Взаимодействие гематопорфиринов с искусственными мембранными системами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

пв ии

ч '£33

- о российская академия наук

ИНСТИТУТ ЭЛЕКТРОХИМИИ ИМ. А.Н.ФРУМКИНА

На правах рукописи

СТОЖКОВА Ирина Николаевна

взаимодействие гшатопорфиринов с искусственными МШБРАННЫМИ СИСТШАШ.

02.00.05 - Электрохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Мостаа - 1992

Работа выполнена в лаборатории биоэлектрохимии мембран Института электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН.

Научные руководители: кандидат физико-математических наук

В.С.Соколов, кандидат химических наук В.М.Мирский.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Е.И.Мальцев, кандидат биологических наук Ю.Н.Антоненко.

Ведущее учревдениэ: НИИ экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАМН.

защита состоится " .¿,1993 г. в № часов на заседании специализированного совета Д 002.66.01 по присуждению ученой степени . доктора наук при Институте электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН то адресу: 117071. Москва. Ленинский проспект, 31, ИЭЛАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН. .

Автореферат разослан " //" ОУсСрь'О"1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандчтат химических наук

Г.М.КорначеЕЕ

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ Актуальность проблемы. Интерес к исследованию гематопорфиринов (НР) ... обусловлен их . двумя уникальными свойствами: преимущественной локализацией в опухолевых тканях -и фототоксичностью. Действие НР исследовали на простейших организмах, экспериментальных животных, развивается ■ клиническое применение производных НР для диагностики и фотохемотерапии различных видов опухолей у человека. Однако, молекулярные механизмы, лежащие в основе фототоксичного действия НР еще далеко не изучены. Одним из основных, факторов повреждения клеток, содержащих НР, считают нарушение целостности плазматических мембран в результате окисления белков и ляпидов. Сложность биологических систем затрудняет исследование молекулярного механизма фотоиндуцировэнного повреждения клеточных мембран ln vivo. Более широкие возможности для детального изучения механизма повреждения липидных бислоез дает использование модальных систем.

Многие электрические характеристики мембраны можно исследовать только на такой модельной системе, как плоская бислойная лкпидная мембрана (БЛМ), параметры которой (толщина, напряжение пробоя, удельная емкость, проницаемость для вода) близки к соответствущкм параметрам биологических мембран. Полученные на БЛМ результаты позволяют судить об изменении ее проницаемости, кинетике повреждения мембраны, распределения электрического поля в мембране при адсорбции нр. Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия диметилового эфира гсмзтоггорфирина (НРЕКЕ) с ВШ. Основные задачи, которые требовалось выполнить з данной работе, следующее: I. Исследовать кинетику повреждения БЛМ, влияние на этот процоос состава мэм^рлин, типа по рфиринэ, дож света, когар.атр'й'кй

- г -

фотосенсибилизаторэ, приложенного'к мембране напряжения, наличия ингибиторов реакций I и II типов в системе.

2. Исследовать транспорт гематопорфиринв через БЛМ.

3. Исследовать изменение граничного потенциала при адсорбции гематопорфиринов и освещении системы.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что при фотосенсибилизированном ИРЫ£Е повреждении БЛМ в ней происходит накопление продуктов, которые вызывают снижение поверхностного натяжения и изменение структуры мембраны, а при достижении некоторой их концентрации - рост проводимости и разрыв мембраны. Установлено, что мишенью при фотодинамическом повреждении модельных мембран являются двойные углерод-углеродные связи в углеводородных цепях липидов. Показано, что в фотодинамических реакциях, приводящих к поврездению БЛМ, главную роль играют мономерные формы нрбмв. Исследованы скачки граничного потенциала на границе БЛМ, возникающие при адсорбции нр, отличающихся гидрофобностыо периферийных групп. Эти скачки определялись с помощью разных методов: компенсациивнутримембранного поля с использованием второй гармоники емкостного тока на БЛМ, релаксации тока, индуцированной проводимости, электрофореза. Полученные результаты указывают на то, что исследованные нр адсорбируются на БЛМ в виде анионов и при освещении появляется положительный заряд в мзкрокольце молекулы. Скачок потенциала, возникающий при адсорбции нр, происходит не только в диффузном слое у поверхности мембраны, но и в некотором слое внутри БЛМ. На основании результатов измерения разности потенциалов разомкнутой цепи сделан вывод, что крсме в электронейтральной форме проникает через мембрану и при этом меняется рН в

неперемешиваемых слоях." ' Предложена схема его транспорта. Практическое значение этой работы состоит в том, что выяснение механизма фототоксического действия и? на мембрану позволит более корректно использовать такие соединения в клинике, разработать критерии проверки их эффективности вне клиники. Апробация работы. Результаты докладывались на III Конгрессе Европейского Общества по Фотобиологии (Будапешт, 1989), на мезду-народной конференции по фотодинамической терапии (София, I9S9), на республиканской конференции "Применение электрохимических методов в медицине" (Конаково, 1989), на VIII всесоюзном рабочем совещании по биоэлектрохимии мембран (Рига, 1990), на XV научной конференции молодых ученых и специалистов МФТИ (Москва, 1990), на конференции молодых ученых ИЭЛАН (Москва, 1991), нэ iv Конгрессе Европейского Общества по Фотобиологии (Амстердам, I99Ï). Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ и 2 статьи находятся в печати.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора лите-

ратуры, описания методов исследования, изложения результатов и обсуждения. Список литературы включает 149 наименований. Работа изложена на 132 'страницах печатного текста, иллюстрирована 39 рисунками.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Реактивы. Для формирования БШ использовались растворы липидоз в декане: L-a-фосфатидилхолин из соевых бобов (азолчктин) фирмы "Sigma" (США) в концентрации 50 мг/мл, L-a-диолеоилфосфатйдилхо-лкн (D0L), L-a-пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), L-a-ди-фитаноилфосфатидилхолин (DPhb) фирмы "Avanti Polar Lipids" (США)

в концентрации 20 мг/мл. ■ Монослои формировали из растворов указанных липидов в хлороформе. Использовались также ки марки х.ч., КН2Р04 марки х.ч., дипикриламин (ДПА) фирмы "Koch Light" (Англия), ( пентахлорфенол (ПХФ) марки х.ч., нонактин фирмы "Serva" (ФРГ). Растворы готовились на двавды дистиллированной Еоде. ыр были синтезированы и любезно предоставлены А.О.Мироновым (ЩТХТ).

Формирование НЛМ и монослоев. БЛМ формировали по методу Мшлера-Рудина на отверстии диаметром 0.8 мм в тефлоновой перегородке, разделяющей два водных раствора в ячейке. Растворы перемешивались магнитными мешалками. В стенке одного из отсеков находилось кварцевое окошко для освещения БЛМ. В работе использовали Agci-электроды. Для освещения БЛМ применяли установку Лвмен-ЗМ (ИХФ АН СССР) с ксеноновой лампой мощностью 150 Вт. Плотность мощности излучения составляла около 200 мВт/см2. Для изменения интенсивности света, падающего на мембрану, использовали нейтральные светофильтры.

Монослои липидов формировали в ленгмюровской • ванне фирмы "Joyoe Loebl" (Англия) объемом Зли площадью 1000 см2. После испарения растворителя монослои сжимали до поверхностного давления 29 мН/м. HPDME добавляли шприцем под монослой до концентрации 15 мкМ.

Методы измерения. Для' измерения электрической емкости БЛМ (Ст)

от генератора Г6-28 на мембрану подавали треугольное напряжение амплитудой 10' мВ и частотой I кГц. Ток регистрировали с помощью преобразователя ток-напряжение Keithley-4'27. Проводимость БЛМ (Gm) измеряли с помощью тех же приборов при подаче переменного прямоугольного напряжения амплитудой 20 мВ и частотой 0.04 Гц.

газнокь потенциалов между объемами растворов то обе стороны

от БЛМ в условиях разомкнутой цепи измеряли в присутствии протонофора (0.25 мкМ ПХФ) с использованием рн-метра 0Р-208 (Венгрия). Измерения проводили в растворе, содержащем 10 мМ КС1, 0.1 мМ фосфатного буфера, рн 6.9. НРСМЕ добавляли (последовательно 2.5 мкМ, 5 мкМ, 7.5 мкМ) только в дальний от источника света отсек ячейки (цис-сторона).

Изменение граничных потенциалов БЛМ определяли по изменению .проводимости, индуцированной ионофором (Б.С-.А.МоЬаиёЪИп et а1, 1971), методом компенсации внутримембранного поля (КВП) с использованием второй гармоники емкостного тока (В.С.Соколов и др., 1980), методом электрофореза (Я.С.ИоПопаЫ е* а1, 1972), методом релаксации тока (В.С.Соколов и др., 1986). 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1.Фотосенсибилизированное повреждение БЛМ. Во всех опытах в этом разделе в качестве фотосенсибилизатора был использован нрбме (рис.1), электролит содержал 10 мМ фосфатный буфер, 100 мМ КС1, . рн = 6.7. Мембрану, кроме специально оговоренных случаев, формировали из азолектина.

Изменение_прдвоаимдсти .Б^^и^свещениж

Добавление НРЕМЕ в ячейку с БЛМ не вызывало изменения проводимости мембраны. После того, как нрвме адсорбировался, включали свет. Некоторое время (индукционный период) проводимость не изменялась, затем начинался ее быстрый рост, заканчивающийся разрывом мембраны (рис.2). В неюторых опытах наблюдался рост проводимости в виде дискретных изменений, амплиту-

Рис.I.Структурная формула порфирина.

да которых была равна или кратна некоторой фиксированной величине. Величина индукционного периода (Т) зависила от приложенного к мембране постоянного напряжения: Т уменьшался с увеличением приложенного напряжения. При более чувствительном измерении ст зарегистрировали во время индукционного периода спонтанные флуктуации проводимости. Со временем амплитуда флуктуаций увеличивалась, достигая наибольшей величины перед разрывом БЛМ. Полученные результаты позволяют предполагать, что при освещении в присутствии НРШГЕ в мембране образуются водные поры.

Для выяснения "мембранной токсичности" продуктов реакции, остающихся в ячейке после разрыва БЛМ, исследовали длительность Т на серии БЛМ, каждую из которых формировали сразу после разрушения предыдущей. НРЮИЕ добавляли только в начале серии, а освещение проводили от момента завершения формирования БЛМ до их разрыва. Каждая следующая БЛМ имела более короткий Т (рис.2), причем последние БЛМ из этой серии разрушались уже без включения света. Это указывает на процесс накопления в мембране веществ, снижающих ее стабильность .

Изменение ст при выключении света во время роста проводимости показано на рис.3. При первом освещении выключение света приводило к полному восстановле-

Рис.2. Изменение проводимости БЛМ при освещении в присутствии НРБМЕ (2.2 мкМ). Вторая БЛМ (2) сформирована после разрыва первой (I). Стрелками обозначено включение света, звездочками- разрыв мембраны.

нию исходной ст. При последующих включениях света рост проводимости происходил через меньший Т, а выключение света во время роста проводимости вызывало неполное восстановление исходной Ст. При каждом последующем освещении вклад остаточной проводимости при выключении света увеличивался, и наконец, выключение света переставало останавливать рост о и ее разрыв. На основании этих результатов можно предположить, что рост проводимости обусловлен двумя типами веществ, одни из которых имеют высокое сродство к липидному бислою, а вторые могут легко уходить в воду или в небислойную часть мембраны. Последовательные включения-выключения света вызывают постепенное накопление в мембране веществ первого типа, вызывающих остаточную проводимость.

Изменение _поверхностного_натяжега

Для регистрации образования поверхностно - активных продуктов

последовательных включениях (обозначено стрелками, направленными вниз) и выключениях (стрелками, направленными вверх) света.

мы использовали известный" метод измерения поверхностного натяжения БЛМ, основанный на измерении емкости изогнутой мембраны в условиях градиента гидростатического давления. При освещении электрическая емкость БЛМ увеличивалась (рис.4). Изменение ст может происходить в результате изменения трех параметров БЛМ: диэлектрической проницаемости, толщины, площади. Значительное увеличение ст в условиях градиента гидростатического давления (от начала освещения до разрыва БЛМ ст увеличивалась на 20 %) можно объяснить только изменением площади мембраны в результате изменения ее поверхностного натяжения, т.к. в отсутствие искусственно созданного градиента давления изменения емкости при освещении были значительно меньше (6 %). Это означает, что при освещении БЛМ в присутствии нрше в ней накапливаются поверхностно-активные продукты. Интересно отметить, что образование поверхностно-активных веществ в БЛМ происходит во время индукционного периода. Вероятно, флуктуации проводимости и увеличение интегральной от могут возникать только тогда, когда концентрация этих продуктов в БЛМ достигает определенной величины.

С/Со

1-е

1.6

1.4т

1.3

SO ISO- е

Рис.4.Относительные изменения электрической емкости БЛМ, изогнутой градиентом гидростатического давления в присутствии 2.2 ккМ кроме при освещении. БЛМ из азолектина (I), рорс (2), . rPh.ii (?). Стрелкой обозначен момент включения света.

Измене1ше_щдацироватой_щовддаоста_В^_при Изменение индуцированной проводимости {а±) может быть обусловлено двумя факторами - изменением трагичного потенциала мембраны и изменением коэффициента проницаемости ионофоров через ЫМ. В первом случае эффект зависит от знака заряда переносимой через мембрану частицы: смена знака заряда вызывает изменение направления изменения а^. Для создания о^ в электролит добавляли 1.7 мкМ нонактина, либо 0.25 мкМ ПХФ. Как для ПХФ, переносимого через БЛМ в виде аниона, так и для нонактина, который переносится через БЛМ в виде положительно заряженного комплекса с ионом калия, наблюдалось 2-3-кратное увеличение G^ (без индукционного периода) при освещении в присутствии HPDME. Увеличение не может быть объяснено вкладом проворности продуктов, вызывающи увеличение фоновой Gm, т.к. абсолютная величина G^ была на 2-3 порядка выше фоновой. Следовательно, наблюдаемые эффекты обусловлены увеличением коэффициента проницаемости ионофоров через БЛМ, вероятно, вследствие снижения ее вязкости при образовании в ней мембранотоксичных продуктов. Выключение света во время роста приводило к восстановлению ее до исходной величины, дальнейшие включения и выключения света вызывали рост остаточной проводимости. Сходство эффектов при последовательных освещениях с аналогичными опытами без ионофоров позволяет предполагать, что увеличение проводимости БЛМ и изменение ее вязкости обусловлено действием одних и тех же веществ.

Проводимость и емкость БЛМ из различных лшшдов. Площади монослоев из фоефатидклхолипоЕ (полектик, dot,, popo, dpíiL) при введении в одной и той же концентрации н?г>та под монослой увеличивались на 10-15 %. Следовательно, гемзтоггорфярта с одинаковой эффективностью встраивается е монослои фосфатгч.л-

холинов с различным содержанием двойных связей в углеводородных цепях. Поэтому мы предполагаем, что встраивание HPDME ' в БЛМ также не зависит от типа указанных фосфатидилхолинов.

Однако, фотоповревдение БЛМ из исследованных липидов резко различалось. Освещение БЛМ из dol или азолектина в присутствии HPDME (в диапазоне концентраций 0.6-18 мкМ) приводило к росту Gm и разрыву БЛМ. Длительность Т на БЛМ из D0L была меньше, чем на мембранах из азолектина. На БЛМ из РОРС при освещении в присутствии 0.6 мкМ HPDME наблюдалось лишь увеличение Gm на на 1-2 порядка, а разрыва БЛМ при этом не происходило. При освещении мембран из E>?hL даже при концентрации HPDME 30 мкМ не наблюдалось ни роста Gm, ни разрыва БЛМ. Сопоставляя эти результаты, можно сделать вывод, что мишенью фотодинамического повревдения БЛМ являются двойные связи углеводородных цепей лишдных 'молекул.

Для выявления эффектов, связанных с изменением поверхностного натяжения БЛМ, для всех липидов проводили опыты в условиях градиента гидростатического давления. Во всех опытах концентрация HPDME была 2.2 мкМ. Емкость БЛМ из всех липидов менялась сразу после включения света (рис.4). В опытах на БЛМ из DOL, как и на БЛМ из азолектина, включение света приводило к постоянному росту ст вплоть до разрыва мембраны. На БЛМ из P0FC при включении света наблюдали рост ст, но- не постоянный, а с выходом на плато. Выключение света во время роста емкости останавливало рост ст. На БЛМ из DPhb зарегистрированы незначительные фотоэффекты. Эти результаты подтверждают-наше предположение об образовании продуктов двух типов в результате взаимодействия возбужденного hpdme с ненасыщенными липидами в Спелое.

Зависж^ость_т^кщощого_перко

Для количественного описания процесса необходимо более

корректно определить понятие индукционного периода. Будем называть индукционным периодом время, в течении которого ст увеличивается на 2,5 « Ю11 Ом-1. При таком определении Т воспроизводимость результатов оказалась наилучшей.

Зависимость скорости фотохимической реакции от интенсивности света должна быть линейной. В наших экспериментах обнаружена линейная зависимость величины 1/Т от интенсивности света. Следовательно, величина 1/Т пропорциональна скорости фотохимической реакции. Тогда мы можем исследовать интересующую нас зависимость скорости фотохимической реакции от концентрации кроне, используя в качестве меры скорости реакции величину 1/Т. Мы выбрали интервал концентраций НРБМЕ от значений, при которых

ъ

120

100 80 60 40 20 О

ш

I

О

10

О 1

О 2

о 3

20 30

.С, 10" м

Рис.5.Зависимость индукционного периода (Т) от концентрации НРШЕ, добавленного в оба отсека ячейки (I и 2) и только в дальний от источника света отсек ячейки (3). БЛМ формировали из шь (I) или азолектина (2, 3).

практически нот агрегации, до значений, при которых агрегационнне формы преобладают» Будем считать, что и мономерная и димерная формы НРЕМЕ способны встраиваться в БЛМ. В случае, если какая-то из этих форм действует гораздо эффективней другой, зависимость 1/Т от их концентрации в растворе должна быть линейной. Были получены зависимости Т от концентрации НРБМЕ для БЛМ из азолектина и ШЬ (рис.5). Только зависимость 1/Т от концентрации мономеров оказалась в пределах ошибки близкой к линейной (для обоих липидов). Это позволяет предположить, что в исследуемой системе мономерные формы наиболее эффективно участвуют в реакциях, продукты которых вызывают повреждение БЛМ.

2.2. транспорт НРБМЕ через БЛМ.

Транспорт и адсорбцию нр мы изучали на БЛМ из БРМ>, т.к. при их освещении не образуются поверхностно-активные вещества и не происходит повреждения мембран.

В зависимости от рН раствора, крсие обладает как кислотными, так и основными свойствами. Известно, что слабые кислоты и основания могут проходить в нейтральном виде через БЛМ и изменять величину рн в неперемешиваемых слоях (Ю.Н.Антоненко и др., 1982). При введении нрсме и освещении системы мы не наблюдали изменения проводимости БЛМ, что является подтверждением того, что если гэматопорфирин проникает через мембрану, то в нейтральном виде. Возникновение градиента рН в неперемешиваемых слоях можно зарегистрировать, измеряя трзнсмембранный потенциал (Фе1) в присутствии протонофора. Добавление нрсме вызывало изменение Фе1, соответствующее тому, что с цис-стороны появился недостаток протонов, а с транс-стороны - их избыток (рис.6). Поскольку рн в объеме раствора пр: вводении нрвме не менялся, наблюдаемые изменения происходят в ноперемешизаемых слоях вблизи БЛМ.

При используемых нами рН, согласно (R.Pottier et al, 1986), в растворе преобладают следующие формы гематопорфирина: Р(соо~)2, HP+(coo")2, HP+(CGGH)(соо"). Молекула может быть нейтральной в случае, когда одна из карбоксильных групп депротонирована, а кольцо имеет положительный заряд - НР+(СООН)(СОО~) и в случае, когда ни карбоксильные группы, ни кольцо молекулы не тлеют заряда -Р(соон)2. Нейтральная форма гематопорфирина- н?+(соон)(СОО") легко проникает через мембрану (R.Pottier et al,1986). Прохождение этой формы не влечет за собой изменение рН. Величина рН в неперемешиваемых слоях может измениться, если в процессе принимает участие еще какая-то из перечисленных форм. Для того, чтобы такая молекула стала нейтральной, группы соо~ должны

40

30

20

10

1 TV i i

о 500 1000 1500 с

Рис.б.Кинетическзя кривая изменения трансмембранного потенциала

БЛМ в присутствии ггротонофора при последовательном добавлении в водный раствор нррме (обозначено стрелками со звездочкой) и освещении системы. Стрелками, направленными вниз ¡т вверх, обозначено соответственно, - начало и конец освещения,

присоединить н+ из раствора,, что и приведет к изменению рН в неперемешиваемых слоях.

Уменьшение фв1 при освещении можно объяснить появлением положительного заряда в макрокольце молекулы нрбме, т.к. карбоксильные группы не являются фотоактивными.

На основании полученных результатов можно предположить такую схему транспорта гематопорфирина через мембрану (рис.7): молекула НРШЕ в виде аниона адсорбируется на поверхности мембраны с цис-стороны, образуется ее нейтральная форма (заряженные С00~-группы присоединяют протоны из водного раствора и рН с этой стороны уменьшается), которая проходит через БЛМ, затем после депротонирования карбоксильных групп с транс-сторони (рн увеличивается) выходит в раствор.

Результаты измерения разности граничных потенциалов (Д^) методом КВП подтверадают, что гематопорфирин адсорбируется на мембране в виде аниона. Скачок Д^ в условиях исходного градиента рН (с цис-стороны рн= 6.8, с транс-стороны - 3.7) гораздо больше, чем в случае, когда рН= 6.8 с обеих сторон БЛМ. Это подтверждает существование транспорта НРБМЕ через БЛМ, т.к.

величину Дс^ опре-

ЕР (СОО")2 •

>1Р*<С00Я)(С0<»-

\

Р«ХХ> >. ■

иг (Соо~)г

ЮЧОООвНСОО) •

•hp ссоо"),

деляет количество заряженной формы hpdme на каждой •и*«*»»«*»"стороне БЛМ. При увеличении концентрации н+ с транс-р<соо")г стороны концентрация заряженных форм

IIEVEPMU

fnc.7.Cxe:.ift транспорта hpdme через мембрану, hpdme на этой сто-

ер<ооо")2-

• В? (СООИХСОО)"

Г(соо~)г- ^

роне БЛМ уменьшится, а разность концентраций этих форм с обеих сторон БЛМ, и следовательно, значение дфь, увеличится.

Предложенную схему транспорта гематопорфнрина через мембрану подтверждает зависимость величины от буферной емкости

раствора. В более разбавленном растворе Дс^ больше. Это можно объяснить тем, что образующийся в результате транспорта нрше градиент рН в неперемешиваемых слоях при уменьшении емкости буфера будет увеличиваться. Это вызовет уменьшение концентрации заряженных форм щ>ше на границе БЛМ с транс-стороны, что приведет к увеличению измеряемого Дфь.

2.3. Адсорбция гематопорфиринов на БЛМ.

В предыдущих разделах в качестве фотосенсибилизатора был использован нрвме, т.е. сноской, где н=снэ. Обозначим его

НР-1. Мы изучали также адсорбцию гематопорфиринов у которых и

=(сн2)3сн3 (обозначим его нр-2) и й=(сн2)15сн3 (нр-з). Было замечено, что при добавке нр-з образуется слой на стенках ячейки и поэтому его концентрация в растворе немного меньше, чем концентрации нр-1 и нр-2.

При введении гематопорфиринов наблюдали отрицательный скачок граничного потенциала (рис.8), измеренный методом КВП. Освещение системы приводило к обратному эффекту, Афь уменьшался по абсолютной величине до некоторого постоянного значения. Это можно объяснить только появлением положительного заряда в лорфириновом кольце. При выключении света потенциал принимал исходное значение, которое имел до освещения. Данные, полученные для нр-1 и нр-2, оказались очень близкими. Это не ктгатся удивительным, так как и гидрофобностью эти молекулы не очень отличаются. Значение Афь при адсорбции нр-з оказалось гораздо выше (рис.9).

В работе (В.С.Соколов и др., 1990) было ьыскг-

Рис.8.Кинетическая кривая изменения граничного потенциала БЛМ при добавлении НРБЫЕ (обозначено стрелками со звездочкой) и освещении системы. Стрелками, направленными вниз и вверх, обозначено начало и конец освещения, предположение, что при адсорбции амфифильных ионов на БЛМ возникает Дфь, не экранируемый электролитом, из-за того, что эти ионы проникают глубже внутрь мембраны, чем неорганические ионы. Для проверки этого, предположения мы провели сравнение величин Д^ и поверхностного потенциала (полагая, что в разбавленных растворах он равен С-потенциалу). Значения С-потенциала в пределах ошибки одинаковы для всех НР. Поэтому можно считать, что, независимо от гидрофобности периферийных групп, количества этих гематопорфиринов на поверхности мембраны практически одинаковы.

С-потенциал по величине меньше Дф^. Чем более гидрофобный гематопорфирин адсорбировался, тем больше различались эти потенциалы. Это свидетельствует о том, что добавление НР вызывает изменение не только поверхностного потенциала БЛМ в

ьо

О 1.

в 2

• 3

0 Ч

.л

9

Г

.1

диффузной части двойного слоя, но и неэкранируемого скачка потенциала, который не может быть зарегистрирован электрофо-ретичесютм методом, но измеряется методом 'КВП. В рамках простейшей модели, в ко-

-6 -5 5 ^[ИРОГЧ]

Рис.9.Зависимости д^ (i) для нр-1 , (4) для НР-3, измеренные методом КВП, и С-по- торой плоскость адсо-тенциалов (2) для нр-1, (3) для нр-3. из- ции ионов расположена меренных электрофоретическим методом от не на поверхности мем-концентрации гематопорфирина. браны, а на некоторой

глубине 0 (Н.Магеа15Л

ег а1, 1985), граничный потенциал представляет собой сумму поверхностного потенциала ф3 и падения потенциала в граничном

зависит от величины адсор-

слое внутри мембраны фе. Величина бированного заряда оа и емкости граничного слоя Сб: Ф2 = с&/сс. Значение фз можно определить с помощью теории Гуи - Чапмена. Величину оа можно выразить через граничный потенциал и объемную концентрацию гематопорфирина са: оа = Коа ехр (-ф^/КР), где к -константа адсорбции. Наилучшее совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными получается при следующих значениях параметров: к = 0.2 Кл/см2 М, С5 = 9.1 * Ю-5 Ф/см2 для НР-1 и К = 0.47 Кл/см2М, с0 - 2.1 * ю^Ф/см2 для НР-3- Глубину плоскости погружения можно оценить по формуле: д = £0е/с^. Значение е в слое толщиной о существенно ниже значения диэлектрической проницаемости водного раствора, но вше, чем в углеводородной обла-

сти БЛМ. Если взять е=5-10,.то 0=0.5-1 2 для нр-1 и 0=2.2-4.3 8 для нр-з. Из этих оценок следует, что нр, имеющий более гидрофобные периферийные группы, адсорбируются глубже в мембране.

Мы исследовали влияние адсорбции НР на изменение индуцированной проводимости БЛМ. По изменению можно определить изменение граничных потенциалов БЛМ, если при адсорбции не меняется структура мембраны. В качестве ионофоров использовались нонак-тин, ПХФ (метод индуцированной проводимости) и ДПА (метод релаксации тока). При добавлении НРВМЕ в растворы с обеих сторон БЛМ проводимость росла как с нонактином, так и с ПХФ. Это указывает на то, что меняется коэффициент проницаемости ионофоров через мембрану из-за изменения структуры БЛМ при адсорбции НРБМЕ. Следовательно, метод проводимости нельзя использовать для измерения Дфь при адсорбции НР. ' При освещении системы индуцированная нонактином С^ уменьшалась, а индуцированная ПХФ -росла. Противоположное изменение с^^ с этими ионофорами и небольшое отличие результатов от данных, полученных методом КВП, указывает на то, что при освещении проводимость БЛМ изменяется в основном из-за изменения электростатических потенциалов, а изменение структуры мембраны при этом незначительно.

. Используя метод релаксации' тока, мы можем получить более детальную информацию о кинетике транспорта гидрофобных ионов через БЛМ по изменению параметров их транспорта (к и И) в результате взаимодействия НРБМЕ с БЛМ. Параметр к (константа скорости перемещения, гидрофобных ионов в БЛМ) зависит от среды, расположенной глубже плоскости адсорбции гидрофобных ионов, параметр и (концентрация гидрофобных ионов в БЛМ) - между водным раствором и этой плоскостью адсорбции. Изменение структуры мембраны по резному скажется в этих областях. Вероятно, большее

влияние структура окажет на изменение параметра к, и незначительное - на изменение параметра N. При добавлении гематопорфи-ринов величина к увеличивалась до некоторого постоянного значения, величина N очень медленно уменьшалась, не достигая постоянного значения. Лф является суммой Лфт и Дф . которые связаны с

§ • та- 5 вт т

параметрами к и N формулами: Дф^ = -у Дф^ = -у

Сначало Дфг растет за счет роста Дф_ .(т.к. величина Дф_ гораздо

£ т. I

больше величины Дф^) и практически равен ому по величине, затем медленно спадает (т.к. Дф, перестает меняться, а дф уменьшает-

I ч

ся). Результаты измерения скачка граничного потенциала методами релаксации тока и КВП не совпадают: при добавлении НР величина дф^ меняется в сторону, противоположную Дфь. Несовпадение результатов, полученных этими методам.», подтверждает наше предположение, что при адсорбции гематопорфиринов меняются не только граничные потенциалы, а и структура мембраны. Параметры к и N меняются тем сильнее (и при добаЕке ИР, и при освещении), чем более гидрофобные молекулы порфиринов адсорбируются. Это указывает на то, что структура мембраны меняется тем сильнее, чем, чем более гидрофобный НР адсорбируется. При освещении Дфт уменьшается, а Дф^ растет. Т.к. величина Дф^ больше дфх, то Дф^ токе растет. Сравнение этих результатов с данными методов индуцированной проводимости и КВП указывает на то, что при освещении изменение индуцированной проводимости связано главным обрезом со скачком граничного потенциала, а не со структурой мембраны.

Мы показали, что более гидрофобный НР-Э глубже адсорбируется в мембране и можно предположить, что он об; эдает Сольем фототоксическим действием на БЛМ. Для проверки этого ми исследовали повреждение БЛМ из азолектина при одинаковой концентрации КР-1 и НР-3 (2 мкМ). В системе с НР-3 время жизни БЛМ при освещении и

- ¿и -

индукционный период были намного меньше: индукционный период в присутствии нр-3 составлял 36-2 с, в присутствии НР-1 - 70-10 с. 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДУ. .

1. Мишенью при фотодинамическом повреждении модельных мембран являются двойные связи в/углеводородных цепях липидных молекул.

2. Проводимость БЛМ из липидов, содержащих двойные связи в обеих углеводородных цепях, некоторое время после освещения остается постоянной (индукционный период), а затем начинается рост проводимости, заканчивающийся разрывом мембраны. Установлено, что при фотосевсибилизированном повреждении БЛМ в ней происходит накопление продуктов, которые вызывают снижение натяжения и изменение структуры мембраны, а при достижении некоторой концентрации -образование водных пор, рост проводимости и разрыв мембраны.

3. Мономерные формы нуйме в исследуемой системе наиболее эффективно участвуют в реакциях, продукты которых вызывают повреждение мембраны. " "

4. Гематопорфирин в нейтральной форме мажет проходить через мембрану. При этом изменяется рН в неперемешиваемых слоях.

5. При использованных нами значениях рН молекулы гематопорфирина адсорбируются на мембране в виде анионов. Изменение разности граничных потенциалов происходит не только в диффузной части двойного слоя, но и возникает дополнительный нээкранируемый скачок потенциала, вследствие погружения заряженных групп гематопорфирина внутрь мембраны.

6. При освещении в адсорбированном на БЛМ гематопорфирине появляется положительный заряд, вероятно, в макрокольце молекулы.

7. В результате адсорбции НР меняется структура мембраны.

8. Более гидрофобные гематопорфирина глубже встраиваются в мембрану, вызывают большие изменения структуры мембраны и

обладают большим фототоксическим действием.

Основше результаты опубликованы в следующих работах;

1. Szito Т., Mirsky V.M., Stoshkova I.N., Markin V.S. Photosensitized damage of bilayer lipid membrane in presense oi hema-toporphyrin dimethylester. Ill Congress of the ESP, Budapest, 1989

2. Mirsky V.M., Stozhkova I.N., Markin 7.S. Towards membrane mohaniam of photoradiation therapy: Photosensitized, effeot of he-ma toporphyrin diaoetate on planar bilayer lipid membranes. International Conferenoe on Photodynamio Therapy, Sofia, 1989, p.42.

3. Столетова И.Н., Мирский B.M. Моделирование повреждения клеточных мембран при фотодинамической терапии: фотосенсибилизация плоского липидного бислоя диметиловым эфиром гематопорфирина. Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1990, т.109, N.7, с. 898-900.

4. Стожкова и.н., Мирский В.М., Сито Т. Фотосенсибилизирован-ное разрушение бислойной липидной мембраны в присутствии димети-лового эфира гематопорфирина. Биол. мембраны, 1991, т.8, N.4, с.412-418.

5. Mirsky V.H., Stozhkova I.N., Szito Т. Photosensitized damage of bilayei* membrane in the presence of haematoporphyrin dimethylether. J.Photochem. and Photobiol., B: 1991, v. 8, p. 315-324.

6. Stozhkova I.N., Mirsky V.M. A stoiohiometry of the lipid

bilayer photodamage in the presenoe of photosensitize!*. IV Congress of the ESP, Amsterdam, 1991, p. 78.

7. Mirsky V.M., Stozhkova I.N., S2ito T.V., Kajushina R.L., Erokhin V.V., Mironov A.P. Double bonds of hydrooarbon ohainn as a target toi* photodynamio damdge of lipid membranes. IV Congress of the ESP, Amsterdam, 1991, p. 80.

8. Стсжсова И.Н. Мирский В.М., Кашина Р.Л., Ерохин В.В., Миронов А.Ф. Взаимодействие диме. талового эфира гематопорфирина с искусственными мембранными системами. Двойные связи углеводородных цепей липидоь - мишень фотодинамического повреждения липидных мембран. Виол, мембраны. 1992, т.9, N. I, с. 74-79.

9. Стожкова И.Н., Мирский В.М., Соколов B.C. Стехиометрия Фотохимической реакции, инициирующей повреждение липидного бислоя в присутствии фотосенсибилизатора. Биол. мембраны, 1993, т. 10, N. I, с. 44-4Э. •