Ретгеноструктурное исследование тирозин - фенол-лиазы из CITROBACTER INTERMEDIUS при разрешении 2.7 Å тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАНЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ ИМ. А.В.ШУБНИКОВА

На правах рукописи

АНТСОН АЛЬФРЕД АКСЕЛЕВИЧ

УДК 548. 737

РЕТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТИРОЗИН - ФЕНОЛ-ЛИАЗЫ ИЗ Citrobacter intermedius ПРИ РАЗРЕШЕНИИ 2.7 i

Специальность 01. 04. 18 - Кристаллография,

физика кристаллов

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва, 1991 г.

Работа выполнена а Оряэиа Трудового Красного Знакени Институте кристаллографии им. А. В. Шубникова АН СССР

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Ведущая организация: Институт Биоорганической химии АН СССР

ка заседании Специализированного совета Д. 002. 58. 01 при Институте кристаллографии АН СССР по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии АН СССР

Э. Г. Арутюнян

Официальные оппоненты: чл.-корр. АН СССР

ю. т. стручков (инэос АН ссср)

доктор физико-математических наук, профессор В.И. Иванов (ИМБ АН СССР)

Защита диссертации состоится

лвтсрвферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат фкзико-математических наук

Б. Н. Канепский

»ДГСШг..

" : I

-«п i,

ОЕЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование пространственной структуры биомакромолекул является в настоящее время одним из наиболер быстро развивающихся направлений рентгеноструктурного анализа. Эти работы важны для понимания фундаментальных вопросов молекулярной биологии, в том числе для понимания процессов ферментативного катализа.

В последнее вреня в нашей стране я за рубежом интенсивно изучаются пространственные структуры и механизм действия пиридоксаль-5'-фосфат-завксикых ферментов, катализирующих

разнообразные реакции метаболизма аминокислот (реакция трансаминиропанил, ß- элиминирования, дакарбоксилирова'няя, рацемизации и др.). К настоящему времени пространственная структура некоторых ферментов этого семейства была определена. Так, например, детально изучена структура ряда трансаминаз, недавно получена пространственная структура триптофан синтазм. Структура пиридоксаль-5'-фосфат-зависииых ферментов, принадлежащих к группе /3- элиминирующих лиаз, представителем которой является тирозин - фепол-лиаза, пока оставалась неизвестной.

Цель работы, - определение пространственной структуры тирозин фенол-лиазы из Citrobacter intermedius методом рентгеноструктурного анализ?..

Научная новизна работы. Показана эффективность сбора дифракционных данных от кристаллов биомакромолекул на пучке синхротронного излучения накопителя ВЭЛП-З. На конкретном объекта установлена эффективность использования метода аномального рассеяния для решения фазовой проблемы при дальнейшей модификации фаз методами Банга и молекулярного усреднения. Впервые определена структура нового представителя пиридоксаль-5'-фосфат-зависимых ферметов -- тирозии - фенол-лиазы при разрешением 2. 7 К. Проведен 1нализ вторичной, третичной и четвертичной структуры тирозин -}>енол-лиазы. Проведен ход полипептидной цепи молекулы, построена юлиаланиновая модель.

Практическая ценность работы заключается в том, что юлученные результаты являются основой как для уточнения структуры •ирозин - фенол-лиазы при высоком разрешении, так и для изучения ¡омплексов фермента с кофактором и различными аналогами

субстратов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 15 Конгрессе международного союза кристаллографов (Бордо, 1990), на интернациональном симпозиуме по. витамин Bg к карбонильному катализу (Осака,1990), на 2-ой европейской школе по кристаллографии биомакромолакул (Комо, 1991) на конкурсе научных работ ИК АН СССР (1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Обьеи работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов я списка литературы. Она изложена на страницах,

содержит рисунков х таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи, сформулирована цель работы.

ГЛАВА I, состоящая из дз ух разделов, написана по литературным данный.

Первый раздел посвящен обзору имеющихся в литературе данных о физико-химических свойствах и пространственной структуре тирозин -фенол-лиазы.

Тирозин - фенол-лиаза (КФ 4.1.99.2) принадлежит к пиридоксаль-5'-фосфат-аависимым ферментам . Фермент катализирует реакцию а, /3-элиминирования ь-тирозина и его аналогов (1) и связанную с элиминированием реакцию ß-замещения (2) [1,2]:

НН СИ (СН R) СООН + Н О - RH + СН СОСООН + NH , (1)

1 v г ' г з з

нн си ich r) соон + r'k = nh сн (сн^') соон + rh. (2)

В ходе реакции а,ß-эляминирования тирозин через ряд промежуточных стадий расщепляется на фекол, пируват к аммиак. Нолекула фермента имеет вес около 200 ООО Да и состоит из четырех химически идентичных субъединиц, каждая из которых содержит коферменг - пиридоксаль-5'-фосфат. субьединицы связаны нековалентными взаимодействиями, дисульфидные мостики между ними отсутствуют J3].

В 1990 году М. Б.Шерман с соавторами провел электронно:. ,¡<роскопическое исследование трубчатых кристаллов тирозин 1,1;нол-.пиагы. После трехмерной реконструкции был восстановлен

элементарный диск трубчатого кристалла. В полученной модели можно выделить 2 примерно равных удлиненных донена, соответствующих, по-видимому, парам субъединиц белка. Длинные оси доменов почти параллельны оси грубы. Размеры молекулы тирозин - фенол-лиазы 80x80x50 А3.

Во втором разделе рассматриваются особенности использования синхротронного излучения при исследовании структур макромолекул.

Синхротрокное излучение возникает вследствие радиационных

потерь высокоэнергетичных частиц, движущихся с ускорением. На

практике электроны (позитроны), предварительно ускоренные в

линейном ускорителе, пводятся в накопительные кольца, где их

энергия поднимается до максимально возможного значения. Из каждой

точки наклонной траектории электроны излучают (вследствие

центростремительного ускорения) в направлении касательной к

2 2

траектории движения в угол 1/г , где у = Е / га0с ( иос энергия покоя электрона). Остаточное давление газа в накопительном кольце определяет время жизни циркулирующих электронов, которое описывается экспоненциальным затуханием типа ехр (-ъ/т) . В накопительном кольце электроны циркулируют в дискретах электронных сгустках, каждый из которых содержит около 10 электронов. Полезным параметром для описания свойств синхротронного излучения является критическая длина волны А . В практических единицах 5.59 К/Е^А] [4], где а - радиус

искривления траектории с м, Е - энергия ускорения электронов в Гэв. Так, для накопительного кольца ВЭПП-3 имеем Л = 6. 15м, Е = 2 Гэв и Лс = 3. 2 А. Заметим, что в силу ряда причин оптимальная длина волны излучения, используемого для сбора дифракционных данных с кристаллов биомакромолекул лежит в пределах О. 8 - 1.8 А. Так как критическая длина волны обратно пропорциональна

напряженности магнитного поля в данной точке орбиты, то на практике, путем создания сверхсильных магнитных полей сдвигают максимум мощности излучения на более короткие длины волн.

Для эффективного использования синхротронного излучения "белый" пучок фогоноз должен быть монохроматизирован и сфокусирован до размеров, равных размеру образца. В зависич зтл от цели эксперимента используют различаю оптические схемы, осноиными элементами которых являются монохроматор и зеркало. Дале.- п этой главе рассматриваются физические принципы функционирот- ь" ч и

особенности конструкции конохрокатора и зеркала.

В 1989 году Институтом кристаллографии АН СССР совместно с Институтом ядерной физики СО АН СССР был завершен комплекс работ, приведших к созданию кристаллографической станции на пучке схксротронного излучения от накопителя ВЭПП-3 (рис.1). Основная задача, которая решается на огой кристаллографической станции -высокоскоростной сбор рентгенодяфракционных дзниах от макроиолекулярных кристаллов с большими периодами решетки с высоким разрешением съемки. Для этого станция обеспечивает: 1) фокусировку излучения на детекторе о пятно размерами 0.5*0.5

2) возможность работать с заданной длиной волны в широком диа-

ми;

пазоне длин волн от 0. Е до 1. В А ; 3) монохроматизацию излучения с 10

-3

¿окусируюсий

Чмойохроматор

—протиро^оновый экран аыера Арната-Вонакотта

Рис.1 Блок-схема кристаллографической станции.

Для регистрации дифракционных данных на этой станции используется фотографическая камера Арндта-Вонакотта фирмы Икраф-Нониус [5]. К настоящему времени на пучке накопителя ВЭПП-3 собрано около шести наборов данных с пяти различных объектов. А именно, собранм наборы дифракционных данных с кристаллов каталазы из Micrococcus lysodeihticus , пирофосфатазы из E.Coli , карбоксипептидазы Т, нитрогеназы, тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedias.

По экспериментальным оценкам, выитрьт в интенсипностп излучения при использовании монохроматора на основе монокристалла германия по сравнению с СиКд - излучением от рентгеновской трубил с вращающимся анодом GX-20 составляет 150-200 раз. Эффективное время жизни кристаллов под пучком ренгеновского излучения возросло по крайней мере п 6 раз в случае пирофосфатазы м в 7-8 раз прп сьемно тирозин - фонол-лиазь;.

ГЛАВД Я. Экспериментальная часть.

- Фермент был выделен из клеточного экстракта Citrobacter intermedins в ИПБ АН СССР Т. В. Денидккной. Кристаллы апойюркы тчрозян - фенол-ляазы были вырааены исходом градиента pH из Ш раствора сульфата аммония в 0.1Н калий-фосфатном буфере прп понижении pH от 7.0 до В.О . Концентрация белка при этом равнялась 20 мг/мл. Дифракционное поле полученных кристаллов на пучко синхротронного излучения составляет 2.3 £ . Максимальный размер кристаллов 1.5x1.5x1.0 мм'. Фотография полученных кристаллов приведена на рис. ?. .

{» О С".

Cl.:.

A oj'?

íi o

*" \ y- - \ f^

Рис. 2 Кристаллы тирозин - фенол-лиазы.

\

Л Чг'

(«а - -щг

\ "г*

■.¡ъ V --г' .*

Рис.3 а) Прецессионная рентгенограмма зоны 0к1 дативного кристалла

тирозин - фенол-лиазы. Угол прецессии 15°.

Л,

Шж

■ ч

"а

; , К;','. . .

б) репггенограьиа. крашения (А0=1.О°}, полученная г.а пучке синхротрокного излучения нгкоп„теля ВЗПП-х

...^....-„^—--.^.....—...... ......——

Предварительное кристаллографическое исследование кативных кристаллов тироои». - фенол-лиазы показало, что кристаллы принадлежат кросураист&окнс.2 группе снклетр.ш ег г 2 с параметрами эт.мвнгарной ячейки а=?6. 02, Ь=1зг. 27, с =93. 54 А В

кристаллографически независимой части находится две субьединицы тетранера, что приводит к специфическому объему [6] 2.3 А3/Да. На рис.За приведана прецессионная рентгенограмма от нативного кристалла тирозин - фенол-лиазы.

исследование пространственной структуры тирозин - фенол-лиазы проводили методом полиизоморфных замещений [7]. Было найдено пять тяжелоатомкых производных. Условия получения соответствующих производных представлены в табл. 1.

Первые наборы дифракционных данных с кристаллов тирозин -фенол-лиазы были получены на 4-х кружном одноканалышм ■ 1 (Тома- ическом дкфрактометре Бут^ех Р2 Наборы высокого

разретеим Ам полукы: a) на 4-х крупном авга.а-тчесетл дифрактоетро с кшогопроволочшй прогорилс!шн-ю:1 кзмэрой KrtRD-4, d) »¡етодогл врз'ззм с рентгеновской плешей в кэтосткэ детектора на пучге спнхротронного излучения накешпшя ЮПП-3 В 00 АН СССР,С} 1ЕТОДОМ ВрЗЗОНИЯ С I«ago-plate исиструкщш Д. Хездшс/А. .йэнгфер з качэствэ дстипора m пучка сшкрспраЕюш ¡гзлучения накопителя Denis.

Таблиц 1. Условия пслучэлия тагэлоатез.гых производных тпрехка -феюл-лиаза

соединен:« Cradil'EEi'pyCiiJSi P'.CTFOP иэнцээтрация, cH гремя кастгитязия

cSjuo2(Mcs)s Gi 0.5 4 СуГСЖ

CH3H3H2FO_f CM 0.3 4 ЧЛСЗ

POMS GA [шд. раствор

HftuCl, CA 1.0 2 суго:;

Дп-Pt CA 1.0 i сутки

Примэчажэ: Д'1-Pt - (n»4)2 [Ptínrap^o]., FCT3 - паржженкгркурбнгот

GA - 2 и сульфата атхям / o.i и гапй-фхфгг; гн = ь.о СИ - 1.2 н сульфата !«пшя / o.i н кез ; ри = 6.о

Опегам, 'ко супестоенюв удугзэвгз очэстга дал*:: стал) «за «гая мм сдаск içœraœsB под пучюч сотфотрашго кэ ояюатгелыю

ишпш да»1\ас bgsh. Псрп.ь* эксперэи-гты по емзгсз крпсталтюз тараня -Ф?нол-л:эзи t:a сгаирслтюшга ¡гатухх-яш ásszt прзвздегг! на пучкэ накопителя ЕЭПП-3 в Шаппуге ядерной iœran CD АН (Ш> на кг0С?хагоюграф1ЧЗСгоА станции, Пакий кгэбор дйраиакяшх данных при разрезеякя 2.7 А сил собран с трех кристаллов урановой производной бздаэ m даже юлни 1.38 А . Счета проводилась ьетодсм вргг«?гля ю кэкре Арндта-Богаютга с ргнтгеновенпй пленной FT-1B в качестве детектора. Обработка тлучнигл реттсж1р.тл1 проводилась то гастеме преграчм "ли-иоко", шставяекга на вычгаггстслыюй систекэ ¡tord-ico/Hord-soo А. И. Рьсшюл. Пояуеннкй radop ;г ..kurdhhlk данных сыграл ргапгау» роль при pacmsî眜 структур« с разрез <4.5 А.

Тайлща 2. Основнш статисгачзск» характеристики наборов экспериментальных данных от кристаллов тирозин - феюл-лиазы.

кристалл д:$ракто- ЛЕЗТР йзреш-иение, A Чкв 1>Эт Rcraa. X R «r(ÚF )>/ СИМ. v ano ' % <¿F > ano

катанка! SyntexP21 5.0 4523 73 7.8 -

КАРД-4 3.0 13452 54 12.3 13.1

31, DORIS 2.3 43535 аз 10.2 5.8

pata SyntexP21 6.0 2766 75 5.5 -

КАРД-4 3.5 11365 52 14.0 15.3

HftuCl. SynteiíP21 5.0 4575 56 13.6 -

Ди-pt SyntexP21 5.0 •»559 74 6.3 -

CHjHgüjPO^ СИ, ooais 3.6 11826 97 5.6 3.5 0.94

CS3WO2(KCS)5 Syntexf>21 6.0 2691 73 6.6 -

OI, DORIS 2.£' .13397 Й7 9.2 4.£. 1.04

ai, взш-з 2.7 B14S 66 10.6 9.8

В тайше шгапюотаны сгедазе.» осЗЬовачзншЕ число шзависиьш

рофчемаа, я - средвлздигпмная caxfaa измерения шгтегральной кпгасиаахян. W I о (ь) / % W £ I < i > - i I / £ < i >,

¿F : I Я - F~l 1 1

aro

G±>p Ki+pam^joii-üK яш при бог.-з норсятой дайне волны - 0.96 8 на пучка \&] наязшггеля CCXUS (C£SV,His,bur3) с Isaga píate КЖСТруРЦИН д. fempiiKc/A.J5a;ra|iep в ¿ачэствэ детектора позволяю кэрдшально реипь пройжц/ радаацжюнего распада крюталлов тнрозин - фетш-лиазы. В итоге все ка&ры дайшционши данных с&ш софшы с одного кристалла в наздем гадальном случае, я-факгор по сшшгричньи отраданюш для ютивньк, уранияыых и ртупьк данных составил 3.8, 4.6 я 3.5% при разрешэнии 2.3, 2.5 и 3.6 8, соотватсвекно. Для всех наборов тяжжтшньк производных били аафпосированы аношльнме разности, кегшрье использовались при расчете фаз ограйгндй.

Основнш характеристики ьсех шборов данньк приведены в таблице Jí 2 .

ГЛАВА 3. Определение структуры тирозин - фшол-лиазы.

Расчета по определен;;» структуры тирозин - фенол-лказы при разрешении

Таблица 3. Параметры пест присоединения тжелых атаюв в производных кристаллов тироеш - фенол-лшы.

Производная нззвэннэ X/a Y/a Z/a OC В

¡.ест

РОЖ p-i 0.942 0.722 0.064 0.05 64

Р-2 0.195 0.557 0.148 0.51 ЬЗ

р-з 0.026 0.381 0.414 0.95 81

Р-4 0.620 0.323 0.494 0.61 66

НйиС14 А-1 0.199 0.553 0.126 0.56 40

fi-2 0.033 0.379 0.421 0.90 17

Дц-Pt D-l 0.963 0.457 0.275 0.62 65

D-2 0.012 0.801 0.320 0.41 35

0-3 0.843 0.320 0.285 0.43 112

CS3UO2(ÎÎCS)5 U-l 0.967 0.309 0.108 2.49 112

U-2 0.273 0.617 0.450 2.44 127

-U-î 0.848 0.441 0.056 1.51 24

U-4 0.494 0.899 0.496 1.09 12

CH3HgH2PO+ H-l 0.261 0.995 0.974 0.23 19

H-2 0.709 0.953 0.832 0.37 15

H-3 0.454 0.879 0.569 0.51 29

H-4 0.124 0.-104 0.530 0.61 33

H-5 0.629 0.335 0,528 0.52 7

H-6 0.C60 0.376 0.589 0.24 11

H-7 0.449 0.261 0.972 0.37 49

H-3 0.239 0.317 0.567 0.30 13

H-9 0.402 0.501 0.983 0.19 25

Г1р1!М?ЧЗККЯ: Х/a, V/a, Z/a - МЗОРдаНЗТИ 1.ЕСГ ПрЙООеД'.ЗШЯЯ таззяых атомов в долях ячейки, ос - етсоленг.осп; ?.гест присоединения тяжльж атаюв в относительной шчале, в-темггератур1Ъй фактор.

1.3 А были выполнены по комплексу програш blanc, созданному А. А. Взгинш на ЭЕМ nord-500. После приведения наборов структурных факторов производных к шкапе набора натжньх металлов рассчитывалась факторы расходимости я для производных (тгйл. 4). Наиболее котрасташ оказалось ураняльнсе производное. Его расак$ровка была выполнена по разностным синтезам Паттерссна и, независимо, прямьми методами по програшэ shelx-86. Остальные производные были раажфрованы по разностным синтезам Фурье. Уточнение параметров тягвльк атомов проводашсь по алгтргщг Дяскерсона. Параметры мест присоединения тяжелых атомов приведены в таблице 3. После объединения $аз при разрешении 4.5 А значение itaicropa достоверности <*> оказалось рамам 0.51.

Таблица 4. Результаты уточнения параметров тяжелых атомов.

производная разрешение,А к cry st Р cullis W

РОКВ 4.5 0.178 0.60 1.73

HAuCl. 4.5 0.184 0.69 1.12

Яй-Pt 5.0 0.135 0.67 1.08

CH3HgH2P04 3.6 0 .077 0.69 0.99

CS3U02(NCS)5 2.7 0 .178 0.53 1.59

Примечания: &cryet-Iirph-Ppl/EFp.

H=nr,sFc/E где rmsFc - среднеквадратичный вклад в рассеяние тяжелых атомов, Е - среднеквадратичная оикбка незамкнутости фазового треугольника.

В дальнейшем было установлено расхождение между наборами кристаллографических данных от нативных кристаллов в разных маточных растворах. Урановая производная в силу ряда причин была получена в растворе 1. 2 И сульфат кагная/О. t Н KES. Поэтому для получения фазовой информации при высоком разрешении использовались только наборы экспериментальных данных, полученные в этом маточном растворе. Расчеты по определению структуры тирозин - фенол-лиазы пря разрешении 2.7 А были выполнены по комплексу программ ССР-4 на сети ВАЮСов (EKEL, Гамбург). В сипу вышеизложенного, для расчета фаз при разрешении 2.7 А использовались только наборы данных, полученных с натиеного кристалла и кристаллов урановой и ртутной производных. Уточнение параметров мест присоединения тяжелых si омов проводились па центроскмметркчнык отражениям. Результирующий К-фактср(Си111з) составил 0.S3 в случае урановой и 0. 69 в случае ртутной производной ( таб. 41 . При расчете фаз были использованы как изоморфные, так и аномальные разности. Показатель достоверности фаз пря разрешении 2. 7 Ä составил О..62 .

Положение некристаллографической оси ' симметрии второго порядка определялось путем вычисления собственной функции вращения R(ip, ф, 180°) [8](рис. 4). Она расположена перпендикулярно оси с элементарной ячейки и составляет с осью а угол Б3°.Точное расположение молекулярной оси было определено из анализа мест присоединения тяжелых атомов. В результате тривиальных расчетов было установлено, что она пересекает кристаллографическую ось

второго порядка в 'сочке с координатами 0;0. 5;0.777, что совпадает с центром молекулы.

Синтез электронной плотности, рассчитанный по фазам, полученным на первом зтапе работы при разрешении 4.5 А был сильно зашумлен; молекулу фермента удалось выделить только после модификации фаз структурных факторов методом Ванга [9]. После четырех циклов процедуры значение К-фактора И = <|РоЬв - Кса1с|> /

<ГоЬэ> снизилось с 0.43 до 0.36, значение фактора корреляции

7 2 1/ 2 С <РоЬз'Гса1с> = ИРо-<Ро>П^с-<Гс>> ' Ш*0-<*0*ГИ*С-<*С>) ) возросло с 0.65 до 0.91. После задания границы молекулы процесс

кодификации фаз структурных факторов был проведен заново, по

методу молекулярного усреднения [10]. Для усреднения молекулы

использовалась программа, написанная Г. Н. Мурзудовым. Посла четырех

циклов процедуры значение Й-фактора снизилось с 0. 48 до О. 38.

Фактор корреляции позрос с 0. 63 до 0.86, Электронная плотность,

рассчитанная по результирующим комбинированным фазам, позволила

проследить доменную структуру молекулы фермента.

После сбора дифракционных данных высокого разрешения процесс модификации фаз структурных факторов был проведен при разрешении 2. 7 А. Для этого использовались программы молекулярного усреднения по Ерккокю [10], адаптированные и зключеиньш в комплекс программ ССР-4. Граница молекулы была вычислена по алгоритму с усреднением в обратном пространстве, как это было предложено Л.Лесли [11]. При этом предполагалось, что раствор занимает 27Х объема кристалла. Поело 6 циклов усреднения с последующей комбинацией изоморфных и вычисленных фаз было проведено 4 цикла усреднения электронной плотности, рассчитанной

N

Ркс.6 Модель молекулы фермента, построенная по координатам Са атомов. Кристаллографическая ось второго порядна расположена

горизонтально.

по пзвепенным коэффициентам Fnew=2*Fobs - Fcalc и вычисленным фазам. R-фактор между вычисленными (после усреднения) амплитудами л измеренными понизился с 0.46 до 0.20 . Значение фактора корреляции возросло с 0.71 до 0.92 .

Результирующая электронная плотность (рис.5) позволила достаточно легко проследить больпую часть хода полипептидной цепи. Поскольку аминокислотная последовательность тирозин - фенол-лиазы из Citrobacter intermedins пока неизвестна, в электронную плотность была вписана полиаланиновая модель. Для построения полиаланиновой модели фермента использовалась программа FRODO [12], работа проводилась на интерактивной графической системе Evans ar.d Sutherland PS300. Полиаланиновая модель, включающая 352 остатка на одну субъединицу, была уточнена по методу Концерта и Хендриксона с наложением геометрических ограничений. R-фактор упал до 3G% . ¡{одель молекулы фермента, построенная по координатам Са атсмоз, прелстаплена на рис. 6 .

ГЛАВА 4. описание структуры тирозин - фенол-лиазы.

Упаковка молекул тирозин - фенол-лиазы в элементарной ячейке кристалла показана на ряс.7 . На независимую часть элементарной

'G-; • ■

iVf ^^{К^

С^*""О -Ii*

Ф I

„ I — "

Рис. 7 Упаковка молекул тирозин - фенол-лиазы и элементарной ячейке кристалла.

иллый ДСЧ-.Ц

БОЛЬШОЙ

Acwi«

рис.8 Расположение домоноа в субъедкницах тирозин - фенол-лиазы и ее четвертичная структура.

ячейкк приходятся две субъздиницы тетрамерной молекулы белка, а на целую ячейку - две молекулы.

Молекула тирозин - фенол-лиазы состоит из четырех химичеяки идентичных субьединиц, расположенных в вершинах тетраэдра с симметрией 02=222. она кожет быть представлена в виде трехосного эллипсоида с полуосями 35 х 45 х 48 А, совпадающими с молекуляркыкк осями симметрии второго порядка р д г, как это представлено на ряс.8, с осью г совпадает кристаллографическая ось второго порядка, параллельная оси с. Субъединкцы молекулы располагаются довольно плотно друг относительно круга, однако смыкание максимумов электронной плотности, относящихся к разным субъединицак, практически отсутствует, и их удается по синтезам легко разделить. Также легко выделяются два домена - большой, который ксжег быть описан эллипсоидом вращения с полуосями 15 х 30 х 30 А, и малый, имеющий форму сферы с радиусом около 13 Л. Взаимное расположение доменов в субъединмцах схематически представлено на ряс. 2 .

Субъединкцы в димере, образованном . кристаллографически екг-метричкыик субъединицами, имеют сложную границу контакта. Взаимное расположение доменов в этих субъединяцах сходно с их расположением в дкнерноё молекуле аспартат-акинотрансферазы [13,14], где в формирования активных центров каждой субъединкцы участвуют анинокислотные остатки большого домена соседней. Из рис.9, где представлено наложение сечений , электронной плотности, перпендикулярных кристаллографической оси второго порядка, видно,

/ ^ о»

« о \?% )<

/гЛ.^./ ЛК'^- С -• ' ,

А ■ !

- -А • • п

'гч.»

'С

«л г

СУ^,.

■У е

• А

• •

с." г

Д-Х1-

Рис.9 Фрагмент нарты электронной плотности, перпендикулярный оси С элементарной ячейки. Указаны границы субьединиц и доменоЕ в НИХ.

/ГУ

! 1 \ > /V

1 1 с

■

¿-Л'-"'

* -.1

■■Л ■ - ? — 1 -'"-'V

' . /-'С<-' К !.„/ -Г"

' ' V \ • У -' * . к>-- ;

Ру.ч. 10. Ленточная модель субъед.шипы тирозин - фонол-л.чаэы.

что большие домены субъэдинкц, связанных атой осью, контактируют с обоими доиснаия соседной субъец иницы и расположен!.! .напротив области контакт?, между нами. Субьодиницы, связанные молекулярной осью синмотрг.и р, достаточно далеко отстоит груг ст друга. Область контакта чежду ними формируется 10 И-концезыми аминокислотами и акннокпслотамт 56- 60 настоящей модели (рис. В). Субъединицы, связаннее молекулярной ось» ц, коктактол не имеют.

Тоцтыа анализ вторичной структуры будет возможен поело епределенит последовательности молекулы л построения полной атсиной подола. На данном этапе по картам электронной плотности была построена полиаланиноэая модель и дальнейпее описание приподится в этой приближении. Ход полипептидной цепи п субъединице тирозин - фенол-лиазы представлен . па рис. 10 0-Цепочки чередуются с а-спиралями, что указывает ка принадлежность тирозин - фенол-лиазы к белкам а/р класса, согласно классификации Лсвитта и Чотиа. Малый домен состоит из К- и С-концевых участков полипептидной цепи, средняя часть цепочки образует большой домен, который включает остатки 51-270 модели и состоит из 8 а-спиралей и 9 (3-цепочек. Основой строения большого, домэиа является р-лист, состоящий из 7 (3-цепей; «-спирали

расположены на поверхности домена, обращенной к раствору. Малый домен, содержащий остатки 1-50 и 271-352, состоит из 4 а-спиралек н 7 0-цепей. 4 |3-цепочки, расположенные в С-концевом участке малого домена, образуют антипараллельный fi-лист. Как и в структуре аспартат-аминотрансферазы, переходный участок из большого доиеиа в малый образован двумя а-спиралями, следующими одна за другой на поверхности субьединицы и расположенными примерно под прямым углом друг к другу.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАбОТЫ

1. Методами рентгеновской кристаллографии белка при разреиении

2. 7 к получены данные о пространственной структуре тирозкп -фенол-лиазы из Citrobacter intermedias. Это исследование включило:

Получение кристаллов нагивного белка и 5 изоморфных тяжелоатомных производных. Прстранственная группа симметрии P3J212, параметры элементарной ячейки а=76. 02, Ь=138. 27, с=аз. 54 %.

Измерение экспериментальна наборов интенсивностей рентгеновских отражений от кристаллоЕ нативного фермента и его тяжелоатомных производных при разрешении 2.7 + 6.0 к. Показала эффективность измерения интенсивностей дифракционных отражений на пучке синхротранного излучения от накопителя БЭПП-3.

Определение и уточнение мест присоединения тяжольи: атонов, расчет фаз стрктурных факторов белкового кристалла. Фазы, соответствующие высокому разрешению (2.7-3.5 Á), получены на основании только одного производного с Использованием аномального рассеяния.

Модифицирование полученных фаз с помощью методов Baiiri V-усреднения вокруг некристаллографическои оси симметрии.

2. На основе анализа карт электронной плотности установлена домоннйл структура субъединиц тирозкп - фенол-лиазы. Показало, что как и в амннотрансферазах, каждая субъединкца состоит из большого и малого доменов. Показано также, что две кристаллографически снннетричныо субъединицы тирозин - фенол-лиазы по пространственному строению очень блкзкк к структуре анинотрансфоразы.

3. Построена полиаланиновая модель молекулы. Установлено, что малый домен состоит из М- и С- концевых участков полипептидной

попя, оа средняя часть образует больпой домен. Проведен анализ

элементов вторичной и третичной структуры молекулы.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Т.V.Demidkina, I.V.Myagkikh, A.A.Antson, E.H.Harutyunyan, Crystallisation and crystal data on Tyrosine ' phenol-lyase, 1088, FEBS Letters, v.2 .

2. A.H.Po^ov, A.A.Antson, V.V.Belvaev, К. P. Eondarenko, E.H.Harutyunyan, D.M.Kheiker, A crystallographic station for structural investigations of macromolecular crystals on the synchrotron beam of the VEPP-3 storage ring, 1989, nuclear instruments and methods, v. A282.

3. К. Б.Перман, Л. А.Антсон, Е.В.Орлова, О. Я. Зограф, Т. В. Демядкина, Электронно-микроскопическое исследование структуры тирозин -фонол-лиазы из Citrobacter intermedins, 1990, Доклады АН СССР, Т. 312, Н 5.

4. Л.Н.Попов, А. А. Антсон, В.В.Беляев, К, П. Бондаренко. Э. Г. Арутпкян, Д. Н. Хо^.кер, Получение дифракциошмх данных для монокристаллов белков на синхротронном излучении от накопителя ПЗПП-З, препринт S0-118 ИЯФ СО АН СССР.

5. A.A.Antson, B.V.Strokopytov, Т.V.Denidkina, Yu.V.Nekrasov, E.H.Harutyunyan, X-ray structure investigation of Tyrosine phenol-lyase, 1990, Abstracts of the 15-th Congress of International Union of Cryst., Bordeaux.

В. Л. А. Аптсон, 5. В. Строкопытов, Г. ii. Иуршудов, Т. В. Демидкина, К. К. Эогелькан 0. Г. Пасхина, М. Хенняг, Ю.В.Некрасов, А.Н.Попов, С. В. Рубкнския, Э. Г. Арутюнян, Пространственная структура тирозин - фенол-лиазы с разрешением 4. 5 А, 1990, Кристаллография, в печати.

7. E.Harutyunyan, A.Antson, T.Demidkina, G.Obraolova, A.Teplyakov, X.Schnackerz, G.Mahler, A.Gabibov, G.Chencliik, X-ray study of some pyridoxal-containingg proteins, 1990, Abstracts of the International Symposium on Vitamin Bg and Carbonil Catalysis, Osaka.

8. A.A.Antson, T.V.Peraidkina, 0.H.Zograph, E.V.Orlova,

E.H.Harutyunyan, И.В.Sherman, Crystallization of tyrosine phenol-lyase, Electron- microskopy of tubes, 1990, Abstracts of the International Symposium on Vitamin B^ and Carbonil

Catalysis, Osaka.

Цитированная литература;

1. Kumagai Н., Yamada П., Matsui И., Ohkishi Н., and Ogata К., 1970. Tyrosine phenol lyase. 1. Purification, crystallization and properties.J. Biol.Cbem,, 245, 1767-1772.

2. Yamada H. , and Kumagai H., 1975. Synthtesis of 1-tyrosine-related amino acids by (3-tyrosinase. Adv.Appl.Microbiol., 19, 249-280.

3. Декидхина Т. В. , Мягких И. В. , 1989. Структурно-функциональные исследования тирозин - фенол-лиазы. Биохимия, S4, 745-750.

4. Тернов "И.М. , Михайлин Б. В. , 1986. Синхротронное излучение. Москва, Энергоатокиздат.

Arndt XI.»., Wonacott A.J. t 1978. The rotation method in crystallography. Amsterdam, North Holland.

6. Matthews B.W., 1968. Solvent content of protein crystals. J.Kol.Biol., v.33, 491-497.

7. Blundell T.L., Johnson L.N., 1976. Protein crystallography. New York, Academic Press.

8. Growther R.A., 1972, The fast rotation function,-In: The molecilar replacement method (edit. Rossmann M.G.), Gordon and Breach, New York, 173-183.

9. Wang B.C. 1985, In: Methods in Enzyraology. V.115t Diffraction Methods for Biological Macromolecules. / Ed.H.Wyckoff, C.H.W.Hirs & S.N.Timasheff. Hew York, Academic Press, 90-112.

10. Bricogne G.,1976. Methods and programs for direct-space exploitation of geometric redundances. Acta Cryst. A32. P.832-B47 .

11. Leslie A.G.W., 1987. A reciprocal-space method for calculating a molecular envelope using the algorithm of B.C.VJang, Acta Cryst. A4 3, 134-136.

12. Jones T.A., 1978. A graphic model building and refinement ' system for macromolecules J. Appl. Cryst., 11, 268-272.

13. Borisov V.V., Bcrisova S.N., Sosfenov N.I., Vainshtein B.K., 1980. Electron density map of chicken heart cytosol aspartate transaminase at 3.5 A resolution. Nature, v.284, N 5752, 189-1S0.

¡4. Браунштейн A. E. , Арутюнян 3. Г. , Малашкевич B.H. , Кочкина В. К. , Торчинсккй Ю. К. ,19 85. Цитозольная аспартат-аминотрансфераза из серднч курицы: трехмерная структура при разрешении 2. 8 А и особенности кон^ормаими некоторых форм фермента, Мол. Биол. , Т. 19, 19^-203.