. Viss.Leipzig, Hath-Phys.Kl. , Acad. Wissen. Leipzig, 69, 262-277.