Выделение фрагментов функциональных белков и количественное определение их содержания в клетках и тканях человека и крысы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

Яцкин Олег Николаевич

Выделение фрагментов функциональных белков и количественное определение их содержания в клетках и тканях

человека и крысы

Специальность: 02.00.10. - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 20

003170021

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель

доктор химических наук Карелин Андрей Авенирович

Официальные оппоненты

Румш Лев Давыдович

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией химии протеолитических ферментов ИБХ РАН

Говорун Вадим Маркович

доктор биологических наук, профессор, руководитель отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ НИИ Физико-химической медицины Росздрава

Ведущая организация

ГУ НИИ Биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН

Защита состоится « 1л » 2008 г в 4V ч

на заседании диссертационного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН по адресу 117997, ГСП-7, Москва, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан « $ » М-И Я_ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного доктор физико-математических наук

диссертационного совета

В А Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования состава низкомолекулярных фракций экстрактов тканей млекопитающих и демонстрация наличия биологической активности у отдельных компонентов привели к формированию концепции пептидного профиля ткани [Slemmon JR, 1997], тканеспецифичного пептидного пула [Karelin АА, 1998], или пептидома, как логического расширения понятия протеома [Ivanov VT, 2000] Показано, что основными компонентами пептидома являются фрагменты функциональных белков, некоторые из которых способны проявлять эффекты, аналогичные действию гормонов и нейромедиаторов [Nyberg F, 1997], для многих из них показана способность влиять на пролиферацию опухолевых клеток [Ivanov VT, 2003] Предполагаемой функцией пептидных комплексов в организме является поддержание тканевого гомеостаза [Ivanov VT, 2005] Количественное исследование пептидного состава тканей, биологических жидкостей и культур клеток актуально, т к является первым и основным шагом к пониманию механизмов формирования пептидома, а также к оценке биологической роли эндогенных фрагментов функциональных белков как в индивидуальном плане, так и в составе пептидных комплексов

Цель работы. Целью работы является исследование состава низкомолекулярных фракций лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы на наличие в них пептидных компонентов, подтверждение их эндогенности, оценка уровня их содержания и установление первичной структуры

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено полное исследование пептидного состава лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы с практическим подтверждением эндогенности идентифицированных компонентов Полученные результаты позволили сформулировать предполагаемые механизмы формирования пептидома и изменения его состава в ответ на изменение состояния ткани Кроме того, на основании полученных результатов разработана методика приблизительной количественной оценки содержания преобладающих пептидных компонентов в сложных смесях, не требующая их глубокой очистки Методика основана на определении площадей хроматографических пиков и обеспечивает точность,

достаточную для оценки возможной биологической роли анализируемых компонентов

Апробация работы и публикации. Результаты данной работы представлены на международных (27-й Европейский и 20-й Американский пептидный симпозиумы) и российских симпозиумах с международным участием (1-й Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, III Российский симпозиум «Белки и пептиды») По материалам исследования подготовлено и опубликовано 11 печатных работ

Структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 154 ссылки

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Оценка стабильности пептидного состава ткани

Ранее полученные результаты исследования пептидного состава различных тканей и крови млекопитающих требуют уточнения, поскольку выделение пептидов осуществлялось в условиях (рН 3 0 -3 5, 4°С), не исключающих действия тканевых протеолитических ферментов (т е без использования ингибиторов) Согласно литературным данным, отсутствие ингибиторов протеолиза в процессе кислотной экстракции пептидов может привести к существенным изменениям концентрации отдельных компонентов [Саггашау КЕ, 1984] При этом, пептидный состав интактной ткани достаточно устойчив к посмертным изменениям [Бкттоп Ж, 1992, 1997] Таким образом, ключевым условием, необходимым для количественного анализа эндогенных тканевых пептидов, является обеспечение стабильности пептидного состава образца на этапе гомогенизации и далее, вплоть до момента полного освобождения образца от белков как потенциального источника артефактов Поскольку среди ранее выделенных тканевых пептидных компонентов наиболее широко представлены фрагменты гемоглобина, стабильность состава пептидной фракции в процессе выделения и влияние на нее ингибиторов протеолиза была исследована на примере лизата эритроцитов человека и гомогената мозга крысы Было показано, что в кислых условиях (рН 3 0-3 5) в отсутствии ингибиторов протеолиза происходит интенсивное (в 3-4 раза после 20 минут инкубации при

комнатной температуре) увеличение концентрации пептидного материала как в лизате эритроцитов, так и в гомогенате мозга В то же время, в присутствии ингибитора кислых протеаз (пепстатин А) пептидный состав лизата (гомогената) стабилен как минимум в отношении преобладающих компонентов (по данным хроматографического анализа) Кроме того, выборочный анализ структуры веществ, возникающих в ходе деградации гемоглобина в лизате эритроцитов в кислых условиях, показал их соответствие пептидам, ранее представленным как эндогенные внутриэритроцитарные фрагменты а(1-29), а(1-33), (3(1-32), (3(1-41), и ¡3(1-45)

Выделение эндогенных внутриэрнтроцитарных пептидов

На основании оценки протеолитического потенциала лизата эритроцитов была предложена схема анализа эндогенных внутриэритроцитарных пептидов, построенная в соответствии со следующими базовыми принципами

• Пробоподготовка проводится с учетом необходимости максимальной инактивации протеаз на все время их возможного контакта с белковыми субстратами и пептидными продуктами Для лизата эритроцитов было применено добавление набора ингибиторов для различных типов протеаз (10 й М пепстатин А, Ю"4 М РМБР, 2 мМ ЕБТА) непосредственно в образец на этапе его первичного разбавления

• Первичный материал фракционируется с учетом необходимости максимальной очистки пептидной фракции от белков (в первую очередь - от гемоглобина) Для лизата эритроцитов была применена препаративная оф-ВЭЖХ, в качестве целевой фракции рассматривался весь материал, собранный вне зоны элюции интактного гемоглобина

• Пептидсодержащие фракции подвергаются последовательному (не менее 3 стадий в различных системах) ВЭЖХ-разделению, на каждом этапе для дальнейшего разделения отбираются фракции, соответствующие преобладающим хроматографическим пикам

• Образцы, полученные на последней стадии очистки, подвергаются масс-спектрометрическому анализу (МАЬЦ1-ТОР) и определению М-концевой аминокислотной последовательности методом Эдмана

• Идентификация пептидов по данным анализа осуществляется следующим образом (1) определение белка-предшественника и положения М-концевой

аминокислоты фрагмента путем сравнения установленной последовательности фрагмента с имеющимися в банке белковых структур (N031 пг), (2) определение положения С-концевой аминокислоты фрагмента в последовательности белка-предшественника на основании положения 1Ч-концевой аминокислоты и установленной молекулярной массы • Количественный анализ пептидов осуществляется по данным определения Ы-концевой аминокислотной последовательности

Таблица 1 Уровни содержания эндогенных внутриэритроцитарных пептидов

Пептид Содержание (пмоль/мл) Пептид Содержание (пмоль/мл) Пептид Содержание (пмоль/мл)

а(1-94) 2500 а(1-33) 90 «(137-141) 40

<х(9-86) 200 а(1-32) 15 PC-69) 150

«(1-78) 1200 а(1-25) 40 (3(16-39) 40

а(1-76) 200 а(1-24) 75 Р(1-29) 150

а(1-75) 400 а(1-22) 75 (3(1-27) 40

а(1-74) а(1-21) 90 (3(1-26)

сх(1-64) 3 00 ot(1-20) 100 PC-25) 75

а(1-59) 300 а(1-19) 40 13(1-24) 230

а(1-58) а(1-18) 230 РС-21) 75

а(1-54) 15 а(1-14) 30 (3(1-16) 110

а(1-51) 800 а(95-141) 500 р(1-15) 60

а(1-48) 115 а(111-141) 40 Р(119-146) 60

а(1-47) 100 «(113-141) 190 (3(120-146) 60

а(1-46) 15 а(114-141) 76 13(123-146) 1300

а(1-43) 100 а(116-141) 30 Р(124-146) 190

а(1-36) 800 а(117-141) 25 Р(128-146) 40

а(1-35) 75 а(124-141) 75

а(1-34) 600 а(127-141) 75 Убиквитин 600

В результате анализа эндогенных внутриэритроцитарных пептидов было

выделено и идентифицировано 54 пептидных компонента, 52 из которых оказались фрагментами гемоглобина Уровень содержания - порядка 10-100-1000 пмоль на 1 мл крови (Таблица 1) Большинство (50 из 52) внутриэритроцитарных фрагментов гемоглобина являются К- и С-концевыми фрагментами а- и р-цепи различной длины а(1-14) - а(1-94) (27 пептидов), а(137-141) - а(95-141) (9 пептидов), (3(1-15) - Р(1-69) (9 пептидов), Р( 129-146) - Р(119-146) (5 пептидов)

Исходя из полученной картины можно предположить, что группы N- и С-концевых фрагментов цепей гемоглобина в эритроцитах образуются в результате квазиравновесного (стационарного) процесса последовательной экзопептидазной деградации первичных фрагментов белка Первичными являются фрагменты 1-94 и 95-141 из а-цепи и, предположительно, 1-99 и 100-146 из Р-цепи Предположение относительно точки первичного расщепления р-цепи основывается на сходстве структурных мотивов лабильная связь Asp-Pro, расположенная на стыке неупорядоченного и а-спирального участков на поверхности белковой глобулы В ходе анализа наблюдаются лишь наиболее устойчивые (долгоживущие) промежуточные продукты процесса последовательной деградации, остальные предположительно присутствуют в количествах, находящихся ниже пределов определения

Кроме того, эндогенные внутриэритроцитарные фрагменты гемоглобина предположительно не являются предшественниками пептидов, секретируемых эритроцитами во внешнюю среду Этому, например, противоречит показанное ранее присутствие в супернаганте переживающей культуры эритроцитов фрагмента а(84-95) Следует однако отметить, что образование секретируемых фрагментов в большей степени укладывается в ранее установленную схему деградации гемоглобина в лизате эритроцитов в кислых условиях Можно предположить, что протеолитический механизм, ответственный за деградацию гемоглобина в лизате в кислых условиях, может быть каким-то образом вовлечен в механизм образования пептидов, секретируемых эритроцитами во внешнюю среду

Методика количественной оценки по площади пика

На основе данных количественного анализа внутриэритроцитарных пептидов была разработана методика приблизительной количественной оценки заранее неизвестных пептидов по площади соответствующего хроматографического пика Базовое соотношение (1000 мВ*с - 500 пмоль) было установлено путем калибровки системы в стандартных условиях анализа (оцифрованный сигнал УФ-поглощения на 226 нм, 1 вольт на 1 оптическую единицу, интегрирование по времени при скорости элюции 1 мл/мин) с помощью известного количества очищенного пептида а(1-33), и округлено для простоты вычислений

Таблица 2 Оценка кочичества вещества по площади пика

Пептид Количество (пмоль) Оценка (пмоль) Поправка* Число аминокислотных остатков

Полное Ароматических

«(1-14) 30 25 1 20 14 1W

а(1-1в) 275 280 0 98 18 1W

а(1-20) 120 180 0 67 20 1W

а(1-25) 50 45 1 11 25 1W1Y

а(1-33) 110 120 0 92 33 1W1Y1F

а(34-72) 1250 1650 0 76 39 1Y2F

а(1-46) 25 55 0 45 46 1W2Y4F

а(1-51) 110 105 1 05 51 1W2Y4F

а(1-64) 70 85 0 82 64 1W2Y4F

а(1-78) 200 295 0 68 78 1W2Y4F

а(9-86) 40 100 0 40 78 1W2Y4F

а(1-94) 300 1000 0 30 94 1W2Y4F

а(137-141) 16800 3800 4 42 5 1Y

«(127-141) 70 35 2 00 15 1Y1F

«(114-141) 100 170 0 59 28 1Y2F

Р(1-15) 70 60 1 17 15 1W

ß( 16-39) 50 60 0 83 24 1W1Y

ß(128-146) 50 30 1 67 19 2Y

ß (86-146) 500 850 0 59 61 2Y3F

Убиквитин 150 125 1 20 76 1Y2F

Соматостатин 2500 1500 1 67 14 1W3F

Брадикинин 2500 360 6 94 9 2F

Нейротензин 2500 960 2 60 13 2Y

Leu-энкефалин 2500 580 4 31 5 1Y1F

Ютношение истинного количества вещества к оценочной величине

Выбор длины волны для оптического детектирования был обусловлен достаточно высоким коэффициентом экстинкции при меньшей его зависимости от структуры пептида, чем в случае характеристических пиков поглощения (210 и 280 нм) В Таблице 2 представлены результаты сравнения оценочных величин, полученных с помощью предложенного соотношения, с данными определения Ы-концевой аминокислотной последовательности ряда выделенных фрагментов гемоглобина, а также результаты контрольных замеров, выполненных с помощью известных количеств синтетических стандартов (пептидных гормонов)

Как видно из таблицы, оценочные величины отличаются от истинного количества не более чем на порядок для любых пептидов Такая точность оценки тканевой концентрации вещества является достаточной, например, для оценки его возможной биологической роли in vivo на основании результатов исследования концентрационной зависимости его биологических эффектов in vitro Для пептидов с длиной цепи 15-45 аминокислотных остатков и содержащих триптофан и тирозин оценка является более точной (отличие не более чем в 2 - 2 5 раза) Данное обстоятельство было предложено использовать в дальнейшем для представления приблизительных количественных оценок по площади пика в виде диапазона величин, границы которого рассчитываются исходя из номинальной величины, полученной в соответствии с вышеупомянутым базовым соотношением (1000 мВ*с - 500 пмоль)

Таблица 3 Соотношение интенсивностей сигнаюв в масс-спектре

Соотношение неокиоторфина и Met-энкефалина в смеси Соотношение интенсивностей сигналов, 104М Соотношение интенсивностей сигналов, 10SM

1 1 20 5 20 (1 1) 10 15 5 (2 3)

1 2 12 9(4 3) 6 5 16 5 (2 5)

2 1 19 5 9 5 (2 1) 20 5 12 (5 3)

1 10 2 20 5(1 10) 0 5 21 (1 40)

10 1 20 5 3 5 (6 1) 20 5 5(4 1)

Соответствие между преобладающими пиками на хроматограмме и преобладающими компонентами в анализируемой смеси было предложено устанавливать по данным масс-спектрометрического анализа (МАЬ01-Т0Р) Корректность такого подхода была подтверждена контрольным экспериментом по сравнению интенсивностей сигналов в масс-спектре для двух пептидов, значительно отличающихся по способности к ионизации, смешанных в различных пропорциях (от 1 10 до 10 1) и в различных исходных концентрациях (101 М и 10' М) В качестве таковых были выбраны неокиоторфин (ТБКУК., MW = 653 35) и МеЬ энкефалин (УООБМ, М\У = 573 23) Результаты представлены в Таблице 3

Как видно из таблицы, преобладающим компонентам в смеси соответствуют преобладающие компоненты в масс-спектре Данное обстоятельство было предложено использовать в дальнейшем для установления соответствия между

хроматографическими пиками и веществами по данным масс-спектрометрического анализа соответствующих фракций

Выделение пептидов из экстрактов тканей крысы

С учетом результатов, полученных для лизата эритроцитов, была предложена менее затратная схема анализа эндогенных пептидов для тканей (мозг, сердце, легкие, селезенка) крысы В базовые принципы построения схемы были внесены следующие изменения

• В процессе пробоподготовки набор ингибиторов различных типов протеаз (106 М пепстатин А, 104 М PMSF, 2 мМ EDTA) добавляется в буфер для гомогенизации ткани (10% АсОН), для оценки эндогенности выделяемых пептидов параллельно готовится контрольный образец, не содержащий ингибиторов Все операции осуществляются на холоду (0-4°С) в течение минимально возможного времени (гомогенизация - 1 мин, осветление - 10 мин)

• С целью повышения разрешающей способности метода, первичное фракционирование осуществляется с учетом необходимости не только максимальной очистки от белков, но и оптимального обеднения пептидных фракций по числу компонентов Для образцов экстрактов тканей крысы применена препаративная гель-фильтрация, получены 4 пептидсодержащих фракции (1)25-5 кДа, (2) 15-25 кДа, (3) 0 5 - 1 5 кДа, (4) < 0 5 кДа + адсорбированное на матрице геля

• Состав материала пептидсодержащих фракций анализируется с помощью микропрепаративной оф-ВЭЖХ в стандартных условиях в одну стадию, с одновременным разделением материала на суб-фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам Количество пептидного материала во фракциях оценивается по площади пика УФ-поглощения на длине волны 226 нм Для оценки спектральных характеристик элюируемых веществ параллельно регистрируется профиль элюции на 280 нм

• Материал суб-фракций подвергается масс-спектрометрическому анализу Вещества, соответствующие основным сигналам в масс-спектре, идентифицируются по спектру вторичных ионов (MS/MS)

Рисунок I Хроматографический анализ фракции ¡(25-45 кДа) экстрактов мозга (А, Д), сердг!а (Б, Е), легких (В, Ж) и селезенки (Г, 3) крысы, полученных в присутствии (слева) и в отсутствие (справа) ингибиторов протеолиза Профили элюции зарегистрированы на 226 нм (сМ) и 280 нм (сИ2)

210 mV f А\ ch lAJ eh 29 50 ' 170 ля ' I 44 " | 52 I г^^Ць4,0 V Vs 4*,7jK9 И« 210 mV 1 ----A—W^j сд) s T!0" 1

I 40 4S SO SS 60 65 70 75 SO ми 40 45 SO 55 60 65 70 75 80 ми

400 mV /Г\ eh W ch 48 171 j-—-— „Л 400 mV 116 1 1 J1 (E) ' 19 1 121 | 1f° |22 "3 2« 4" .h ch 25 173 1 iFIftl" L J

40 45 50 55 60 65 70 7S 60 ми -,-T.....л riY - 40 45 50 S5 60 65 70 75 60 ми

340 mV ЛОЧ ch v ; f 29 340 mV 1 114 J_-—A---- (Ж) 1 7 42 121 29 I yaJl» 53 fch h 24 I 25 1isis li л.. » ...

40 45 50 55 60 65 70 75 80 ми 40 45 SO S5 60 65 70 7S 60 ми

1000 mV ГГ*\ Ch ^ ' ch 36 172 f J.fcaU-LxJV_Lei— 1000 mV ^3) 1 31 121 42 1ШЕ * ей ch 12 И 47 ■ Lk?

40 45 50 5S 60 65 70 75 80 мин 40 45 SO 55 60 6S 70 75 80 ми*

Рисунок 2 Хроматографический анализ фракции 2 (1 5 - 2 5 кДа) экстрактов мозга (А, Д), сердца (Б, Е), легких (В, Ж) и селезенки (Г, 3) крысы, полученных в присутствии (счева) и в отсутствие (справа) ингибиторов протеолиза Профили эчюции зарегистрированы на 226 нм (chl) и 280 нм (ch2)

Рисунок 3 Хроматографический анализ фракции 3 (О 2 - 1 5 кДа) экстрактов мозга (А, Д), сердца (Б, Е), легких (В, Ж) и селезенки (Г, 3) крысы, полученных в присутствии (слева) и в отсутствие (справа) ингибиторов протеолиза Профипи элюции зарегистрированы на 226 нм (chl) и 280 нм (ch2)

Рисунок 4 Хроматографический анализ фракции 4 (< 0 2 кДа + адсорбированное на матрице геля) экстрактов мозга (А, Д), сердца (Б, Е), легких (В, Ж) и селезенки (Г, 3) крысы, почученных в присутствии (слева) и в отсутствие (справа) ингибиторов протеочиза Профили эпюции зарегистрированы на 226 нм (сИ1) и 280 нм (сЬ2)

В результате сравнительного анализа было показано, что отсутствие ингибиторов протеолиза приводит не к увеличению содержания имеющихся компонентов (их уровень содержания в большинстве случаев неизменен), а к появлению новых (Рис 1-4) Полученные результаты свидетельствуют о различии протеолитических механизмов образования преобладающих компонентов пептидома интактной ткани и гомогената Таким образом, преобладающие пептидные компоненты экстрактов тканей, приготовленных с использованием ингибиторов протеолиза, можно рассматривать как реально присутствующие в ткани на момент ее разрушения

Поскольку все операции с образцами интактной ткани осуществлялись на холоду и за минимально возможное время, единственным промежутком времени, в течение которого сохранялась принципиальная возможность появления артефактов ex vivo, искажающих пептидный профиль ткани т vivo, был период от момента умервщления животного до момента заморозки извлеченного органа в жидком азоте Возможность существенного изменения пептидного профиля (по крайней мере, в отношении преобладающих компонентов) в течение этого промежутка представляется маловероятной многочисленные литературные данные свидетельствуют об относительной устойчивости (по меньшей мере, в течение нескольких часов) пептидных профилей тканей к посмертным изменениям, как в целом, так и в отношении отдельных компонентов На этом основании присутствие пептида в качестве преобладающего компонента в составе экстракта ткани, полученного в присутствии ингибиторов протеолиза, можно достоверно экстраполировать к его присутствию в ткани in vivo в сопоставимом количестве, и таким образом классифицировать пептид как эндогенный

Таким образом, по результатам хроматографического анализа все преобладающие пептидные компоненты были разделены на три группы (1) эндогенные - присутствующие в сопоставимых количествах в экстрактах, полученных как в присутствии, так и в отсутствие ингибиторов протеолиза, (2) артефакты экстракции - присутствующие только в экстрактах, приготовленных без использования ингибиторов протеолиза, (3) эндогенные пептиды, существенным образом меняющие свое содержание (как в сторону увеличения, так и уменьшения) в экстрактах в результате деградации в отсутствие ингибиторов протеолиза

Сбор материала еуб-фракций в ходе ВЭЖХ-разделения осуществлялся непрерывно, вдоль всего профиля элюции, для всех образцов Границы фракций задавались вручную, согласно ходу профиля элюции на 226 нм (Рис 1-4), с целью максимально отделения суб-фракций, соответствующих основным хроматографическим пикам В качестве таковых рассматривались пики, не менее чем десятикратно превышающие по высоте положение общей базовой линии

Масс-спектрометрическому анализу (МАГЛЛ-ТОР) подвергались все собранные суб-фракции Далее, результаты масс-спектрометрического анализа, полученные для суб-фракций, совпадающих по хроматографическим характеристикам, сравнивались между собой Основное внимание при сравнительном анализе уделялось субфракциям, соответствующим основным хроматографическим пикам Соответствие между преобладающими компонентами и основными хроматографическими пиками устанавливалось по данным масс-спектрометрического анализа

Было показано, что многие из преобладающих компонентов являются общими для нескольких тканей Общими считались вещества, присутствующие в качестве преобладающего компонента хотя бы в одной из тканей, и при этом детектирующиеся при масс-спектрометрическом анализе в других тканях, но не обязательно соответствующие там основным хроматографическим пикам Критерием совпадения компонентов, присутствующих в разных образцах, являлось совпадение молекулярных масс и хроматографических характеристик

Всего в ходе анализа было выявлено более 100 общих пиков, соответствующих эндогенным веществам, около 60 общих пиков-артефактов, соответствующих продуктам протеолитической деградации в гомогенате в отсутствие ингибиторов, и около 40 пиков, соответствующих тканеспецифичным (т е обнаруженным только в одной из тканей, как эндогенным, так и артефактам) веществам На хроматограммах исследованные пики пронумерованы подряд в порядке элюции 1-104 - эндогенные, 105-165-артефакты, 166-210 - тканеспецифичные (Рис 1-4)

Среди пронумерованных пиков часть является повторяющимися, те соответствующими одному и тому же веществу, распределившемуся между соседними фракциями в сравнимых долях в ходе первичного фракционирования Кроме того, некоторые пики соответствуют одновременно нескольким (2-3) преобладающим компонентам, присутствующим в сравнимых количествах В целом,

число подлежащих идентификации преобладающих компонентов суммарно по всем образцам было оценено в 200 шт Уровень содержания преобладающих компонентов оценивался по площадям основных пиков УФ-поглощения на длине волны 226 нм, и составлял по предварительным оценкам порядка 100-1000-10000 пмоль на 1 г ткани, в отдельных случаях (преимущественно в тканях мозга) - порядка 10 пмоль на 1 г ткани В среднем, распределение численности преобладающих пептидных компонентов ткани по уровням содержания можно оценить следующим образом (1) -10 нмоль/г- единицы, (2) ~1 нмоль/г - десятки, (3) -10-100 пмоль/г - сотни

Структуры преобладающих пептидных компонентов устанавливались по спектру вторичных ионов (MALDI-TOF/TOF MS/MS, поиск с помощью программного обеспечения Mascot, названия белков-предшественников приведены по базе данных NCBI пг) В результате анализа была установлена структура 105 пептидов, из них 5 были подтверждены методом деградации Эдмана Для 3 пептидов структура была определена лишь частично N-концевая аминокислотная последовательность из 10 остатков получена методом Эдмана, поиск в банке данных белковых структур результатов не дал Структуры остальных установить не удалось вследствие недостаточного для надежной идентификации числа сигналов в спектре вторичных ионов

Уровни содержания идентифицированных веществ представлены в Таблице 4 Границы диапазонов возможного содержания индивидуальных компонентов в тканях рассчитаны следующим образом (1)0 5N-2N для однокомпонентных пиков, где N - номинальная величина уровня содержания, рассчитанная по площади пика в соответствии с базовым соотношением (1000 мВ*с - 500 пмоль) и нормированная на 1 г ткани, (2) 0 Зп-Зп для компонентов многокомпонентных пиков, где п есть величина N, деленная на число компонентов Вещества, идентифицированные как артефакты, возникающие в процессе выделения в отсутствие ингибиторов протеолиза, отмечены в таблице курсивом Уровни содержания веществ, идентифицированных как эндогенные, но показывающие различный уровень содержания в образце в зависимости от использования или неиспользования ингибиторов протеолиза (как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения), представлены в таблице двумя значениями верхнее соответствует результату анализа в присутствии, нижнее - в отсутствие ингибиторов протеолиза

Предшественник (ЫСВ1 пг) Фрагмент Содержание (пмоль/г)

Мозг Сердце Легкие Селезенка

Гемоглобин альфа-1 1-34 90 - 360 70 - 280 210-850 1400-5400

Гемоглобин альфа-2 1-34 50-180 30-120 130-500 740 - 2900

Гемоглобин альфа-1 1-33 20-100 20-100 100-440 1000-4200

Гемоглобин альфа-2 1-33 < 10 < 10 < 10 100-1000

Гемоглобин альфа-1 1-32 20-150 75-450 250 - 1500 3500- 14000

Гемоглобин альфа-2 1-32 15-60 50-200 250- 1000 1500 - 6000

Гемоглобин альфа-1 1-31 25-90 10-40 50 - 200 1000-4000

Гемоглобин альфа-2 1-31 10-60 < 10 30-210 400-3600

Гемоглобин альфа-1 1-30 20-80 25-100 100-400 250-2100

Гемоглобин альфа-2 1-30 10-40 10-40 25-100 80 - 700

Гемоглобин альфа-1 1-25 20-180 20-150 80 - 750 500 - 4500

Гемоглобин альфа-2 1-25 10-40 20-80 50 - 200 350-1400

Гемоглобин альфа-1 1-12 < 10 < 10 <10 300-1200

Гемоглобин альфа-2 1-12 < 10 < 10 < 10 50 - 200

Гемоглобин альфа-1 1-9 < 10 < 10 < 10 150-600

Гемоглобин альфа-2 1-9 < 10 < 10 < 10 50 - 200

Гемоглобин альфа-1/2 106-141 15-60 15-60 25-100 25-100 200-800 200 - 800 4000-16000 500-2000

Гемоглобин альфа-1/2 107-141 20-80 30-120 100-400 1000-4000

Гемоглобин альфа-1/2 122-141 < 10 < 10 10-60 350 - 3000

Гемоглобин альфа-1/2 124-141 п/а < 10 10-60 350 - 3000

Гемоглобин альфа-1/2 127-141 < 10 < 10 35 - 300 350 - 3000

Гемоглобин альфа-1/2 128-141 < 10 10-90 35 - 300 350 - 3000

Гемоглобин альфа-1/2 130-141 15-60 25-100 50 - 200 250-1000

Гемоглобин альфа-1/2 131-141 30-120 50 - 200 100-400 450-1800

Гемоглобин альфа-1/2 134-141 20-80 35-140 50 - 200 300-1200

Гемоглобин бета-1 1-33 35-140 100-400 250-100 4500-18000

Гемоглобин бета-1 1-32 50 - 200 50-200 300-1200 1000-4000

Гемоглобин бета-2 1-32 10-100 10-100 2500-10000 5000-20000 350-1400 350-1400 10000-40000 3000-12000

Гемоглобин бета-1 1-31 < 10 350-1400 < 10 2000 - 8000 50 - 200 5000-20000 2000 - 8000 20000 - 80000

Гемоглобин бета-2 1-31 п/а 100-400 < 10 500 - 2000 50-200 1000-4000 1000-4000 2500-20000

Гемоглобин бета-1 1-29 50 - 200 100-400 200 - 800 150-600

Гемоглобин бета-2 1-29 10-40 25-100 25-100 150-600

Гемоглобин бета-1 \Л/15-\/15 гомолог 1-25 < 10 10-45 10-60 150-1200

Гемоглобин бета-1 1-24 < 10 10-45 10-60 50 - 450

Гемоглобин бета-2 1-24 10-20 10-40 15-60 100-400

Предшественник (N061 пг) Фрагмент Содержание (пмоль/г)

Мозг Сердце Легкие Селезенка

Гемоглобин бета-1 1-22 < 10 < 10 10-45 200- 1500

Гемоглобин бета-2 1-22 < 10 10-30 20-150 900 - 7500

Гемоглобин бета-1 1-21 < 10 < 10 10-45 200- 1500

Гемоглобин бета-2 1-21 < 10 < 10 15-60 1000-4000

Гемоглобин бета-2 1-19 < 10 10-90 55 - 450 1300-10000

Гемоглобин бета-1 1-16 < 10 150-600 150-600 150-600 500-2000 500 - 2000 1000-4000 1000-4000

Гемоглобин бета-2 1-16 15-60 20-80 35 - 300 350 - 3000

Гемоглобин бета-1 1-12 10-20 20-80 100-400 5000 - 20000

Гемоглобин бета-1 1-10 < 10 < 10 < 10 300- 1200

Гемоглобин бета-1 120-146 20-80 10-40 100-400 3000-12000

Гемоглобин бета-1/2 126-146 < 10 < 10 15-120 150-1300

Гемоглобин бета-1/2 127-146 20-180 < 60 10-60 70 - 600

Гемоглобин бета-1/2 136-146 < 10 10-20 10-20 50-200

Гемоглобин бета-1/2 139-146 10-20 15-60 25-100 100-400

Гемоглобин бета-1 17-33 < 10 10-45 10-60 50-450

Гемоглобин бета-1 17-31 < 10 10-90 10-30 20 - 150

Гемоглобин бета-1 13-32 < 10 < 10 10-20 400- 1600

Гемоглобин бета-1 13-31 10-20 30- 120 40-160 2500- 10000

Гемоглобин бета-1 13-29 n/d n/d n/d 100-400

Гемоглобин бета-1/2 32-45 < 10 20-80 100-400 150-600

Гемоглобин бета-1/2 32-44 10-40 10-40 30-120 250 - 1000

Гемоглобин бета-1/2 32-43 15-60 50-200 50-200 1000-4000

Гемоглобин бета-1/2 32-42 < 10 10-40 < 10 150-600

Гемоглобин бета-1/2 32-41 15-60 150-600 250-1000 1500- 6000

Гемоглобин бета-1/2 33-41 10-50 10-75 20-150 150- 1300

Тимозин бета-4, окисленный (М) 1-43 < 10 < 10 35 - 300 350 - 3000

Тимозин бета-4, окисленный (М) 1-41 < 10 < 10 35 - 300 350 - 3000

Тимозин бета-4 1-43 70 - 600 20-150 350-3000 3500 - 30000

Тимозин бета-4 1-41 70 - 600 20-150 350 - 3000 3500 - 30000

Тимозин бета-10 1-43 10-60 < 10 20-150 200-1500

Сывороточный альбумин 25-50 10-20 25-100 15-60 200 - 800

Сывороточный альбумин 25-49 10-60 13-130 50-450 35 - 300

Сывороточный альбумин 25-48 10-20 20-80 15-60 250-1000 40-160 500-2000 25-100 25-100

Предшественник (NCBI пг) Фрагмент Содержание (пмоль/г)

Мозг Сердце Легкие Селезенка

Актин, бета/гамма 349-374 n/d n/d 25- 100 250- 1000

Актин, бета/гамма 355-374 30- 120 < 10 150-600 500-2000

Актин, бета/гамма 356-374 500 - 2000 25- 100 1000-4000 3000- 12000

Актин, альфа 358-376 10-20 500 - 2000 100-400 25- 100

Гпицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа 308-323 10-45 10- 75 20- 150 150- 1300

Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа 308-324 50 - 200 50-200 100-400 150-600

Гпицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа 311-324 10-90 < 10 20- 150 140- 1200

lg гамма-2В-цепь область С 121-133 < 10 < 10 10-30 500 - 4500

Аконитаза 2, митохондриальная 755-779 < 10 < 10 < 10 150- 1300

Ферритин, легкая цепь 1 164-182 < 10 < 10 100-400 35-140

Малат дегидрогеназа, митохондриальная 24-43 30-120 300-1200 10-40 n/d

Просоматостатин 52-63 10-20 < 10 < 10 < 10

Предшественник альфа-цепи фибриногена 20-36 < 10 < 10 30-120 50 - 200

Вакуолярная Н+ АТФаза Е1 212-225 < 10 < 10 < 10 50 - 500

Гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины А2/В1 335-342 < 10 100-400 1000-4000 1000-4000 300-1200 300-1200 150-600 150-600

Белок DJ-1 167-189 10-45 10-75 10-90 < 10

Альфа-1-антитрипсин 392-411 10-45 10- 75 10-90 < 10

Цитохром с оксидаза, полипептид Vllb, митохондриапьный предшественник 25-48 20- 150 50-450 200 - 1500 < 10

Низкомолекулярный убихинон-связывающий белок 58-81 25- 100 100-400 10-30 200 - 800

NADH дегидрогеназа (убихинон) флавопротеин 3, митохондриапьный предшественник 87-107 10-40 50-200 < 10 10-20

АТР синтаза, D-цепь, митохондриальная 136-160 10-20 45- 180 < 10 < 10

Предшественник (NCBI пг) Фрагмент Содержание (пмоль/г)

Мозг Сердце Легкие Селезенка

АТР синтеза, Н+ транспортирующая, митохондриальный F1-комплекс, бета-субъединица 507-528 15- 120 20- 150 80 - 750 2000- 15000

Кальмодулин 141-148 25 - 100 < 10 10-40 10-40

Альфа-1 -макроглобулин 1231-1242 < 10 20-80 20-80 10- 70

Гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины А2/В1 (Mouse) 310-340 10-30 10- 60 < 10 20- 150

АТР синтаза, Н+ транспортирующая, митохондриальный F0-комплекс, субъединица d 1-15 100-400 500 - 2000 50 - 200 100- 1000

Цитохром с оксидаза, субъединица 7С, митохондриальный предшественник (Mouse) 42-62 10-90 20- 150 10-45 20- 150

Убихинол-цитохром с редуктаза, (6 4kD)-субъединица (Mouse) 42-55 20-80 50-200 < 10 < 10

Кальретикулин 318-329 10-40 10-20 150-600 150-600

Фосфоглицерат мутаза 2 234-252 n/d 15-45 n/d n/d

Цитохром с оксидаза, субъединица Via, полипептид 2 1-20 n/d 40- 160 n/d n/d

Углеродная ангидраза 2 239-259 n/d n/d n/d 400

АТР синтаза, Н+ транспортирующая, митохондриальный F0-комплекс, субъединица F6 97-107 n/d 10-90 n/d n/d

Гпутамин синтетаза 360-372 50 - 200 n/d n/d n/d

Миоглобин 138-153 n/d 15-60 n/d n/d

Трансаминаза А 1-20 n/d 100-400 n/d n/d

Глутамат оксалоацетат трансаминаза 2, митохондриальная 29-45 10-40 n/d n/d n/d

Нижний предел количественного определения, задаваемый чувствительностью

детектора, составил 10 пмоль/г Величины, представленные в таблице как "< 10", означают, что присутствие данного компонента детектируется при масс-спектрометрическом анализе соответствующей суб-фракции, но уровень его содержания находится ниже предела количественного определения Символ "пЛГ в таблицах означает, что присутствие данного компонента в соответствующей субфракции не детектируется при масс-спектрометрическом анализе

Как видно из Таблицы 4, среди идентифицированных пептидов более половины (60 из 108) являются фрагментами гемоглобина, из них 44 идентифицированы как эндогенные, 5 - эндогенные, но существенным образом меняющие концентрацию в отсутствие ингибиторов, 11 - артефакты, образующиеся в процессе выделения в отсутствие ингибиторов Среди остальных 48 пептидов (20 - эндогенные, 2 -эндогенные, но существенным образом меняющие концентрацию в отсутствие ингибиторов, 26 - артефакты) преобладают фрагменты ферментов, гормонов и структурных белков

Большинство (47 из 49) идентифицированных эндогенных гемоглобиновых пептидов аналогично внутриэритроцитарным пептидам образуют группы N- и С-концевых фрагментов различной длины 14 (7 пар) N-концевых фрагментов обоих вариантов о;-цепи в диапазоне от 1-9 до 1-34, 9 С-концевых фрагментов а-цепи в диапазоне от 134-141 до 106-141, 19 (12 - за вычетом парных) N-концевых фрагментов обоих вариантов р-цепи в диапазоне от 1-10 до 1-33, 5 С-концевых фрагментов Р-цепи в диапазоне от 139-146 до 120-146 Эндогенные фрагменты сывороточного альбумина также образуют группу, предположительно сформированную процессом последовательной экзопептидазной деградации 25-48, 25-49 и 25-50 Кроме того, среди остальных идентифицированных эндогенных пептидов многие являются N- и С-концевыми фрагментами функциональных белков

На основании этого сходства можно предположить, что механизм образования эндогенных фрагментов гемоглобина и других функциональных белков в тканях аналогичен предложенному для эритроцитов квазиравновесный (стационарный) процесс последовательной экзопептидазной деградации первичных (эндопептидазных) фрагментов белка, при котором в тканях детектируется присутствие лишь его наиболее устойчивых (долгоживущих) промежуточных продуктов Можно также предположить сходство механизмов первичного расщепления цепей гемоглобина в тканях и в эритроцитах (гемоглобины человека и крысы имеют одинаковый структурный мотив - лабильная связь Asp-Pro в позициях 94-95 в a-цепи и 99-100 Р-цепи) При этом, уровень тканевого содержания N- и С-концевых фрагментов гемоглобина в тканях в среднем на порядок превосходит уровень содержания аналогичных пептидов в эритроцитах, что не позволяет рассматривать присутствующие в тканях эритроциты в качестве непосредственного

источника выделяемых из тканей гемоглобиновых пептидов Таким образом, общий механизм возникновения первичных тканевых фрагментов гемоглобина ш vivo остается неясен

Среди пептидов, идентифицированных как артефакты, образующиеся в процессе выделения в отсутствие ингибиторов протеолиза, также наблюдаются аналогичные структурные группы, но на основе других участков последовательности гемоглобина, либо же из иных белков (1) фрагменты 17-31, 13-31, 13-29 ос-цепи гемоглобина, (2) фрагменты 32-45, 32-44, 32-43, 32-42, 32-41, 33-41 Р-цепи гемоглобина, (3) С-концевые фрагменты 349-374, 355-374, 356-374 Р(у)-актина, (4) фрагменты 308-323, 308-324, 311-324 глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы Можно предположить, что образование этих групп подчиняется тем же закономерностям, что и у эндогенных пептидов (последовательная экзопептидазная деградация, наблюдаются лишь наиболее устойчивые продукты), при иной специфичности первичного эндопептидазного расщепления белка-предшественника В частности, для гемоглобина, с учетом присутствия в тканях эндогенных фрагментов а(1-34) и Р(1-33), появления фрагмента а(1-32) в качестве артефакта и резкого (на порядок) увеличения содержания фрагмента Р(1-31), предполагаемыми сайтами первичного расщепления в отсутствие ингибиторов протеолиза, не реализующимися при эндогенной деградации, являются связи Met32-Phe" в a-цепи и Leu3l-Leu32 в Р-цепи В целом, на основании полученных данных можно предположить, что число сайтов первичного эндопептидазного расщепления белков, реализующегося в гомогенизированной ткани в кислых условиях, больше, чем в случае их эндогенной деградации

На основании полученных результатов можно сформулировать предполагаемые механизмы формирования пептидома ткани, поддержания постоянства его состава и возникновения изменений

• Пептидом ткани в норме представляет собой квазиравновесный (стационарный) набор промежуточных продуктов процесса последовательной экзопептидазной деградации первичных фрагментов тканевых белков При этом, в детектируемых количествах присутствуют лишь наиболее долгоживущие промежуточные продукты этого процесса, т е те, для которых константа скорости образования в достаточной мере превышает константу скорости распада

• Количественные изменения в пептидоме (те изменения уровня содержания отдельных преобладающих компонентов без потери ими статуса преобладающих) происходят преимущественно вследствие изменения локальных констант скоростей на тех или иных этапах процесса последовательной деградации пептидов (т е вследствие изменения состава и/или уровней активности в наборе тканевых экзопептидаз)

• Качественные изменения в пептидоме (т е изменения состава набора преобладающих компонентов, исчезновение ранее присутствовавших и появление новых) происходят преимущественно вследствие изменения состава набора первичных фрагментов белков (т е вследствие изменения состава и/или уровней активности в наборе тканевых эндопептидаз)

• Разделение механизмов количественных и качественных изменений не абсолютно Количественные изменения могут быть вызваны изменением интенсивности (без изменения специфичности) первичной фрагментации, качественные изменения могут быть вызваны существенными изменениями аминокислотной специфичности процесса экзопептидазной деградации пептидов (т е в результате перехода количественных изменений в качественные)

ВЫВОДЫ:

1 Исследована стабильность пептидного состава лизата эритроцитов человека и гомогената тканей крысы в различных условиях Сформулированы принципы пробоподготовки, исключающие появление артефактов

2 Проведен полный скрининг низкомолекулярной фракции лизата эритроцитов человека на присутствие в нем преобладающих пептидных компонентов, установлена их первичная структура На основании полученных данных сформулирован предполагаемый механизм эндогенной внутриэритроцитарной деградации гемоглобина

3 Проведен количественный анализ преобладающих пептидных компонентов лизата эритроцитов На основании полученных данных предложен метод приблизительной количественной оценки содержания преобладающих компонентов в сложной смеси по площади соответствующих хроматографических пиков

4 Проведен полный скрининг низкомолекулярных фракции экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы на присутствие в них преобладающих пептидных компонентов, подтверждена их эндогенность, определена молекулярная масса и оценен уровень содержания в тканях

5 Установлена первичная структура для части пептидов, выделенных из тканей крысы, как эндогенных, так и артефактов, образующихся в результате протеолитической деградации в гомогенате тканей в кислых условиях На основании полученных данных сформулированы предполагаемые механизмы формирования пептидома ткани, поддержания постоянства его состава и возникновения изменений

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Bhschenko Е Yu, Mernenko О А , Yatskin О N , Ziganshin R Н , Philippova М М , Kaielin А А , Ivanov VT Neokyotorphin and neokyotorphin (1-4) cytolytic activity and comparative levels in rat tissues Biochem Biophys Res Commun , 1996, v 224, p 721-727

2 Blishchenko E Yu , Mernenko О A , Yatskin О N, Ziganshin R H , Philippova M M , Kaielin A A, Ivanov VT Neokyotorphin and neokyotorphin (1-4) secretion by erythrocytes and regulation of tumor cell growth FEBS Lett, 1997, v 414, p 125128

3 Yatskin О N , Philippova M M , Blishchenko E Yu , Karelin A A , Ivanov V T LVV-and VV-hemorphins comparative levels in rat tissues FEBS Lett, 1998, v 428, p 286-290

4 Карелин A A , Филиппова M M , Яцкин О H , Блищенко Е Ю , Назимов И В , Иванов В Т Протеолитическая деградация гемоглобина в эритроцитах приводит к образованию биологически активных пептидов Биоорганическая химия, 1998, т 24, с 271-281

5 Karelin А А , Philippova М М , Yatskin О N, Kahnina О А , Nazimov I V , Blishchenko Е Yu , Ivanov V Т Peptides comprising the bulk of rat brain extracts isolation, amino acid sequences and biological activity J Pept Sci, 2000, v 6, p 345354

6 Ivanov VT, Yatskin ON, Kalinwa OA, Philippova MM, Karelin A A, Blishchenko E Yu Tissue-specific peptide pools Generation and function Pure Appl Chem , 2000, v 72, p 355-363

7 Blishchenko E Yu, Sazonova О V , Kalinina О A , Yatskin О N , Philippova M M , Surovoy A Y, Kaielin A A , Ivanov V T Family of hemorphms co-relations between amino acid sequences and effects in cell cultures Peptides, 2002, v 23, p 903-910

8 Yatskin О N , Karelin A A , Philippova M M , Ivanov V T, Hemoglobin degiadation pathways in human eiythrocytes Peptides 2002 Proceedings of 27,h European Peptide Symposium, (Eds E Benedetti, С Perdone), Ediziom Znno, Napoh, 2002, p 424-425

9 Karelin A A , Blishchenko E Yu , Yatskin ON , Gara О G, Khachin D P , Ivanov VT Peptide pools from tissues and cell cultuies Peptides 2004 Proceedings of 28th Euiopean Peptide Symposium, (Flegel M , Fndkin M , Gilon С Slaninova J, Eds), Kenes International, Geneva, 2005, p 384-385

10 Ivanov VT, Kaielin A A, Yatskin ON Generation of peptides by human erythiocytes facts and aitifacts Biopolymers, 2005, v 80, p 332-346

11 Ivanov V T , Yatskin О N Peptidomics a logical sequel to proteomics Expert Rev Pioteomics, 2005, v 2, p 463-473

12 Ivanov VT, Yatskin ON, Sazonova OV, Tolmazova AG, Leontiev KV, Philippova M M , Karelin A A , Blishchenko E Yu Tissue-specific peptide pools Generation and function Pure Appl Chem , 2006, v 78, p 963-975

13 Филиппова MM, Хачин ДП, Сазонова OB, Блищенко ЕЮ, Яцкин ОН, Назимов И В , Карелин А А , Иванов В Т, Расстригин Н А , Пивник А В Фрагменты функциональных белков в переживающей культуре эритроцитов человека Биоорганическая химия, 2008, т 34, с 160-170

Заказ № 19/05/08 Подписано в печать 05 05 2008 Тираж 100 жч Уст пл 15

' о ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ^ \izww с/г ги , е-таП т/о@с/г п/

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

Проблема эндогенности.8

Подготовка образца.10Экстракция.10Преципитационная очистка.12Улътрафилътрация и диализ.12Хроматографическая очистка.13Твердофазная экстракция.17Оптимизация процесса пробоподготовки.18Биологические методы.19иммунохимические методы.20Методы с использованием антител.20Радиорецепторный метод.25хроматографические и смежные методы.27Пептидомика.38Заключение.42РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.44Оценка стабильности пептидного состава ткани.44Выделение эндогенных внутриэритроцитарных пептидов.51Методика количественной оценки по площади пика.61Выделение пептидов из экстрактов тканей крысы.64Заключение.91ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.96Анализ состава лизата эритроцитов человека.96Получение биологического материала.96Хроматографический анализ лизата.96Первичная обработка биологического материала.96Получение пептидной фракции.97Хроматографический анализ пептидной фракции.97Выделение пептидов.98Выделение неокиоторфина.99Количественная оценка.99Масс-спектрометрический анализ.99Установление структуры.100Анализ состава экстрактов тканей крысы.100Получение биологического материала.100Экстракция.100Первичное фракционирование.101Хроматографический анализ.101Количественная оценка.102Масс-спектрометрический анализ.102Установление структуры.102ВЫВОДЫ.103СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.104СПИСОК СОКРАЩЕНИЙPMSF ФенилметилсульфонилфторидTLCK Na-Тозил-Ь-лизин хлорометилкетонEDTA Этилендиаминтетрауксусная кислотаоф-ВЭЖХ Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматографияVIP Вазоактивный интестинальный пептидсм- КарбоксиметилDEAE- ДиэтиламиноэтилSP- СульфопропилQAE- Диэтил-(2-гидроксипропил)аминоэтилa-ANP Атриальный натриуретический пептид альфаQMA Четвертичный метиламмонийРИА Радиоиммунный анализSP Вещество РРРА Радиорецепторный анализDAGO Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-Gly-олDADLE Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Gly-D-LeuАКТГ Адренокортикотропный гормонВЭКЭ Высокоэффективный капиллярный электрофорезLH-RH ЛюлиберинФИТЦ ФлуоресцеинизотиоцианатPBS Изотонический фосфатный буферАсОН Уксусная кислотаTFA Трифторуксусная кислотаTOFNCBInrMW MSMS/MS GuaHClБаза данных белковых структур Национального центра биотехнологической информации, СШАМолекулярная массаМасс-спектрометрияМасс-спектрометрия вторичных ионовГуанидин-гидрохлоридВВЕДЕНИЕИсследования состава низкомолекулярных фракций экстрактов тканей млекопитающих и демонстрация наличия биологической активности у отдельных компонентов привели к формированию концепции пептидного профиля ткани [1], тканеспецифичного пептидного пула [2], или пептидома, как логического расширения понятия протеома [3]. Показано, что основными компонентами пептидома являются фрагменты функциональных белков, некоторые из которых способны проявлять эффекты, аналогичные действию гормонов и нейромедиаторов [4]; для многих из них показана способность влиять на пролиферацию опухолевых клеток [5]. Предполагаемой функцией пептидных комплексов в организме является поддержание тканевого гомеостаза [2, 6]. Количественное исследование пептидного состава тканей, биологических жидкостей и культур клеток актуально, т.к. является первым и основным шагом к пониманию механизмов формирования пептидома, а также к оценке биологической роли эндогенных фрагментов функциональных белков как в индивидуальном плане, так и в составе пептидных комплексов.

Целью данной работы является исследование состава низкомолекулярных фракций лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы на наличие в них пептидных компонентов, подтверждение их эндогенпости, оценка уровня их содержания и установление первичной структуры. В рамках данной работы первые было проведено полное исследование пептидного состава лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы с практическим подтверждением эндогенности идентифицированных компонентов. Полученные результаты позволили сформулировать предполагаемые механизмы формирования пептидома и изменения его состава в ответ на изменение состояния ткани. Кроме того, на основании полученных результатов была разработана методика приблизительной количественной оценки содержания преобладающих пептидных компонентов в сложных смесях, не требующая их глубокой очистки. Методика основана на определении площадей хроматографических пиков и обеспечивает точность, достаточную для оценки возможной биологической роли анализируемых компонентов.

ВЫВОДЫ

1. Исследована стабильность пептидного состава лизата эритроцитов человека и гомогената тканей крысы в различных условиях. Сформулированы принципы пробоподготовки, исключающие появление артефактов.

2. Проведен полный скрининг низкомолекулярной фракции лизата эритроцитов человека на присутствие в нем преобладающих пептидных компонентов, установлена их первичная структура. На основании полученных данных сформулирован предполагаемый механизм эндогенной внутриэритроцитарной деградации гемоглобина.

3. Проведен количественный анализ преобладающих пептидных компонентов лизата эритроцитов. На основании полученных данных предложен метод приблизительной количественной оценки содержания преобладающих компонентов в сложной смеси по площади соответствующих хроматографических пиков.

4. Проведен полный скрининг низкомолекулярных фракций экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы на присутствие в них преобладающих пептидных компонентов, подтверждена их эндогенность, определена молекулярная масса и оценен уровень содержания в тканях.

5. Установлена первичная структура для части пептидов, выделенных из тканей крысы, как эндогенных, так и артефактов, образующихся в результате протеолитической деградации в гомогенате тканей в кислых условиях. На основании полученных данных сформулированы предполагаемые механизмы формирования пептидома ткани, поддержания постоянства его состава и возникновения изменений.

Заключение

Проблема эндогенноети исследуемых веществ прямо или косвенно касается всех аспектов данной работы. Полученные в работе результаты показывают, что принятые для инактивации протеолиза меры (рН < 3.5, ингибиторы) достаточны для предотвращения изменений в пептидном профиле ткани в процессе ее гомогенизации и экстракции пептидов. Тем не менее, в отношении проблемы эндогенноети данный подход имеет ряд очевидных ограничений.

Во-первых, невозможно полностью исключить образование наблюдаемых пептидов в процессе гомогенизации ткани под действием неких гипотетических короткоживущих (и потому не обнаруживаемых при сравнительном анализе образцов, приготовленных с разницей во времени инкубации) и нечувствительных к предложенному набору ингибиторов протеаз, активных при рН < 3. Хотя, согласно базе функциональных данных ферментов BRENDA (http://www.brenda-enzymes.info) существование таких протеаз маловероятно.

Во-вторых, стабильность гомогенатов тканей в присутствии ингибиторов протеолиза строго показана лишь в отношении преобладающих пептидиых компонентов. Эндогенность минорных компонентов в рамках данного подхода гарантирована быть не может, и требует отдельного рассмотрения.

В третих, несмотря на принятые меры для предотвращения изменений пептидного состава тканей ex vivo (минимизация рабочей температуры и длительности процедур в операциях с интактной тканью), соответствие наблюдаемых пептидных профилей составу пептидома тканей in vivo следует считать лишь приблизительным или гипотетическим. Тем не менее, основываясь на известных данных о характерных скоростях посмертной генерации или деградации пептидов в тканях, присутствие преобладающих (по меньшей мере, наиболее представленных) пептидных компонентов в экстрактах тканей, процедура приготовления которых предусматривает инактивацию протеолитических ферментов, можно надежно экстраполировать к их присутствию в тканях in vivo в сопоставимых концентрациях.

Вообще говоря, проблема эндогенноети распадается на два аспекта, общий и частный. Если под общей эндогенностью понимать присутствие исследуемого вещества в организме в состоянии физиологической нормы при отсутствии внешних воздействий, то проблема не имеет строгого решения в силу недостаточной определенности этих понятий. В любом исследовании речь всегда идет о конкретном объекте (или наборе сходных объектов), находящихся в определенных условиях, то есть о частном случае физиологической нормы для данной группы организмов и данного набора внешних факторов. Проблема же частной эндогенности, если под эндогенностью понимать точное количественное соответствие между наблюдением исследуемого вещества в ходе анализа и его реальным присутствием в организме на момент анализа, также не имеет строгого решения: сам процесс анализа неизбежно влияет на состояние анализируемого объекта. Особенно это касается традиционно используемых инвазивных методов анализа, нарушающих связность объекта. Поскольку живой организм является гетерогенной и не равновесной, но квазиравновесной системой (т.е. локальный уровень содержания любого компонента определяется локальным равенством скоростей его образования из предшественников и распада на продукты), изоляция любой его части (или же прекращение жизнедеятельности организма) немедленно запускает процесс изменения уровней содержания компонентов.

Таким образом, эндогенность, как общая, так и частная, является абстрактным понятием, для которого возможна лишь та или иная степени приближения со стороны реальных результатов, последовательно от «менее эндогенных» к «более эндогенным» веществам. В случае общей эндогенности это достигается - в широком смысле -накоплением статистического материала. В случае частной - последовательным выявлением и компенсацией возможных путей изменения концентрации анализируемых веществ в ходе анализа. В обоих случаях важное значение имеет применение различных методических подходов: сопоставление результатов, полученных разными путями, делает более обоснованной экстраполяцию полученных реальных результатов к идеальному состоянию.

Следует, однако, учитывать, что результаты пептидомных исследований критически зависят от процедур, применяемых в ходе пробоподготовки и анализа, что затрудняет корректное накопление статистических данных и прямое сопоставление результатов, полученных в разных исследованиях. Сколь бы ни были стандартизованы системы подготовки образцов, их неизбежные индивидуальные различия могут сказаться на результатах одновременного анализа большого числа веществ, хотя бы в отношении некоторых из них. Строгая стандартизация аналитических систем также невозможна: сочетание высокой эффективности разделения (совершенно необходимой при одновременном анализе большого числа веществ) и неизбежных индивидуальных различий в селективности (как результата интерференции различий аналитических систем с различиями объектов анализа) приводит к слабой воспроизводимости результатов, получаемых в однотипных аналитических системах для однотипных объектов. Тем не менее, в последнее время уделяется много внимания унификации методических подходов и технических средств в рамках крупных международных пептидомных проектов.

В рамках данной работы описан один из этапов приближения к эндогенности — компенсация изменений пептидного состава биологического образца в процессе кислотной экстракции пептидов. Выявлен механизм уменьшения степени эндогенности (активация кислых протеаз и приведение их в контакт с субстратом в гомогенате), предложен способ его компенсации (ингибиторы), проверена его эффективность (результаты сравнительного анализа), получены новые, «более эндогенные» результаты. С опорой на справочные данные (база данных функциональных характеристик протеолитических ферментов), результаты изучения пептидного состава экстрактов тканей крысы экстраполированы к эндогенности на уровне замороженного образца ткани. С опорой на литературные данные [7-13], эти результаты частично экстраполированы далее, к частной эндогенности in vivo в среднем для данной группы животных.

Кроме того, сопоставление «более эндогенных» и «менее эндогенных» результатов, выявившее определенное сходство между двумя наборами пептидов, как качественное (структурные группы, преобладание гемоглобина), так и количественное (доля пептидного материала ~ 0.1% от веса сырой ткани, число преобладающих компонентов ~ 100, уровень их содержания ~ 100 пмоль/г - 10 нмоль/г) не противоречит выдвинутой ранее гипотезе о биологической роли пептидома (поддержание тканевого гомеостаза путем буферизации совокупной биологической активностью индивидуальных компонентов пептидома, демпфирующей импульсное действие отдельных биологически активных факторов [2]).

Далее, в настоящей работе показано, что пептидные комплексы различных тканей на уровне преобладающих компонентов проявляют значительную степень сходства. С учетом того, что исследованные органы (мозг, сердце, легкие и селезенка крысы) крайне разнородны по природе образующих их тканей и, следовательно, гетерогенны на уровне клеточных популяций, можно предположить, что составы пептидомов органов, по крайней мере — на уровне преобладающих компонентов, не связан с их специфической функцией, но подчиняется общим для всего организма закономерностям. Данное обстоятельство существенно снижает информативность данных по составу пептндома органов с точки зрения изучения механизмов его формирования и функционирования, специфических для данного органа.

На уровне менее представленных компонентов состав пептидома демонстрирует значительно большую степень тканеспецифичности. Однако, как нам кажется, интерпретация этих данных с функциональной точки зрения была бы преждевременной. Для получения надежных количественных данных о концентрации минорных компонентов необходимы более строгие меры для контроля их эндогенности, исключающие образование артефактных пептидов в результате посмертной деградации пептидов в ткани в процессе пробоподготовки. Очевидно, что такие процессы должны сильнее сказаться на составе минорных, чем преобладающих компонентов. Кроме того, количественный анализ и идентификация огромного числа пептидов на уровне единиц пикомолей на грамм ткани и ниже требует более чувствительных и селективных методик, чем использованные в данной работе.

Результаты настоящего исследования приводят также к выводу, что для изучения механизмов образования и функционирования пептидома сложных объектов (ткань, орган) необходимо исследование пептидных комплексов в модельных системах, таких как культуры клеток и клеточные модели тканей с максимальной степенью гомогенности. Конечно, при таком подходе об эндогенности в вышеописанном смысле речь вообще не идет, и неизбежны определенные трудности при соотнесении полученных структур, равно как и их детектируемых концентраций, с процессами, происходящими в целых тканях (органах), то есть при взаимодействии пептидомов различных клеточных популяций. Тем не менее, регуляторные процессы, проходящие на уровне гомогенной ткани (равно как и внутри единичной клетки), в которые вовлечены компоненты протеомов, представляют самостоятельный интерес для определения роли компонентов пепетидома, а знание количественного и качественного состава пептидомов отдельных гомогенных тканей дает основания для экстраполяции этих данных на уровень пептидома органа в целом.

На основании полученных данных можно сделать следующее предположение: сумма пептидомов отдельных тканей (здесь под тканями понимается гомогенная клеточная популяция) приводит к образованию своеобразного «надпептидома», характерного для целого органа, состоящего из этих тканей, который вовлечен в регуляцию функционирования данного органа. Можно также предположить, что эта сумма не будет являться результатом механического сложения компонентов пептидомов, поскольку протеолитическая активность не может быть идентична в разных тканевых комплексах, составляющих орган, и взаимодействие пептидов, происходящих из одной ткани, с протеолитическими ферментами другой ткани будет приводить к значимым изменениям состава и содержания компонентов «надпептидома». В свою очередь, «надпептидомы» органов составляют «сверхпептидом» организма в целом, который вовлечен в глобальные регуляторные процессы на уровне организма и подчиняется тем же закономерностям в образовании и содержании своих компонентов по отношению к «надпептидомам» органов, как и эти «надпептидомы» по отношению к пептидомам составляющих органы тканей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Анализ состава лизата эритроцитов человека

Получение биологического материала

Венозная донорская кровь была получена в Гематологическом научном центре РАМН. Образцы крови (20-25 мл) помещали в пробирки с цитратом (10 г/л безводной лимонной кислоты в буфере PBS, рН 4.5, конечная концентрация цитрата 0.25%). Клетки отделяли от плазмы центрифугированием (15 мин, 1000 об/мин, 0-4°С, центрифуга с охлаждением TJ-6R, ротор ТН-4, Beckman, США). Осадок 4 раза промывали 0.9% NaCl с последующим центрифугированием в тех же условиях. Лизат эритроцитов получали последовательной заморозкой-разморозкой эритроцитарпой массы согласно [143].

Хроматографический анализ лизата

Для анализа образцов лизата эритроцитов (5 мкл) использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Vydac protein С4 4.6x250 мм (Vydac, США) в линейном градиенте ацетонитрила (16-56% за 100 мин при скорости элюции 0.75 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. При разделении (здесь и далее) использовалась ВЭЖХ-система Waters (США), состоящая из двух насосов модели 510, градиентного контроллера модели 680 и оптического детектора модели 481. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению па 226 нм, запись осуществлялась в цифровом формате с помощью аналого-цифрового преобразователя и программного обеспечения МультиХром-Спектр версии 2.67 (Ampersand, Россия). Интенсивность регистрируемого сигнала в 1 В соответствовала поглощению в 1 оптическую единицу.

Первичная обработка биологического материала

Лизат эритроцитов разбавлялся 4:100 водой в присутствии 10'6 М пепстатина и 10° М PMSF, и центрифугировался с помощью микроцентрифуги Biofuge В (Heraeus, Германия) при 11000 об/мин в течение 20 мин. Затем пептидно-белковый материал осаждался добавлением к надосадочной жидкости 10 объемов холодного (-20°С) ацетона с последующим перемешиванием и инкубированием в течение 6 ч при -70°С. Осадок отделялся мягким центрифугированием (10 мин, 600 об/мин, 0-4°С, центрифуга с охлаждением TJ-6R, ротор ТН-4, Beckman, США) и ресуспендировался в прежнем объеме холодного ацетона. Диссоциация гема и перевод его в раствор вызывалась добавлением 2% 12 N НС1 [154]. Осадок отделялся центрифугированием (10 мин, 2500 об/мин, 0-4°С, центрифуга с охлаждением TJ-6R, ротор ТН-4, Beckman, США), дважды промывался холодным ацетоном и высушивался с помощью вакуумного концентратора (SpeedVac Plus SC 210А, Savant, США).

Получение пептидной фракции

На этапе выделения основных пептидных компонентов материал, полученный из 120 мкл лизата эритроцитов, растворялся в 1.2 мл 6 М GuaHCl с добавлением 10"6 М пепстатина и 10~3 М PMSF, и подвергался препаративному разделению с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 7Cg 20x250 мм (Macherey-Nagel, Германия), ступенчатая элюция (8% ацетонитрила - нанесение и промывка, 40% ацетонитрила - элюция пептидной фракции, 10 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Собранная пептидная фракция лиофилизовалась (лиофильная сушка FreeZone 6, Labconco, США).

На этапе выделения минорных пептидных компонентов материал, полученный из 660 мкл лизата эритроцитов, растворялся в 6 мл 6 М GuaHCl с добавлением 10"6 М пепстатина и 10" М PMSF, и подвергался препаративному разделению (5 нанесений по 1200 мкл раствора образца) с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 7Cs 20x250 мм, градиентная элюция (8% ацетонитрила - 25 мин, 8-40% ацетонитрила - 20 мин, 40% ацетонитрила — 20 мин, 40-80% ацетонитрила - 5 мин; 10 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. Детекция по оптическому поглощению при 226 им. Собирались две пептидные фракции в соответствии с профилем элюции: фракция 1 содержала вещества, элюирующиеся раньше преобладающих пептидных компонентов, фракция 2 соответствовала области элюции преобладающих компонентов. Соответствующие фракции по 5 разделениям объединялись и лиофилизовались.

Хроматографический анализ пептидной фракции

Для анализа преобладающих пептидных компонентов лизата эритроцитов использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Vydac protein С4 4.6x250 мм в линейном градиенте ацетонитрила (20-60% за 80 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, собирались и высушивались с помощью вакуумного концентратора.

Для анализа минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся раньше преобладающих компонентов, использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 120-5Cg 4.0x250 мм (Macherey-Nagel, Германия) в линейном градиенте ацетонитрила (8-60% за 105 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. Для анализа минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся позже преобладающих компонентов, использовалось разделение с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Dionex-Vydac ЗОО-5С4 4.6x250 мм (Vydac, США) в линейном градиенте ацетонитрила (28-68% за 80 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, собирались и высушивались с помощью вакуумного концентратора.

Выделение пептидов

Для выделения преобладающих пептидных компонентов лизата эритроцитов фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, рехроматографировались с помощью оф-ВЭЖХ в двух различных системах: (1) колонка Vydac protein С4 (4.6x250 мм), линейный градиент ацетонитрила (20-52% за 30 мин, 1 мл/мин), 50 мМ ацетат натрия, рН 4.5; (2) колонка Nucleosil 120-5Cg (4.0x250 мм), линейный градиент ацетонитрила (20-60% за 30 мин, 1 мл/мин), 0.1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, полученные на второй стадии, высушивались с помощью вакуумного концентратора. Высушенные образцы хранились при -70°С.

Для выделения минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся раньше преобладающих компонентов, фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, рехроматографировались с помощью оф-ВЭЖХ в двух различных системах: (1) колонка Nucleosil 120-5Cg (4.0x250 мм), линейный градиент ацетонитрила (8-40% за 30 мин, 1 мл/мин), 50 мМ ацетат натрия, рН 4.5; (2) колонка Nucleosil 100-5Cis 4.0x250 мм (Macherey-Nagel, Германия), линейный градиент ацетонитрила (8-48% за 30 мин, 1 мл/мин), 0.1% TFA. Для выделения минорных пептидных компонентов лизата эритроцитов, элюирующихся позже преобладающих компонентов, фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам, рехроматографировались с помощью оф-ВЭЖХ в двух различных системах: (1) колонка Dionex-Vydac ЗОО-5С4 4.6x250 мм, линейный градиент ацетонитрила (24-56% за 45 мин, 0.7 мл/мин), 50 мМ ацетат натрия, рН 4.5; (2) колонка Dionex-Vydac 300-5 Diphenyl 4.6x250 мм (Vydae, США), линейный градиент ацетонитрила (20-60% за 40 мин, 0.75 мл/мин), 0.1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Фракции, полученные на второй стадии, высушивались с помощью вакуумного концентратора. Высушенные образцы хранились при -70°С.

Выделение неокиоторфина

Материал, полученный из 300 мкл лизата эритроцитов, растворялся в 1 мл 6 М GuaHCl с добавлением 10" М пепстатина и

10"J М PMSF, и подвергался препаративному разделению с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 120-7Cib 10x250 мм (Macherey-Nagel, Германия), ступенчатая элюция (0% ацетонитрила -нанесение и промывка, 20% ацетонитрила - элюция фракции, содержащей неокиоторфин; скорость элюции 2.5 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Собранная фракция лиофилизовалась.

Материал полученной фракции подвергался разделению с помощью оф-ВЭЖХ на колонке Nucleosil 300-5C]g 4.0x250 мм (Macherey-Nagel, Германия) в линейном градиенте ацетонитрила (0-24% за 50 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. Профиль элюции регистрировался по оптическому поглощению на 226 нм. Область элюции неокиоторфина определялась с помощью синтетического стандарта. Две фракции, перекрывающие область элюции неокиоторфина, собирались и высушивались с помощью вакуумного концентратора.

Количественная оценка

Содержание пептидов в биологическом материале оценивалось по площадям соответствующих хроматографических пиков и подтверждалось данными определения аминокислотной последовательности. Площади пиков определялись методом нормализации площадей с помощью программного обеспечения МультиХром-Спектр версии 2.67 (Ampersand, Россия).

Масс-спектрометрический анализ

Молекулярные массы выделенных пептидов определялись с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра Vision 2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Великобритания).

Установление структуры

Аминокислотные последовательности выделенных пептидов определялись с помощью газофазного секвенатора Model 447А (Applied Biosystems, США). Поиск белков-предшественников велся по базе данных NCBI nr (Национальный центр биотехнологической информации, США). Структура устанавливалась по сопоставлению аминокислотной последовательности и молекулярной массы.

Анализ состава экстрактов тканей крысы

Получение биологического материала

Крысы (Wistar, взрослые самки, 250-300 г, 10 животных) умерщвлялись декапитацией. Немедленно после умерщвления (в течение 1-2 мин) извлекались мозг (без мозжечка), сердце, легкие и селезенка, и замораживались в жидком азоте. Замороженные органы хранились при -70°С в течение не более чем 1 недели.

Экстракция

Замороженные органы от 5 животных взвешивались (не допуская разморозки), механически измельчались на фрагменты, не превышающие ~5 мм по размеру, и помещались в стеклянный стакан, охлаждаемый на ледяной бане (0-4°С). К измельченной ткани добавлялся заранее охлажденный экстрагирующий буфер, содержащий ингибиторы протеолитических ферментов (10% АсОН, 10'6 М пепстатин А, 10"4 М PMSF, 4 мМ EDTA, 0-4°С, ингибиторы добавляются непосредственно перед экстракцией), в соотношении 10 мл буфера на 1 г ткани. Полученная смесь гомогенизировалась роторным гомогенизатором при 45 000 об/мин (VirTis, США) на ледяной бане (0-4°С) в течение 1 мин. Гомогенат осветлялся центрифугированием (10 мин, 10 000 об/мин, 0-4°С, центрифуга с охлаждением BR4i, ротор АВ 50.1 OA, Jouan, Франция), супернатант замораживался в круглодонной колбе с помощью жидкого азота и лиофилизовался (лиофильная сушка FreeZone б, Labconco, США). Лиофилизованный экстракт извлекался из колбы, растирался до однородности, взвешивался и хранился в герметичной упаковке при -70°С.

Вторая партия образцов (замороженные органы от оставшихся 5 животных) готовилась аналогичным образом, но без использования ингибиторов протеолитических ферментов.

Первичное фракционирование

Навеска сухого экстракта, эквивалентная 3 г исходной ткани, растворялась в 10 мл 0.1 М АсОН в течение 10 мин при интенсивном встряхивании при комнатной температуре, суспензия осветлялась центрифугированием (11 ООО об/мин, 10 мин, Biofuge В, Heraeus, Германия), супернатант отделялся и разбавлялся добавлением 0.1 М АсОН до конечного объема 10 мл. Полученный образец подвергался разделению с помощью гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25sf (2.5 х 87 см), уравновешенной в 0.1 М АсОН, скорость элюции — 60 мл/ч, регистрация профиля элюции по оптическому поглощению на 226 нм. Сбор фракций осуществлялся по объему элюции, в соответствии с условиями, подобранными ранее [116]: 2.5-4.5 кДа (1), 1.5-2.5 кДа (2), 0.2-1.5 кДа (3), менее 0.2 кДа и вещества, адсорбирующиеся на матрице геля (4). Собранные фракции замораживались в круглодонных колбах и лиофилизовались. Лиофилизованный материал фракций перерастворялся в 6 мл 0.1 М АсОН и высушивался в стеклянных пробирках с помощью вакуумного концентратора (SpeedVac Plus SC 210А, Savant, США). Высушенные образцы хранились при -70°С.

Хроматографический анализ

Материал фракций растворялся в 750 мкл стартового хроматографического буфера (0.1% TFA в воде), центрифугировался (11 000 об/мин, 10 мин, Biofuge В) и подвергался разделению с помощью офВЭЖХ на колонке Nucleosil 120-5Cg (4.0 х 250 мм, Macherey-Nagel, Германия) в линейном градиенте ацетонитрила (0-60% за 120 мин при скорости элюции 1 мл/мин) в системе, содержащей 0.1% TFA. При разделении использовалась ВЭЖХ-система Waters (США), состоящая из двух насосов модели 515, градиентного контроллера модели 680 и двухволнового оптического детектора модели 2487. Профили элюции регистрировались по оптическому поглощению на 226 и 280 нм, запись осуществлялась в цифровом формате с помощью аналого-цифрового преобразователя и программного обеспечения МультиХром для Windows версии 1.5 (Ampersand, Россия). Интенсивность регистрируемого сигнала в 1 В соответствовала поглощению в 1 оптическую единицу. Сбор элюируемого материала осуществлялся непрерывно в процессе анализа, вручную, с разделением на суб-фракции в соответствии с профилем элюции (т.е. так чтобы границы суб-фракций максимально соответствовали границам хроматографических пиков). Собранные образцы высушивались с помощью вакуумного концентратора и хранились при -70°С.

Количественная оценка

Количество пептидного материала в суб-фракциях оценивалось по площади соответствующего хроматографического пика исходя из следующего соотношения: 1000 мВ*с площади пика соответствует 500 пмоль вещества. Площади пиков вычислялись автоматически программой МультиХром.

Масс-спектрометрический анализ

Молекулярные массы веществ, содержащихся в суб-фракциях, определялись с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonik, Германия).

Установление структуры

Аминокислотные последовательности пептидов устанавливались по спектрам вторичных ионов (MALDI-TOF/TOF). Спектры регистрировались с помощью масс-спектрометра Ultraflex, результаты анализировались с помощью программного обеспечения Mascot (Matrix Science, США). Поиск белков-предшественников велся по базе данных NCBI пг (Национальный центр биотехнологической информации, США) с ограничением на организм-источник (Rattus norvegicus).

1. Slemmon J.R., Wengenack Т.М., Flood D.G. Profiling of endogenous peptides as a tool for studying development and neurological disease. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 157170.

2. Karelin A.A., Blishchenko E.Yu., Ivanov V.T. A novel system of peptidergic regulation. FEBS Lett., 1998, v. 428, p. 7-12.

3. Ivanov, V.T. Peptidomics a logical sequel to proteomics? Int. J. Immunorehabilitation, 2000, v. 2, p. 90.

4. Nyberg F., Sanderson K., Glamsta E.L. The hemorphins: a new class of opioid peptides derived from the blood protein hemoglobin. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 147-156.

5. Ivanov V.T., Blishchenko E.Yu., Sazonova O.V., Karelin A.A. What to synthesize? From Emil Fischer to peptidomics. J. Pept. Sci., 2003, v. 9, p. 553-562.

6. Ivanov V.T., Yatskin O.N. Peptidomics: a logical sequel to proteomics. Expert Rev. Proteomics., 2005, v. 2, p. 463-473.

7. Slemmon J.R., Flood D.G. Profiling of endogenous brain peptides and small proteins: methodology, computer-assisted analysis, and application to aging and lesion models. Neurobiol. Aging, 1992, v. 13, p. 649-660.

8. Lorente J.A., Hernandez-Cueto C., Villanueva E. Postmortem stability of the rat atrial natriuretic peptide in blood and atrial tissue. Rev. Esp. Fisiol., 1989, v. 45, p. 127-130.

9. Beal M.F., Mazurek M.F., Lorenz L.J., Chattha G.K., Ellison D.W., Martin J.B. An examination of neuropeptide Y postmortem stability in an animal model simulating human autopsy conditions. Neurosci. Lett., 1986, v. 64, p. 69-74.

10. Richter W.O., Schwandt P. Postmortal degradation of neuropeptides in the neurohypophysis. Neuropeptides, 1983, v. 3, p. 379-386.

11. Sorensen K.V. Rapid post-mortem decomposition of the somatostatin cells in human brain. An immunohistochemical examination. Biomed. Pharmacother., 1984, v. 38, p. 458-461.

12. Lee C.M., Emson P.C., Iversen L.L. Chromatographic behaviour and post-mortem stability of somatostatin in the rat and mouse brain. Brain Res., 1981, v. 220, p. 159-166.

13. Ratter S.J., Ackland J., Corder R., Emson P., Rossor M., Tomlin S., Rees L.H. Stability of pro-opiocortin-related peptides in post-mortem mouse brain tissue. Neuroendocrinology, 1982, v. 35, p. 336-341.

14. Mathe A.A., Stenfors C., Brodin E., Theodorsson E. Neuropeptides in brain: effects of microwave irradiation and decapitation. Life Sci., 1990, v. 46, p. 287-293.

15. Roncales P., Cena P., Beltran J.A., Jaime I. Ultrasonication of lamb skeletal muscle fibres enhances postmortem proteolysis. Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1993, v. 196, p. 339-342.

16. Correa F.M., Saavedra J.M. Radioimmunoassay of met-enkephalin in microdissected areas of paraformaldehyde-fixed rat brain. Life Sci., 1984, v. 34, p. 809-817.

17. Cooper P.E., Rahman Q., Phillips Т., Tu J. Postmortem stability of somatostatin in brain tissue. Neurochem. Res., 1988, v. 13, p. 513-515.

18. Herraiz T. Sample preparation and reversed phase-high performance liquid chromatography analysis of food-derived peptides. Anal. Chim. Acta, 1997, v. 352, p. 119-139.

19. Singh J.K., Diemel L.T., Willars G.B., Tomlinson D.R. The extraction and assay of substance P in the rat sciatic nerve. J. Neurosci. Methods, 1993, v. 47, p. 133-137.

20. Yamashita Y., Hoist Pedersen J., Stadil F. Extraction of neurotensin-like immunoreactivities from porcine ileal mucosa. Peptides, 1987, v. 8, p. 639-643.

21. Ryder S., Eng J., Straus E., Yalow R.S. Alkaline extraction and characterization of cholecystokinin-immunoreactivity from rat gut. Gastroenterology, 1981, v. 81, p. 267275.

22. Marley P.D., Rehfeld J.F. Extraction techniques for gastrins and cholecystokinins in the rat central nervous system. J. Neurochem., 1984, v. 42, p. 1515-1522.

23. Мог A., Nguyen V.H., Delfour A., Migliore-Samour D., Nicolas P. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin. Biochemistry, 1991, v. 30, p. 8824-8830.

24. Grigoriants O.O., Desiderio D.M. Beta-endorphinl-31 in the rat pituitary. Int. J. Pept. Protein Res., 1996, v. 47, p. 123-130.

25. Carraway R.E., Cochrane D.E., Ruane S.E. Isolation, structures, and biologic activity of neurotensin-related peptides generated in extracts of avian tissue. J. Biol. Chem., 1987, v. 262, p. 15886-15889.

26. Dahl J.L., Epstein M.L., Silva B.L., Lindberg I. Multiple immunoreactive forms of met-and leu-enkephalin in fetal and neonatal rat brain and in rat gut. Life Sci., 1982, v. 31, p. 1853-1856.

27. Carraway R.E. Rapid proteolytic generation of neurotensin-related peptide(s) and biologic activity during extraction of rat and chicken gastric tissues. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, p. 10328-10334.

28. Cerpa-Poljak A., Lahnstein J., Mason K.E., Smythe G.A., Duncan M.W. Mass spectrometric identification and quantification of hemorphins extracted from human adrenal and pheochromocytoma tissue. J. Neurochem., 1997, v. 68, p. 1712-1719.

29. Kreymann В., Ghatei M.A., Burnet P., Williams G., Kanse S., Diani A.R., Bloom S.R. Characterization of glucagon-like peptide-1-(7-36)amide in the hypothalamus. Brain Res., 1989, v. 502, p. 325-331.

30. Ueda S., Sudoh Т., Fukuda K., Kangawa K., Minamino N., Matsuo H. Identification of alpha atrial natriuretic peptide 4-28. and [5-28] in porcine brain. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1987, v. 149, p. 1055-1062.

31. Carraway R.E., Ferris C.F. Isolation, biological and chemical characterization, and synthesis of a neurotensin-related hexapeptide from chicken intestine. J. Biol. Chem., 1983, v. 258, p. 2475-2479.

32. Carraway R.E., Cochrane D.E., Mitra S.P. Xenopsin-related peptide generated in avian gastric extracts. Regul. Pept., 1988, v. 22, p. 303-314.

33. Matsumura Y., Kimura M., Kato H., Yamamoto Т., Maeda H. Quantification, isolation and structural determination of bradykinin and hydroxyprolyl-bradykinin in tumor ascites. Adv. Exp. Med. Biol., 1989, v. 247A, p. 587-592.

34. Stegehuis D.S., Tjaden U.R., van der Greef J. Bioanalysis of the peptide des-enkephalin-gamma-endorphin. On-line sample pretreatment using membrane dialysis and solid-phase isolation. J. Chromatogr., 1990, v. 511, p. 137-145.

35. Hubbard M.J. Rapid purification and direct microassay of calbindin9kDa utilizing its solubility in perchloric acid. Biochem. J., 1993, v. 293, p. 223-227.

36. Adelson J.W., Nelbach L., Yates G.B., Ehrlich A., Glaser C.B., Chang R. Purification and characterization of chymodenin, a hormone-like peptide from porcine duodenum. J. Biol. Chem., 1986, v. 261, p. 10569-10575.

37. Silberring J., Nyberg F. Rapid analysis of endogenous LVV-hemorphin-7 in cerebrospinal fluid by size-exclusion chromatography and electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1997, v. 777, p. 41-45.

38. Heine G., Raida M., Forssmann W.-G. Mapping of peptides and protein fragments in human urine using liquid chromatography mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1997, v. 776, p. 117-124.

39. Smyth D.G. Chromatography of peptides related to р-endorphin. Anal. Biochem., 1984, v. 136, p. 127-135.

40. Swann R.W., Li C.H. Isolation and characterization of beta-endorphin-like peptides from bovine brains. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1980, v. 77, p. 230-233.

41. Rosenquist G.L., Maruthainar K., Smyth D.G. р-endorphin is present in active and inactive forms in rat gastric antrum. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, v. 134, p. 14-20.

42. James S., Gibbs B.F., Toney K., Bennett H.P. Purification of antimicrobial peptides from an extract of the skin of Xenopus laevis using heparin-affinity HPLC: characterization by ion-spray mass spectrometry. Anal. Biochem., 1994, v. 217, p. 8490.

43. Park C.B., Lee J.H., Park I.Y., Kim M.S., Kim S.C. A novel antimicrobial peptide from the loach, Misgurnus anguillicaudatus. FEBS Lett., 1997, v. 411, p. 173-178.

44. Herraiz Т., Casal V. Evaluation of solid-phase extraction procedures in peptide analysis. J. Chromatogr. A, 1995, v. 708, p. 209-221.

45. Bennett H.P. Use of ion-exchange Sep-Pak cartridges in the batch fractionation of pituitary peptides. J. Chromatogr., 1986, v. 359, p. 383-390.

46. Kai M., Ohkura Y. Liquid chromatography of peptides treated with fluorogenic reagents and its application to analyses of opioid peptides, their precursors and related enzymes in rat brain. Anal. Chim. Acta, 1997, v. 352, p. 103-117.

47. Sanderson K., Thornwall M., Nyberg G., Glamsta E.-L., Nyberg F. Reversed-phase high-performance liquid chromatography for the determination of haemorphin-like immunoreactivity in human cerebrospinal fluid. J. Chromatogr. A, 1994, v. 676, p. 155160.

48. Kohse K.P., Feifel K., Wisser H. Quantitative determination of natriuretic peptides in human biological samples with a bioassay using cultured cells. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1992, v. 30, p. 837-845.

49. Liu В., Burbach J.P. Detection and high performance liquid chromatography identification of the summer rises of vasopressin and oxytocin immunoreactivity in the rat pineal gland. Endocrinology, 1987, v. 121, p. 1716-1720.

50. Pikula D.L., Harris E.F., Desiderio D.M., Fridland G.H., Lovelace J.L. Methionine enkephalin-like, substance P-like, and beta-endorphin-like immunoreactivity in human parotid saliva. Arch. Oral. Biol., 1992, v. 37, p. 705-709.

51. Zhu X., Desiderio D.M. Effects of space flight stress on proopiomelanocortin, proenkephalin A, and tachykinin neuropeptidergic systems in the rat posterior pituitary. Life Sci., 1994, v. 55, p. 347-350.

52. Grigoriants O.O., Pravdenkova S.V., Andersen B.J., Desiderio D.M. Alteration of opioid peptide concentrations in the rat pituitary following survivable closed head injury. Neurochem. Res., 1995, v. 20, p. 827-831.

53. Yamamoto H., Kato T. Enzyme immunoassay for cholecystokinin octapeptide sulfate and its application. J. Neurochem., 1986, v. 46, p. 702-707.

54. Rehfeld J.F., Goltermann N., Larsson L.-I., Emson P.M., Lee C.M. Gastrin and cholecystokinin in central and peripheral neurons. Fed. Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 1979, v. 38, p. 2325-2329.

55. Rehfeld J.F., Morley J.S. Residue-specific radioimmunoanalysis: a novel analytical tool. Application to the C-terminus of CCK/gastrin peptides. J. Biochem. Biophys. Methods, 1983, v. 7, p. 161-170.

56. Tinsley P.W., Fridland G.H., Killmar J.T., Desiderio D.M. Purification, characterization, and localization of neuropeptides in the cornea. Peptides, 1988, v. 9, p. 1373-1379.

57. Parris W.G., Tanzer F.S., Fridland G.H., Harris E.F., Killmar J., Desiderio D.M. Effects of orthodontic force on methionine enkephalin and substance P concentrations in human pulpal tissue. Am. J. Orthod. Dentofacial Orthop., 1989, v. 95, p. 479-489.

58. Higa Т., Wood G., Desiderio D.M. Substance P-like immunoreactivity in human cerebrospinal fluid. Int. J. Pept. Protein Res., 1989, v. 33, p. 446-451.

59. Desidero D.M. Analysis of endogenous neuropeptides by reversed-phase high-performance liquid chromatography and mass-spectrometry. Anal. Chim. Acta, 1997, v. 352, p. 85-102.

60. Davletov E.G., Kurochkin I.N., Zaitsev S.V. Radioreceptor method of determination of opioid peptides in the rat brain. Vopr. Med. Khim., 1988, v. 34, p. 136-138.

61. Liu D.X., Desiderio D.M. Measurement of dynorphins with 3H-etorphine and canine limbic system receptors. Neuropeptides, 1988, v. 12, p. 35-40.

62. Desiderio D.M., Fridland G.H., Francisco J.T., Sacks H., Robertson J.T., Cezayirli R.C., Killmar J., Lahren C. Opioid peptide profile in human pituitary. Clin. Chem., 1988, v. 34, p. 1104-1107.

63. Desiderio D.M., Cezayirli R.C., Fridland G., Robertson J.T., Sacks H. Metabolic profiling of radioreceptor-assayable opioid peptides in a human pituitary ACTH-secreting tumor. Life Sci., 1985, v. 37, p. 1823-1828.

64. Muhlbauer M., Metcalf J.C. Jr., Robertson J.T., Fridland G., Desiderio D.M. Opioid peptides in the cerebrospinal fluid of Alzheimer patients. Biomed. Chromatogr., 1986, v. l,p. 155-158.

65. Desiderio D.M., Onishi H., Fridland G., Wood G., Pagidipati D. HPLC receptorassay of opioid peptides in the cerebrospinal fluid of lower back pain patients. Biomed. Chromatogr., 1987, v. 2, p. 47-52.

66. Desiderio D.M., Liu D.X., Wood G. Opioid receptoractivity in CSF from an atypical lower back pain patient. Life Sci., 1988, v. 43, p. 577-583.

67. Liu D., Desiderio D.M. Reversed-phase high-performance liquid chromatographic-radioreceptor assay of human cerebrospinal fluid neuropeptides. Maximizing recovery of picomoles of peptides and minimizing memory. J. Chromatogr., 1987, v. 422, p. 61-71.

68. Takeshita H., Desiderio D.M., Fridland G. Metabolic profiling of opioid peptides in canine pituitary and selected brain regions using HPLC with a radioreceptor assay detector. Biomed. Chromatogr., 1986, v. 1, p. 126-139.

69. Desiderio D.M., Tanzer F.S., Fridland G. Metabolic profiling of opioid peptides in tooth pulp by HPLC and radioreceptor assay. Neuropeptides, 1985, v. 6, p. 463-469.

70. Robinson Q.C., Killmar J.T., Desiderio D.M., Harris E.F., Fridland G. Immunoreactive evidence of beta-endorphin and methionine-enkephalin-Arg-Gly-Leu in human tooth pulp. Life Sci., 1989, v. 45, p. 987-992.

71. Nylander I., Tan-No K., Winter A., Silbcrring J. Processing of prodynorphin-derived peptides in striatal extracts. Identification by electrospray ionization mass spectrometry linked to size-exclusion chromatography. Life Sci., 1995, v. 57, p. 123-129.

72. Zhao Q., Piot J.M. Neokyotorphin formation and quantitative evolution following human hemoglobin hydrolysis with cathepsin D. Peptides, 1998, v. 19, p. 759-766.

73. Dizdaroglu M., Krutzsch H.C. Comparison of reversed-phase and weak anion-exchange high-performance liquid chromatographic methods for peptide separations. J. Chromatogr., 1983, v. 264, p. 223-229.

74. Miller C., Rivier J. Peptide chemistry: development of high performance liquid chromatography and capillary zone electrophoresis. Biopolymers, 1996, v. 40, p. 265317.

75. Advis J.P., Hernandez L., Guzman N.A. Analysis of brain neuropeptides by capillary electrophoresis: determination of luteinizing hormone-releasing hormone from ovine hypothalamus. Pepet. Res., 1989, v. 2, p. 389-394.

76. Takahashi N., Ishioka N., Takahashi Y., Putnam F.W. Automated tandem high-performance liquid chromatographic system for separation of extremely complex peptide mixtures. J. Chromatogr., 1985, v. 326, p. 407-418.

77. Moore A.W. Jr., Jorgenson J.W. Rapid comprehensive two-dimensional separations of peptides via RPLC-optically gated capillary zone electrophoresis. Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 3448-3455.

78. Moore A.W. Jr., Jorgenson J.W. Comprehensive three-dimensional separation of peptides using size exclusion chromatography/reversed phase liquid chromatography/optically gated capillary zone electrophoresis. Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 3456-3463.

79. Dagouassat N., Garreau I., Sannier F., Zhao Q., Piot J.M. Generation of VV-hemorphin-7 from globin by peritoneal macrophages. FEBS Lett., 1996, v. 382, p. 37-42.

80. Fell A.F., Clark B.J., Scott H.P. Analysis and characterisation of aromatic amino acids, metabolites and peptides by rapid-scanning photodiode array detection in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 1984, v. 297, p. 203-214.

81. Bennett G.W., Brazell M.P., Marsden C.A. Electrochemistry of neuropeptides: a possible method for assay and in vivo detection. Life Sci., 1981, v. 29, p. 1001-1007.

82. Sauter A., Frick W. Determination of neuropeptides in discrete regions of the rat brain by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr., 1984, v. 297, p. 215-223.

83. Dawson R. Jr., Steves J.P., Lorden J.F., Oparil S. Reverse-phase separation and electrochemical detection of neuropeptides. Peptides, 1985, v. 6, p. 1173-1178.

84. Timperman A.T., Oldenburg K.E., Sweedier J.V. Native fluorescence detection and spectral differentiation of peptides containing tryptophan and tyrosine in capillary electrophoresis. Anal. Chem., 1995, v. 67, p. 3421-3426.

85. Ohno M., Kai M., Ohkura Y. On-line post-column fluorescence derivatization of arginine-containing peptides in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., 1987, v. 392, p. 309-316.

86. Desiderio D.M., Yamada S. Field desorption mass spectrometric measurement of picomole amounts of leucine enkephalin in canine spinal cord tissue. Biomed. Mass Spectrom., 1983, v. 10, p. 358-362.

87. Desiderio D.M., Katakuse I., Kai M. Measurement of leucine enkephalin in caudate nucleus tissue with fast atom bombardment-collision activated dissociation-linked field scanning mass spectrometry. Biomed. Mass Spectrom., 1983, v. 10, p. 426-429.

88. Simpson R.C., Emary W.B., Lys I., Cotter R.J., Fenselau C.C. High-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry and its application to peptide analyses. J. Chromatogr., 1991, v. 536, p. 143-153.

89. Perkins J.R., Tomer K.B. Characterization of the lower-molecular-mass fraction of venoms from Dendroaspis jamesoni kaimosae and Micrurus fulvius using capillary-electrophoresis electrospray mass spectrometry. Eur. J. Biochem., 1995, v. 233, p. 815827.

90. Kuwahara H., Tanaka-Isoyama J., Kihara Т., Matsubae M., Matsui Y., Такао Т., Isoyama M., Minamino N. Efficient data acquisition system for peptidome database. Peptide Science 2003: M. Ueki (Ed.), The Japanese Peptide Society (2004), p. 465-466.

91. Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturized proteomics and peptidomics using capillary liquid separation and high resolution mass spectrometry. FEBS Lett., 2004, v. 567, p. 92-95.

92. Jurgens M., Schrader M. Peptidomic approaches in proteomic research. Curr. Opin. Mol. Ther,. 2002, v. 4, p. 236-241.

93. Clynen E., De Loof A., Schoofs L. The use of peptidomics in endocrine research. Gen. Сотр. Endocrinol., 2003, v. 132, p. 1-9.

94. Schulz-Knappe P., Zucht H.D., Heine G., Jurgens M., Hess R., Schrader M. Peptidomics: the comprehensive analysis of peptides in complex biological mixtures. Comb. Chem. High. Throughput Screen., 2001, v. 4, p. 207-217.

95. Kislinger Т., Rahman K., Radulovic D., Сох В., Rossant J., Emili A. PRISM, a Generic Large Scale Proteomic Investigation Strategy for Mammals. Mol. Cell. Proteomics, 2003, v. 2, p. 96-106.

96. Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics, 2002, v. 2, p. 3-10.

97. Corthals G.L., Wasinger V.C., Hoehstrasser D.F., Sanchez J.C. The dynamic range of protein expression: a challenge for proteomic research. Electrophoresis, 2000, v. 21, p. 1104-1115.

98. Gygi S.P., Corthals G.L., Zhang Y., Rochon Y., Aebersold R. Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, v. 97, p. 9390-9395.

99. Domon В., Broder S. Implications of new proteomics strategies for biology and medicine. J. Proteome Res., 2004, v. 3, p. 253-260.

100. Mutt V. Recent developments in the chemistry of gastrointestinal peptides. Eur. J. Clin. Invest., 1990, v. 20 Suppl 1, p. S2-9.

101. Karelin A.A., Philippova M.M., Yatskin O.N., Kalinina O.A., Nazimov I.V., Blishchenko E.Yu., Ivanov V.T. Peptides comprising the bulk of rat brain extracts: isolation, amino acid sequences and biological activity. J. Pept. Sci., 2000, v. 6, p. 345354.

102. Che F.Y., Yan L., Li H., Mzhavia N., Devi L.A., Fricker L.D. Identification of peptides from brain and pituitary of Cpe(fat)/Cpe(fat) mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001, v. 98, p. 9971-9976.

103. Skold K., Svensson M., Kaplan A., Bjorkesten L., Astrom J., Andren P.E. A neuroproteomic approach to targeting neuropeptides in the brain. Proteomics, 2002, v. 2, p. 447-454.

104. Quadroni M., Ducret A., Stocklin R. Quantify this! Report on a round table discussion on quantitative mass spectrometry in proteomics. Proteomics, 2004, v. 4, p. 2211-2215.

105. Russell R.B. Genomics, proteomics and bioinformatics: all in the same boat. Genome Biol., 2002, v. 3, REPORTS 4034.

106. Ivanov V.T., Blishchenko E.Yu., Sazonova O.V., Karelin A.A. What to synthesize? From Emil Fischer to peptidomics. J. Pept. Sci., 2003, v. 9, p. 553-562.

107. Villanueva J., Philip J., Entenberg D., Chaparro C.A., Tanwar M.K., Holland E.C., Tempst P. Serum peptide profiling by magnetic particle-assisted, automated sample processing and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal. Chem., 2004, v. 76, p. 15601570.

108. Bergquist J., Ekman R. Future aspects of psychoneuroimmunology lymphocyte peptides reflecting psychiatric disorders studied by mass spectrometry. Arch. Physiol. Biochem., 2001, v. 109, p. 369-371.

109. Petricoin E.F., Ardekani A.M., Hitt B.A., Levine P.J., Fusaro V.A., Steinberg S.M., Mills G.B., Simone C., Fishman D.A., Kohn E.C., Liotta L.A. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet, 2002, v. 359, p. 572-577.

110. Baggerman G., Verleyen P., Clynen E., Huybrechts J., De Loof A., Schoofs L., Peptidomics. J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2004, v. 803, p. 316.

111. Clynen E., Huybrechts J., Baggerman G., Van Doom J., Van Der Horst D., De Loof A., Schoofs L. Identification of a glycogenolysis-inhibiting peptide from the corpora cardiaca of locusts. Endocrinology, 2003, v. 144, p. 3441-3448.

112. Clynen E., Huybrechts J., De Loof A., Schoofs L. Mass spectrometric analysis of the perisympathetic organs in locusts: identification of novel periviscerokinins. Biochem. Biophys. Res. Commun, 2003, v. 300, p. 422-428.

113. Huybrechts J., Nusbaum M.P., Bosch L.V., Baggerman G., De Loof A., Schoofs L. Neuropeptidomic analysis of the brain and thoracic ganglion from the Jonah crab, Cancer borealis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, v. 308, p. 535-544.

114. Huybrechts J., De Loof A., Schoofs L. Diapausing Colorado potato beetles are devoid of short neuropeptide F I and II. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, v. 317, p. 909916.

115. Chei F.Y., Eipper B.A., Mains R.E., Fricker L.D. Quantitative peptidomics of pituitary glands from mice deficient in copper transport. Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand)., 2003, v. 49, p. 713-722.

116. Verhaert P., Uttenweiler-Joseph S., de Vries M., Loboda A., Ens W., Standing K.G., Matrix-assisted laser desorption/ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry: an elegant tool for peptidomics. Proteomics, 2001, v. 1, p. 118-131.

117. Galoyan A.A. Primary structure and biological activity of hemoglobin-related hypothalamic peptides. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 135-137.

118. Petrov R.V., Mikhailova A.A., Fonina L.A. Bone marrow immunoregulatory peptides (myelopeptides): isolation, structure, and functional activity. Biopolymers, 1997, v. 43, p. 139-146.

119. Ivanov V.T., Karelin A.A., Nazimov I.V., Pletnev V.Z. Hemoglobin as a source of endogenous bioactive peptides: the concept of tissue-specific peptide pool. Biopolymers,1997, v. 43, p. 171-188.

120. Karelin A.A., Philippova M.M., Karelina E.V., Strizhkov B.N., Grishina G.A., Nazimov I.V., Ivanov V.T. Peptides from bovine brain: structure and biological role. J. Pept. Sci.,1998, v. 4, p. 211-225.

121. Karelin A.A., Philippova M.M., Ivanov V.T. Proteolytic degradation of hemoglobin leads to biologically active peptides. Peptides, 1995, v. 16. p. 693-697.

122. Карелин А.А., Филиппова M.M., Яцкин O.H., Блищенко Е.Ю., Назимов И.В., Иванов В.Т. Протеолитическая деградация гемоглобина в эритроцитах приводит к образованию биологически активных пептидов. Биоорганическая химия, 1998, т. 24, с. 271-281.

123. Yamamoto К., Ueno Е., Uemura Н., Kato Y. Biochemical and immunochemical similarity between erythrocyte membrane aspartic proteinase and cathepsin E. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, v. 148, p. 267-272.

124. Yonezawa S., Nakamura K. Species-specific distribution of cathepsin E in mammalian blood cells. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v. 1073, p. 155-160.

125. Ueno E., Sakai H., Kato Y., Yamamoto K. Activation mechanism of erythrocyte cathepsin E. evidence for the occurrence of the membrane-associated active enzyme. J. Biochem. (Tokyo), 1989, v. 105, p. 878-882.

126. Arnold D., Keilholz W., Schild H., Dumrese Т., Stevanovic S., Rammensee H.G. Substrate specificity of cathepsins D and E determined by N-terminal and C-terminal sequencing of peptide pools. Eur. J. Biochem., 1997, v. 249, p. 171-179.

127. Blishchenko E.Yu., Mernenko O.A., Yatskin O.N., Ziganshin R.H., Philippova M.M., Karelin A.A., Ivanov V.T. Neokyotorphin and neokyotorphin (1-4): secretion by erythrocytes and regulation of tumor cell growth. FEBS Lett., 1997, v. 414, p. 125-128.

128. Piszkiewicz D., Landon М., Smith E.L. Anomalous cleavage of aspartyl-proline peptide bonds during amino acid sequence determinations. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, v. 40, p. 1173-1178.

129. Weatherall D.J., Clegg J.B., Naughton M.A. Globin synthesis in thalassaemia: an in vitro study. Nature, 1965, v. 208. p. 1061-1065.