Универсальная шкала хроматографических времен удерживания биомакромолекул в задачах "скорострельной" протеомики

Придатченко, Марина Леонидовна

Универсальная шкала хроматографических времен удерживания биомакромолекул в задачах "скорострельной" протеомики тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

Придатченко, Марина Леонидовна АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

01.04.17 КОД ВАК РФ

Диссертация по физике на тему «Универсальная шкала хроматографических времен удерживания биомакромолекул в задачах "скорострельной" протеомики»

Автореферат диссертации на тему "Универсальная шкала хроматографических времен удерживания биомакромолекул в задачах "скорострельной" протеомики"

тах рукописи 41.64:543.544

4857700

ПРИДАТЧЕНКО Марина Леонидовна

УНИВЕРСАЛЬНАЯ ШКАЛА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ВРЕМЕН УДЕРЖИВАНИЯ БИОМАКРОМОЛЕКУЛ В ЗАДАЧАХ «СКОРОСТРЕЛЬНОЙ» ПРОТЕОМИКИ

01.04.17. - химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

1 3 ОКТ 2011

Москва 2011

4857700

Работа выполнена в Учреждении российской академии наук Институте энергетических проблем химической физики РАН

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук,

Горшков Михаил Владимирович

Официальные оппоненты: кандидат физико-математических наук

Козловский Вячеслав Иванович

доктор физико-математических наук Таганов Николай Геннадиевич

Ведущая организация: Московский государственный университет

им. М.В.Ломоносова, г. Москва

Защита состоится "26" октября 2011 г. в "П." час. 00 мин. на заседании диссертационного совета № Д 002.112.01 при Институте энергетических проблем химической физики Российской академии наук по адресу: 119334 Москва, Ленинский проспект, д. 38, корп.1, 3 этаж, актовый зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан "_" сентября 2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.112.01 кандидат физико-математических наук

М.Н.Ларичев

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В последние годы одним из наиболее быстро развивающихся направлений в науках о живых организмах стала "протеомика". Основной задачей протеомики является исследование белкового состава клеток живых организмов (протеом). Сложность этой задачи требует использования мощных аналитических средств, способных отслеживать карту протеома, изменяющуюся в зависимости от физиологических и патогенных состояний организма, что оказывает стимулирующее влияние на развитие высокопроизводительных методов так называемой «скорострельной» (в англоязычной литературе "shotgun") протеомики.

К аналитическим средствам, используемым в протеомике, в первую очередь, относятся такие физико-химические методы как масс-спектрометрия и жидкостная хроматография. В настоящее время масс-спектрометрия позволяет проводить измерения масс сложных биоорганических молекул с относительной точностью порядка одной миллионной в широком массовом диапазоне, в то время как воспроизводимость хроматографического разделения сложных смесей биомолекул достигает нескольких секунд в рамках продолжительного (до нескольких часов) хромато-масс-спектрометрического эксперимента. Благодаря прогрессу, достигнутому в последние годы в области хромато-масс-спектрометрических методов анализа биомолекул, одним из перспективных методов высокопроизводительной идентификации белков является подход, основанный на создании и использовании баз данных точных масс и хроматографических времен удерживания пептидных маркеров белков (.Accurate Mass and Time tags, AMT). Создание баз данных AMT требует одновременных усилий со стороны разных исследовательских групп в рамках совместных проектов, однако, хроматографические данные в них оказываются привязанными к конкретным экспериментальным условиям и не переносимы с одной инструментальной платформы на другую. В диссертации рассматривается подход к решению этой проблемы. Актуальность темы исследования обусловлена необходимостью развития хромато-масс-спектрометрических методов "скорострельной" протеомики для использования в масштабных исследованиях протеомов живых организмов и их количественного анализа в рамках совместных исследований, включая реализацию международного проекта "Протеом человека".

Цель и задачи исследования

Основной целью работы является развитие метода жидкостной хроматографии на основе баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков для использования его в задачах «скорострельной» протеомики. Для реализации поставленной цели в рамках представленной работы были определены следующие конкретные задачи исследований:

(1) создание единой универсальной временной шкалы на основе концепции линейной корреляции времен удерживания, получаемых в различных экспериментальных условиях;

(2) экспериментальное исследование диапазона хроматографических условий, в которых наблюдается линейная зависимость хроматографических времен удерживания пептидов;

(3) проведение модельных экспериментов, создание прототипов баз данных AMT в универсальной шкале времен удерживания для статистически значимых массивов экспериментальных данных сложных смесей протеолитических пептидов, а также исследование точности представленных в них времен;

(4) теоретическое описание нелинейных эффектов в хроматографии полипептидов, в частности, инверсии времен удерживания пептидов при изменении хроматографических условий разделения;

(5) проверка возможности предсказания времен удерживания белков в обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и идентификация точечных модификаций их аминокислотных последовательностей с целью возможного расширения применимости метода AMT для прямой идентификации белков, минуя стадию протеолитического гидролиза.

Используемые методы исследований

Эксперименты по разделению и идентификации индивидуальных пептидов и их смесей проводились на трех нано ВЭЖХ системах: две Agilent 1100 и одна Ultimate 3000 (Dionex). Каждая из трех ВЭЖХ систем была соединена с гибридными масс-спектрометрами LTQ-FT (Thermo Fisher, Бремен, Германия) с использованием хроматографических колонок со стационарной фазой С ¡s. Для идентификации пептидов применялось несколько методов фрагментации ионов: фрагментация в результате столкновения с молекулами буферного газа (ДАС, CAD) в ионной ловушке и фрагментация в результате захвата медленных электронов (ДЭЗ, ECD) в ловушке ионного циклотронного

резонанса (ИЦР). Спектры фрагментации использовались для восстановления пептидов по базе данных NCBI с помощью поисковых систем Mascot и X ¡Tandem.

В качестве образцов были использованы следующие коммерческие стандарты: триптические гидролизаты белка Cytochrome с и смеси шести белков (6 Protein Mixture: Bovine serum albumin, ß-Galactosidase, Lysozyme, Alcohol dehydrogenase, Cytochrome с, Apo-transferrin) производства компании Dionex/LCPacking (США).

Эксперименты по разделению модельных белков (Cytochrome с из организмов Equine, Bovine, Canine, производства Sigma-Aldrich и Calbiochem) и их пепсиновых гидролизатов были проведены на ВЭЖХ системе Janeiro CNS (Thermo Scientific, Швейцария) с использованием хроматографической колонки со стационарной фазой С]8. Хроматографическая система была соединена с масс-спектрометром LTQ XL (Thermo Scientific, Бремен, Германия), в качестве метода фрагментации родительских ионов был выбран метод CAD.

Расчеты хроматографических времен удерживания производились с помощью модели критической хроматографии биомакромолекул BioLCCC (Liquid Chromatography of Biomolecules at Critical Conditions).

Научная новизна

Впервые было предложено использование физико-химической модели жидкостной критической хроматографии для идентификации полипептидов и белков на основе метода точных масс и времен удерживания AMT, а также предложен и реализован метод приведения хроматографических данных полипептидов и белков к единой временной шкале для создания универсальных баз данных AMT. Обнаружено и впервые описано явление инверсии порядка выхода пептидов с близкими временами удерживания при ВЭЖХ разделении на обращенной фазе в зависимости от их аминокислотного состава и их последовательности при изменении параметров хроматографической колонки (длина, размер пор, внутренний диаметр) и профиля градиента сильного растворителя. Определен масштаб явления инверсии в протеомных исследованиях при изменении профиля градиента сильного растворителя.

Положения, выносимые на защиту

1. Концепция линейности хроматографических данных, получаемых при разделении пептидов в различных экспериментальных условиях.

2. Результаты экспериментальных исследований условий разделения для определения границ применимости концепции линейности хроматографических данных.

3. Метод многоточечной нормализации экспериментальных хроматографических времен пептидов к универсальной временной шкале, основанный на использовании модели критической жидкостной хроматографии макромолекул для предсказания времен удерживания.

4. Результаты определения точности приведения хроматографических данных к единой универсальной шкале времен на основе создания прототипа базы данных АМТ для смесей протеолитических пептидов модельных белков.

5. Результаты исследования явления инверсии порядка выхода пептидов с близкими временами удерживания при ВЭЖХ разделении на обращенной фазе в зависимости от их аминокислотного состава и их последовательности при изменении параметров хроматографической колонки (длина, размер пор, внутренний диаметр) и профиля градиента сильного растворителя. Определение масштаба явления инверсии в протеомных исследованиях.

6. Результаты исследования возможности предсказания времен удерживания целых белков при их разделении методом обращено-фазовой ВЭЖХ. Результаты разделения модельных белков, включая белки-гомологи, отличающиеся точечными мутациями аминокислотных последовательностей и теоретических расчетов их времен удерживания.

Научная и практическая ценность

Полученные результаты могут быть использованы специалистами в области высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также протеомных исследований для решения следующих задач: развитие новых методов разделения смесей сложных веществ органического и биоорганического происхождения; разработка новых разделительных сред, обладающих высокой специфичностью по удерживанию макромолекул с заданными физико-химическими свойствами; фильтрация масс-спектрометрических идентификаций, получаемых при анализе протеомов живых организмов; создание баз данных времен удерживания для высокопроизводительного анализа белков; реализация хроматографически зависимых методов количественного анализа протеолитических смесей на основе мониторинга уникальных фрагментационных переходов МЯМЛЯМ; разработка методов «скорострельной» протеомики на основе многомерной «предсказательной» хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией; а также разработка новых

поисковых протеомных машин, основанных на использовании хроматографических данных.

Личный вклад автора

Материал, представленный в диссертации, получен при непосредственном участии автора в реализации задач исследований, в выполнении экспериментов, в обсуждении и анализе полученных результатов. Диссертационная работа выполнена в период с 2007 по 2011 год.

Апробация работы

Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: 35-ом конгрессе Международного хроматографического общества по высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC-2010 (Бостон, США, 2010), 57-ой и 58-ой конференции Американского масс-спектрометрического общества (Денвер, США, 2008 и Солт-Лейк-Сити, США, 2010 ), VI-ом Российском симпозиуме «Белки пептиды» (Казань, 2009), 50-ой , 51-ой и 52-ой научной конференции МФТИ (Москва, 2008, 2009, 2010), 3-ей международной конференции - школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и энергетике» (Звенигород, 2007), Ш, IV и V Всероссийской конференции с международным участием Всероссийского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007, 2009, 2011).

Работы, вошедшие в диссертацию, были выполнены при поддержке РФФИ (гранты №№ 09-08-00663, 08-04-01339), программы президиума РАН №П8, Американского фонда гражданских исследований и развития АФГИР (грант CDRF RUB1-2909-M0-07) и Международного фонда поддержки науки ИНТАС (гранты №04-83-2643 и Genomics-05-1000004-7759).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 150 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и содержит 13 таблиц. Диссертация состоит из введения, пяти глав, включая литературный обзор, основных результатов и выводов, списка цитируемой литературы, насчитывающей 70 наименований, трех приложений.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы диссертации и сформулирована цель исследования, приведены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 является литературным обзором, посвящена хромато-масс-спектрометрии как основному методу исследования в протеомике. Рассмотрены основные проблемы, возникающие при идентификации белков в биологических смесях, представлены возможные пути их решения. Показаны роль высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе макромолекул и потенциальные возможности теоретических аналитических расчетов хроматографических данных разделяемых биомакромолекул. Приведен обзор существующих математических и полуэмпирических подходов к расчету времен удерживания пептидов.

Глава 2 содержит теоретическое описание модели жидкостной хроматографии биополимеров в критических условиях (ВюЬССС). Рассматриваются основные предположения, которые легли в основу модели ВюЬССС. Также в главе представлено теоретическое описание подхода многоточечной нормализации (МТН) хроматографических данных пептидов и обоснованы критерии выбора единой временной шкалы для реализации такой нормализации.

Основные уравнения градиентной хроматографии. Модель критической жидкостной хроматографии биомакромолекул ВюЬССС аналитически описывается следующей системой уравнений:

В системе уравнений (1), определяющей объем удерживания Уд биомакромолекул в условиях градиентного элюирования, главным является уравнение (1с), связывающее коэффициент распределения Кл численно совпадающий со статистической суммой цепи в поре, с ее микроскопическим строением. Состояние макромолекулы в поре задается цепью случайных

(а) Ф)

(с)

(1)

№

блужданий, описываемых переходной матрицей W. Уравнение (1с) описывает конкуренцию между энергией притяжения, стремящейся упорядочить состояние звеньев на поверхности, и потерями энтропии. Произведение переходных матриц в (1с) некоммутативно и зависит от последовательности аминокислотных остатков. Таким образом, в диссертации показано, что текст последовательности заложен порядком произведения матриц. Модель одновременно учитывает и химическую природу аминокислотных остатков через их энергию адсорбции е,, и их последовательность, место в цепи, а также описывает все возможные режимы разделения - адсорбционный {LAC), эксклюзионный (SEC) и критический (LCCC).

Остальные параметры в системе уравнений (1): V0 - объем межчастичного пространства (объем подвижной фазы), Vp - объем пор (объем неподвижной фазы), D - размер пор, выраженный в единицах размера звена, NB - мольная доля одного из компонентов растворителя, V - объем прокачанного через колонку растворителя. U - единичный вектор-столбец, задающий начальное распределение С-концевой группы в поре. Феноменологическими параметрами модели являются эффективные энергии адсорбции в,, описывающие взаимодействие аминокислотных остатков с поверхностью. Стандартные энергии адсорбции аминокислотных остатков X°i (выраженные в единицах кТ) при pH 2.0 на обращенной фазе С« приведены в таблице 1.

Обозначения аминокислотных остатков соответствуют общепринятым. Параметры, описывающие энергии адсорбции молекул воды и ацетонитрила, равны, соответственно, £д=0 кТ, гв=2,40 кТ. В диссертации использовался тот факт, что природные белки обычно имеют концевые группы H2N- и -СООН, энергии которых составляют - 1,69 кТ и - 0,03 кТ, соответственно.

Таблица 1. Стандартные энергии адсорбции природных аминокислот Х°1, выраженные в единицах кТ. ______

К Н R N G S Q D Т Е

0,266 0,386 0,516 0,614 0,656 0,698 0,746 0,781 0,876 0,984

А Р С Y У М I L F W

1,143 1,143 1,296 1,686 1,751 1,822 2,156 2,298 2,319 2,436

Многоточечная нормализация хроматографических времен удерживания к универсальной шкале времен. В диссертации показано, что, используя

предсказанные времена удерживания для выбранного пептидного стандарта и свойство линейной корреляции хроматографических данных, получаемых в различных условиях разделения, можно ввести новую шкалу времени, в которой экспериментальные значения времен удерживания исследуемых пептидов будут иметь одни и те же (для одних и тех же пептидов) нормализованные времена. Шкала нормализованных времен строится

«Эталон» времен удерживания:

"Теоретический хроматограф: BioLCCC-MS/MS"

Калибровочная смесь:

8 пептидов белка Cytochrome С (Dionex Inc., USA)

Последовательность

KYIPGTK IFVQK

TGQAPGFSYTDANK TGPNLHGLFGR MIFAGIK EDLIAYLK

GITWGEETLMEYLENPKK GITWGEETLMEYLENPK

DTtheor : K1caUb,/

J hear am,,

0.3632 0.3976 0.5966 0.6557 0.6562 0.7731 0.9810 1.0000

Стандартный протокол: 0-50% В за 60 мин; 300 нл/мин Мертвое время = 15 мин 75 мкм X 150 мм; С18; 100 А A: CH3CN :НгО:НСООН (2:97.9:0.1%, по объему) В: CH3CN:H20:HC00H VJ80:19.92:0.08%, по объему)^

Определение калибровочных коэффициентов:

Стандартизация времен удерживания анализируемых пептидов:

КГГ" =a-RT"p+b

Рис.1. Схематическое представление стандартизации экспериментальных времен удерживания пептидов методом многоточечной нормализации с использованием модели ВюЬССС для расчёта теоретических времен удерживания.

следующим образом: выбирается пептидный стандарт, для которого рассчитываются теоретические значения времен удерживания в условиях единого, заранее определенного протокола разделения («базисный» протокол). Далее теоретические времена удерживания для пептидов стандарта нормализуются в диапазоне [0;1], где время удерживания для наиболее гидрофобного пептида стандарта выбирается равным единице. Подставляя экспериментальные и нормализованные теоретические значения времен удерживания для пептидов стандарта в линейное уравнение (2а):

(2а)

определяются калибровочные коэффициенты а и Ь. Используя полученные калибровочные коэффициенты а и Ь, все экспериментальные времена RT"P для исследуемых пептидов переводятся в новую шкалу нормализованных времен с помощью линейного уравнения:

RT,"""" =a-RT"p+b (2b)

Такой подход к стандартизации хроматографических времен удерживания был назван авторами методом многоточечной нормализации (МТН).

Подробное пошаговое описание процедуры стандартизации времен, использованной в данной работе, схематически представлено на Рис.1. В работе в качестве стандартного («базисного») протокола предлагается использовать протокол, являющийся стандартным в микроколоночной хроматографии пептидов. В качестве стандартной смеси для построения шкалы и калибровки разделительных систем были использованы пептиды Cytochrome с.

Глава 3 посвящена экспериментальному исследованию диапазона хроматографических условий, в которых наблюдается линейная зависимость хроматографических времен удерживания пептидов, а также проведению модельных экспериментов, созданию прототипов баз данных АМТ в универсальной шкале времен удерживания для статистически значимых массивов экспериментальных данных сложных смесей протеолитических пептидов и исследованию точности представленных в них времен.

При определении диапазона были рассмотрены условия, типичные для протеомных исследований с использованием методов ВЭЖХ-МС/МС: обращенная фаза С,8 в качестве адсорбента, размер пор в диапазоне от 90 до 300А, смесь вода/ацетонитрил (АЦН) в качестве бинарного растворителя со значениями рН в диапазоне 2,0-^3,0 и линейные профили градиентов с наклоном 0,2-Я ,7% АЦН/мин. В качестве ион-парных агентов в ВЭЖХ-МС, как правило, использовалась муравьиная кислота. Хроматографические колонки, применявшиеся в этих исследованиях, представлены в Таблице 2А. Эксперименты по разделению и идентификации пептидов из гидролизата шести белков проводились в рамках совместной работы с учеными из Университета Уппсалы в Швеции, лаборатории исследования динамики протеомов Министерства атомной энергетики Франции в Гренобле и Института

биохимической физики РАН в Москве с использованием различных инструментальных систем и протоколов ВЭЖХ, представленных в Таблице2Б.

Таблица 2. Условия хроматографических экспериментов, использованных при

При определении диапазона применимости концепции линейности хроматографических данных было показано, что для обращенных фаз С,8 различного типа (силикагелевые, монолитные и полимерные) наблюдается высокая степень линейной корреляции хроматографических данных (в среднем « = 0,985+0,995). В Таблице 3 представлены результаты некоторых экспериментов, в которых изменялись следующие условия разделения: (1) профиль градиента (при фиксированных колонке I и скорости подачи растворителя (300 нл/мин)); (2) скорость подачи растворителя (при фиксированных колонке I и наклоне градиента 0,8% В/мин); а также (3) параметры колонок при разделении в двух различных градиентах 1,7% В/мин и 0,3% В/мин и фиксированном потоке - 300 нл/мин.

тестировании концепции линеиности хроматографических данных.

№ ЖХ Колонка Внутренний диаметр, мкм Длина колонк и, мм Размер частиц, мкм Размер пор, А Фаза

1. РерМар LC Packings 75 15 3 100 С18

II. РерМар LC Packings 75 25 3 100 С18

III. AtlantisCI 8 Waters 75 15 3.5 110 С18

IV. РерМар LC Packings 75 15 5 100 С18

V. PLRP-S LC Packings 75 15 5 300 С18

VI. Chromolith Merck 100 15 - 110 С18 (Monolith)

Лаборатория (I) (Гренобль) Лаборатория (II) (Москва) Лаборатория (III) (Уппсала)

Образец Протеолитическая смесь стандарта 6 белков (Dionex)

ЖХ система Ultimate 3000 (Dionex) Agilent 1100 Agilent 1100

ЖХ колонка PepMapC18 Dionex, 100 A, 3 мкм, 75 мкм X 150 мм Reprosil-Pur C18-AQ 3-мкм silica, 120 А, 75 мкм X 120 мм Reprosil-Pur C18-AQ 3-мкм silica, 120 А, 75 мкм X 150 мм

ЖХ градиент 4-50%В за 60 мин 0-35%В за 120 мин 2-45%В за 91 мин

Расход 300 нл/мин 300 нл/мин 200 нл/мин

Мобильная фаза А: СНзС№Н:0:НС00Н (2:97,9:0,1% по объему) В: CHjCN:H20:HC00H (80:19,92:0,08% по объему) A: C№CN:H20:HC00H (99,9:0,1% по объему) В: СНзС№Н20:НС00Н (80:19,9:0,1% по объему) A: СНзС№Н20:СНзС00Н (2:97,5:0,5% по объему) В: СНзС№Н20:СНзС00Н (89,5:10:0,5% по объему)

Таблица 3. Коэффициенты линейной корреляции экспериментальных времен удерживания пептидов белка Cytochrome с для различных условий разделения, колонок и протоколов._

Фиксированные параметры Значения R2 при различных наклонах градиента

Колонка I-I* 300 нл/мин 1,7 % В/мин 1,4 % В/мин 1,2 % В/мин 0,8 % В/мин 0,4 % В/мнн 0,3 % В/мин

0,992 0,998 0,998 0,997 0,995 0,988

Фиксированные параметры Значения К2 при различных скоростях потока растворителя

Колонка I-I* 0,8 % В/мин 200 нл/мнн 300 нл/мнн 400 нл/мнн

0,998 0,998 0,997

Фиксированные параметры Значения R2 при использовании различных колонок

300 нл/мнн I-I* II-I* III-1* IV-I* V-I* VI-I*

1,7 % В/мин 0,994 0,994 0,978 0,992 0,974 0,990

0,3 % В/мин 0,998 0,992 0,966 0,990 0,967 0.988

Примечание: I* Коэффициенты /с отражают корреляцию времен удерживания при тестируемых условиях с «эталонными» данными, полученными на колонке I (см. Таблицу 2А) при градиенте 0-50% В в течении 60 мин.

Создание прототипа базы данных АМТ для смесей протеолитических пептидов модельных белков методом МТН. Экспериментальная проверка предложенной процедуры нормализации осуществлялась на примере смеси триптических пептидов шести белков. В состав смеси также входили пептиды белка Cytochrome с, по которым осуществлялась нормализация времен удерживания всех пептидов смеси («внутренняя калибровка»). Данные, полученные в различных лабораториях, были объединены в три группы: (1) пептиды, идентифицированные в Москве и Гренобле (174 пептида); (2) пептиды, идентифицированные в Москве и Упсале (103 пептида); а также (3) идентификации, общие для всех трех лабораторий (69 пептидов). При этом стандартные отклонения для полученных нормализованных хроматографических времен идентифицированных пептидов составляли, соответственно: 1,4%, 1,6% и 1,5%. В диссертации показано, что приведение хроматографических времен удерживания, полученных на разных инструментальных платформах и при различных параметрах разделения протеолитической смеси, к единой шкале выявило соответствие между нормализованными временами удерживания для одних и тех же пептидов с точностью порядка 1,5% при калибровке системы ВЭЖХ по внутреннему стандарту.

Продемонстрировано, что использование альтернативных моделей предсказания времен удерживания позволяет получать сопоставимые данные по точности нормализованных времен удерживания. Так, точность «внутренней калибровки» с использованием доступного алгоритма SSRCalc (Sequence Specific Retention Calculator) для расчёта времен удерживания варьировалась в пределах 0,9-1,5%. Следует отметить, что полуэмпирический алгоритм SSRCalc считается наиболее точным алгоритмом вычисления времен удерживания триптических пептидов и широко используется в протеомных исследованиях. Однако, в настоящее время этот алгоритм разработан, во-первых, для ограниченного количества экспериментальных условий разделения, и изменение, например, размера поры, профиля градиента, требует перенастройки алгоритма, а во-вторых, только для триптических пептидов. Модель BioLCCC не имеет указанных недостатков и позволяет рассчитывать времена удерживания при любых условиях ВЭЖХ на обращенной фазе Сщ для произвольно заданных профилей градиента и параметров колонки. При этом в силу малого количества феноменологических параметров модель BioLCCC может быть легко адаптирована для работы с различными фазами.

Предложенная в диссертации процедура нормализации времен удерживания пептидов позволяет стандартизовать экспериментальные данные, полученные в рамках градиентной ВЭЖХ на обращенной фазе типа С;« при различных профилях градиента, параметрах колонок и мобильных фазах. Предложенный подход к нормализации времен удерживания пептидов и приведения их к единой временной шкале может быть использован в задачах идентификации белков методами «скорострельной» протеомики и при создании баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков AMI.

В Главе 4 представлены результаты изучения нелинейных эффектов в хроматографии полипептидов, в частности, явления инверсии времен удерживания пептидов при изменении хроматографических условий разделения и результаты исследования масштаба их влияния на идентификацию пептидов на основе использования баз данных AMI.

Модель BioLCCC позволяет вычислить изменения коэффициентов распределения Kj для выбранных пептидов в зависимости от процентного содержания органического растворителя %АЦН в мобильной фазе и построить кинетические кривые К/%АЦН). В случае пересечения кинетических кривых даже незначительные вариации экспериментальных параметров (габариты колонки при фиксированном размере пор, наклон профиля градиента, скорость

подвижной фазы) могут приводить к изменениям времен выхода полипептидов вплоть до инверсии времен удерживания. В связи с этим, интересным представляется ряд вопросов, связанных с масштабом этого явления. К таким вопросам относятся: зависимость количества пар пептидов с измененными порядками выхода от состава и размера выборки пептидов; масштаб изменения профиля градиента, при котором число пар пептидов с инверсией становится значимым при работе с базами данных AMT, возможность теоретической оценки числа пар пептидов с изменившимися порядками выхода в зависимости от условий хроматографического эксперимента.

В модели BioLCCC при фиксированных энергиях адсорбции аминокислот и компонент мобильной фазы с поверхностью адсорбента, а также при фиксированном размере пор адсорбента, на угол наклона у кинетической кривой влияет не только длина пептида, но и его аминокислотный состав и последовательность. На Рис.2 показана ситуация, когда более длинный пептид в инверсионной паре сильнее удерживается в пологом градиенте, а при более крутом градиенте — наоборот, имеет меньшее время удерживания. Это наиболее распространенная ситуация (примерно 95% всех случаев инверсии порядка выхода) в проанализированных экспериментальных данных. Кинетическая кривая для пептида TGPNLHGLFGR (количество аминокислотных остатков в цепи N = \2, средняя энергия адсорбции пептидах = 0.891 кТ) характеризуется большим углом наклона <р в резко возрастающей части кривой, в то время как для более короткого пептида MIFAGIK (N - 8,Х = 1.099 кТ) этот наклон меньше. При этом оказывается, что в медленном градиенте (Рис.2В) более короткий пептид на протяжении всего эксперимента движется быстрее длинного пептида. В градиенте с резким наклоном (Рис.2Б) характер движения пептидов в колонке меняется: на начальном этапе короткий пептид движется быстрее, но по мере нарастания концентрации АЦН скорость перемещения короткого пептида уменьшается относительно скорости перемещения длинного пептида. В определенный момент времени координаты их положения в колонке становятся равными - эта точка обозначена на рисунке как точка инверсии - после прохождения этой точки длинный пептид начинает обгонять короткий. С точки зрения модели BioLCCC, такая картина разделения трактуется следующим образом. В медленном градиенте при разделении преобладает адсорбционный режим, при котором большим удерживанием характеризуются молекулы большего размера. В то время как, при разделении в градиентах с резким наклоном, по мере нарастания концентрации АЦН происходит смена режима с адсорбционного на эксклюзионный, что приводит к

Длина ВЭЖХ колонки L, мм

Рис.2. (А) Зависимость коэффициента распределения для пептидов TGPNLHGLFGR и MIFAGIK от процентного содержания ацетонитрила в подвижной фазе, где K<j* = 1/(1+K<j), (Б) и (В) кинетические кривые коэффициента распределения от времени для выбранных пептидов в резком (1,3%АЦН/мин) и пологом (0,2%АЦН/мин) градиентах.

изменению порядка выхода пептидов. Графики 2А-В демонстрируют, что пептиды в течение градиентного элюирования движутся в критической области с ускорениями, зависящими от скорости нарастания концентрации более сильного растворителя. При этом для пептидов с близкими временами удерживания существуют экспериментальные параметры разделения, при которых изменение профиля элюирования приводит к инверсии порядка выхода пептидов из колонки. В более нетривиальном случае существуют пары пептидов одинаковой длины, и даже одинакового состава аминокислотных остатков, но разной последовательности, для которых модель предсказывает изменение порядка выхода.

Результаты обработки как полученных автором, так и литературных данных показали, что количество пептидов, вовлеченных в перестановки друг относительно друга при смене градиента, может достигать 90% от общего числа пептидов в выборке. При этом в диссертации показано, что для всех используемых экспериментальных условий минимальное количество пептидов, участвующих в перестановках при смене градиента составило не менее 50% от

общего числа пар в рассмотренной выборке. Отмечено, что явление инверсии порядка выхода пептидов необходимо учитывать при использовании хроматографических времен в качестве фильтра ложно-положительных идентификаций пептидов для предотвращения потери правильных идентификаций (как показал анализ экспериментальных данных, проведенный в работе, такие потери могут достигать ~ 20%).

В главе 5 представлены результаты исследования возможности предсказания времен удерживания целых белков в обращено-фазовой ВЭЖХ и идентификации точечных модификаций их аминокислотных последовательностей с целью возможного расширения применимости метода AMT для прямой идентификации белков без использования протеолитического гидролиза.

Исследование возможности предсказания времен удерживания целых белков при их разделении методом обращено-фазовой ВЭЖХ. В работе на примере литературных данных была продемонстрирована возможность модели BioLCCC предсказывать разделение целых белков в широком диапазоне длин аминокислотных последовательностей. В Таблице 4 представлены хроматографические системы, которые были использованы для разделения следующих белков: Cytochrome с Equine (N = 104, X = 1,026 кТ), Ribonuclease а bovine (N = 124, X = 1,014 кТ), Lysozyme chicken (N = 129, X =1,091 кТ), Rabbit skeletal troponin (N= 159, X = 1,175 kT), Chymotrypsinogen A bovine (N = 245, X = 1,164 kT), Tropomyosin-] rabbit (N = 284, X = 1,080 kT), Enolase baker's yeast (N = 436, X =1,155 kT), Bovine Serum Albumin BSA (N = 583, X =1,173 kT), Ovalbumin chicken (N = 386, X =1,240 kT), myoglobin (N = 152, X =1,159 kT), и Insuline Chain В (N = 36, X =1,132 kT). Последовательности белков были взяты из базы данных UniProt (http://www.uniprot.orp/).

В работе было показано, что модель BioLCCC позволяет предсказывать времена удерживания целых белков с высокой точностью. В частности, для описанных выше белков коэффициент линейной корреляции экспериментальных и расчетных данных составил R2=0,86-0,97. Следует отметить, что такая точность недостижима для альтернативных моделей расчета времен удерживания. Более того, большинство существующих алгоритмов позволяют рассчитывать времена удерживания полипептидов с длинами аминокислотных последовательностей, не превышающими N ~ 50. В работе была продемонстрирована высокая корреляция (R2=0,99-l,00) между расчетными и экспериментальными временами удерживания для одного и того

же белка на разных системах. При этом было сделано заключение, что макроскопические свойства хроматографических систем, а также конкретные

Таблица 4. Хроматографические системы, применяемые для разделения белков (ТФА - трифторуксусная кислота, АЦН - ацетонитрил)._

№ ЖХ колонка Расход, мл/мин Элюент "А" Элюент"В" Профиль градиента, (мин;%В)

1 Aquapore RP 300 С8 220 мм х 4.6 мм 1.0 0.1% ТФУ вН20 0.1% ТФУ в АЦН (0;0) (100; 100)

2 Astee RPC18 150 мм х 6.0 мм 1.0 0.05% ТФУ в H20/CAN (90/10) 0.05% ТФУ в Н20/АЦН (40/60) (0;0) (30; 100)

3 Macrosphere 300 С4 100 мм х 4.6 мм 1.0 0.15% ТФУ в Н20 0.15% ТФУ in H20/ACN (5/95) (0;25) (30; 100)

4 Macrosphere 300, С8, 250 мм х 4.6 мм 1.0 0.15% ТФУ в Н20 0.15% ТФУ в Н20/АЦН (5/95) (0;25) (30; 100)

5 Vydac 228 ТР (218) С18 250 мм х 4.6 мм 1.5 0.25% ТФУ в Н20 0.15% ТФУ в Н20/АЦН (30/70) (0;5) (30; 100)

б Spherisorb ЗООА С18 250 мм х 4.6 мм 1.5 0.1% ТФУ в Н20 100% АЦН (0;20) (30;80)

7 Astee RPC18 150 мм х 5.0 мм 1.0 0.05% ТФУ в H20/ACN (80/20) 0.05% ТФУ в Н20/АЦН (50/50) (0;0) (20; 100)

8 Kromasil С8 250 мм х 4.6 мм 2.0 0.1% ТФУ в Н20 /ACN (90/10) 0.1% ТФУ в Н20/АЦН (10/90) (0;0) (8;25) (20;70)

9 Vydac 219 TPCY С4 250 мм х 4.6 мм 1.0 0.1% ТФУ в Н20 0.1% ТФУ в Н20/АЦН (30/70) (0;0) (50;50) (60;70) (67.5; 100)

10 In-house С8 L мм х 4.6 мм 1.5 0.1% ТФУ в Н20 0.1% ТФУ в АЦН (0;15) (30;60)

условия разделения, достаточно точно учитываются моделью, а их случайные различия усредняются. Другими словами, даже если предсказанное и экспериментальное время удерживания какого-то белка различаются, это различие воспроизводимо на разных системах, т.е. можно использовать времена удерживания, получаемые теоретически, в качестве единой временной шкалы.

Разделения модельных белков-гомологов, возможность теоретического расчета времен удерживания. Возможность предсказывать времена удерживания белков и пептидов в зависимости от их аминокислотной последовательности позволяет решать задачи, связанные с идентификацией белков с незначительными отличиями в последовательности (мутациями) или имеющими модифицированные аминокислотные остатки. Влияние перестановки двух разных аминокислот в цепи (или изменение места модифицированной группы в цепи, что является, по сути одинаковыми задачами) на адсорбционное взаимодействие макромолекулы можно условно

разделить на химическое и физическое. Под первым (химическим) подразумевается взаимное влияние ближайших соседей переставляемых групп. Второе (физическое) влияние более универсально и вытекает непосредственно из связывания аминокислот в цепь и некоммутативности произведения матриц, описывающих такое связывание. В соответствии с этим, даже если перестановка разных аминокислот не приводит к изменению их эффективной энергии и, следовательно, средней энергии звена гомополимера, адсорбционное взаимодействие всей макромолекулы может заметно измениться. Какой из факторов более значим для адсорбционного взаимодействия, зависит от конкретного белка и его последовательности. При определенных обстоятельствах физический фактор усиливается с ростом длины цепи и для длинных макромолекул белков может оказаться определяющим.

94 92 90 -88 ^ 86 -84

Hippopotamus

Oryctolagus Camelus

Hippopotamus

♦ Miniopterus 1 Canine

Bovine

Equine

R = 0.95

♦ все кандидаты □ правильные кандидаты

I 90 Г,«„, mihi

Рис.З. Сравнение расчетных и экспериментальных времен удерживания для белков Cytochrome с разных организмов. Представлены кандидаты, выданные поисковой машиной Mascot по результатам ВЭЖХ/МС/МС анализа протеолитических пептидов этих белков. Условия элюирования белков: A:5%AUH+0.1%FA в Н20; B:95%AIJH+0.1%FA в Н20; градиент 0-35%В за 120 мин; скорость потока 0,2 мл/мин; при комнатной температуре; ЖХ колонка BIO WidePore С18 300 Ä, 150x2,1 мм, 5 мкм.

В диссертации показано, что можно хроматографически различить два близких по последовательности белка, отличающихся, например, заменой или перестановкой нескольких остатков (так называемыми, точечными мутациями). В качестве таких белков с точечными мутациями нами были выбраны белки-гомологи Cytochrome с, принадлежащие разным организмам - Bovine, Equine и Canine. Cytochrome с Bovine отличается от Equine заменой остатков S (47) в положении 47, К G (60), Т<-> G (88), a Canine, соответственно, заменой Т О

S (47), K<r*G (60), К о T (87), Т о G (88), Е<^А (92) и N о К (103). Средние энергии адсорбции для этих белков (без учета концевых групп, дающих одинаковый небольшой вклад) равны: X =1,043 кТ (Equine, Bovine) и X =1,047 кТ (Canine), т.е. очень близки или совпадают. При этом времена удерживания этих белков существенно различаются. Результат сопоставления экспериментальных и расчетных времен удерживания для этих последовательностей приведен на Рис.3 и демонстрирует высокую точность модели BioLCCC при предсказании времен удерживания таких сложных (с точки зрения масс-спектрометрической идентификации) систем. Этот пример показывает, что «предсказательная» хроматография белков может служить дополнительным инструментом для анализа биомакромолекул с небольшими отличиями в последовательности.

Основные результаты и выводы

1. Предложена процедура создания универсальной шкалы времен удерживания для баз данных AMT и процедура приведения экспериментальных хроматографических данных к этой шкале на основе метода многоточечной нормализации и модели жидкостной критической хроматографии биомакромолекул. Продемонстрировано на примере пептидной смеси гидролизата шести белков, что точность приведения хроматографических данных пептидов к единой временной шкале составляет 1-2%.

2. Экспериментально исследован диапазон хроматографических условий, в которых применим метод многоточечной нормализации и приведения времен удерживания к единой нормализованной шкале. Показано, что этот диапазон покрывает хроматографические протоколы, широко используемые в современных протеомных исследованиях.

3. Теоретически исследовано и экспериментально показано явление инверсии порядка выхода пептидов при смене профиля градиентного элюирования. Предложен механизм этого явления. Показано, что если не учитывать явление инверсии порядка выхода при работе с хроматографическими фильтрами, потери правильных пептидных идентификаций могут достигать -20%.

4. Показана возможность предсказания времен удерживания целых белков в обращенно-фазовой ВЭЖХ, и экспериментально продемонстрирована применимость «предсказательной» хроматографии на основе модели BioLCCC для идентификации белков, различающихся точечными заменами аминокислотных остатков.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Статьи в журналах, входящих в перечень ВАК:

1. Толмачев Д.А., Вилков А.Н., Агапов А.Ю., Тарасова И.А., Новоселов K.P., Сагуленко П.Н., Шитов С.С., Придатченко М.Л., Дорошенко В.М., Горшков М.В. Масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса на постоянном магните с атмосферным источником ионизации // Масс-спектрометрия. 2008. Т. 5, № 2. С. 83-102.

2. Tarasova I.A., Guryca V., Pridatchenko M.L., Gorshkov A.V., Kieffer-Jaquinod S., Evreinov V.V., Masseion C.D., Gorshkov M.V. Standardization of retention time data for AMT tag proteomics database generation // Journal of Chromatography B. 2009. T. 877, C. 433-440.

3. Придатченко МЛ., Тарасова И.А., Гурыча В., Кононихин A.C., Адаме К., Толмачов Д.А., Агапов А.Ю., Евреинов В.В., Попов И.А., Николаев E.H., Зубарев P.A., Горшков A.B., Масселон К.Д., Горшков М.В. Использование моделей хроматографического разделения для создания баз данных AMT в задачах «скорострельной» протеомики // Биохимия. 2009. Т. 74, № 11, С. 1469-1478.

4. Придатченко МЛ., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков A.B., Горшков М.В. Единый подход к созданию универсальных баз данных точных масс и времен удерживания на основе модели критической хроматографии биомакромолекул // Труды МФТИ. 2009. Т. 1, № 1, Долгопрудный С. 94-103.

5. Perlova T.Yu., Margolin Y., Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Goloborodko A.A., Gorshkov A.V., Moskovets E., Ivanov A.R., Gorshkov M.V., Retention time prediction using the model of liquid chromatography of biomacromolecules at critical conditions in LC-MS phosphopeptide analysis // Proteomics. 2010. T. 10, № 19, C. 3458-68.

6. Pridatchenko M.L., Perlova T.Yu., Hamidane H.B., Goloborodko A.A., Tarasova A.A., Gorshkov A.V., Evreenov V.V., Tsybin Yu.O., Gorshkov M.V., On the utility of predictive chromatography to complement mass spectrometry-based intact protein identification // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. принято в печать.

7. Горшков A.B., Евреинов В.В., Придатченко МЛ., Тарасова И.А., Филатова H.H., Роздина И.Г., Горшков М.В., О применимости концепции критической хроматографии к анализу белков. Зависимость времен удерживания от последовательности аминокислотных остатков в цепи // Высокомолекулярные соединения А. 2011. Т. 53, №12, С. 1-16.

Труды и тезисы конференций:

8. Придатченко МЛ., Тарасова И.А., Горшков М.В. Тарасова И.А., Универсальная шкала времен удерживания биомакромолекул в задачах

«скорострельной» протеомики // V Всероссийская конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2011. Москва, РФ, МБУ-2, С. 66.

9. Перлова Т.Ю., Горшков А.В., Евреинов В.В., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Хроматомасс-спектрометрически анализ пептидов: инверсия хроматографических порядков выхода и ее влияние на точность ВЭЖХ-МС идентификаций // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 90.

Ю.Горшков А.В., Придатченко М.Л., Голобородько А.А., Тарасова И.А., Перлова Т.Ю., Евреинов В.В., Горшков М.В., Жидкостная хроматография как комплементарный масс-спектрометрическому метод анализа биомакромолекул // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 92.

11 .Голобородько А.А. Перлова Т.Ю., Придатченко M.JL, Горшков А.В. Иванов А.Р., Зубарев Р.А., Горшков М.В., Экспериментальный подход к анализу достоверности масс-спектрометрических идентификаций пептидов // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 113.

12.Pridatchenko M.L., Perlova T.Yu., Tarasova I.A., Goloborodko A.A., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Tsybin Yu.O., and Gorshkov M.V., On the utility of critical chromatography of biomacromolecules to predict protein retention in gradient HPLC // 35th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. 2010. Boston, Massachussets, USA. P-308-T.

13.Perlova T.Yu., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Goloborodko A. A., Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Moskovets E., Ivanov A.R., and Gorshkov M.V., Basics of the model of liquid chromatography of biomacromolecules at critical conditions: theory and experimental applications // 35th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. 2010. Boston, Massachussets, USA. P-2806-W.

14.Goloborodko A.A., Perlova T.Yu., Pridatchenko M.L., Gorshkov A.V., Tarasova I.A., Moskovets E., Gorshkov M.V., and Ivanov A.R., Calibration of user-defined LC-MS systems for complementary filtering and validation of MS based identifications by "predictive" chromatography of biomacromolecules // 58th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2010. Salt Lake City, Utah. ThP 413.

15.Придатченко M.JI., Тарасова И.А., Горшков M.B., Филатова Н.Н., РоздинаИ.Г., Горшков А.В., Евреинов В.В., О применимости модели критической хроматографии BioLCCC к анализу белков // IV Российский симпозиум "Белки и пептиды". 2009. Казань, РФ, С. 131.

16.Перлова Т.Ю., Тарасова И.А., Придатченко M.JL, Иванов А.Р., Горшков М.В., Модель критической хроматографии биомакромолекул в задачах фосфопротеомики // IV Российский симпозиум "Белки и пептиды". 2009. Казань, РФ, С. 297.

П.Тарасова И.А., Горшков A.B., Евреинов В.В., Придатченко M.JL, Голобородько A.A., Перлова Т.Ю., Горшков М.В., Критическая хроматография белков и пептидов в задачах протеомики: возможно ли чтение текста последовательности? // IV Российский симпозиум "Белки и пептиды". 2009. Казань, РФ, С. 139.

18.Перлова Т.Ю., Тарасова И.А., Придатченко М.Л., Голобородько A.A., Евреинов В.В., Горшков A.A., Иванов А.Р., Горшков М.В., Калибровка феноменологических параметров модели критической жидкостной хроматографии биомакромолекул // 52-я Научная конференция МФТИ. 2009. Москва, РФ. С. 108-111.

19.Тарасова И.А., Горшков A.B., Евреинов В.В., Масселон К.Д., Гурыча В., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Изменение порядка выхода пептидов при изменении условий градиентного элюирования в ВЭЖХ на обращённой фазе: о возможном объяснении с точки зрения теории критической хроматографии биомакромолекул // Ш Всероссийская конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2009. Москва, РФ, МБС-6, С. 80.

20.Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Kononikhin A.S., Guricya V., Tolmachev D.A., Agapov A.Yu., Adams С., Popov I.A., Gorshkov A.V., Masseion C.D., Zubarev R.A., Nikolaev E.N., Gorshkov M.V.; Standard Retention Time Scale for Collaborative Generation of Accurate Mass and Time Tag(AAÍ7) Databases // 56th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topic. 2008. Denver, Colorado, MP-656.

21.Шитов C.C., Горшков A.B., Горшков M.B., Тарасова И.А., Придатченко МЛ., Учет нелокальных взаимодействий в модели критической жидкостной хроматографии биомакромолекул // Труды 51-й научной конференции МФТИ. 2008. Москва, РФ. С. 110-113.

22.Придатченко МЛ., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков A.B., Горшков М.В., Стандартизация хроматографических данных для макромолекул в условиях градиентной ВЭЖХ И 3-я Международная Конференция - школа. 2007. Звенигород, РФ. С. 78.

23.Тарасова И.А., Горшков A.B., Евреинов В.В., Голобородько A.A., Шитов С.С., Придатченко M.JL, Горшков М.В., Теоретический хроматограф: практическая реализация концепции жидкостной хроматографии в критических условиях // 3-я Международная Конференция - школа. 2007. Звенигород, РФ. С. 48.

24.Придатченко МЛ., Тарасова И.А., Масселон К., Горшков A.B., Горшков М.В., Единый подход к созданию универсальных баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков на основе модели критической хроматографии биомакромолекул // Труды 50 конференции МФТИ. 2007. Долгопрудный, РФ. С. 100-102.

25.Tarasova I.A., Masseion C.D., Pridatchenko M.L., Kieffer-Jaquinod S., Gyryca V., Garin J., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Gorshkov M.V., Retention time conversion for cross-platform transfer of HPLC-MS/MS proteomics data // 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2007. Indianapolis, Indiana, TP-144. ^

26.Придатченко МЛ., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков A.B., Горшков М.В., Универсальный подход к'созданию баз данных времен удерживания и точных масс пептидов // Третий съезд ВМСО, П Всероссийская конференция с международным участием, "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы". 2007. Москва, РФ. С. МБС-5.

Придатченко Марина Леонидовна

Автореферат

Подписано в печать 23.09.2011г.

Усл.п.л. - 1.5 Заказ № 06059 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «Чертеж.ру» ИНН 7701723201 107023, г.Москва, ул.Б.Семеновская И, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Придатченко, Марина Леонидовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОСНОВНОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О ПРЕДМЕТЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1. Хромато-масс-спектрометрия как основной метод идентификаций биомолекул в протеомике.

1.2. Двумерная карта хромато-масс-спектрических данных пептидов.

1.3. Проблема инверсии хроматографических пиков пептидов в литературе

1.4. Протеомика «сверху-вниз». «Предсказательная» хроматография белков

1.5. Критическая жидкостная хроматография биомакромолекул в задаче создания универсальной шкалы времен удерживания пептидов.

ГЛАВА 2. МЕТОД МНОГОТОЧЕЧНОЙ НОРМАЛИЗАЦИИ.ВРЕМЕН УДЕРЖИВАНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ.

2.1. Теоретические основы «предсказательной» хроматографии полипептидов на основе модели ВюЬССС.

2.2. Процедура приведения хроматографических времен удерживания к единой временной шкале. Метод многоточечной нормализации (МТН).

ГЛАВА 3. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ МЕТОДА МТН.

3.1. Проверка концепции линейной корреляции хроматографических времен удерживания.

3.2. Описание экспериментов.

3.3. Обсуждение результатов.

3.3.1.Экспериментальная проверка концепции линейности хроматографических данных.

3.3.2. Экспериментальная проверка подхода МТН к выравниванию времен удерживания пептидов на основе модели ВюЬССС.

3.4. Выводы к главе 3.

ГЛАВА 4. ЯВЛЕНИЕ ИНВЕРСИИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ПОРЯДКОВ ВЫХОДА ПЕПТИДОВ И ЕГО ФЕНОМЕНОЛОГИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ

4.1. Описание экспериментов.

4.2. Обсуждение результатов.

4.2.1. Обнаружение инверсии порядка выхода пептидов.

4.2.2. Исследование экспериментально обнаруженных пар пептидов с инверсией порядка выхода при смене градиента.

4.2.3. Масштаб распространения инверсии порядка выхода пептидов в протеомных исследованиях.

4.2.4. Предсказание сдвигов хроматографических пиков при смене условий элюирования.

4.2.5. Проблема количественного предсказания инверсии порядка выхода пептидов при смене градиента.

4.3. Выводы к главе 4.

ГЛАВА 5. ЗАВИСИМОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ВРЕМЕН' УДЕРЖИВАНИЯ ОТ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В ЦЕПИ ЦЕЛОГО БЕЛКА.

5.1. Описание экспериментов.

5.2. Обсуждение результатов.

5.211. Сравнение теории и эксперимента.

5.2.2. Универсальность в хроматографии белков.

5.2.3. О возможности создания баз данных AMT белков.

5.2.4. Проблема создания баз данным AMT на целых белках.

5.3. Выводы к главе 5.

Введение диссертация по физике, на тему "Универсальная шкала хроматографических времен удерживания биомакромолекул в задачах "скорострельной" протеомики"

Актуальность темы исследований

К аналитическим средствам, используемым в протеомике, в первую очередь, относятся такие физико-химические методы как масс-спектрометрия и жидкостная хроматография. В настоящее время масс-спектрометрия позволяет проводить измерения- масс сложных биоорганических молекул с относительной точностью порядка одной миллионной, в широком массовом диапазоне, в то время как воспроизводимость, хроматографического разделения сложных смесей биомолекул достигает нескольких секунд в рамках продолжительного (до нескольких часов) хромато-масс-спектрометрического эксперимента. Благодаря прогрессу, достигнутому в последние годы в области хромато-масс-спектрометрических методов анализа биомолекул, одним из перспективных методов высокопроизводительной идентификации белков является подход, основанный на создании и использовании баз данных точных масс и хроматографических времен удерживания пептидных маркеров белков (Accurate Mass and Time tags, AMT). Создание баз данных AMT требует одновременных усилий со стороны разных исследовательских групп в рамках совместных проектов, однако, хроматографические данные в них оказываются привязанными к конкретным экспериментальным условиям и не переносимы с одной инструментальной платформы на другую. В диссертации рассматривается подход к решению этой проблемы.

Актуальность темы исследования обусловлена необходимостью развития хромато-масс-спектрометрических методов "скорострельной" протеомики для использования в масштабных исследованиях протеомов живых организмов и их количественного анализа в рамках совместных исследований, включая реализацию международного проекта "Протеом человека".

Цели и задачи исследования

Основной целью работы является развитие метода жидкостной хроматографии для использования в задачах «скорострельной» протеомики1 на основе баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков. Для реализации поставленной цели в рамках представленной работы были определены следующие конкретные задачи исследований:

1) создание единой универсальной временной шкалы на основе концепции линейной корреляции времен удерживания, получаемых в различных экспериментальных условиях;

2) экспериментальное исследование диапазона хроматографических условий, в которых наблюдается линейная зависимость хроматографических времен удерживания пептидов;

3) проведение модельных экспериментов, создание прототипов баз данных AMT в универсальной шкале времен удерживания для статистически значимых массивов экспериментальных данных сложных смесей протеолитических пептидов, а также исследование точности представленных в них времен;

4) теоретическое описание нелинейных эффектов в хроматографии полипептидов, в частности, инверсии времен удерживания пептидов при изменении хроматографических условий разделения;

5) проверка возможности предсказания времен удерживания белков в обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и идентификация точечных модификаций их аминокислотных последовательностей с целью возможного расширения применимости метода AMT для прямой идентификации белков, минуя стадию протеолитического гидролиза.

Используемые методы исследований

Эксперименты по разделению и идентификации индивидуальных пептидов и их смесей проводились на трех нано ВЭЖХ системах: две Agilent 1100 и одна Ultimate 3000 (Dionex). Каждая из трех ВЭЖХ систем была соединена с гибридными масс-спектрометрами LTQ-FT (Thermo Fisher, Бремен, Германия) с использованием хроматографических колонок со стационарной* фазой Cjg. Для идентификации пептидов использовалось несколько методов фрагментации ионов: фрагментация' в результате столкновения с молекулами буферного газа (ДАС, CAD) в ионной ловушке и фрагментация в результате захвата медленных электронов (ДЭЗ, ECD) в ловушке ионного циклотронного резонанса (ИЦР). Спектры фрагментации использовались для восстановления пептидов по базе данных NCBI с использованием поисковых систем Mascot и XÎTandem.

В качестве образцов были использованы следующие коммерческие стандарты: триптические гидролизаты белка Cytochrome с и смеси шести белков {Bovine serum albumin, beta-Galactosidase, Lysozyme, Alcohol dehydrogenase, Cytochrome c, Apo-transferrin) производства компании Dionex/LCPacking (США).

Эксперименты по разделению модельных белков {Cytochrome с из организмов Equine, Bovine, Canine, производства Sigma-Aldrich и Calbiochem) и их пепсиновых гидролизатов были проведены на ВЭЖХ системе Janeiro CNS (Thermo Scientific, Швейцария) с использованием хроматографической колонки со стационарной фазой С/§. Хроматографическая система была соединена с масс-спектрометром LTQ XL (Thermo Scientific, Бремен, Германия) в качестве метода фрагментации родительских ионов был выбран метод CAD.

Во всех ВЭЖХ/МС экспериментах использовался бинарный растворитель вода/ацетонитрил (АЦН) с добавлением либо муравьиной, либо уксусной кислоты.

Научная новизна

Положения, выносимые на защиту

2. Результаты экспериментальных исследований условий разделения по определению границ применимости концепции линейности хроматографических данных полипептидов.

3. Метод многоточечной нормализации экспериментальных хроматографических времен пептидов к универсальной временной шкале, основанный на использовании модели критической жидкостной хроматографии-макромолекул для предсказания времен удерживания.

4. Прототип баз данных AMT для смесей протеолитических пептидов модельных белков.

5. Описание явления инверсии порядка выхода пептидов с близкими временами удерживания при ВЭЖХ разделении на обращенной фазе в зависимости от их аминокислотного состава и их последовательности при изменении параметров хроматографической колонки (длина, размер пор, внутренний диаметр) и профиля градиента сильного растворителя. Определение масштаба этого явления в протеомных исследованиях.

6. Модель предсказания времен удерживания целых белков при их разделении методом обращено-фазовой ВЭЖХ и экспериментальная проверка применимости модели для описания разделения модельных белков, включая белки-гомологи, отличающиеся точечными- мутациями аминокислотных последовательностей.

Научная и практическая ценность

Полученные результаты могут быть использованы специалистами в области высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также в области протеомных исследований для решения следующих задач:

1. Развитие новых методов разделения смесей сложных веществ органического и биоорганического происхождения;

2. Разработка новых разделительных сред, обладающих высокой специфичностью по удерживанию макромолекул с заданными физико-химическими свойствами;

3. Фильтрация масс-спектрометрических идентификаций, получаемых при анализе протеомов живых организмов;

4. Создание баз данных времен удерживания для высокопроизводительного анализа белков;

5. Реализация хроматографически зависимых методов количественного анализа протеолитических смесей на основе мониторинга уникальных фрагментационных переходов МКМУ811М;

6. Разработка методов «скорострельной» протеомики на основе многомерной- «предсказательной» хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией;

7. Разработка новых поисковых протеомных машин, основанных на использовании хроматографических данных.

Личный вклад автора

Материал, представленный. в- диссертации, получен при непосредственном участии автора в реализации задач исследования, в выполнении экспериментов, в- обсуждении и анализе полученных результатов. Диссертационная работа выполнена в период с 2007 по 2011 I год.

Апробация работы

Результаты' работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: 35-ом конгрессе Международного хроматографического общества по высокоэффективной жидкостной хроматографии НРЬС-2010 (Бостон, США, 2010), 57-ой и 58-ой конференции Американского масс-спектрометрического общества (Денвер, США, 2008 и Солт-Лейк-Сити, США, 2010 ), У1-ом Российском симпозиуме «Белки пептиды» (Казань, 2009), 50-ой , 51-ой и 52-ой научной конференции МФТИ (Москва, 2008, 2009, 2010), 3-ей международной конференции -школе «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и энергетике»

Звенигород, 2007), III, IV и V Всероссийской конференции с международным участием Всероссийского масс-спектрометрического общества «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2007, 2009, 2011).

Работы, вошедшие в диссертацию, были выполнены при поддержке РФФИ (гранты №№ 09-08-00663, 08-04-01339), программы президиума РАН №П8, Американского фонда гражданских исследований и развития АФГИР, грант СБКР ЇШВ1 -2909-М0-07, и Международного фонда поддержки науки ИНТАС (гранты №04-83-2643 и Сепошісз-05-1000004-7759).

Изложение в диссертации построено следующим образом:

Заключение диссертации по теме "Химическая физика, в том числе физика горения и взрыва"

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Статьи в журналах, входящих в перечень ВАК:

2. Tarasova I.A., Guryca V., Pridatchenko M.L., Gorshkov A.V., Kieffer-Jaquinod S., Evreinov V.V., Masseion C.D., Gorshkov M.V. Standardization of retention- time data for AMT tag proteomics database generation// Journal of Chromatography B. 2009. T. 877, C. 433-440.

3. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Гурыча В:, Кононихин A.C., Адаме К., Толмачов Д.А., Агапов А.Ю., Евреинов В.В., Попов И.А., Николаев E.H., Зубарев P.A., Горшков A.B., Масселон К.Д., Горшков М.В. Использование моделей хроматографического разделения для создания баз данных AMT в задачах «скорострельной» протеомики // Биохимия. 2009. Т. 74, № 11 С. 1469-1478.

5. Perlova T.Yu., Margolin Y., Pridatchenko M.L., Tarasova I. A., Goloborodko A.A., Gorshkov A.V., Moskovets E., Ivanov A.R., Gorshkov M.V., Retention time prediction using the model of liquid chromatography of biomacromolecules at critical conditions in LC-MS phosphopeptide analysis // Proteomics. 2010. T. 10, №19: C. 3458-68.

7. Горшков А.В., Евреинов В.В., Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Филатова Н.Н., Роздина И.Г., Горшков М.В., О применимости концепции критической хроматографии к анализу белков. Зависимость времен удерживания* от последовательности аминокислотных остатков в цепи // Высокомолекулярные соединения А. 2011. Т. 53; №12, С. 1-16.

Труды и тезисы конференций:

8. Придатченко- М.Л., Тарасова И.А., Горшков М.В. Тарасова И.А., Универсальная шкала времен удерживания биомакромолекул в задачах «скорострельной» протеомики // V Всероссийская конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2011. Москва, РФ, МБУ-2, С. 66.

9. Перлова Т.Ю., Горшков А.В., Евреинов В.В., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Хромато-масс-спектрометрический анализ пептидов: инверсия хроматографических порядков выхода и ее влияние на точность ВЭЖХ-МС идентификаций // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 90.

10. Горшков А.В., Придатченко M.JL, Голобородько А.А., Тарасова И.А., Перлова Т.Ю., Евреинов В.В., Горшков М.В., Жидкостная хроматография как комплементарный масс-спектрометрическому метод анализа биомакромолекул // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 92.

11. Голобородько А.А. Перлова Т.Ю., Придатченко'МЛ., Горшков А.В. Иванов А.Р:, Зубарев Р.А., Горшков М.В., Экспериментальный подход к анализу достоверности масс-спектрометрических идентификаций пептидов // Четвертая Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения». 2010. Звенигород, РФ. С. 113

12. Pridatchenko M.L., Perlova T.Yu., Tarasova I.A., Goloborodko A.A., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Tsybin Yu.O., and Gorshkov M.V., On the utility of critical chromatography of biomacromolecules to predict protein retention in gradient HPLC // 35th International Symposium- on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. 2010; Boston, Massachussets, USA. P-308-T

13. Perlova T.Yu., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Goloborodko A.A., Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Moskovets E., Ivanov A.R., and Gorshkov M.V., Basics of the model of liquid chromatography of biomacromolecules at critical conditions: theory and experimental applications // 35th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques. 2010. Boston, Massachussets, USA. P-2806-W.

14. Goloborodko A.A., Perlova T.Yu., Pridatchenko M.L., Gorshkov A.Y., Tarasova I.A., Moskovets E., Gorshkov M.V., and Ivanov A.R., Calibration of user-defined LC-MS systems for complementary filtering and validation of MS based identifications by "predictive" chromatography of biomacromolecules //

58th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2010. Salt Lake City, Utah. ThP 413.

15. Придатченко M.JI., Тарасова И.А., Горшков M.B., Филатова H.H., РоздинаИ.Г., Горшков A.B., Евреинов В.В., О применимости модели критической хроматографии BioLCCC к анализу белков // IV Российский симпозиум "Белки и пептиды". 2009. Казань, РФ, С. 131.

16. Перлова Т.Ю., Тарасова И.А., Придатченко M.JL, Иванов А.Р., Горшков М.В., Модель критической хроматографии биомакромолекул в задачах фосфопротеомики // IV Российский симпозиум "Белки и пептиды". 2009. Казань, РФ, С. 297.

17. Тарасова И.А., Горшков A.B., Евреинов В.В., Придатченко M.JL, Голобородько A.A., Перлова Т.Ю., Горшков М.В., Критическая хроматография белков и пептидов в задачах протеомики: возможно ли чтение текста последовательности? // IV Российский, симпозиум "Белки и пептиды". 2009. Казань, РФ, С. 139.

18. Перлова Т.Ю., Тарасова И.А., Придатченко М.Л., Голобородько A.A., Евреинов В.В., Горшков A.A., Иванов А.Р., Горшков, М.В., Калибровка феноменологических параметров модели критической* жидкостной хроматографии биомакромолекул // 52-я Научная конференция МФТИ. 2009. Москва, РФ. С. 108-111

19. Тарасова И.А., Горшков A.B., Евреинов В.В., Масселон К.Д., Гурыча

B., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Изменение порядка выхода пептидов при изменении условий градиентного элюирования в ВЭЖХ на обращенной фазе: о возможном объяснении с точки зрения теории критической хроматографии биомакромолекул // III Всероссийская конференция «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы». 2009. Москва, РФ, МБС-6, С. 80.

20. Pridatchenko M.L., Tarasova I.A., Kononikhin A.S., Guricya V., Tolmachev D.A., Agapov A.Yu., Adams С., Popov I.A., Gorshkov A.V., Masseion

C.D., Zubarev RA., Nikolaev E.N., Gorshkov M.V.; Standard Retention Time Scale for Collaborative Generation of Accurate Mass and Time T&g(AMT)

Databases // 56th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topic. 2008. Denver, Colorado, MP-656.

21. Шитов С.С., Горшков А.В., Горшков М.В., Тарасова И. А., Придатченко М.Л., Учет нелокальных взаимодействий в модели критической жидкостной хроматографии биомакромолекул // Труды 51-й научной конференции МФТИ. 2008. Москва, РФ. С. 110-113.

22. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков А.В1, Горшков М.В., Стандартизация, хроматографических данных для макромолекул в условиях градиентной ВЭЖХ // 3-я Международная Конференция — школа. 2007. Звенигород, РФ. С. 78.

23. Тарасова И.А., Горшков А.В., Евреинов В.В., Голобородько> А.А., Шитов С.С., Придатченко М.Л., Горшков М.В., Теоретический хроматограф: практическая реализация концепции жидкостной хроматографии; в критических условиях // 3-я Международная Конференция - школа. 2007. Звенигород, РФ. С. 48

24. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К., Горшков А.В., Горшков М.В., Единый подход к созданию универсальных баз данных точных масс и времен удерживания пептидных маркеров белков на основе модели' критической хроматографии биомакромолекул // Труды 50 конференции МФТИ. 2007. Долгопрудный, РФ. С. 100-102.

25. Tarasova I.A., Masselon C.D., Pridatchenko M:L., Kieffer-Jaquinod S., Gyryca V., Garin J., Gorshkov A.V., Evreinov V.V., Gorshkov M.V., Retention time- conversion for cross-platform transfer of HPLC-MS/MS proteomics data // 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics. 2007. Indianapolis, Indiana, TP-144.

26. Придатченко М.Л., Тарасова И.А., Масселон К.Д., Горшков А.В., Горшков М.В., Универсальный подход к созданию баз данных времен удерживания и точных масс пептидов // Третий съезд ВМСО, II Всероссийская конференция с международным участием, "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы". 2007. Москва, РФ. С. МБС-5.

БАЛГОДАРНОСТИ

Данная работа выполнялась в лаборатории 006 физико-химических методов исследования структуры веществ под руководство к.ф.-м.н. Горшкова Михаила Владимировича Института энергетических проблем химической физики РАН. Тематика исследований была предложена автору М.В. Горшковым в 2006 году. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Горшкову М.В. за помощь при подготовке диссертации, за помощь в постановке задач, возможность работы на современном оборудовании в передовых европейских лабораториях, а также за плодотворное и результативное обсуждение результатов и помощь при подготовке публикаций и формулировке выводов, И.А. Тарасовой,

A.B. Горшкову и В.В. Евреинову, за помощь в постановке задач, проведении экспериментов, анализе результатов и подготовке публикаций, и всем сотрудникам лаборатории физико-химических методов исследования структуры веществ ИНЭШХ ХФ РАН за многолетнее внимание и поддержку. Автор благодарит Зубарева Р.А и его сотрудников из Университета Уппсалы в Швеции, Масселона К.Д. и его сотрудников » из лаборатории исследования динамики протеомов Министерства атомной энергетики Франции в Гренобле и Николаева E.H. и его сотрудников Института биохимической физики РАН за помощь в сборе хромато-масс-спектрометрических данных и ценные советы. Автор выражает глубокую признательность профессору Цыбину Ю.О. и всем сотрудникам лаборатории биомолекулярной масс-спектрометрии Лозаннского политехнического университета за помощь в постановке экспериментов и обсуждения. Автор благодарен Козловскому

B.И., Таганову Н.Г. и Лебедеву А.Т. за прочтение рукописи диссертации и полезные замечания. Автор благодарит всех участников конференций, семинаров и школ, на которых были представлены результаты данной работы, за обсуждения и замечания. Автор хотел бы выразить благодарность родным и близким за моральную и материальному поддержку. Автор благодарит Придатченко О.Л., Придатченко Д.Л., Головастому C.B., Петрову A.A., за творческое обсуждение работы.

Список источников диссертации и автореферата по физике, кандидата физико-математических наук, Придатченко, Марина Леонидовна, Москва

1. Kelleher N.L. et al. Top Down versus Bottom Up protein characterization by tandem high-resolution mass spectrometry. // Journal of the American Chemical Society. 1999. Vol. 121, № 4. P: 806-812.

2. Kinter M»., Sherman N.E. Protein sequencing and identification using tandem mass spectrometry. / ed. Desiderio D.M., Nibbering N.M.M. New York: John Wiley & Sons Inc., 2000. P. 320.

3. Durbin K.R. et al. Intact mass detection, interpretation, and visualization to automate Top-Down proteomics on a large scale. // Proteomics. 2010. Vol. 10, № 20. P. 3589-3597.

4. Gucinski A.C. et al. Understanding and exploiting peptide fragment ion intensities using experimental and informatic approaches. // Proteome Bioinformatics / ed. Walker J.M., HubbardS.J. London, UK: Humana Press, 2010. Vol. 604, № 3. P. 73-94:

5. McCormack a L. et al. Direct analysis and identification of proteins in mixtures by LC/MS/MS and database* searching at the low-femtomole level. // Anal. Chem. 1997. Vol. 69, № 4. P. 767-776.

6. Wolters D.A., Washburn M.P., Yates J.R. An automated multidimensional protein identification technology for shotgun proteomics. // Anal. Chem. 2001. Vol. 73, № 23. P. 5683-5690.

7. Nesvizhskii A.I. Protein identification by tandem mass' spectrometry and sequence database searching. // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2007. Vol.367. P. 87-119.

8. Brosch M., Choudhary J. Scoring and validation of tandem ms peptide identification methods // Proteome Bioinformatics / ed. Walker J.M., Hubbard S.J. London, UK: Humana Press, 2010. Vol. 604, № 3. P. 43-53.

9. Conrads T.P. et al. Utility of accurate mass tags for proteome-wide protein identification // Anal. Chem. 2000. Vol. 72, № 14. P. 3349-3354.

10. Norbeck A.D. et al. The utility of accurate mass and LC elution time information in the analysis of complex proteomes // American Society for Mass Spectrometry. 2005. Vol. 16. P. 1239-1249.

11. Bochet P. et al. Fragmentation-free LC-MS can identify hundreds of proteins. //Proteomics. 2011. Vol. 11, № 1. P: 22-32.

12. May D. et al. A platform for accurate mass and time analyses of mass spectrometry data research articles // Journal of Proteome Research. 2007. Vol. 6, № 7. P. 2685-2694.

13. Petritis K. et al. Use of artificial neural networks for the accurate prediction of peptide liquid chromatography elution times in proteome analyses // Anal. Chem. 2003. Vol. 75, № 5. P. 1039-1048.

14. Scanlon M.G., Sapirstein H.D., Bushuk W. Computerized wheat varietal identification by high-performance liquid chromatography. // Cheral Chemistry. 1989. Vol. 66, № 149. P. 439-444.

15. Krokhin O.V. et al. An improved model for prediction of retention times of tryptic peptides in ion pair. // Molecular & Cellular Proteomics. 2004. Vol. 3, № 9\ P. 908-9191.

16. Shinoda K., Tomita M., Ishihama Y. Aligning LC peaks by converting gradient retention times to retention index of peptides in proteomic experiments // Bioinformatics. 2008. Vol. 24, № 14. P. 1590-1595.

17. Snyder L.R. Mobile phase effects in liquid-solid chromatography. Importance of adsorption-site geometry, adsórbate derealization and hydrogen bonding // Journal of chromatography. 1983. Vol. 255. P. ,3-26.

18. Snyder L.R., Dolan J.W., Gant J.R. Gradient elution in high-performance liquid chromatography 1. Theoretical basis for reversed-phase systems // Journal of Chromarography. 1979. Vol. 165. P. 3-30;

19. Stadalius M.A. et al. Optimization model for the gradient elution separation of peptide mixtures by reversed-phase high-performance liquid chromatography Verification of retention relationships // Journal of Chromarography. 1984. Vol. 296. P. 31-59.

20. Glajch J.L. et al. Separation of peptide mixtures by reversed-phase gradient elution. Use of flow rate changes for controlling band spacing and improving resolution. //Anal. Chem. 1986. Vol. 58, № 2. P. 280-285.

21. Riddle L.A., Guiochon G. Influence of mobile phase gradients on the retention and separation of peptides from a Cytochrome-c digest by reversed-phase liquid chromatography. // Chromatographia. 2006. Vol. 64. P. 121127.

22. Lange V. et al. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. // Molecular systems biology. 2008. Vol. 4, № 222. P. 222.

23. Snyder L.R., Dolan J.W. High-performance gradient elution: the practical application of the linear-solvent-strength model. New York: Wiley, 2006. P. 500.

24. Spicer V. et al. Predicting retention time shifts associated with variation of the gradient slope in peptide RP-HPLC. // Anal. Chem. 2010. Vol. 82, № 23. P. 9678-9685.

25. Krokhin O.V., Spicer V. Peptide retention standards and hydrophobicity indexes in reversed-phase high-performance liquid chromatography of peptides // Anal. Chem. 2009. Vol. 81, № 22. P. 9530-9530.

26. Gorshkov A.V. et al. Liquid chromatography at critical conditions: comprehensive approach to sequence-dependent retention time prediction // Anal. Chem. 2006. Vol. 78, № 22. P. 7770-7777.

27. Gorshkov A.V. et al. Applicability of the Critical Chromatography Concept to proteomics problems: dependence of retention time on the sequence of amino acids. // Polymer Science B. 2007. Vol. 49, №4. P. 93-107.

28. Tarasova I.A. et al. Applicability of Critical Chromatography Concept to proteomics problems: experimental study of dependence of retention time on the sequence of amino acids // Polymer Science A. 2008. Vol. 50, № 3. P. 309-321.

29. Энтелис С.Г., Евреинов B.B., Кузаев- А.И. Реакционноспособные олигомеры. Москва: Химия, 1985. Р. 304.

30. URL: http://hs2.proteome.ca/SSRCalc/SSRCalc32.html Online.

31. Gorshkov A.V. et al. Critical chromatography of macromolecules as a tool for reading the amino acid sequence of biomacromolecules: Reality or science fiction? // J Anal Chem. 2010. Vol. 65, № 1. P. 4-14.

32. Горшков A.B. Критическая хроматография макромолекул. 2003. P. 367.

33. Palmblad M. et al. Prediction of chromatographic retention and protein identification in liquid chromatography/mass spectrometry // Anal. Chem. 2002. Vol. 74, № 22. P. 5826-5830.

34. Gilar M. et al. Peptide retention prediction applied to proteomic data analysis // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2007. P. 2813-2821.

35. Klammer A.A. et al. Impruving tandem mass spectrometry identification using peptide retention time prediction across diverse chromatography conditions. //Anal. Chem. 2007. Vol. 79, № 16. P. 6111-6118.

36. Pfeifer N. et al. Statistical learning of peptide retention behavior in chromatographic separations: a new kernel-based approach for computational proteomics. // BMC Bioinformatics. 2007. Vol. 14. P. 1-14.

37. Goloborodko A.A. et al. Empirical approach to false discovery rate estimation in shotgun proteomics // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2010. P. 454-462.

38. Lee J.E. et al. A robust two-dimensional separation for top-down tandem mass spectrometry of the low-mass proteome. // J Am Soc Mass Spectrom. Elsevier Inc., 2009i Vol. 20, № 12. P. 2183-2191.

39. Calligaris D., Villard C., Lafitte D. Advances in top-down proteomics for disease biomarker discovery. // Journal of Proteomics. Elsevier B.V., 2011. Vol. 74, № 7. P. 920-934.

40. Kellie J.F. et al. The emerging process of Top Down mass spectrometry for protein analysis: biomarkers, protein-therapeutics, and achieving high throughput//Mol Biosyst. 2010. Vol. 6, № 9. p. 1532-1539.

41. Sanger F. The arrangement of amino acids in proteins. // Advances in protein chemistry. 1952. Vol. 7. P. 1-67.

42. Baczek T., Kaliszan R. Predictions of peptides' retention times in reversed-phase liquid chromatography as a new supportive tool to improve protein identification in proteomics. // Proteomics. John Wiley & Sons, 2009. Vol. 9, № 4. P. 835-847.

43. Babushok V.I., Zenkevich I.G. Retention characteristics of peptides in rp-lc: peptide retention prediction. // Chromatographia. 2010. Vol. 72, № 9-10. P. 781-797.

44. Meek J.L. Prediction of peptide retention times in high-pressure liquid-chromatography on the basis of amino-acid-composition. // Proc Natl Acad Sci USA. 1980. Vol. 77, № 3. P. 1632-1636.

45. Guo D., Mant C.T., Hodges R.S. Effects of ion-pairing reagents on the prediction of peptide retention in reversed- phase high-performance liquid-chromatography. // Journal of Chromatography. 1987. Vol. 386. P. 205-222.

46. Entelis S.G., Evreinov V.V., Gorshkov A.V. Functionality and molecular-weight distribution of telechelic polymers. // Adv. Polym. Sci'. 1986. Vol. 76. P. 129-175.

47. Perlova T.Y. et al. Retention time prediction using the model of liquid chromatography of biomacromolecules at critical conditions in LC-MS phosphopeptide analysis. //Proteomics. 2010. Vol. 10, № 19. P. 3458-3468.

48. DiMarzio E.A., Rubin R.J. Adsorption of a chain polymer between two plates. // The Journal of Chemical Physics. 1971. Vol. 55, № 9. P. 4318.

49. Obukhov S.P. Adsorption onto the surface of a random heteropolymer chain. //JETP. 1987. Vol. 66, №6. P. 1125-1131.

50. URL: http://www.theorchromo.ru/lib/tutorial.html. Online.

51. Лифшиц И.М. Некоторые вопросы статистической теории биополимеров. // ЖЭТФ. 1968. Vol. 55, № 26. Р. 2422-2422.

52. MacLean В., Eng J.K., Beavis R.C. M.M. General framework for developing and evaluating database scoring algorithms using the TANDEM search engine // Bioinformatics. 2006. Vol. 22. P. 2830-2832.

53. Faith M. et all SwedCAD, a database of annotated: high-mass accuracy MS/MS spectra of tryptic peptides, // Journal of Proteorne Research. 2007. Vol. 6, № 10. P. 4063-4067.

54. Strittmatter E.F. et: al. Application of peptide. LC retention time information in a discriminant: function for peptide identification by tandem mass spectrometry research.articles. // Journal of Proteome Research. 2004. Vol. 3, № 4. P. 760-769.

55. Krokhin O.V. et al; Use of peptide retention time prediction for protein identification by off-line reversed-phase HPLC-MALDI MS/MS. // Anal. Chem. 2006. Vol. 78, № 17. P. 6265 6269.

56. Mant C.T., Zhou N.E., Hodges R.S. Correlation of protein retention times in reversed-phase chromatography with polypeptide: chain: length and1 hydrophobicity. II Journal of chromatography. 1989i Voli 476. P. 363-375:

57. Koyama J. et al. Effect of column length and elution. mechanism on the separation^ of proteins by reversed-phase' higliTperformance liquid chromatography. // Journal of Chromatography A. 1992. Vol. 625. P. 217— 222.

58. Enzymatic Assay of pepsin. EC 3.4.23.1. Online. // http://www.sigmaaldrich.com. 1996.

59. Гросберг А.Ю:, Хохлов A.P. Статистическая физика макромолекул. Наука. Москва: 11аука, 1989. Р. 344.

60. Mant C.T. et al. Effect of peptide chain length on peptide retention behavior in reversed-phase chromatography. // Journal of Chromarography. 1988. Vol. 458. P. 193-205.

61. Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. Prediction of peptide retention times. // Journal of Chromatography. 1988. Vol. 442. P. 69-79.

62. Senko M.W., Beu S.C., Mclafferty F.W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions // J Am Soc Mass Spectrom. 1995. Vol. 6, № 4. P. 229-233.