Влияние физико-химических параметров метода термической активации трития на выход меченных ω-хлорэтиламинопроизводных фенилаланина и использование их в фармакокинетике тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.14 ВАК РФ

" Ч ■ : .

МОСКОВСКИЙ ГОСЩРШЕНШЙ 7НЙВЕРСШЖ т. Ы.В.ЛШОШССВА

' Хзшзмскла факультет ~

Еа правах рлсопис» . Ш 54I.I5f546.IIO.23

Хэ-Доз Гвр

ВЛШЙВ 1Ж0-ШШЖ ПАРАМЕТРОВ МЕТОДА. ЮТЯЕСКОЙ АКТИВАЦИЙ ТРИТИЯ НА ШХОД МЕЧЕННЫХ р- ]ОЮРЭТ1ШШЮПР0313БОЛШХ ФШЙШВЙНА.

и использование их в шшттш

« ■ . » * *

02.00.14 - радйоетмвя

автореферат"

диссертация на совсканае" ученой степени канстцат'з химических паук

Москва - 1922 г.

Работа выполнена на кафедре рададаюта Хшйгческато факультета

" Научные руководите^®: доцент, кандидат хни.каук

Э.С .Филатов

ст.в.с. канц.хда.наун Е.Ф.Симонов

Офзцвалвнне оппонептя: доктор хни,ваук дроф. Н.Ф.Мясоедов,

доктор <5ишгогЕ«гескю: наук ВЛС.Мазо »

Ведущая организация: ВННИ'Еаотеязологет'

Ззшта состоятся " Т " октября 1992 г« в часов

па заседания Сдецгадвзароваввого ученого совета к.053.05.61 ШУ ем.. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, Ленинские горнг, МУ, Хкдаческий факультет, кафедра радаохшги, аудитория й 308.

С щгссертшщеЁ можно ознакомиться в бйдлнотзке йшячеокого факультета МГУ-им. М.В.Яоиовоеова.

• .-Автореферат разослан * иЮ^_. ^ 1992 года

УчешЙ секретарь сяещая08®ровзнЕого совета, кандвдат $изихо-математвческвх наук —— Н.К.Трокяяз

Известно, что' ряд постижений в области молекулярпой биологии и медицины связаны с использованием моченных биологически-активных вещест как при изучении процессов на молекулярном уровне, так и на уровне целого организма. Среди применяющихся для этих целей радионуклидов ваиное место принадлежит тритии.

Актуальность исследования определяется тем, что в настоящее время в БОНД АМН проводятся комплексные доклинические испытания таких противоопухолевых препаратов, как асалпн (этиловый эфир /у - ацетилснрколизил валяна) и хлогифен ( 4 - хлорфепилаланил

(2-хлорэтил) - гицразиц гидрохлорид), относящихся к классу (3 - хлорэтшгароизводных фенилаланина, т.е. слохьйх по составу производных.аминокислот.

Асалпн

СНСсИо),

(ас№)д N -<а>инА- С Н - со N«0.11 - со о с, н,

мнсосн,

Хлогифен: ^

« .сила а^ся.-сн-с-ичм^

м^нсА

Фармакокинетпческие испытания с использованием моченных чрптсе».' препаратов имеют преимущества по сравпеппю с обычными аналитическими процедурами.

В работе получены л вицелеяы - осалил и '3Н - хчогяйод с молярной радиоактивностью п радиохимической чистотой, удовлетворяющими требованиям фармакокинетики. На шшогпых (шилг л к;-!,'су) проведены фармакокинетичгские исследования с использование!..

полученных препаратов и определены полупериода всасывания. Рацио-химическая часть работы состояла б нахождении физико-химических 'условий, при которых использований метод получения меченных вещест: дает наилучшие результаты.

Способ получения меченых веществ

Меченные тритием вещества получали изотопным обменом протия в исходных молекул на тритий путем воздействия атомарные тритием, имеющим высокую среднто температуру ( ~ 2000К), на твердые мишени веществ, находящиеся при ?7К (Метод термической активации трития, МТАТ). Вещества в количестве 0,01-Змг в растворителях (вода, метанол) помещали в реактор-цилиндрический сосуд диаметром 7 см> объемом 420-520 мл и готовили мишень путем лиофилизации или упаривания. Реактор подсоединяли к вакуумной установке, откачивали до остаточного давления <. Ю"аП8, . В реактор дозировали

.- 3На '{срез палладиевьй фильтр до давления 0,5-4 Па. Реактор охлаядали'до 7'7К. Установленный коаксиально источник атомов-вольфрамовая спираль от электролампы (150Вт, 127В) -обеспечивал поток атомов на поверхность твердой мишени ~ 10*® атомов / см^. (200СК).

Отличительной чертой использованного метода получения-меченых веществ является многофакторность процесса. Целью радиохимической части было определение значений параметров, лимитирующих скорость реакций. Среди этих факторов выделены основные: давление ^Н^ , масса л площадь мишени, время реакции, температура источники.

Внделенае. очистка и идентификация меченых соединений

Основные аналитическим методом определения природы получа-

ющлхся продуктов выбрана тонкослойная хроматография. В случае необходимости использовали также жидкостную хроматографию. Внутримолекулярное распределение трития определяли методом ЭН --я м р - спектроскопии.

После реакции мишень растворяли в метаноле и определяли общую радиоактивность на сциициляционном счетчике. "Лабильны;:" тритий удаляли упаривание;.! растворов на роторном испарителе. Аликвоту раствора наносили на пластику " б'Лц-ро] " и проводили хроматографирование в системе С Н ~ С Н3 ОН , Распределение радиоактивности по пластине находили измерением активности отдельных полосок, а также методом сканЦирования. Объединенные образцы подвергали очистке путем полупрепаратпвного выделения в аналитических условиях.

Фармзкокинетпческпе исследования

Эксперименты проводили на шиах - следах массой - — 20 г и крнсзх-самцах массой 280 г. Препарата вводили перо-

рально или внутривенно. тгерез определенные интервалы времени отбирали пробы крови, мочи, кала и после обработки НN 03 измеряли их радиоактивность. По экспериментальным, данным расчитывали полупериоды всасывания и выведения.

Попбош

Тля исследования взаимодействия атомов трития с веществами и получения меченых соединений использовали установи, созданную но кафедре радиохимии ?1ПУ. Радпоактизиость измеряли на спинтплляцяон-Н01.1 спектрометре " МАЯК-И". Окаяиировянпе хромстограмм о ответвляли на приборе фирм« . Спектры Н ~ -Я М Р снимали на спектрометре '< АС 250, Вгцкег " ка '""Я2"'0"'1 266,8 Г.ЕПц,

Погрешность результатов

Как правило, приведенные в диссертации данные, касающиеся .зависимостей выходов меченных веществ от какого-либо параметра (давления, температуры, массы и т.д.) представляют результат одно-краткого эксперимента. Однако, в каждом случае для оценки погрешности проводили несколько опытов при фиксированном значении выбранного параметра. Оказалось, что среднее значение находится в пределах 30^-кого интервала отдельного измерения (для р = 0,9Е Основной вклад в погрешность цэе! низкая воспроизводимость поверхности мипени .'касТИЧЦОП)увеличений точности удалось достичь путем стандартизации поверхности путем её шлифования и травления. При расчетах выходов учитывалось парциальное давление трития в реакторе путем проведения (периодически) реакция гидрирования-коричной кислота и определения получающейся радиоактивности.

Результата

В работе исследовано влияние основных параметров метода терелческой активации трития на выход меченых целевых продуктов. Табл.1 и 2 иллюстрируют, как пример, характер проведенных исследований.

I. Давление трития

Подробные исследования влияния давления трития на выход меченных соединений не проводили, поскольку известно, что скорость реакции отрыва водорода-лимитирувдей стадии процесса обмена - максимально- при давлении 3 Н2 » обеспечивающем свободный пролет атомов от источника до мишени. Однако, благодаря сложному механизму реакции отрыва (протекание реакции путем туннелиро-вания против) возможно образование меченых соединений и при высо-

кпх давлениях, т.е. в условиях полной термализации атомов до температуры мишени. Согласно полученным нами данным (табл.3), в условиях полной термализации атомов ( Р (3НД) = Ц- Па} радиоактивность веществ существенно уменьшается,что указывает па малый вклад тунельного механизма.

2. Температура источника При низких давлениях, ~ 0,5 Па (больших числах Кнудсена) обеспечивается " прямой пролет" атомов от источника до мишени. Это задает их энергетическое распределение, соответствующее температуре источника. В случае асалина температурит! эффект источника не выявлен. Однако выход ^Н - хлогифена существенно зависит от температуры источника. Это связано с различным влиянием побочных факторов: слабая зависимость выхода ' Я - асалпна от температуры источника обусловлена, возмокло, близкими значениями энергий активации отрыва водорода и побочных реакций; обнаруженная зависимость выхода 3 Н - хлогифена от температуры источника связана, видимо, с возможны.! разложением последнего под действием света. Температурную зависимость может лимятпровпть такке процесс рекомбинации атомов трития на поверхности мияепп, увеличивающийся с ростом плотности потока атомов при увеличении температуры. Правда,согласно литературкнм данным, атомы водород?> не стабилизируются. в органических матрицах вплоть до самих низких температуру, т.е. стационарная концентрация их слишком мала, чтобы процесс рекомбинации мог бы конкурировать с основной реакцией. Влияние таких факторов, как вероятность побочтшх релкппй, рекомбинация атомов, а также действие света в работе не изучалось.

Табл. I. Влияние параметров Г.УТЛТ на выход и радиоактивность

асалина

Масса мишени, мг Время реакции, сек Давление тгатия, Па Температура источника, К Ао А1 В а Ауд

0.0 Г 10 5,3 1800 3,6 1,5 20,1 0.5 50,0

0.02 10 5,3 1800 7,8 6,2 8,0 0,6 31,0

0,03 10 5,3. 1800 8.9 5,5 11,0 0,6 14,8

0',04 10 5,3 1800 6,1 3,4 17,8 0,6 15,8

5,3 1800 6,5 5,5 9,4 0,5 12,5

5,3 1800 6,9 3,8 15,8. 0,6 16,0

5,3 1РСС 3,4 1,2 29,6 0,5 13,5

0,06 1С 5,3 1СС0 12,3 2,3 8,2 0,6 9,3

0,10 10 5,3 18С0 6,8 3,3 24,2 0,8 7,9

0,12 10 5,3 1СС0 14,8 8,0 5,0 0,4 3,3

5,3 1800 12,8 8,9 9,1 0,8 5,0

0,16 10 5,3. 1800 7,4 1,8 39,4 0,7 4,4

0,20 10 5,3 1800 10,3 7,4 12,1 0.9 4,5

0,24 10 5,3 .1800 12,9 6,2 8,1 0,5 о о

С',5Г 1С Г8СС от т 6,7 19,4" 1,3 О О » '

1,00 тс 5,3 ТРОС 12,0 г» о 4 »" ТС,9 1,0 1,0

1,50 10 5,3 18С0 19,6 7,3 16,2 1,2 0,9

2,00 1С Г} 1ГС0 7,3 4,5 26,7 1,2 0,6

з,оо 10 5,3 1800 12,1 4,0 оо сг о 1,3 0,4

^•о - общая радиоактивность мипени, пКц. ; Ат радиоактивность мишени после уделения "лабильного" трития,

3 - еыход целейого продукта, %% ; А - радиоактивность целевого продукта, м Ки ; Ауд - удельная радиоактивность продукта, мк«/мГ.

Выход и радиоактивность ^М- хлогифеиа в зависимости от условий реакции, (давление трития равно 5,3 Па)

Табл. 2.

Темпер. Время спирали, реакции, 1С С 6К4 Масса мишени, иг Ао А1 А В ЛУЯ

10 0,87 0.7 0,3 0,1 49.0 0,2

1,74 0.8 0,6 0,3 44,0 0,1

3,48 0,8 0,6 0,8 45,5 0,1

1600 1,74 1,8 0,9 0,20 23,0 0,1

20 3,48 1,4 1,2 0,2 20,5 0,1

5 у 23 1,5 1,4 0,3 31,4 ОД

0,35 3,0 2,5 0,6 22,6 1.6

0,87 5,8 2,6 0,5 37,9 1.1

1.74 3,2 2,1 1,2 5В,3 0,7

1Р00 10 1.74 7,0 2,4 1,5 43,6 0,8

3,40 3,2 3,1 1,9 62,2 0,6

7,00 7,8 3,9 2,6 65,3 0,4

0,50 7,1 2,7 0,3 10,7 0,6

20 2,00 9,5 2,7 0,5 17,5 С,5

1,74 1,Р т т - » - С,6 51,2 0,3

2СОО 1С 3,48 2,5 1.5 0,8 52,2 0,2

7,00 1,2 т т - » С,9 79,4 0,3

1.74 1,0 и 0,6 5Т у 2 0,3

20 3,48 2,5 1,5 0,8 52) 2 0,2

7,00 Т.2 1,1 0.9 79,4 0.3

(Обозначения си. табл.1)

Образований меченого асалина при различных давлениях молекулярного трития ( Т = I800K)

Табл.3

Условия рекции Радиоактивность

асалина

Давление тштия. Па масса мишени мг врет реакции, с. мКИ % от общей радиоактивности мишени

0,5 0,5 10 1,32 15

1,0 0,5 .10 0,89 14

4,0 2 5 0,12 12

4,0 2 10 0.09 5

4,0 2 10 0,01 5

3. Реактор, масса и поверхность мишени.

В работе использовали реактор из обычного стекла, а также из стекла, поверхность которого была обработана плавиковой кислотой или абразивом с целью увеличения поверхности. Результаты показали, что в случае обработанной поверхности "запредвливание" радиоактивности мишени достигалось при больших значениях массы мпгени и обнаруживалась лучшая воспроизводимость результатов.

Молярная радиоактивность целевых продуктов зависит от массы -V

кипени как т л ( т - масса кипени). Это следует ожидать, если предположить, что мишень представляет собой "бесконечно-толстые" микрокрпсталы веществ, рост которых с увеличением массы происходит по поверхности стекла, т.е. выпадающие из раствора (пли Нормирующиеся при лиофилизацпи) зародыши кристаллов имеют размеры, превышаюсье толщину реакционного слоя, т.е.~1СП?м.

На рис.1 приведена соответствующие данные. Видно, что молярная радиоактивность пропорциональна пГ^ (коэффициент корреляции 0,998).

В случае асалина обнаружена иная зависимость радиоактивности от массы, а именно: полярная радиоактивность пропорциональна 1/т (рис.2). Это указывает на то, что, видимо, в этом случае мишень представляет собой иную поверхность, отличную от первой . В диссертации рассмотрены предполагаемые варианты организации поверхности.

Из полученных данных следует также, что МТАТ ограничен по значению общей и молярной радиоактивности. ГТовпдпмому, "идеальной" мишенью в Г.1ТЛТ может быть равномерно распределенный мопо-молекулярный слой вещества. Для исследованных веществ и реакторов это соответствует массе ~ 10 мкг. Реальное же значение массы, для которой достигается "запределпвание" значения радиоактивности, соответствует т = 0.01 — 1 м г , т.е. на несколько порядков шгае расчетного. Дальнейшие успехи могут быть на пути поисков способа диспергирования веществ на "молекулярном уровне".

4. Время реакции

Эксперименты показали, что время однозначно не определяет радиоактивность мпиеип. Оптимизация по времени связана со значением массы и поверхности, но как правило, опо составляет Юс, что значительно меньше времени реакции, устаноачеиных ранее для простых аминокислот, хотя значение молярной радиоактивности асалина и хлогпфена оказалось сопоставимо с таковым для ранее изученных аминокислот.

5. Внутримолекулярное распределение трития. Меченые вещества, полученные по МТЛТ, являются, как правило,

свидетельствует о преимущественной локализации трития в эфирной С Н з - группе асалина. Это шзвано, возмонно, двумя причинами: дезактивирующим действием заместителей з бензольном кольце и пространственной ориентацией молекул в кристаллах, выпав-еих на поверхности стекла в процессе приготовления мишени. .

6. Влияние приводи вещества Предпринятые иопвткл получения меченого сарколизина

сарколизина не поднималась выше 0,1 мки/мг. Было предположено, что причиной являются побочные процессы декарбоксилирования и дезаминирования аминокислоты под действием атомов трития. Действительно, введение "защиты" (формальной по аминогруппе и ацетильной по карбоксильной) привело к существенному увеличению радиоактивности соответствующих соединений, однако, после их гидролиза радиоактивность полученного сарколизина сказалась низкой, т.е. "мечение" сарколизина пло по грушам "защита". Это согласуется с анализом 3Н--ЯМР - спектра асалина, где таете обнаружена радиоактивность в эфирной группе. Таким образом атаке *; атомами трития подвержены вполне определенные части

молекул-их гидробная часть. Значит, по 1.ПАТ возможно получение по крайней мере, "преимущественно меченных" молекул.

неселективно-меченымЕ. Сравнение спектров ^Я-ЯМР и 3Н~ЯМР

не увенчались успехом. Молярная радиоактивность 3Н

Рис. I. Зависимости удельной радиоактивности Н

хлогифена от з/Лп при различных температурах.

зо-

45 ■

ЛО

iS

А/Я;

10 -

-,--.-.-.-.-J/m, Mf-1

10 t 30 5Ô

Рис. 2. Зависимость удельной радиоактивности ¿H -асалина от массы.

Время

А

-.3,6

I 4 24 48 72 96 168 264 336

Концентрация - асалина, п№сгп/'тг

6,43 13,25 30,19 49,08 45,43

27.18 20,08

14.19 11,67

Рис. 3. '1'армакокпнетгка - асалина в крови кркс,

при однокрзтном пероральном введении в дозе 80 мг (2,17 - Ю8 расп./мпн.) /кг.

- 14 -

7. Фармакологические исследования

Результаты исследований, проведенных автором в ВОНЦ АМН, представлены в виде графиков, показывающих уровни радиоактивности, появляющейся в крови, а также в выделениях опытных кивотных. На рис.3, представленном в качестве примера, дана одна нз кпнетик описываемого процесса. По кинетическим кривым расчптаны параметры процесса, получены значения полупериодов всасывания и выведения. Подтверждена двухкамерная модель

процесса. Нз защиту выносятся:

I. Научное обоснование - теоретическое

и экспериментальное - значений физико-химических параметров Г.'ИЛТ, лимитирующих (пли определяющих) процес обмена протпя на тритий в биологически-активных веществах асалине и хлогвфене.

2. Экспериментальное доказательство того, что атака атомами трптля, поступавшими из газовой фазы, молекул бпологичсскн-активных соединений, распределенных на поверхности стекла, происходит ПС' гидрофобии,1 частям молекул. Это предполагает возможность получения "преимущественно" меченых молекул биологически-активных веществ.

3. Доказательство того, что полученные по Т.ТТАТ меченнге ■ тритием асалпн и хлогпфен коано применять для изучения фармако-" кинетики.

- 15 -

Апробация работа: Результаты работы докладывались на научных коллоквиумах лаборатории радионуклидов и меченных соединений. Материалы работы докладывались на совещании и конференциях и опубликованы в тезисах:

Ш Всесоюзного совещания по проблеме "<Ззззологически-активныв соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами", 1991 г., 2-ой Всесоюзной конференции "Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств", 1991 г., а также Третьей Всесоюзной конференции по фармзкокипетакс "Современное состояние и перспективы развития йармзкокшетлкп", 1991 г.

Основные выводы

1. Изучено взаимодействие атомов трития, получаемых по методу термической активации, с асалином, хлогифеном, сарколизином и производными сарколизина с целью получения медицинских препаратов, по радиохимической чистоте и молекулярной радиоактивности удовлетворяющих требованиям фармакокипетикп.

2. Изучено влияние основных факторов метода термической активации трития на выход меченых соединений и определены физико-химические условия, при которых асалин и хлогиЛен получаются с максимальной радиоактивностью.

3. Сделаны цредыололеппя о структуре мппеней п хпрпг.тсре реакции атомов трития, а также о причинах, по которым один из препаратов - сарколпзпн - не мояет быть получен в указанных условиях.

4. Методом — -Я М Р - спектроскопии няйцепо внутримолекулярное распределение трития в ссалипе, показавшее преимущественную локализацию в эфирной группе молекулы.

- 16 -

5. Проведены фармако-кинетические исследования на животных полученных препаратов и по экспериментальным данным рассчитаны их полуперяоцн всасывания и выведения.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Хэ Дон Гир, Г.А.Бадун, И.Б'.Ярцева, С.Г.Розенберг, Н.И. Зпмакова, ЕЛ».Симонов, Э.С.Филатов. Получение меченых тритием препаратов асалина для медицинских исследований. Бестн. ун-та, сер.2, химия, 1992, 155.

2. Н.И. Зимакова, А.П.Будысо, Е.Ю.Колесникова, О.В.Яцевич, Хэ Дон Гир, Г.А.Бадун, Е.О.Симонов. Получение противоопухолевого препарата [ЭНЗ- ИПБ'ЭУ п исследование его фармакокинетики. Ш Всесоюзное совещание по проблеме "Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами". Тезисы докладов, Звенигород, 1991, с.35.

3. С.А.Караганов, О.В.Яцевич, Н.И.Зимакова, Хэ Дон Гир, Г.А.Бадун, Е.Ф.Симонов. Получение противоопухолевого

препарата 3Н — асалина и изу4ение его биодоступности при пероральном применении. Там не, с.36.

4. Н.И.Зимакова, С.А.Караманов, О.В.Яцевич, З.Г.Гасан-Гусей-кова, Хэ Дон Гир, Г.А.Бадун, Е.'5.Симонов. Некоторые аспекты экспериментального изучения бпрмакокинетики и метаболизма противоопухолевого препарата 3 И — асалина. Третья Всесоюзная конференция по фзрнакоккнетике "Современное состояние в перспективы развития фармакокинегики". Тезисы докладов, Москва, 1991, с.58.

5 ДИ,Зимакова, Л.П.Будько, Е.Ю.Колесникова, О.В.Яцевич, Хэ Дон Гир, Г.А.Бадуя, Е.О.Симонов. Разработка методов количествеи-ного определения хлогифена в биоматериале и изучение его доклинической фармакокинетики. Там же, с.60. 6. А.П.Будъко, З.Г.Гасан-Гусейнова, О.В.Яцевпч, И.И.Зимакова, Хэ Дон Гир, Г.А.Бацун, Е.<5.Симонов. 3-я Всесоюзная Конференция "Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств? Тезисы докладов. Г'осква, 1291, с.34.

Автор приносит благодарность Г.А.Балуну за постоянную помощь в работе, а тоае благодарит Н.И.Зимакову за консультадпи, постоянное внимание к работе п помощь в проведении фармгкокпнетп-ческих исследований.