Воздействие анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

РГ6 ол

На правах рукописи

ГАЛКИНА Ольга Згютояапиа

ХкГ

шшщшж

Шк ДОВДВДГШ

в -вшлштшк п шлштщш

02.00.04 - физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск 1995

Работа выполнена в Институте неорганической химии СО РАН и Институте физиологии СО РАМН

Научный руководитель:

кандидат химических наук О. В. Поляков

Научный консультант:

кандидат биологических наук Е. К. Подгорная

Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор В. И. Белевандев; канд. физико-математических наук С. И. Еременко

Ведущая организация:

Институт химической кинетики и горения СО РАН

Защита состоится " 1995 г. в 10 часов на за-

седании диссертационного совета Д.002.52.01 в Институте неорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева,3.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института неорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан " 5~" 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук Буянова Л. М.

с/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Химические превращения, инициируемые анодными микроразрядами в электролитах, представляют фундаментальный интерес с физико-химической точки зрения. В системе с микроразрядами действующей может являться широкая совокупность факторов, включающая как термическое, так и нетермические виды воздействия, в том числе рождаемые в электролите активные радикальные частицы (ОН, eaq", Н). Физико-химические закономерности воздействия микроразрядов на растворы ограниченного числа веществ отражены в литературе, однако воздействие на вещества, адсорбированные коллоидом, до сих пор не исследовалось.

Дофамин (ДА, 3,4-диоксифенилэтиламшр—удобный объект для изучения физико-химических закономерностей и химических эффектов микроразрядного процесса в коллоидах. Это связано с возможностью контролируемо осуществлять как ориентированную, так и неориентированную адсорбцию ДА по методикам, отработанным для коллоидов биологического происхождения, параметры и адсорбционное взаимодействие с которыми детально известны.

Физико-химические процессы с участием ДА являются фундаментальной основой механизмов нейрохимических превращений. Существующие в настоящее время представления опираются на данные о макроскопическом характере этих процессов. Дальнейшая детализация до молекулярного уровня требует проведения модельных исследований химических превращений дофамина в средах, приближенных к естественным. Однако, попытки инициирования подобных превращений обычно применяемыми методами приводят к неудаче из-за повреждения модельной системы. Представляется вероятным, что анодные микроразряды могут быть перспективны для инициирования превращений ДА в модельных системах из-за локальности и короткого времени воздействия на среду с реакционными компонентами. Поэтому необходимо исследовать возможности моделирования нейрохимических превращений ДА с использованием анодных микроразрядов.

Таким образом, актуальным является изучение воздействия анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах.

Целью работы являлось исследование воздействия анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах, выявление основных физико-химических закономерностей этого воздействия

з

и оценка возможности использования анодных микроразрядов как инструмента для моделирования нейрохимических превращений дофамина.

Исходя из дели, были определены следующие задачи:

1. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимической детекцией идентифицировать продукты превращения ДА в растворах под воздействием микроразрядов. •

2. Методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией идентифицировать продукты превращения ДА в состоянии ориентированной и неориентированной,адсорбции на коллоидных препаратах под воздействием микроразрядов в среде с составом, требуемым для протекания нейрохимических процессов.

3. Исследовать закономерности образования продуктов превращения дофамина под воздействием анодных микроразрядов и выявить участие генерируемых микроразрядом активных частиц в превращениях ДА с помощью введения акцепторов.

4. Сравнить продукты превращения при действии анодных микроразрядов на дофамин, связанный коллоидными препаратами природного происхождения с веществами, найденными в природных системах.

Научная новизна работы заключается в том, что в ней впервые установлено образование норадреналина (НА), 3,4-диоксифенилаланина (ДОФА) при воздействии анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах;

обнаружено образование под воздействием анодных микроразрядов пара-тирамина (п-ТА)—продукта отрыва 3-ОН группы от дофамина в состоянии ориентированной адсорбции на коллоидных препаратах, выделенных из предварительно активированной природной системы. Показано, что тот же продукт наблюдается в активированной природной системе;

показано, что основной фактор воздействия анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах обусловлен реакциями первичных продуктов разложения воды, а не термическим действием плазмы разряда.

Практическая ценность работы состоит в том, что результаты исследования расширяют и дополняют представления о физико-химическом воздействии анодных микроразрядов на растворы и коллоиды, и могут бы-п. использованы как физико-химическая основа установления механизма специфического действия дофамина при передаче нервного импульса в биосистемах, для мо-

делирования превращений дофамина и других биологически активных веществ в природных системах. Полученные результаты могут явиться частью физико-химической базы для создания нового класса препаратов для лечения дофаминовых патологий. На защиту выносятся:

— идентификация и закономерности накопления норадреналина и 3,4-диоксифенилаланина при воздействии анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах;

— идентификация и закономерности накопления пара-тирамина при воздействии анодных микроразрядов на дофамин в состоянии ориентированой адсорбции на коллоиде;

— факт, что основное воздействие анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах обусловлено реакциями первичных продуктов разложения воды, а не термическими эффектами в плазме разряда;

— сходство продуктов превращения дофамина в экспериментальных системах под воздействием микроразрядов с катехолами, образующимися в природных системах; принципиальная возможность моделировать с помощью микроразрядов нейрохимические превращения дофамина.

Работа выполнена в соответствии с Договором о научном сотрудничестве между Институтом неорганической химии СО РАН и Институтом физиологии СО РАМН от 20.02.88 г.

Апробация работы. Результаты, использованные в диссертационной работе докладывались на Международном симпозиуме "Биотехнология ростовых факторов" (Милан, 1991), VII Международном симпозиуме по катехоламинам (Амстердам, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, включая 3 тезисов докладов.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы. Изложена на 116 страницах машинописного текста, содержат 31 рисунок, 7 таблиц. Список литературы—105 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, поставлены цель и основные задачи работы, сформулированы положения, выносимые на защиту.

В первой главе проведен анализ имеющихся в литературе представлений о химических эффектах микроразрядов в водных растворах, о химических свойствах дофамина и родственных соединений.

В первом параграфе изложены основные представления о природе анодных микроразрядов на вентильных металлах в растворах электролитов. Отмечена множественность разнообразных физических процессов, сопровождающих явления микроразряда.

Во втором и , третьем параграфах обсуждены данные различных авторов о физико-химических процессах и химических превращениях различных веществ, инициируемых анодными микроразрядами в приразрядном объеме электролита, и происходящих в газе внутри пароплазменного пузырька. Подчеркивается, что практически все классы химически активных частиц (ускоренные электроны и ионы, электронно и колебательно возбужденные молекулы, радикалы и ион-радикалы, тер-мализованные электроны и ионы) генерируются при микроразряде. Отмечено, что эффекты в приразрядном объеме раствора подобны радиолитическим, а в пароплазменном пузырьке—могут быть описаны как плазмохимические; приразрядный объем раствора характеризуется в основном реакциями растворенного вещества с продуктами разложения воды.

В четвертом параграфе рассмотрены реакции продуктов разложения воды с ароматическими соединениями и биополимерами на основе данных по радиолизу растворов. Отмечена высокая реакционная способность этих соединений по отношению ^ радикальным и ион-радикальным продуктам разложения воды.

В пятом параграфе подробно обсуждены свойства и превращения молекулы дофамина.

Отмечено, что данные по радиолизу этого соединения в каких-либо условиях, а также о реакциях с продуктами разложения воды в литературе отсутствуют, однако могут быть сделаны некоторые качественные прогнозы о его реакционной способности в условиях воздействия микро-

разрядов на раствор по аналогии с родственными молекулами.

Несмотря на значительное количество работ по химии дофамина, физико-химические свойства природных систем, содержащих этот моноамин, мало изучены и продвижение в исследовании зависимостей между свойствами таких систем, их составом и условиями существования сдерживается отсутствием новых экспериментальных подходов.

Во второй главе описана техника эксперимента и основные методические приемы, приведены основные составы экспериментальных растворов и способы приготовления коллоидных препаратов.

Анодные микроразряды генерировались на поверхности электрода, изготовленного из тантала, при его положительной поляризации. Во всех экспериментах источником питания являлся выпрямитель. Контроль напряжения на разряде осуществляли прибором М 252 класса 0,5 с зеркальной шкалой. Прибор подключали через делитель напряжения. Напряжение снимали с анода и зондового электрода, расположенного вблизи поверхности анода на расстоянии 1 мм. Для поддержания тока в заданных пределах использовали стабилизированный источник питания. В рабочих режимах точность стабилизации составляла 1,5—5%. Рабочая ячейка представляла собой герметичный сосуд (после сборки) с термостатирующей водяной рубашкой. Объем рабочей ячейки составлял 2 мл. Танталовый анод был изготовлен в виде стержня диаметром 0,8 мм и длиной погруженной части 10 мм. Катод был изготовлен из титана и отделен от раствора пористой мембраной.

Для каждого отдельного эксперимента использовали предварительно подготовленный анод. Подготовка анода заключалась в обработке его в режиме горения микроразрядов в тренировочном электролите, который был такого же состава, как и базовый: 0,2 М КН2РО4 (рН 7,4), до достижения напряжения и = 480В"1-10%, т. е. в формировании оксидного слоя до такого состояния, при котором изменения достигнутого напряжения были несущественными за время, значительно превышающее длительность эксперимента.

Экспозицию растворов проводили в гальваностатическом режиме при напряжении 11 = 480В±0,5%, разрядном токе 1 = 4,2мА±5%, температуре Т=16н-18°С и постоянном перемешивании магнитной мешалкой. Доза воздействия микроразрядов определялась временем экспозиции I, которое варьировали в

интервале от 2 до 60 сек. Для стандартизации дозы воздействия микроразрядов поддерживали постоянными 4 параметра системы: напряжение на аноде и, ток через ячейку I, время экспозиции раствора 1 и долю токов утечки 1. Эксперименты с нестандартными значениями и и 1 отбраковывали.

После окончания воздействия микроразрядов жидкость, исходное количество ДА в которой составляло 0,3 мг, анализировали на содержание дофамина и электроактивных продуктов его превращения. По окончании воздействия микроразрядов на коллоиды пробы центрифугировали при 12000 g в течение 20 мин при Т = 4°С. В супернатанте определяли ДА и электроактивные продукты его превращения.

Анализ дофамина н продуктов его превращения под воздействием анодных микроразрядов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (прибор фирмы "ЬКВ", Швеция). Условия хроматографии были следующие: колонка из нержавеющей стали размером 250x4,6 мм, упакованная сорбентом для обращенно-фазовой хроматографии 1ЛсИгозогЬ ЯР-18 с размером частиц 5 мкМ ("ЬКВ", Швеция); подвижная фаза, приготовленная на бидистиллированной воде, содержала 0,1 М ЫаН2РС>4, 1мМ ЭДТА, 10 мкМ ЫаС1, 5 мг/л натрия октил сульфоната и 10% (по объему) метилового спирта, рН 4,0. Скорость элюции составляла 1,0 мл/мин. Потенциал стеклоуглеродного электрода устанавливали равным 0,65 В или 0,85 В. Электрод сравнения Ag/AgCl. Анализируемый раствор разбавляли несколько раз 0,01 N НС1 и вводили (20 мкл) через инжектор ("ИЬеос1упе", США) в колонку для ВЭЖХ. Идентификацию веществ на хроматограмме проводили по времени удерживания (1) веществ стандартной смеси.

Содержание ДА и продуктов его превращения рассчитывали в нмолях и процентах от исходного количества ДА, для чего соотносили высоту соответствующего пика на хроматограмме анализируемого раствора с высотой пика внутреннего стандарта 3,4-диоксибензиламина (ДОБА) известной концентрации или с высотой пика ДА на хроматограмме контрольного, т. е. без воздействия микроразрядов, 1 мМ раствора ДА.

Результаты представляли как среднее арифметическое 5—10 значений содержания определяемого вещества со среднеквад-ратическим отклонением.

Для исследования воздействия микроразрядов на ДА, адсорбированный коллоидом, использовали коллоидные препараты природного происхождения с известными из литературы параметрами ориентации адсорбированного ДА на активных центрах. Типы и число активных центров, участвующих в адсорбции ДА, задавались выбором источника биополимерной матрицы и его предварительной подготовкой ("активация" по стандартным методикам), и контролировались методом радиолигандного связывания по величине константы равновесия диссоциации комплекса активный центр—дофамин (Ка) и величине "рецепторной плотности" Вшах, соответственно.

Процедура получения коллоидов были следующая. Выделенные структуры мозга животных гомогенизировали на льду в 9 объемах 0,32 М сахарозы в 10 мМ трис-НС1, 2 мМ ЭДТА, рН 7,4. Эндогенный дофамин и другие низкомолекулярные соединения удаляли из гомогената, центрифугируя его при 50000 g (20 мин, 4°С). Полученный таким образом осадок использовали в качестве биополимерной матрицы для адсорбции ДА, осадок гомогената содержал 0,5 мг белка.

Адсорбция ДА на биополимерной матрице достигалась выдерживанием охлажденного 1 мМ ДА в присутствии осадка гомогената в 0,2 М калий—фосфатном буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтола, 1 мМ аскорбиновой кислоты и 1 мМ паргилина (ингибитор ферментов), рН 7,4, при Т = 4°С в течение 17 часов по методу Подгорной Е. К. (Нейрохимия.—1990.—Т. 9.—N 3.—С. 301—308). В результате получали коллоиды, содержащие ДА в состоянии адсорбции на биополимерной матрице.

Проверку сохранения реакционной способности биополимерной матрицы осуществляли измерением параметров связывания [ Н]-ДА активными центрами—рецепторной плотности, Вшах и константы равновесия, диссоциации комплекса активный центр: дофамин, К«>, по методу Подгорной Е. К. (Нейрохимия.—1990.— Т. 9.—N 3.—С. 301—308).

Статистическую обработку данных проводили по ^критерию Стьюдента.

В третьей главе представлены результаты экспериментального исследования физико-химических закономерностей воздействия анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах и дана их интерпретация.

Основой для выявления закономерностей воздействия анодных микроразрядов на ДА явились данные хроматографического

анализа (ВЭЖХ) компонентов реакционной смеси по окончании воздействия при различных временах экспозиции.

Хроматограммы, представленные на рис.1 демонстрируют эффект воздействия анодных микроразрядов, который проявляется в образовании продуктов химических превращений ДА.

Установлено, что превращения ДА в растворах и коллоидах начинаются через Юн-15 сек после включения анодных микроразрядов. По-видимому, это связано с особенностями микроплазменного процесса.

раз/оялол*

л ю

¿>ез /оаз/ол^с

а

А*

/О лип

¿Г

Рис. 1. Эффект воздействия микроразрядов на дофамин в коллоиде (А) и в растворе (Б)

Ю О

/о г.нио-

1. Превращение дофамина в растворах

После воздействия анодных микроразрядов на 1 мМ ДА в 0,2 М КН2РО4 (рН 7,4) обнаружены продукт /?-гидроксилирования . ДА—норадреналин (НА), продукты окисления НА и ДА—норад-реналин-орто-хинон (НА-о-Х) и дофамин-орто-хинон (ДА-о-Х). Зависимость выхода НА от времени воздействия микроразрядов сложная и при Ькс = 33 сек имеет минимум—7,2 нмолей НА, что составляет 0,43% от введенного количества ДА (рис. 2). Сравнение зависимостей выходов НА и НА-о-Х от времени воздействия микроразрядов показывает, что снижение выхода НА (с 18,9 нмолей до 7,2 нмоля) сопровождается одновременным нарастанием количества НА-о-Х и наоборот. Известно, что способность катехолов обратимо окисляться в орто-хиноны является их

р"""иуг- фундаментальным свойством.

Учитывая это, динамика изменения выхода НА находит свое объяснение в протекании окислительно-восстановительного процесса НА «^НА-о-Х + 2Н + 2е в интервале экспозиции микроразрядов 25-^60 сек. Динамика изменения выхода ДА-о-Х (рис. 2) также интерпретируется протеканием окислительно-восстановительного процесса ДА^ДА-о-Х + 2Н + 2е в интервале экспозиции микроразрядов 25т60 сек.

При добавлении в электролит акцепторов электронов (0,2 /Л ЫН4Ж)з) или ОН радикалов (0,25 М С2Н5ОН) НА и НА-о-Х не детектируются, также, как и ДА-о-Х после добавления акцепторов ОН радикалов. Эти результаты свидетельствуют об участии продуктов разложения воды: ОН радикалов и валентно-несвязанных электронов в превращении ДА в НА и ОН радикалов в реакциях окисления ДА и НА.

После воздействия анодных микроразрадов на 1 мМ ДА в 0,2М КН2РО4, содержащем 1 мМ аскорбиновой кислоты (АК), рН 7,4, обнаружены НА, продукт а-карбоксилирования ДА—3,4-диоксифенилаланин (ДОФА) и четыре неидентифицированных электроактивных продукта (Х1, Х2, Хз, Х4), которые не принадлежат к известным продуктам обмена ДА, НА и производным орто-хинона.

Зависимости выходов НА и ДОФА от времени экспозиции микроразрядов сложные и при 1Экс = 33 сек имеют максимум: 30,6 нмоль НА и 5,3 нмоля ДОФА, что составляет соответственно 1,7% и 0,35% от исходного количества ДА (рис. 3). Сравнение кривых накопления НА, ДОФА и Х1, Х2, Хз, Х4 (рис. 3) показывает, что понижение выходов НА и ДОФА при 1Экс = 33 сек сопровождается появлением продуктов Х1, Х2, Хз, Х4 и

Рис. 2. Зависимости выходов норадре-налина, норадреналин-орто-хинона, до-фамин-орто-хинона от времени воздействия микроразрядов (I) в калий-фосфат ном буфере (рН 7,4); и = 480 В, 1 = 4,2 тЛ

Вспалн мо/!6

Вшах, %

л? но < саг

Рис. 3. Зависимосги выходов но-радреналина, 3,4-диоксифенила-ланина, продуктов Хь Х2, Хз, Х4 от времени воздействия микроразрядов О) в калий-фосфатном буфере (рН 7,4); и = 480 В, 1 = 4,2 тА

возрастанием их количеств. Вещества Х1 и Х2 являются продуктами последующих превращений НА и ДОФА соответственно, так как эти вещества обнаруживаются после воздействия анодных микроразрядов на контрольные растворы НА и ДОФА. Вещества Хз и Х4 являются продуктами превращения ДА. Таким образом, вывод НА и ДОФА из реакции при экспозиции анодных микроразрядов свыше 33 сек находит свое объяснение прежде всего в последующих превращениях НА и ДОФА соответственно в продукты Х1 и Хг.

При добавлении в электролит акцептора электронов (0,2М ЫН4Шз) выход ДОФА возрастает примерно в 10-^-20 раз, достигая 2,5н-3,0% от исходного количества ДА, выходы продуктов Хз и Х4 не изменяются, а НА и продукты Х1 и Хг не детектируются.

При добавлении в электролит акцептора ОН радикалов (0,25М С2Н5ОН) выходы про-

дуктов Хз и Х4 не изменяются, а НА, ДОФА, продукты Х1 и Х2 не детектируются; в значительных количествах появляется продукт Х5. Вещество Х5 не относится к известным продуктам обмена ДА, НА и производными о-хинона и может образовываться в незначительных количествах и в отсутствие аскорбиновой кислоты.

Полученные результаты свидетельствуют об участии ОН радикалов и валентно-несвязанных электронов в образовании НА и продуктов Х1 и Хг; ОН радикалов—в образовании ДОФА и независимости превращений ДА в продукты Хз и Х4 от ОН радикалов и валентнонесвязанных электронов.

2. Воздействие анодных микроразрядов на дофамин в коллоидах

При воздействии микроразрядов на коллоид, содержащий ДА в состоянии ориентированной адсорбции на активном центре, происходит образование иных продуктов, чем в растворе: образуется пара-тирамин (п-ТА), который отличается от ДА отсутствием 3-ОН группы ароматического кольца.

Условия образования п-ТА из ДА являются специфическими, так как этот моноамин не обнаружен после воздействия микроразрядов на ДА ориентированно адсорбированный на коллоиде, полученном из неактивированной природной системы. Микроразрядный процесс в коллоидах, содержащих ДА в состоянии неориентированной адсорбции, также не сопровождается образованием п-ТА. Факт образования п-ТА из ДА ориентированно адсорбированного на коллоиде, полученном из предварительно активированной природной системы, указывает на сохранение активных центров ориентированной адсорбции в коллоиде после воздействия анодных микроразрядов. Это подтверждается также приближенным совпадением величин Вшах и Ка до и после воздействия анодных микроразрядов (табл. 1). Сохранение реакционной способности макромолекул, а значит и их структуры, свидетельствует о принципиальном различии воздействия анодных микроразрядов по сравнению с радиолизом, фотолизом, механолизом, термолизом, действием Н2О2, при которых происходят повреждения, деструкции макромолекул и олигомеризации отдельных молекул.

Трансформация ДА в п-ТА протекает в интервале экспозиции микроразрядов от 25 до 35 сек и при I = 33 сек достигает максимума 1400ч-1600 нмолей или 70 ч-7 5% от исходного

Параметры связывания [3Н1-ДА Д2 рецепторами синоптических мембран до и после воздействия анодных микроразрядов на коллоиды, полученные из природной системы

Таблица 1

Экспериментальная система

фМОЛЬ

К а, им

^тах -

мг белка

контроль

воздействие анодных микроразрядов

контроль

воздействие анодных микроразрядов

Коллоид № 1 Коллоид № 2

26+3 56±4

20±3 48±5

1,00±0,Ю 1,00+0,10 0,80+0,07 0,80±0,07

количества ДА. Образование п-ТА сопровождается значительным увеличением выходов НА (более 300 нмолей или 14-г-15% от количества ДА) и ДОФА (около 100 нмолей или 4-н5% от количества ДА) по сравнению с их образованием в растворах (ср. рис. 3 и 4). Как видно из рис. 3 и 4 профили выхода НА, ДОФА, продуктов Х1, Хг, Хз, Х4 в растворах и коллоидах качественно совпадают. Это, видимо, обусловлено схожестью протекания микроразрядного процесса в растворах и коллоидах. Количественные различия в образовании производных ДА можно связать с

различием в природе экспериментальных систем. Не столь значительное, но увеличение выходов НА и ДОФА в коллоидах, где п-ТА не образуется, отражает, по-видимому, влияние коллоида на концентрации активных частиц, которые генерируются при микроразрядном процессе и участвуют в трансформации ДА.

Образование п-ТА в точке максимума (Ькс = 33 сек) приводит к снижению количества ДА до 1-^2%. Последующим реакциям превращения ДА в продукты Хз и Х4 при дальнейшем воздействии микроразрядов предшествует реакция превращения п-ТА в ДА; п-ТА выводится из реакции в течение 2 сек (рис. 4) и это сопровождается возрастанием концентрации ДА. Действительно, после воздействия анодных микроразрядов на контрольные растворы п-ТА было обнаружено значительное количество ДА и понижение концентрации п-ТА.

Зб/хо^

//МО/16

/{ОО л- Г/?г

/МО А0Ш,

/ш- ХгХг Xь

/¿оо-

/200-

/гоо-

/ООО

ш

800■

700

500-

400-

300.

200-

ЮО

л? <л? еелг

Рис. 4. Зависимости выходов пара-тира^мина, норадреналина, 3,4-диоксифенилаланина, продуктов Хь Хг, Хз, Х4 от времени воздействия микроразрядов (1) на ДА ориентированно адсорбированном на коллоиде, полученном из предварительно активированной природной системы; и = 480 В, I = 4,2 тА

Легкость превращения п-ТА в ДА можно объяснить тем фактом, что п-ТА—аналог тирозина, который присоединяет пщроксил в ароматическое кольцо с высокой скоростью [К-Ю10 л/(моль-с) ].

В присутствии акцептора электронов (0,2 М ЫЩЬЮз) п-ТА не образуется. Это может указывать на участие гидратированных или квазисвободных электронов в превращении ДА в п-ТА. Также не образуются НА, продукты Х1, Х2; выход ДОФА возрастает, а выходы продуктов Хз и Х4 не изменяются.

В присутствии акцептора ОН радикалов (0,25 М С2Н5ОН) п-ТА также не образуется, однако появляется в значительных количествах продукт, идентичный веществу Х5. Можно полагать, чго процесс образования продукта Х5 конкурирует с превращением ДА в п-ТА. Добавление акцептора ОН радикалов к коллоидам также препятствует образованию НА, ДОФА, продуктов Х1 и Х2, но не влияет на выходы продуктов Хз и Х4.

В четвертой главе результаты экспериментов обсуждены с привлечением представлений химии высоких энергий и теоретических положений физической химии органических реакций.

При анодных микроразрядах в растворах под воздействием ускоренных в газоразрядной области заряженных частиц, проникающих в приразрядный слой водного раствора, как предполагается, происходит ионизация молекул воды. При этом процесс генерации активных частиц можно представить в виде: Н20~>Н20 + + е-; Н20 + Н30 + ; е~ + пН20-»е~ач

Активные частицы—радикалы ОН и гидратированные электроны—могут захватываться вводимыми в раствор веществами—акцепторами этих частиц:

е—ац + Бе-» [8 -»продукты; ОН + Бон-» [БОН ]-»продукты Разнообразие продуктов превращения ДА под воздействием микроразрядов указывает на то, что молекула ДА является одним из основных акцепторов активных частиц в экспериментальных системах. Высокая реакционная способность молекул ДА при микроразрядном процессе связана, по-видимому, с наличием связей и функциональных групп (ОН, ИН2) с достаточно высоким значением дипольного момента.

Обсуждены механизмы превращений ДА при воздействии анодных микроразрядов с привлечением представлений химии высоких энергий и теоретических положений физической химии органических реакций. В основу механизмов образования продук-

тов из ДА положено комплексное воздействие анодных микроразрядов, включающее локальные световое и термическое действия на экспериментальные системы и реакции генерированных активных частиц.

Предложены гипотетические маршруты превращений ДА в растворах и коллоидах при микроразрядном процессе, включающие реакции радикальных присоединений в ароматическом ряду, восстановления с передачей электронов, восстановления водородом, окисления посредством электрофильной или радикальной атаки на неподеленную электронную пару, фотоактивируемого гемолитического распада связи С-Н, термического декар-боксилирования уЗ-замещенных кислот.

Особое внимание уделено превращению ДА в п-ТА, которое относится к труднопротекающим реакциям восстановления ароматических ядер. Для их осуществления необходимы соль-ватированные электроны, причем расщепление устойчивой связи кислород-ароматическое ядро (Аг-О) протекает при условии, что атом кислорода связан с электроннооттягивающей группой. На этом основании можно представить, что сольватированные электроны, действуя как нуклеофильные агенты, атакуют связь 3-ОН или 4-ОН группы с ароматическим кольцом молекулы ДА, но расщепляется именно та связь Аг-О, где атом кислорода связан с электроннооттягивающей группой. Значит, факт образования п-ТА из ДА, т. е. отрыва 3-ОН группы от молекулы ДА ориентированно адсорбированного на коллоиде^ указывает на то, что связь 3-ОН группы с ароматическим кольцом более поляризована, чем связь 4-ОН группы. В теоретических моделях Олсона

(Med. Res. Rev.—1985.—V. 5.—N 2.—Р. 145—229), Симана и др. (Mol. Phannacol.—1985.—V. 28.—Р. 391—399) при

Схема I. Теоретическая модель связывания дофамина дофаминовым рецептором— активным центром в природной системе (по Олсону)

ДА в состоянии ориентированной адсорбции

активный центр

/Г/С

О /<7 ЛГ ¿о ^ "ли*.

Рис. 5. Хроматограмма катехолов, выделенных из предварительно активированной природной системы; ДОФУК (3,4-диоксифенилуксусная кислота) и ГВК (гомо-ванилиновая кислота)—продукты обмена ДА

ориентированной адсорбции ДА на ДА-рецепторе 3-ОН группа молекулы ДА -образует водородную связь с соответствующим атомом рецептора (схема 1). Следовательно, образование п-ТА из ДА^ ориентированно адсорбированного на коллоиде, полученном из природной системы после ее активации, можно рассматривать как экспериментальное подтверждение имеющихся в литературе теоретических моделей связывания ДА с ДА-рецептором.

В пятой главе проведен сравнительный анализ продуктов превращения дофамина в экспериментальных системах под воздействием анодных микроразрядов и катехолов природных систем и рассмотрены перспективы практического применения результатов. Сравнительный анализ хроматограмм производных ДА, обнаруженных в экспериментальных системах после воздействия анодных микроразрядов, и катехолов, выделенных из природных систем (рис. 5) при варьировании условий их существования, демонстрирует сопоставимость этих хроматограмм. Это указывает на принципиальную возможность использования микроразрядов для моделирования превращений ДА в природных системах, в частности при нейрохимических процессах.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано воздействие анодных микроразрядов, возникающих на поверхности погруженного в электролит танталового анода при напряжении на нем 480В, разрядном токе 4,2 мА и температуре электролита 16-4- 18°С, на 3,4-диоксифенилэтиламин (дофамин). Установлено, что это воздействие приводит к превра-

щениям дофамина в норадреналин (продукт присоединения ОН группы к /?-С), 3,4-диоксифенилаланин (продукт присоединения -СОО группы к а-С), пара-тирамин (продукт отрыва 3-ОН группы), дофамин-орто-хинон (продукт окисления 3- и 4-ОН групп), причем пара-тирамин образуется исключительно из дофамина, ориентированно адсорбированного на коллоиде, полученном из предварительно активированной природной системы.

2. Получены временные зависимости выхода продуктов превращения дофамина под действием анодных микроразрядов в условиях идентичности вольт-амперных характеристик микроразрядного процесса, причем максимальный эффект наблюдается в диапазоне экспозиции 25-5-35 сек, а в начальный период воздействия разрядов (до 15 сек) продукты превращения дофамина не обнаружены.

3. Обнаружено влияние акцепторов ОН радикалов и электронов на превращения дофамина в микроразрядном процессе, причем акцептор ОН радикалов (этанол) предотвращает превращение дофамина в норадреналин, 3,4-диоксифенилаланин, пара-тирамин, дофамин-орто-хинон, а акцептор электронов (NO~3) предотвращает образование норадреналина, пара-тирамина и способствует увеличению выхода 3,4-диоксифенилаланина в 10-ь20 раз.

4. Установлено сохранение активных центров ориентированной адсорбции дофамина в коллоиде природного происхождения после воздействия анодных микроразрядов. Показана принципиальная возможность использования микроразрядов для моделирования нейрохимических превращений дофамина.

5. Показано, что основной фактор воздействия анодных микроразрядов на дофамин в растворах и коллоидах обусловлен реакциями первичных продуктов разложения воды, а не термическим действием плазмы разряда.

6. Предложены гипотетические механизмы образования продуктов превращения дофамина с участием продуктов разложения воды и вторичных радикалов, основанные на представлениях химии высоких энергии и физической органической химии, и удовлетворительно описывающие экспериментальные результаты.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Галкина О. В., Подгорная Е. К., Поляков О. В. Превращение дофамина, связанного рецепторами синаптических мембран, в пара-тирамин, норадреналин, диоксифенилаланин при воздействии анодных микроразрядов в растворе электролита - Деп. в ВИНИТИ 8.12.1989; N 7271-В 89.

2. Подгорная Е. К., Галкина О. В., Поляков О. В. Образование п-тирамина из дофамина, связанного рецепторами синаптических мембран, in vitro//Украинский биохимический журнал.—1989.—Т 61.—N 6.—С. 27—31.

3. Поляков О. В., Подгорная Е. К., Галкина О. В. Превращение дофамина, связанного рецепторами синаптических мембран, при воздействии анодных микроразрядов в растворе электролита // Химия высоких энергий.—1990.—N 6.—С. 85.

4. Подгорная Е. К., Галкина О. В., Ильюченок Р. Ю. Связывание [ Н ) дофамина ДА2-рецепторами синаптических мембран//Нейрохимия.—1990.—Т. 9—N 3.—С. 301—308.

5. Поляков О. В., Подгорная Е. К., Галкина О. В. Превращение дофамина, специфически связанного рецепторами синаптических мембран при воздействии анодных микроразрядов в растворе электролита^- Деп. в ВИНИТИ. 14.02.1990, N 866.—В 90.

6. Podgornaya Е. К., Galkina О. V., Polyakov О. V. Importance of ascorbic acid in the mechanisms of dopaminergic transmission//International Symposium. Biotechnology of Growth factors: Coll. abs.—Milan, Italy, 1991—V. 2.—P. 28.

7. Galkina О. V., Polyakov О. V. Neurochemical mechanisms of decreasing . synaptic activity / /7th International Catecholamine Symposium: ColLAbs.—Amsterdam, Holland, 1992.—P. 104.

8. Podgornaya E. K., Galkina О. V., Polyakov О. V. The role of redox reactions in synaptic plasticity//7 th. International Catecholamine Symposium: Coll. Abs.—Amsterdam, Holland, 1992.—P. 260.

Подписано к иечаш и в свет 28.04.95.

Зак. 42. Тир. 100. Печ. л. 1 Уч.-изд. л. 0,8.

Бумага офетная, Формат 60x84Vi6-

Типография СО РАМН. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 9, 1995.