ТСХ-скрининг и ВЭЖХ-определение производных фенотиазина в биологических объектах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Клищенко Роман Александрович

ТСХ-СКРИНИНГ И ВЭЖХ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОТИАЗИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Краснодар 2005

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Кубанского государственного университета

Научьый руководитель: доктор химических наук, профессор Темердашев Зауаль Ахлоович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Стрижов Николай Константинович кандидат технических наук, доцент Якуба Юрий Федорович

Ведущая организация: Пятигорская государственная фармацевтическая академия

Защита состоится 8 декабря 2005 г. в 1200 в ауд. 231 на заседании диссертационного совета Д 212.101.10 в Кубанском государственном университете по адресу: г. Краснодар, ул. Ставропольская 149, КубГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кубанского государственного университета: 350040, Краснодар, ул. Ставропольская 149.

Автоэеферат разослан « 3 » ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук,

доцент

Киселева Н.В.

ЫЛ-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Производные фенотиазина - лекарственные препараты, обладающие широким спектром действия, находят применение в терапии заболеваний сердечно-сосудистой и центральной нервной системы, а также при неврологичес<их заболеваниях.

Для рутинного скрининга этих лекарственных веществ и их метаболитов в биологических средах широко используются различные виды хроматографии. Особую популярность в настоящее время приобретает систематичес сий токсикологический анализ, так как такой подход позволяет с высокой степенью надежности определять широкий спектр токсикантов в биообразцах. Однако существующие методики направлены главным образом на групповую идентификацию и контроль отдельных наиболее часто используемых веществ и ограничены в применении из-за различных недостатков в селективности и чувствительности. Повысить эффективность методики анализа может использование специального вида пробоподготовки, обеспечивающего извлечение и очистку целевых компонен"ов. Широкое применение лекарственных средств на основе фенотиазинового ряда в терапевтической практике, а также при диагностике отравлений требует разработки унифицированной методики их определения в биологических объектах.

Диссертационная работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ-юг грант №03-03-96542). Цель работы. Разработка аналитической схемы хроматографического определения лекарственных препаратов в биологических объектах.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- теоретическое и практическое обоснование оригинальной схемы анализа биологических объектов методами хроматографии;

- поиск новых методов разделения и концентрирования для извлечения произвол -шх фенотиазина из биологических объектов;

- разработка методики скрининга биологических объектов на наличие произвол -1ых фенотиазина методом тонкослойной хроматографии;

- разработка методики количественного определения производных фенотиазина в би алогических объектах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Научная новизна. Разработана аналитическая схема хроматографического определения производных фенотиазина для целей химико-токсикологического контроля.

Предложен методический подход по оценке зависимости хроматографического удерживания производных фенотиазина от состава элюента на осчове его физико-химических параметров.

Практическая значимость. Разработана универсальная методика хроматографического количественного определения производных фенотиазина, пригодная для целей химико-токсикологического контроля и контроля качества ле <арственных препаратов.

Реализован метод твердофазной экстракции производных фенотиазина из биологических объектов, обеспечивающий эффективное концентрирование и отделение от матрицы пробы. На защиту выносятся:

- разработанная схема хроматографического анализа биологических объектов на содержание производных фенотиазина;

- методика определения производных фенотиазина в биологических объектах;

- сорбционные характеристики сверхсшитого полистирола по отношению к производным фенотиазина в различных системах растворителей;

установленные зависимости между хроматографическим удерживанием производных фенотиазина и физико-химическими параметрами используемой системы элюирования;

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Международной кснференции «Новые технологии и приложения современных физико-химических методов для изучения окружающей среды» (Ростов-на-Дону, 2001), Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002), Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Москва, 2004), II Международном симпозиуме «Разделение и

концентрирование в аналитической и радиохимии» (Краснодар, 2005). По материалам диссертации опубликовано 11 работ в виде статей и тезисов докладов. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, одной главы экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, приложения Материал диссертации изложен на 137 страницах текста, содержит 38 рисунков и 27 таблиц, в списке цитируемой литературы 129 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В литературном обзоре обсуждены методы пробоподготовки, скрининг! и определения, производных фенотиазина и их метаболитов в биологических объег-ах, их основные достоинства и недостатки.

Разработку методик определения проводили с использованием аминазина, перициазина, этаперазина, нонахлазина, сонапакса, трифтазина и тизерцина.

Извлечение производных фенотиазина из биологических объектов с использованием твердофазной экстракции

Метод твердофазной экстракции имеет ряд преимуществ по сравнению с жидко-жидкостной и более перспективен для применения в химическом анализе как способ пробоподготовки. Как показали наши исследования, сверхсшитый полистирол в качестве сорбента для извлечения производных фенотиазина из биологических объектов является высокоэффективным, так как он является органическим неполярным материалом, в структуру которого входят бензольные кольца, что позволяет сделать предположение о высоком сродстве и селективности к соединениям с ароматическим фрагментами. Мы провели исследование сорбционных свойств сверхсшитого полистирола по отношению к исследуемым веществам.

Динамическую емкость сверхсшитого полистирола изучали на водчых растворах аминазина с концентрацией 1 мг/мл при скорости прокачивания его через патрон 1 мл/мин. Динамическая сорбционная емкость патрона достаточно высока и составляет 15 мг, а удельная динамическая сорбционная емкость - 65 мг/г, что

позволило применить сверхсшитый полистирол для целей извлечения производных фенотиазина из матрицы биологической пробы.

Другим важным параметром в процессе экстракции при работе с концентрирующим патроном является объем растворителя, необходимый для вымывания целевого компонента. В качестве таких растворителей использовали этанол, ацетонитрил, этилацетат, хлороформ, ацетон

Наиболее эффективными элюентами оказались хлороформ и ацетон с объемом элюирования 8 мл. При использовании гидрофильных растворителей (этанол, ацетонитрил, ацетон) необходимый объем растворителя можно уменьшить добавлением в него небольшого количества трифторуксусной кислоты (10 мкл Ш ТФ У на 10 мл растворителя) до 6 мл для этанола и ацетона и до 5 мл для ацстонитрила.

Для повышения степени очистки образца в пробу вводили этанол, и сорбция пигментных веществ, присутствующих в пробе, существенно снижалась. Однако добавка этанола также снижает эффективность извлечения целевых компонентов, при добавке которого в количестве 10% об. к водному раствору смеси фенотиазинов наблюдался проскок после прокачивания 15 мл, а при 20% об. - после 2 мл исследуемой смеси. Поэтому дальнейшие исследования проводили с объемом пробы в 10 мл.

ТСХ-скрининг и определение производных фенотиазина в биологических объектах

Метод тонкослойной хроматографии, наиболее пригодный для экспрессного об чаружения лекарственных препаратов в биологических объектах, использовали для реализации скрининговых исследований в ходе систематического анализа. Эффективность применения этого метода зависит от ряда факторов (состав элюента, проявителя, условия детектирования, относительная влажность в хроматографической камере), и наиболее оптимальными являются такие условия, в которых достигается максимальное разделение определяемых веществ.

В исследовании использовали растворители, применяемые в тонкослойной хроматографии на силикагеле, такие как: гексан, бензол, ацетонитрил, диэтиловый эфир, ацетон, этилацетат, хлороформ, метанол, этанол и изопропанол. В качестве

элюентов использовали чистые растворители, бинарные и тройные смеси. Е>ыло изучено 10 элюентов чистых растворителей, 21 элюент двойных смесей в соотношении 1:1 (без этанола и изопропанола) и 35 тройных смесей (1:Г1).

По результатам проведенных экспериментов можно сделать вывод, что для получения эффективной системы элюирования необходим особый модификатор, аналогичный по природе разделяемым веществам и обладающий основными свойствами Таким модификатором может быть аммиак, который использовался авторами. В этом случае основная сложность связана с тем, что аммиак использ) ется в виде водного раствора, а вода не смешивается со многими органическими растворителями, что требует использования гидрофильных растворителей, как в чистом виде, так и в качестве добавки для повышения взаимной растворимости компонентов элюентов.

Другим способом оптимизации разделения может быть модификация сорбента, которая достигается насыщением аммиаком объема камеры Недостагком такого способа модификации является то, что ее устройство должно позволять одновременно использовать две жидкости без их смешивания, то есть необходимо как минимум два разделенных отдела для растворителей, что реализуется в специал »ных типовых камерах. Кроме того, для получения воспроизводимых результатов необходимо насыщение камеры перед каждым экспериментом.

Кроме аммиака можно применить и другие вещества-модификаторы элюгнта. Наиболее типичным примером таких веществ являются алифатические производные аммиака, например триметиламин, триэтиламин и т.д Такие соединения более липофильны по сравнению с аммиаком и, следовательно, лучше смешиваются с органическими растворителями, что в значительной степени расширяет возможности их применения С другой стороны, эффективность третичных аминов с длинной цепью углеводородных радикалов низка, и наилучший результат можно получит! с их самыми простыми представителями Нами изучено хроматографическое поведение производных фенотиазина при использовании триметиламина. Поскольку в свободном виде он газообразен, то работали с его гидрохлоридом.

В результате проведенных экспериментов установлены составы элюентов, обеспечивающие приемлемое разделение компонентов' 1 - гексан-ацетон-25% аммиак (60:40.насыщ), 2 - гексан-ацетон-25% аммиак (50'50:насыщ), 3 - ацетонитрил-

25% аммиак (95:5), 4 - ацетонитрил-25% аммиак (90:10), 5 - хлороформ-ацетон-25% аммиак (80:20:насыщ), 6 - хлороформ-ацетон-25% аммиак (50:50:насыщ) 7 - ацетон-25% аммиак (100:1), 8 - этилацетат-ТМА (40мг/мл), 9 - хлороформ-ТМА (30 мг/мл), 10 - метанол. Значения веществ в системах 1-10 приведены в таблице 1. Приведенные первые девять систем ранее для подобных разделений не использовались.

Таблица 1 - Значения Яг исследуемых соединений в различных системах элюирования

Соединение Элюент

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Аминазин 0,48 0,70 0,66 0,80 0,74 0,78 0,67 0,70 0,75 0,45

Перициазин 0,17 0,36 0,54 0,67 0,24 0,53 0,64 0,34 0,17 0,69

Отаперазин 0,16 0,33 0,42 0,58 0,29 0,46 0,36 0,21 0,28 0,59

Нонахлазин 0,21 0,40 0,43 0,63 0,62 0,69 0,39 0,35 0,49 0,52

Сонапакс 0,39 0,61 0,60 0,76 0,74 0,77 0,58 0,55 0,65 0,37

Трифтазин 0,28 0,51 0,50 0,68 0,65 0,69 0,39 0,44 0,61 0,44

Тизерцин 0,63 0,74 0,82 0,87 0,81 0,83 0,78 0,80 0,81 0,54

Приведенные системы могут использоваться в рутинном анализе для ТСХ-скрининга производных фенотиазина. Более высокой разрешающей способности предварительного анализа можно добиться при использовании метода двумерной тонкослойной хроматографии. Для подбора пар систем элюирования изучено наличие корреляции между значениями компонентов в предложенных системах. Наименьшие коэффициенты корреляции были получены для следующих сочетаний элюентов: ацетон-25%-аммиак (100.1) - метанол (г = 0,25) и ацетонитрил-аммиак (95:5) - метанол (г = 0,42) Полученные хроматограммы двумерной ТСХ показаны на рисунках 1 и 2.

Определение аналитических характеристик производных фенотиазина для целей количественного определения осуществляли на растворах с концентрацией 15 «кг/мл в диапазоне 0,1-10,0 мкг Элюирование проводили в системе ацетон-аммиак (100:1) с предварительным насыщением камеры. В качестве программного

обеспечения использовали программу «ТСХ-менеджер». Пример хроматограммы для аминазина приведен на рисунке 3.

Рисунок 1 - Двумерная хроматограмма Рисунок 2 - Двумерная хроматограмма

в системах ацетон-25%- в системах ацетонитрил-

аммиак (99:1) - метанол 25%-аммиак (95:5) - метанол

При количестве Юмкг аминазина на пластинке получается заниженное значение объема пятна, которое не укладывается на градуировочную кривую.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использоваь ия метода тонкослойной хроматографии для количественного определения производных фенотиазина.

Рисунок 3 - ТС-хроматограмма аминазина в диапазоне 0,1-10,0 мкг

Исследование хроматографического поведения производных фенотиазина

Определение связи между удерживанием вещества и условиями хроматографирования является актуальной прикладной и теоретической задачей. Удерживание в жидкостной хроматографии является функцией трех основных факторов - характеристик сорбата, сорбента и элюента. При условии постоянства сорбата и сорбента эта величина будет зависеть только от параметров подвижной фаз ,1, поэтому функция удерживания упрощается и ее можно рассматривать как более простую - однопараметрическую. Применение такой эмпирической зависимости может быть эффективным для скрининга исследуемых веществ при наличии данных об еналитическом виде этой функции.

Как было показано ранее, наиболее высокие значения производных фенотиазина наблюдаются при использовании метанола. Улучшить разделение компонентов в этом случае можно при использовании его смеси с малополярным растворителем. Метанол крайне ограниченно смешивается с гексаном, поэтому исключается возможность применения последнего в качестве разбавителя. Для этих целей вторым компонентом элюента выбрали бензол и в дальнейшем исследования проводили со смесью бензола и метанола Было детально изучено хроматографическое поведение исследуемых веществ и при различных составах элюента определены значения (таблица 2).

Таблица 2 - фенотиазинов в системе бензол - метанол

Вещество Соотношение бензола и метанола в элюенте

10:0 9:1 7:3 5:5 3:7 1:9 0:10

Аминазин 0,00 0,37 0,66 0,71 0,58 0,45 0,45

Перициазин 0,00 0,18 0,61 0,80 0,76 0,68 0,69

Эгаперазин 0,00 0,19 0,63 0,78 0,75 0,65 0,59

Нонахлазин 0,00 0,21 0,61 0,72 0,64 0,57 0,52

Сонапакс 0,00 0,30 0,64 0,68 0,50 0,40 0,37

Трифтазин 0,00 0,27 0,64 0,74 0,64 0,53 0,44

Тизерцин 0,00 0,50 0,65 0,77 0,66 0,56 0,54

Графический вид зависимости Яг от состава элюента для всех исследуемых веществ идентичен и на рисунке 4 приведен пример для аминазина.

0,8

0,2

0,в

0,4

о

0,00 0,20 0.40 0,60 0,80 1,00

Рисунок 4 - Зависимость аминазина от объемной доли метанола в смеси с бензолом

Как видно, такая зависимость имеет максимум и отличается от классического вида зависимости - состав при использовании в качестве элюента бинарной смеси гексан - полярная добавка, в соответствии с которой монотонно возрастает с увеличением доли полярной добавки.

Это дало основание предположить, что содержание полярного модификатора в рассмотренных системах элюирования не является определяющим фактором для величины Яг по сравнению с вариантами использования гексана в качестве разбавителя Многовариантность задачи оптимизации хроматографической системы делает эту работу достаточно трудоемкой и для ее успешной практической реализации необходима информация о возможных типах физико-химических взаимодействий и закономерностях изменения параметров удерживания, на основании которых можно было бы получить эмпирические зависимости, описывающие экспериментальные данные. Для этого необходим подбор парамсров, отражающих все возможные типы взаимодействий, присутствующи> в рассматриваемой системе- дисперсионные, диполь-дипольные, кислотно-основны;.

С учетом этих факторов форма экспериментальной кривой, показанной на рисунке 4, описывается уравнением зависимости значений Rf для одного из веществ от физико-химических параметров элюента следующего вида:

Rf = ао + a,f(e) + a2f(n) + а3Рхе + a4Pxd + a5Pxn, (1)

где fife) - функция диэлектрической проницаемости элюента, f(n) - функция коэффициента преломления элюента, Рхе - параметр элюента, характеризующий его как акцептор электрона (по Снайдеру), Pxd - параметр элюента, характеризующий его как донор электрона и Рхп - параметр элюента, характеризующий его как диполь Функции f(e) и f(n) характеризуют неспецифическую сольватацию растворителя, обусловленную полярностью и дисперсионными взаимодействиями Данные по е и п аппроксимированы полиномом второй степени в координатах е(п) - состав смеси. Коэффициенты корреляции составляют 0,9992 и 0,9998 соответственно.

Параметры Рхе, Pxd и Рхп включены в уравнение (1) для характеристики кислотности и основности элюентов. Их значения рассматривались как аддитивная сумма составляющих её растворителей.

Расчет коэффициентов ао-а5 для каждого вещества проводился решением сисгемы уравнений вида (1) для шести различных составов элюентов. Полученные зна«ния коэффициентов приведены в таблице 3.

Таблица 3 - коэффициенты ао-а5

Вещество ао ai а2 аз 34 а5 г

Аминазин -16,45 2,95 28,64 2,93 1559,82 -1106,74 0,9908

Пгрициазин 17,49 6,14 -35,25 0,84 1775,42 -1267,57 0,9948

Этаперазин 10,06 4,74 -22,90 -0,22 755,80 -539,43 0,9991

Нэнахлазин 8,70 5,61 -17,87 0,86 1328,79 -948,08 0,9969

Сонапакс -0,52 6,15 1,72 2,79 2170,90 -1546,55 0,9880

Трифтазин -0,73 4,08 -2,29 1,17 1241,22 -882,77 0,9971

Тизерцин -39,28 0,02 69,70 3,71 982,17 -689,82 0,9974

Анализ данных таблицы 3 на наличие связи между коэффициентами а0-а5 показал, что коэффициенты корреляции выше 0,9 имеются между: Эо-Э] (0,9303); а0-а2 (-0,9989); а[-а2 (-0,9126) и а4-а5 (-0,9999). Наличие корреляции свидетельству!,т о взаимосвязи между соответствующими параметрами и предложенное уравнение (1) может быть упрощено, однако это приведет к снижению точности расчета. Отрицательная корреляция между коэффициентами а1 и а2, а также а+и указывает на обратно-пропорциональную связь между специфическим и неспецифическим взаимодействием сорбата с элюентом. Величина коэффициента а3 незначительна по сравнению со значениями а» и а5, что свидетельствует о том, что свойства элюента в данной системе как акцептора электрона проявляются в наименьшей степени. Вместе с тем, исключение из уравнения какого-либо параметра приводило к значительному снижению точности расчета.

Знаки «+» и «-» указывают на вклад соответствующего параметра в величину удерживания. Рхс! увеличивает и уменьшает удерживание, а Рхп, наоборот, уменьшает Яг и увеличивает удерживание. Это напрямую связано со свойствами сорбата и сорбента Специфическое кислотно-основное взаимодействие сорбага с элюентом препятствует его сорбции на сорбенте, а неспецифическое диполь-дипольное, наоборот, способствует.

С учетом вышеизложенных зависимостей уравнение (1) принимает вид:

= ао + а, ^е) + а2{(п) + а1р<рР, + а2р(1 - ср)Р2 (2)

Уравнение (2) более наглядно, из него видно, что величина пропорциональна полярности каждого из растворителей В случае если полярнэсть одного из растворителей равна нулю, то Яг зависит только от полярности второго компонента смеси, что реализуется в случае использования гексана в качестве одного из компонентов элюента. Коэффициенты а1р и а2р можно интерпретировать как суммарный вклад каждого растворителя в полярность элюента с учетом рассмотренных выше типов взаимодействий.

Рассчитанные значения коэффициентов а1р и а2р для соединений фенотиазинового ряда представлены в таблице 4.

Таблица 4 - коэффициенты а,р и а2р

Вещество а2р

Аминазин 1,79 1,48

Перициазин -2,08 -1,95

Этаперазин -0,94 -1,05

Нонахлазин -1,23 -1,16

Сонапакс -0,62 -0,49

Трифтазин 0,21 -0,03

Тизерцин 4,73 4,01

Высокая степень корреляции между коэффициентами а1р и а2р (г = 0,9989) свидетельствует о том, что сольватация исследуемых веществ элюентом происходит по одному механизму.

С использованием полученных коэффициентов ао-а5 были рассчитаны значения для исследуемых веществ в тех же элюентах (таблица 5).

Таблица 5 - Рассчитанные значения Яг для системы бензол - метанол

Вещество Соотношение бензола и метанола в элюенте

10:0 9:1 7.3 5:5 3:7 1:9 0:10

Аминазин 0,00 0,33 0,70 0,71 0,62 0,51 0,45

Перициазин 0,00 0,13 0,66 0,80 0,81 0,75 0,69

Эгаперазин 0,00 0,17 0,65 0,78 0,77 0,67 0,59

Нонахлазин 0,00 0,17 0,65 0,72 0,68 0,58 0,52

Сонапакс 0,00 0,24 0,70 0,68 0,56 0,43 0,37

Трифтазин 0,00 0,23 0,68 0,74 0,68 0,53 0,44

Тизерцин 0,00 0,47 0,78 0,77 0,68 0,59 0,54

Расхождение между расчетными и экспериментальными данными не превышает 0,07.

Таким образом, полученное уравнение, позволяет прогнозировать значение Яг некоторых соединений фенотиазинового ряда на пластинах с силикагелем в системе бензол-метанол. Данное уравнение применимо для целей направленного скрининга и,

при наличии данных о произвольной группы веществ для шести базовых составов элюентов позволяет рассчитать оптимальный состав элюента для разделения любой гипотетической смеси веществ из этой группы. В случае большого числа веществ процедуру расчета и оптимизации хроматографических параметров целесообразно проводить с использованием ЭВМ.

Использование величины для идентификации и сопоставления результатов исследований, полученных в разных лабораториях, затруднено низкой воспроизводимостью свойств хроматографических пластинок разных производителей и даже разных партий.

С учетом методического подхода Карташова В. А. по исследованию воспроизводимости параметра относительной миграции веществ нами было предложено использовать произвольное количество стандартных веществ, причём величины миграции рассчитываются по формуле:

м =м + К/°~ва К/,,ст

отн итн.и.ст п п

/ест [и .ст

где Мотн - относительная миграция вещества, М^,, ,(ст - относительная миграция нижнего стандарта, ва, „ ст, ЯГв ст - вещества, нижнего и верхнего стандартов соответственно.

Величина относительной миграции для линии старта равна 0, первого стандартного вещества - 1, второго - 2, третьего - 3, и т.д.

Для проверки эффективности такого подхода к идентификации компонентов сложных смесей использовали вещества разных классов, поскольку литературных данных по отдельному классу производных фенотиазина недостаточно для проведения подобных расчетов.

Использовали 5 хроматографических систем, из них первые 4 из числа 10-ти стандартных, применяемых в химико-токсикологическом анализе с различными элюентами: ацетон (1, 5), этилацетат-метанол-25%аммиак (17:2:1) (2), метанол (3), хлороформ-метанол (9:1) (4) При использовании в качестве подвижной фазы ацетона и смеси хлороформ-метанол (9 1) пластинки обрабатывали 0,1М раствором КОН

Сравнивали рассчитанные значения относительной миграции по литературным и экспериментальным данным В системе 1 в качестве стандартных вещесч в были выбраны прокаин и седуксен, в системе 2 - изониазид и папаверин, в системе 3 - хинин, галоперидол и папаверин и в системе 4 - димедрол и папаверин. Полученные результаты для систем 1-4 представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Значения относительной миграции

Название Мотн

Ацетон 0.1М КОН(1) EtAc-MeOH-NH3 (25%) (2) МеОН (3) СНС13-МеОН (9:1) (4)

Эксп. Табл. Эксп. Табл. Эксп. Табл. Эксп. Табл.

Церукал 0,51 0,44 1,53 1,55 0,58 0,67 0,37 0,22

Обзидан 0,41 0,24 1,61 1,58 0,89 0,75 0,51 0,31

Циннаризин 2,07 2,15 - - 3,16 3,20 2,11 2,38

Прокаин 1,00 1,00 2,18 2,04 - - 1,07 0,94

Лидокаин 2,09 2,10 2,27 2,36 3,10 2,83 2,02 2,23

Изоптин 1,25 1,42 2,18 2,17 1,37 1,71 1,82 2,15

Папаверин 1,47 1,52 2,00 2,00 3,00 3,00 2,00 2,00

Курантил 1,00 1,42 1,53 1,30 3,17 3,31 1,32 1,13

Изониазид - - 1,00 1,00 1,98 2,18 0,54 0,34

Амитриптилин 0,68 0,50 2,18 2,04 0,87 0,97 1,22 0,97

Атропин 0,11 0,04 - - 0,32 0,23 0,21 0,10

Димедрол 0,63 0,50 1,96 1,98 0,82 1,05 1,00 1,00

Тразикор 0,40 0,44 - - 0,86 0,71 0,50 0,34

Галоперидол 1,04 1,11 2,07 2,17 2,00 2,00 0,93 0,82

Кодеин 0,25 0,10 - - 0,67 0,75 0,66 0,55

Дипразин 0,60 0,57 - - 0,94 1,13 1,29 1,07

Седуксен 2,00 2,00 - - 3,09 3,31 2,02 2,23

Хинин 0,26 0,14 - - 1,00 1,00 0,53 0,34

Полученные значения лежат в пределах разброса относительно идеальной кривой, соответствующей идентичности экспериментальных результатов и величин

16

относительной миграции, рассчитанных по справочным данным, что подтверждается величиной Меритерия (Р = 0,95)

ВЭЖХ определение производных фенотиазина в биологических объектах

Для подтверждения результатов скрининга и количественного определения производных фенотиазина использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Установлено, что все соединения, за исключением нонахлазина, имеют три максимума поглощения в диапазонах 200-210 нм и 250-260 нм, поэтому в качестве рабочих волн детектирования выбрали 254 и 210 (для нонахлазина) нм

Методику количественного определения фенотиазинов разрабатывали в обращенно-фазовом режиме хроматографии на колонках с различной эффективностью Варьировали состав и концентрацию подвижной фазы

Наиболее положительные результаты получили при использовании колонки Нуклеосил-С,8 и элюента, составленного из фосфатного буфера с концентрацией 50 мМ в смеси с ацетонитрилом в соотношении 60 40, а также на колонке Диасорб-130С1бТ с тем же буфером в соотношении с ацетонитрилом 45 55 Вид хроматограмм, полученных в этих условиях, представлен на рисунках 5 и 6.

Найденные оптимальные режимы были проверены на возможность применения для анализа реального биологического объекта. Установили, что из матрицы пробы получается два хроматографических пика с низкими временами удерживания и наиболее близкий к ним перициазин выходит отдельно от пиков матрицы пробы и может быть обработан

В работе для количественной оценки результатов анализа мы применяли метод абсолютной градуировки Для построения калибровочной зависимости использовали растворы исследуемых веществ в диапазоне концентраций от 5 до 200 мкг/мл. Более высокие концентрации не использовали из-за возможной перегрузки колонки и исходя из реальных концентраций в анализируемых объектах

Графический вид полученных зависимостей представлен на рисунке 7

5 - сонапакс, 6 - трифтазин, 7 - тизерцин Рисунок 5 - Хроматограмма модельной смеси фенотиазинов при соотношении буфер-ацетонитрил 60:40

1 - аминазин, 2 - перициазин, 3 - этаперазин, 4 - нонахлазин,

5 - сонапакс, 6 - трифтазин, 7 - тизерцин Рисунок 6 - Хроматограмма модельной смеси фенотиазинов при соотношении буфер-ацетонитрил 45:55

1 - аминазин, 2 - перициазин, 3 - этаперазин, 4 - нон^хлазин, 5 - сонапакс, 6 - трифтазин, 7 - тизерцин Рисунок 7 - Зависимость аналитического сигнала от концентрации фенотиазинов

Для оценки эффективности методики определили степень извлечения определяемых компонентов из матрицы пробы методом ВЭЖХ в подобранных условиях анализа Полученные результаты представлены в таблице 7

Таблица 7 - Степень извлечения фенотиазинов из матрицы пробы

Название Степень извлечения, (р, %

Аминазин 82±5

Перициазин 77±5

Этаперазин 75±5

Нонахлазин 78±5

Сонапакс 81±5

Трифтазин 75±5

Тизерцин 84±5

В случае проведения направленного анализа на наличие в образце конкретного вещества схему анализа можно представить в виде последовательности образец -пробоподготовка - скрининг - подтверждение - результат

19

Все виды задач можно разделить на три группы: 1 - когда нужно определить конкретно оговоренное соединение; 2 - когда нужно определить соединение из какого-либо списка; 3 - когда об определяемом соединении ничего неизвестно. Для каждой такой задачи нужна своя методика анализа

По вышеизложенной схеме нами проводился систематический анализ реального биологического образца на наличие в нем фенотиазинов. Для пробоподготовки образца применили метод ТФЭ, скрининг образца проводили с использованием метода ТСХ, а подтверждающий анализ - ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием. Для скрининга применили систему ацетон-25% аммиак (100 1), а подтверждение провели на колонке Диасорб-130С1бТ с элюентом фосфатный буфер (50мМ) - ацетонитрил (45:55) ТС-хроматограмма показана на рисунке 8.

В пробе обнаружено вещество со значением = 0,65, которое по положению на пластинке соответствует таким соединениям как аминазин = 0,67) и перициазин (Яг=0,64). ВЭЖХ-хроматограмма анализируемого образца представлена на рисунке 9, которая показала на наличие 0,80±0,12 мкг/мл перициазина.

Рисунок 8 - ТС-хроматограмма экстракта биологического объекта

А 2,0

0 10 20 мин

1 - перициазин

Рисунок 9 - Хроматограмма экстракта биологического объекта

Предложенная схема аналитического контроля является возможным вариантом реализации схемы ненаправленного систематического анализа.

ВЫВОДЫ

1. Разработана аналитическая схема систематического анализа биологических объектов для определения производных фенотиазина, включающая ТФЭ, ТСХ-скрининг и подтверждение результатов скрининга методом ВЭЖХ, обеспечивающая определение с относительной погрешностью 15% и чувствительностью 1-10мкг/мл для разных веществ соответственно.

2. Реализован новый метод количественной тонкослойной хроматографии для определения производных фенотиазина в биологических объектах на основе компьютеризированной обработки сканированных изображений хроматографических пластин. Установлен диапазон линейности для производных фенотиазина с нижним пределом 0,1-1,0 мкг и верхним пределом 5 мкг.

3. Изучены закономерности удерживания производных фенотиазина на силикагеле и построено параметрическое уравнение зависимости Яг в тонкослойной хроматографии от физико-химических свойств элюента, позволяющее теоретически

оптимизировать его состав в системе бензол-метанол Установлено, что основными параметрами, влияющими на величину Rf, являются диэлектрическая проницаемость, коэффициент преломления, кислотность, основность и полярность элюента. 4 Проведены исследования сорбционных свойств сверхсшитого полистирола по отношению к производным фенотиазина, определена удельная динамическая емкость и десорбирующие объемы различных органических растворителей, показана возможность использования сверхсшитого полистирола для экстракции фенотиазинов из биологических проб с эффективностью 75-85%.

5. Оптимизированы условия ТСХ-скрининга и ВЭЖХ определения фенотиазинов в биологических объектах. Минимизирован объем ТФЭ извлечения. Подобраны 10 ТСХ систем элюирования, обеспечивающих разделение и определение производных фенотиазина, а также условия ВЭЖХ анализа на колонке Нуклеосил-С^ с элюентом буфер-ацетонитрил (60:40) и на колонке Диасорб-130С16Т с элюентом (45 55).

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях

1. Клищенко РА., Удалов A.B., Киселева HB. Автоматизированная система скрининга токсикантов в биологических продуктах / Материалы Международной конференции «Новые технологии и приложения современных физико-химических методов для изучения окружающей среды», Ростов-на-Дону, 25-28 сентября, 2001, с. 35.

2. P.A. Клищенко, Н.В. Киселева, A.B. Удалов, З.А. Темердашев Идентификация компонентов но данным ТСХ-алализа с использованием параметров относительного удерживания / Материалы Всероссийского симпозиума «Современные проблемы хроматографии», Москва, 18-22 марта, 2002, с. 122.

3. З.А. Темердашев, Н В Киселева, А В Удалов, Р А Клищенко Методика ТСХ-скрининга биообъектов на основе величин относительной миграции компонентов / Материалы Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии», Краснодар, 6-11 октября, 2002, с 114.

4. 3 А. Темердашев, Н.В. Киселева, А В. Удалов, Р А Клищенко Методика ТСХ-скрининга биообъектов на основе величин относительной миграции компонентов / Журнал аналитической химии, 2003, т. 58, №7, с. 722-723.

5 РА Клищенко, H В. Киселева, 3 А Темердашев, А В. Удалов Некоторые закономерности удерживания производных фенотиазина на силикагеле в тонкослойной хроматографии / Материалы Всероссийского симпозиума «Хроматография и хроматографические приборы», Москва, 15-19 марта, 2004, с 259

6. Н.В. Киселева, A.B. Удалов, 3 А Темердашев, Р.А Клищенко ТСХ-скрининг сильнодействующих лекарственных препаратов в биологических объектах / Экологический вестник научных центров ЧЭС, 2004, №2, с. 25-30.

7. Н.В. Киселева, A.B. Удалов, 3 А. Темердашев, Р А Клищенко Изучение возможности количественного определения аминазина методом ТСХ / Материалы Всероссийской конференции «Аналитика России», Москва, 27 сентября - 1 октября, 2004, с. 190.

8. P.A. Клищенко, Н.В. Киселева, З.А Темердашев, A.B. Удалов Хроматографическая идентификация производных фенотиазина при анализе биологических жидкостей / Материалы Ш Международной конференции «Новые технологии и приложения современных физико-химических методов для изучения окружающей среды», Ростов-на-Дону, 21-25 марта, 2005, с. 215.

9. З.А Темердашев, Н.В. Киселева, Р А. Клищенко, A.B. Удалов Разделение и концентрирование производных фенотиазина / Материалы II Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии», Краснодар, 25-30 сентября, 2005, с. 270.

10 HB Киселева, З.А Темердашев, P.A. Клищенко Особенности ТСХ-скрининга производных фенотиазина / Известия вузов. Северо-Кавказский регион Естественные науки, 2005, №3, с. 59-61.

11. HB Киселева, А.В Удалов, 3 А Темердашев, Р А Клищенко Разделение и идентификация соединений ряда фенотиазина методом тонкослойной хроматографии /Журнал аналитической химии, 2006, т 61, Xsl, с. 6-9

Кубанский государственный университет 350040 г. Краснодар, ул. Ставропольская № 149. Типография КубГУ 350023 г. Краснодар ул. Октябрьская № 25 Заказ №187 Тираж 100

í i

I

I I

í»

s

1

i

r \

I ¡

J

РНБ Русский фонд

2007-4 6576

уС ¿ ч <■• С S I \ » g- % <* \

v|s * У

а»'

? q 7005

ВВЕДЕНИЕ.

1. Обзор литературы.

1.1. Физико-химические свойства производных фенотиазина.

1.2. Определение производных фенотиазина в биообъектах.

1.2.1. Общие проблемы пробоподготовки.

1.2.2. Методы определения фенотиазинов.

1.2.2.1. Идентификация по качественным реакциям.

1.2.2.2. Спектральные методы.

1.2.2.3. Метод тонкослойной хроматографии.

1.2.2.4. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

1.2.2.5. Метод газовой хроматографии. i* 1.2.2.6. Электрофорез.

1.3. Скрининг.

1.4. Анализ метаболитов.

1.5. Выводы к литературному обзору и постановка задач исследования

2. Экспериментальная часть и обсуждение результатов.

2.1. Использованное оборудование и материалы.

2.2. Теоретическое и экспериментальное обоснование аналитической схемы определения производных фенотиазина методом тонкослойной хроматографии.

2.2.1. Твердофазная экстракция.;.

2.2.2. Тонкослойная хроматография.

2.2.2.1. Экспериментальный поиск оптимального элюента.

2.2.2.2. Описание хроматографического процесса.

2.2.2.4. Количественное определение исследуемых веществ на основе метода тонкослойной хроматографии.

2.2.3. Определение фенотиазинов методом ВЭЖХ.

2.2.3.1. Оптимизация условий хроматографирования фенотиазинов.

2.2.3.2. Количественное определение методом ВЭЖХ.

2.2.4. Построение аналитической схемы определения фенотиазинов.

ВЫВОДЫ.

При лечении психических и неврологических заболеваний широко используются препараты, обладающие нейролептическим действием, рекомендованные и утвержденные перечнем Минздрава России. Заметное место в нем занимают производные фенотиазина. Выбор назначаемых препаратов из числа рекомендуемых и их дозы зависят от состояния больного и выраженности того или иного синдрома. Поэтому в терапевтической практике, а также при диагностике отравлений несомненный практический интерес представляет разработка унифицированной методики контроля такого рода препаратов.

В судебной и клинической токсикологии для рутинного скрининга наркотических, лекарственных веществ и их метаболитов в биологических средах широко используются различные виды хроматографии [1-9]. Особую популярность в настоящее время приобретает систематический токсикологический анализ, так как такой подход позволяет с высокой степенью надежности определять широкий спектр токсикантов в биообразцах.

Обычная стратегия аналитической процедуры токсикологического анализа включает на первом этапе скрининговые тесты, на втором этапе подтверждающий анализ проб, дающих положительные реакции при скрининге, вторым независимым методом с количественным определением идентифицируемого вещества. Такая двухступенчатая процедура оптимальна для анализов, в которых идентифицируются вещества, входящие в определенный ограниченный перечень. Однако в судебной и особенно в клинической токсикологии не всегда возможно ограничиться заранее определенным списком веществ, и для скрининга необходимо использовать метод, охватывающий как можно более широкий круг потенциальных токсикантов определенного класса. Существующие методики направлены главным образом на групповую идентификацию и контроль отдельных наиболее часто используемых веществ и обладают различными недостатками по селективности и чувствительности. В этой связи практический интерес представляет разработка унифицированной методики скрининга соединений класса фенотиазина для терапевтической практики, а также при диагностике отравлений.

Целью настоящей работы являлась разработка унифицированной аналитической схемы хроматографического определения производных фенотиазина в биологических средах для терапевтической практики и токсикологии.

В соответствии с этим в работе решались следующие задачи:

- обоснование и построение оригинальной схемы скрининга биологических объектов для идентификации производных фенотиазина методом тонкослойной хроматографии;

- поиск и исследование методов концентрирования и разделения для извлечения производных фенотиазина из биологических жидкостей;

- оптимизация условий ТСХ-скрининга фенотиазинов;

- разработка методики количественного определения производных фенотиазина методом ВЭЖХ.

Диссертационная работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ-юг грант №03-03-96542)

1. Обзор литературы

ВЫВОДЫ

1. Разработана аналитическая схема системного анализа биологических объектов для определения производных фенотиазина, включающая ТФЭ, ТСХ-скрининг и подтверждение результатов скрининга методом ВЭЖХ, обеспечивающая определение с относительной погрешностью 15% и чувствительностью 1-10 мкг/мл для разных веществ соответственно.

2. Реализован новый метод количественной тонкослойной хроматографии для определения производных фенотиазина в биологических объектах на основе компьютеризированной обработки сканированных изображений хроматографических пластин. Установлен диапазон линейности для производных фенотиазина с нижним пределом 0,1-1,0 мкг и верхним пределом 5 мкг.

3. Изучены закономерности удерживания производных фенотиазина на силикагеле и построено параметрическое уравнение зависимости Rf в тонкослойной хроматографии от физико-химических свойств элюента, позволяющее теоретически оптимизировать его состав в системе бензол-метанол. Установлено, что основными параметрами, влияющими на величину Rf являются, диэлектрическая проницаемость, коэффициент преломления, кислотность, основность и полярность элюента.

4. Проведены исследования сорбционных свойств сверхсшитого полистирола по отношению к производным фенотиазина, определена удельная динамическая емкость и десорбирующие объемы различных органических растворителей, показана возможность использования сверхсшитого полистирола для экстракции фенотиазинов из биологических проб с эффективностью 75-85%.

5. Оптимизированы условия ТСХ-скрининга и ВЭЖХ определения фенотиазинов в биологических объектах. Минимизирован объем ТФЭ извлечения. Подобраны 10 ТСХ систем элюирования, обеспечивающие разделение и определение производных фенотиазина, а также ВЭЖХ определение на колонке Нуклеосил-Cig с элюентом буфер-ацетонитрил (60:40) и на колонке Диасорб-НОС^Т с элюентом буфер-ацетонитрил (45:55).

1. О.Н. Drummer, S. Horomidis, S. Kourtis, M.L. Syrjanen, P.Tippett / J. Anal. Toxicol., 1994, V. 18, p. 134-138.

2. D.J. Ehresman, S.M. Price, D.J.Lakatua / J. Anal. Toxicol., 1985, V. 9, p.55-62.

3. V.W. Watts, T.F.Simonick // J. Anal. Toxicol., 1986, V. 10, p. 198-204.

4. H.H. Maurer / J. Chromatogr. B, 1992, V. 580, p. 3-41.

5. R.A. Brainthnaite, D.R. Jarvie, P.S.B. Minty, D. Simpson, В. Widdop // Ann. Clin. Biochem., 1995, V. 32, p. 123-153.

6. D. Simpson, R.A. Brainthnaite, D.R. Jarvie, M.J. Stewart, S. Walker,

7. W. Watson, B. Widdop // Ann. Clin. Biochem., 1997, V. 34, p. 460-510.

8. H.H. Maurer // Med. Focus., 1994, V. 12, p. 32-36.

9. M.R. Moeller // J. Chromatogr. B, 1992, V. 580, p. 125-134;

10. O.H. Drummer / J. Chromatogr. B, 1999, V. 733, p. 27-45.

11. S.A. Barker / Matrix solid-phase dispersion // J. Chromatogr. A., 2000, V. 885, p. 115-127.

12. C.K. Еремин, Б.Н. Изотов, H.B. Веселовская // Анализ наркотических средств, 1993.

13. Е.М. Koves / Use of high-performance liquid chromatography-diode array detection in forensic toxicology // Journal of Chromatography A, 1995, 692, 103-119.

14. Филиппова Г.Т. / Применение физико-химических методов к анализу производных фенотиазина // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук (15.00.02), М., 1978.

15. Ярыгина Т.П. / Анализ и изолирование некоторых производных фенотиазина на основе их реакций соле- и комплексообразования // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук (15.00.02), М., 1977.

16. В.Е. Чичиро, З.П. Пономарева / Применение хроматографии в тонком слое сорбента в фармацевтическом анализе (Сообщение 3) // Фармация, 1967, №1, с. 78-83.

17. А.А. Андерсон // Жидкостная хроматография аминосоединений, 1984,295.

18. А.А. Андерсон // Газовая хроматография аминосоединений, 1982, 374.20 3. Дейл, К. Мацек, Я. Янак // Жидкостная колоночная хроматография, 1978, т. 3, С. 428.

19. А.П. Арзамасцев, Д.Б. Никуличев, Д.М. Попов, А.В. Соколов / Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе лекарственных препаратов (Обзор) // Химико-фармацевтический журнал, 1989, №4, с. 486^491.

20. M.M. Hefnawy / Analysis of certain tranquilizers in biological fluids // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, V. 27, p. 661-678.

21. Кувырченкова И.С. / Сравнительное изучение физико-химических свойств и разработка методов оценки качества производных фенотиазина // Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук (15.00.02), М., 1982.

22. В.Г. Беликов, Г.Ф. Моисеева / Фармацевтический анализ производных фенотиазина по реакции окисления // Фармация, 1986, №3, с. 87-90.

23. Н.В. Егоров, Т.П. Казакова, М.И. Шмарьян / Систематический ход анализа при идентификации некоторых производных фенотиазина // Фармация, 1972, №2, с. 62-64.

24. Н.В. Егоров, Т.П. Казакова, М.И. Шмарьян / Систематический ход анализа при идентификации некоторых производных фенотиазина // Фармация, 1974, №5, с. 72-74.

25. Rabkin М. / Rapid microchemical identification of four phenothiazine antiemetics with gold bromide and iodine-potassium iodide reagents: collaborative study. // J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1985, V. 68, №3, p. 527-529.

26. A.B. Котов, T.M. Зайцева / Методы молекулярной спектроскопии в анализе соединений фенотиазинового ряда // Фармация, 1975, №3, с. 85-88.

27. Н.М. Туркевич, Б. Мендыбаев / Основные характеристики электронных полос поглощения фенотиазина и его производных. I. 10-диалкиламиноалкильные производные фенотиазина // Фармация, 1977, №6, с. 43^15.

28. Б. Мендыбаев, Н.М. Туркевич / Основные характеристики электронных полос поглощения фенотиазина и его производных. Сообщение И. Производные 10-пиперазинилпропилфенотиазина// Фармация, 1978, №3, с. 32-35.

29. А.П. Арзамасцев, И.С. Кувырченкова, В.И. Прокофьева / Применение УФ-и ИК-спектроскопии для оценки подлинности производных фенотиазина // Химико-фармацевтический журнал, 1981, №9, с. 102-106.

30. Е.М. Салсматин / Использование спектроскопии в УФ- и видимой областях спектра для определения производных фенотиазина при химико-токсикологическом исследовании биологического материала // Фармация, 1987, №4, с. 46-48.

31. Е.М. Саломатин / Применение УФ-спектроскопии для обнаружения производных фенотиазина при химико-токсикологическом исследовании биологического материала// Фармация, 1987,№5, с. 34-40.

32. А.Р. Трофимов, Е.Г. Кульянов, В.И. Прокофьева / Автоматическая классификация и идентификация производных фенотиазина по колебательным спектрам // Фармация, 1991, №4, с. 37-39.

33. Е. Regulska, М. Tarasiewicz, Н. Puzanowska-Tarasiewicz / Extractive-spectrophotometric determination of some phenothiazines with dipicrylamine and picric acid // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, V. 27, p. 335-340.

34. A. Noirfalise, M.H. Grosjean / Mise en evidence de quelques derives de la phenothiazine par chromatographic en couche mince // Journal of Chromatography, 1964, V. 16, p. 236-237.

35. A. Noirfalise / Mise en evidence de quelques derives phenothiazines par chromatographic en couche mince de silicagel // Journal of Chromatography, 1965, V. 19, p 68-74.

36. A.B. Сибилев, В.И. Прокофьева, А.П. Арзамасцев, М.М. Ламм, Э.И. Кирпичева / Унифицированная методика оценки качества 10-алкилпроизводных фенотиазина на основе ТСХ // Химико-фармацевтический журнал, 1989, №10, с. 1267-1270.

37. А.В. Сибилев, Ц. Дашбалын / Разработка унифицированных хроматографических методик оценки качества производных фенотиазина // Фармация, 1989, №5, с. 75.

38. Ц. Дашбалын, В.И. Прокофьева, А.Е. Егоров, В.В. Каштанова, Е.Б. Нечаева / Применение тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии для идентификации и разделения 10-ацилпроизводных фенотиазина// Фармация, 1989, №6, с. 39-41.

39. С. Korczak-Fabierkiewicz, G. Cimbura / Differentiation of phenothiazine derivatives by locating agent on thin-layer chromatographic plates // Journal of Chromatography, 1970, V. 53, №2, p. 413^114.

40. E.M. Саломатин / Химико-токсикологическое определение левомепромазина // Фармация, 1975, №5, с. 39-44.

41. Clarke E.G.C. // Isolation and identification of drugs. The pharmaceutical press. 1969, p. 416-419.

42. Cochin J., Daly J.W. / The use of thin-layer chromatography for the analysis of drugs. Identification and isolation of phenothiazine tranquilizers and antihistaminic in body fluids and tissues // Pharmacol. Exp. Ther., 1963, V. 139, p. 160-165.

43. I. Zingales / Systematic Identification of Psychotropic Drugs by Thin-Layer Chromatography. Part I // Journal of Chromatography, 1967, V. 31, p. 405-419.

44. I. Zingales / Systematic identification of psychotropic drugs by thin-layer chromatography. Part II// Journal of Chromatography, 1968, V. 34, p. 44-51.

45. A. de Leenheer / Thin-layer chromatography of phenothiazine derivatives and analogues // Journal of Chromatography, 1973, V. 75, p. 79-86.

46. H. Eberhardt, O.W. Lerbs, K.J. Freundt / Die Anwendung der Dunnschichtchromatographie beim Nachweis von Psychotropen Phenothiazin-Derivaten//Arch. Exp. Pathol. Pharmakol., 1963, V. 245, p. 136.

47. C. Cimpoiu, S. Hodisan, M. Tos, С. P, C. Majdik, F.-D. Irimie / Separation of jV-alkyl phenothiazine sulfones by HPTLC using an optimum mobile phase // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2002, V. 28, p. 385-389.

48. Буленков Т.И. // Медицинская промышленность СССР, 1963, №9, с. 26-66.

49. Margasinski Z., Danielak R., Pomazanska Т. и др // Acta Pol. Pharm., 1964, т. 21, c. 253.

50. Margasinski Z., Danielak R., Pomazanska Т. и др // Acta Pol. Pharm., 1964, т. 21, c. 15.

51. Theodore I. et al. // J. pharm. Sci., 1962, V. 51, p. 1169.

52. Rusiecki W., Henneberg M. // Acta pol. Pharm., 1964, V. 21, p. 23.

53. Y. Gaillard, G. Pepin / Use of high-performance liquid chromatography with photodiode-array UV detection for the creation of a 600-compound library. Application to forensic toxicology // Journal of Chromatography A, 1997, V. 763 p.149-163.

54. J.L.E. Reubsaet, S. Pedersen-Bjergaard / Screening for central nervous system-stimulating drugs in human plasma by liquid chromatography with mass spectrometric detection // Journal of Chromatography A, 2004, V. 1031, p. 203-211.

55. Georg Diehl, Uwe Karst / Post-column oxidative derivatization for the liquid chromatographic determination of phenothiazines // Journal of Chromatography A, 2000, V. 890, p. 281-287.

56. Dahl S.G.,.Jakobsen S. / GLC determination of methotrimeprazine and its sulfoxide in plasma //J. Pharm. Sci., 1976, V. 65, №9, p. 1329-1333.

57. Davis C.M., Meyer C.J., Fenimore D.C. / Improved gas chromatographic analysis of chlorpromazine in blood serum // Clin. Chim. Acta, 1977, V. 78, №1, p. 71-77.

58. Laitem L., Bello I., Gaspar P. / Gas chromatographic determination of tranquillizer residues in body fluids and in the meat of slaughtered animals // Journal of Chromatography, 1978, V. 156, №2, p. 327-329.

59. Gillspie T.J;, Sipes I.G. / Sensitive gas-chromatographic determination of trifluoperazine in human plasma // Journal of Chromatography, 1981, V. 223, №1, p. 95-102.

60. P.G.H.M. Muijselaar, H.A. Claessens, C.A. Cramers / Determination of structurally related phenothiazines by capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography // Journal of Chromatography A, 1996, V. 735, p. 395^102.

61. Ching-Erh Lin, Kuo-Hsing Chen / Enantioseparation of phenothiazines in capillary zone electrophoresis using cyclodextrins as chiral selectors // Journal of Chromatography A, 2001,V. 930, p. 155-163.

62. Ching-Erh Lin, Kuo-Hsing Chen, Yu-You Hsiao, Wei-Ssu Liao, Chia-Chong Chen / Enantioseparation of phenothiazines in cyclodextrin-modifled micellar electrokinetic chromatography // Journal of Chromatography A, 2002, V. 971, p. 261-266.

63. R. Wang, X. Lu, M. Wu, Erkang Wang / Separation of promethazine and thioridazine using capillary electrophoresis with end-column amperometric detection // Journal of Chromatography B, 1999, V. 721, p. 327-332.

64. Clesia C. N., Soledad Cardenas, Mercedes Gallego, Miguel Valcarcel / Continuous photometric method for the screening of human urines for phenothiazines // Analytica Chimica Acta, 2002, V. 462, p. 275-281.

65. R.A. de Zeeuw / Drug screening in biological fluids. The need for a systematic approach // Journal of Chromatography B, 1997, V. 689, p. 71-79.

66. B.A. Карташов, B.M. Овсянникова, JI.E. Кудрикова / Вариант TCX-скрининга ядовитых и сильнодействующих азотсодержащих органических оснований // Судебно-медицинская экспертиза, 1982, №3, с. 39-41.

67. Stoll A.L., Baldessarini R.J., Cohen В.М., Finklestein S.P. / Assay of plasma thioridazine and metabolites by high-performance liquid chromatography with amperometric detection // Journal of Chromatography, 1984, v. 32, №2, p. 457-463.

68. P.N. Kaul, M.W. Conway, M.L. Clark / Sensitive Quantitative Determination of Chlorpromazine Metabolites // Nature, 1970, V. 226, p. 372-373.

69. P. Turano, W.J. Turner / Quantitation of Chlorpromazine and its Metabolites by Two-Dimensional Thin-Layer Chromatography and Direct Scanning Microdensitometry // Journal of Chromatography, 1972, V. 64, p. 347-354.

70. C.L. Boehme, H.W. Strobel / High-performance liquid chromatographic methods for the analysis of haloperidol and chlorpromazine metabolism in vitro by purified cytochrome P450 isoforms // Journal of Chromatography B, 1998, V. 718, p. 259-266.

71. C.K. Луканина / Метод определения флюфеназина и его метаболитов при помощи тонкослойной хроматографии // 554-557.

72. I. Liska / Fifty years of solid-phase extraction in water analysis historical development and overview // J. Chromatogr. A, 2000, V. 885, p. 3-16

73. M.E. Leon-Gonzalez, L.V. Perez-Arribas / Chemically modified polymeric sorbents for sample preconcentration // J. Chromatography A, 2000, V. 902 p. 3-16.

74. C.W. Huck, G.K. Bonn / Recent developments in polymer-based sorbents for solid-phase extraction // J. Chromatogr. A, 2000, V. 885, p. 51-72.

75. I. Rodrigues, M.P. Llompart, R. Cela / Solid-phase extraction of phenols // J. Chromat. A, 2000, V. 885, p. 291-304.

76. M.-C. Hennion / Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography // J. Chromat. A, 1999, V. 856, p. 3-54.

77. L.I. Andersson / Molecular imprinting for drug bioanalysis. A review on the application of imprinted polymers to solid-phase extraction and binding assay // J. Chromatogr. A, 2G00, V. 739, p. 163-173.

78. J.S. Fritz, P.J. Dumont, L.W. Schmidt / Methods and materials for solid-phase extraction // J. Chromatogr. A, 1995, V. 691, p. 133-140.

79. N. Delaunay, V. Pichon, M.-C. Hennion / Immunoaffinity solid-phase extraction for the trace-analysis of low-molecular-mass analytes in complex sample matrices // J; Chromatogr. B, 2000, V. 745, p. 15-37.

80. A. Schellen et al. / Generic solid phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast determination of drugs in biological fluids // J. Chromatogr. B, 2003, V. 788, p. 251-259.

81. V.A. Davankov and M.P. Tsyurupa / Structure and properties of hypercrosslinked polystyrene the first representative of a new class of polymer networks // Reactive Polymers, 1990, V. 13, p. 27-42.

82. B.A. Даванков, K.C. Сычев, М.М. Ильин / Применение сверхсшитых полистирольных сорбентов в высокоэффективной жидкостной хроматографии // Заводская лаборатория, 2003, Т. 69, №4, с. 3-7.

83. М.С. Hennion et al. // J. Chromatogr. A, 1995, V. 712, p. 287.

84. V.A. Davankov, C.S. Sychov, M.M. Ilyin, K.O. Sochilina. / Hypercrosslinked polystyrene as a novel type of high-performance liquid chromatography column packing material. Mechanisms of retention. // J. Chromatogr. A, 2003, V. 987 p. 67-75.

85. E.M. Саломатин // Методические рекомендации по химико-токсикологическому определению психотропных соединений фенотиазинового ряда, Казань 1988.

86. I. Zingales // Journal of Cromatography. 1967. V. 31. с. 405-419.

87. V.G. Gimpelson, V.G. Berezkin // J. Liq. Chromatogr, 1988, V. 11. p. 2199.

88. B.G. Belenkii, V.V. Nesterov, E.S. Gankina, M.M. Smirnov / A dynamic theory of TLC // J. Chromatogr, 1967, V. 31, p. 360.

89. G. Guiochon, A. Siouffi, H. Engelhardt, I. Halasz / Study of the performances of TLC. I. A phenomenological approach // J. Chromatogr. Sci., 1978, V. 16, p. 152.

90. G. Guiochon, A. Siouffi / Study of the performances of TLC. II. Band broadening and plate height equation // J. Chromatogr. Sci., 1978, V. 16, p. 470. ^ 99 G. Guiochon, F. Bressole, A. Siouffi / Study of the performances of TLC. IV.

91. Optimization of experimental conditions // J. Chromatogr. Sci., 1979, V. 17, p. 368.

92. G. Guiochon, A. Siouffi / L'optimisation en chromatographic sur couche mince // Analusis, 1979, V. 7, p. 316.

93. A. Siouffi, F. Bressole, G. Guiochon / Optimization in TLC. Some practical considerations // J. Chromatogr., 1981, V. 209, p. 129.

94. G. Guiochon, A. Siouffi / Study of performances of TLC. Spot capacity in TLC // J. Chromatogr., 1982, V. 245, p. 1.

95. L.R. Snyder // Principles of adsorption chromatography, Dekker: New York, 1968.A

96. P.C. Sadek, P.W. Carr, R.M. Doherty, M.J. Kamlet, R.W. Taft, M.H. Abraham // Anal. Chem., 1985, V. 57, p. 2971.

97. M.H. Abraham // Chem. Soc. Rev., 1993, V. 23 p. 660.

98. N.S. Wilson, M.D. Nelson, J.W. Dolan, L.R. Snyder, R.G. Wolcott, P.W. Carr / Column selectivity in reversed-phase liquid chromatography I. A general quantitative relationship // Journal of Chromatography A, 2002, V. 961, p. 171-193.

99. N.S. Wilson, M.D. Nelson, J.W. Dolan, L.R. Snyder, P.W. Carr / Column selectivity in reversed-phase liquid chromatography II. Effect of a change in conditions // Journal of Chromatography A, 2002, V. 961, p. 195-215.

100. N.S. Wilson, J.W. Dolan, L.R. Snyder, P.W. Carr, L.C. Sander / Column selectivity in revei sed-phase liquid chromatography III. The physico-chemical basis of•sselectivity // Journal of Chromatography A, 2002, V. 961, p. 217-236.

101. Схунмакерс П. // Оптимизация селективности в хроматографии. М.: «Мир», 1989, С. 399.

102. Райхардт К. // Растворители и эффекты среды в органической химии. М.: «Мир», 1991, С. 763.

103. Крестов Г.А. // Физико-химические свойства бинарных растворителей. М.: «Наука», 1988, С. 688.

104. D.S. Galanos, V.K. Kapoulas / The paper chromatographic identification of compounds using two reference compounds // Journal of Chromatography, 1964, V. 13, p. 128.

105. A.C. Moffat / The standartization of thin layer chromatographic systems for the identification of basic drugs // Journal of Chromatography, 1975, V. 110, p. 341.

106. J.H. Dhont, C. Vinkenborg, H. Compaan, F.J. Ritter, R.P. Labadie, A. Verweij, R.A. de Zeeuw / Application of Rf correction in TLC by means of two reference Rf values // Journal of Chromatography, 1970, V. 47, p. 376.

107. J.H. Dhont, C. Vinkenborg, H. Compaan, F.J. Ritter, A. Verweij, R.A. de Zeeuw / Application of Rf correction in TLC by means of two reference Rf values III.

108. Results obtained in reversed phase TLC // Journal of Chromatography, 1977, V. 130, p. 205.

109. M.D. van Wendel de Joode, H. Hindriks, J. Lakeman / Rf correction in TLC // Journal of Chromatography, 1979, V. 170, p. 412.

110. Машковский M. Д. // Лекарственные средства: Пособие по фармакотерапии для врачей. 10-е изд., перераб. и доп. - Мн.: «Беларусь», 1987, Т. 1, С. 543.

111. Машковский М. Д. // Лекарственные средства: Пособие по фармакотерапии для врачей. 10-е изд., перераб. и доп. - Мн.: «Беларусь», 1987, Т. 2, С. 528.

112. Волынец М.П. // Количественная тонкослойная хроматография в неорганическом анализе. М.: Наука, 1993, С. 226.

113. J. Bladek // J. Planar Chromatogr., 1993, V. 6, № 6, p. 487.

114. Pondor F. // J. Liq. Chromatogr., 1982, V. 5, № 8, p. 1583.

115. Герасимов A.B.//Журнал аналитической химии, 2001, т. 56, № 4, с. 419.

116. Герасимов А.В. // Журнал аналитической химии, 2003, т. 58, № 3, с. 241.

117. Шатц В. Д., Сахартова О.В. // Высоко-эффективная жидкостная хроматография, Рига, Зинатне, 1988, С. 390.

118. Барам Г.И. // Развитие метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и его применение для решения комплексных аналитических задач: Дис. д-ра хим. наук. Иркутск. 1997.