Межфазные потенциалы, возникающие при фотосенсибилизированных окислительных реакциях на поверхности БЛМ

Соколенко, Елена Александровна

Межфазные потенциалы, возникающие при фотосенсибилизированных окислительных реакциях на поверхности БЛМ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

Соколенко, Елена Александровна АВТОР

кандидата физико-математических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.05 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Межфазные потенциалы, возникающие при фотосенсибилизированных окислительных реакциях на поверхности БЛМ»

Автореферат диссертации на тему "Межфазные потенциалы, возникающие при фотосенсибилизированных окислительных реакциях на поверхности БЛМ"

на правах рукописи

003461778

СОКОЛЕНКО ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

МЕЖФАЗНЫЕ ПОТЕНЦИАЛЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЯХ НА ПОВЕРХНОСТИ БЛМ.

Специальность 02.00.05 - Электрохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

' ? г-

Москва 2009

003461778

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН

Научный руководитель:

Кандидат физико-математических наук Соколов Валерий Сергеевич

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор

Яковенко Леонид Владимирович

Кандидат химических наук Лебедев Александр Владимирович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится О марта 2009 года в 11 час. оо мин. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.259.03 при Учреждении Российской академии наук Институте физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский проспект, д. 31., корп. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина

РАН.

Автореферат разослан января 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

Г.М.Корначева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Окисление жизненно важных молекул в мембране активными формами кислорода, образующимися при фотовозбуждении фотосенсибилизаторов (ФС), лежит в основе метода фотодинамической терапии (ФДТ) раковых заболеваний. По схожему механизму происходит деградация клеточных структур зрительной системы фотоактивными продуктами, образованными в результате метаболизма зрительного родопсина, что приводит к развитию заболевания зрения - возрастной деградации сетчатки глаза (AMD) (Островский М.А., 2005). В обоих случаях, в разрушении клеток участвуют фотосенсибилизаторы. В случае AMD ими являются побочные продукты цикла зрительного родопсина, а в случае ФДТ искусственно синтезированные соединения (порфирины или фталоцианины). Механизм их взаимодействия с мембраной недостаточно изучен. Наибольшее значение в фотодинамическом разрушении клеток имеет синглетный кислород, первичной мишенью которого являются мембранные белки и липиды (Красновский A.A., 1990). Несмотря на интенсивные исследования, которые проводятся в течение ряда лет, многие аспекты, касающиеся механизма фотодинамического окисления компонентов мембраны активными формами кислорода, образующимися в присутствии ФС, остаются неизученными. Большинство исследований квантового выхода и свободного пробега активных форм кислорода проводилось в гомогенных растворах, в то время как работ, в которых изучалась проницаемость мембраны для кислорода сравнительно мало, а исследований, посвященных определению проницаемости мембраны для короткоживущих активных форм кислорода: синглетного и супероксидного радикалов, нет. В настоящей работе сделана попытка восполнить этот пробел с помощью исследований на бислойной липидной мембране (БЛМ). Для регистрации фотодинамических реакций на поверхности БЛМ применен электрохимический подход, основанный на измерении межфазного скачка потенциала на границе бислойной липидной мембраны с водой. С помощью такого подхода изучены адсорбция различных соединений, обладающих свойствами фотосенсибилизаторов, а также фотодинамические реакции окисления мишеней, молекулы которых адсорбируются на поверхности БЛМ и создают на ней межфазный скачок потенциала.

Цель и основные задачи исследования.

Изучить механизм взаимодействия побочных продуктов фотопревращения зрительного родопсина с БЛМ, их адсорбцию на поверхности мембраны, их свойства как

фотосенсибилизаторов и их способность к автоокислению, то есть служить мишенью для активных форм кислорода (АФК), генерируемых самим продуктом под действием света.

Изучить механизм адсорбции на БЛМ классических фотосенсибилизаторов -фталоцианинов, используемых при ФДТ раковых заболеваний.

Оценить проницаемость мембраны для синглетного кислорода с помощью подхода, основанного на сравнении скорости окисления молекул флоридина - мишени синглетного кислорода, адсорбированных либо с одной, либо с противоположной стороны относительно молекул фталоцианина.

Научная новизна работы.

В работе предложен оригинальный подход, в котором с помощью электрохимического метода измерения межфазных потенциалов на границе БЛМ удалось исследовать не только адсорбцию различных соединений на липидной мембране, но и процессы окисления в мембране, происходящие с их участием. Этот подход позволил впервые оценить проницаемость плоской бислойной липидной мембраны для синглетного кислорода и изучить влияние на нее различных факторов.

Теоретическая и практическая значимость.

Выяснение механизмов дестабилизации мембраны при воздействии на нее побочных продуктов фотолиза зрительного пигмента родопсина и активных форм кислорода, образующихся при освещении, имеет большое значение для выяснения механизмов развития патологических изменений сетчатки глаза, к которым, прежде всего, относится возрастная макулярная дегенерация эпителиальных клеток.

Установление механизма действия ФС на мембрану необходимо для разработки новых, более эффективных фотосенсибилизаторов, применяемых в методе фотодинамической терапии раковых заболеваний.

Определение проницаемости мембраны для АФК играет существенную роль в понимании механизма фотодинамических реакций, поскольку от нее зависит доступность компонентов клеточной мембраны к фотодинамическому воздействию и в конечном итоге эффективность фотосенсибилизаторов, применяемых в ФДТ.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на 8-м Международном Фрумкинском симпозиуме (Москва, 2005), 3-ем съезде биофизиков России

(Воронеж, 2004), Международном конгрессе биофизиков (Монпелье, Франция,2005), Международном съезде Американского биофизического общества (Балтимор, США, 2007).

Публикации.

Основные положения диссертации опубликованы в четырех статьях в отечественных и международных реферируемых журналах, входящих в список ВАК, а также в сборниках тезисов международных и отечественных конференций.

Объем н структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 145 наименований. Работа изложена на 118 страницах, иллюстрирована 34 рисунками.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования.

В работе использовались искусственные БЛМ, которые формировали двумя методами. В первом методе (Мюллера-Рудина) бислойную мембрану формировали из раствора дифитаноилфосфатидилхолина (DPhPC) («Avanti Polar Lipids», США) в декане («Aldrich», США) в концентрации 15 мг/мл, на отверстии в перегородке диаметром 0,7-1,5 мм. Во втором методе (Монталла) использовалась ячейка, перегородкой в которой служила тефлоновая пленка толщиной 30 мкм с отверстием диаметром 0,1-0,2 мм.

В работе использовались спиртовые растворы А2Е, любезно предоставленные А.Е. Донцовым (ИБФ РАН Москва), спиртовой раствор флоретина («Fluka», Швейцария), растворы фталоцианинов («Porphyrine Products», США).

Для приготовления растворов использовали KCl, («Merck», Германия), HEPES(«Sigma», USA). Основной буферный раствор содержал 10 mM KCl, 1 тМ HEPES, pH доводился добавлением КОН до величины 7.5.

Электрические измерения проводили с помощью хлорсеребряных электродов, соединенных с ячейкой агаровыми мостиками. Наконечники заполнялись тем же раствором, что и ячейка.

В исследованиях по бис-ретинилиден-этаноламину (А2Е) для освещения использовалась ртутная лампа мощностью 250 Вт. Ее свет проходил через водный тепловой фильтр и стеклянный светофильтр СЗС-20, ограничивающий спектр синим цветом (максимум спектра поглощения А2Е лежит в районе 430 нм). В исследованиях с несимметричными мембранами для возбуждения фталоцианина использовалась ртутно-ксеноновая лампа мощностью 1 кВт с монохроматором, ограничивающим спектр областью шириной 20 нм с центром, расположенным при 670 нм («Oriel Instruments», США). При исследованиях фотодинамического окисления флоридина использовался полупроводниковый лазерный модуль с мощностью излучения 1 мВт на длине волны 670 нм. Мощность излучения всех источников света контролировалась с помощью фотокалориметра РТН-31С (ВНИИОФИ, Москва, Россия), расположенного в плоскости формирования мембраны.

Разность граничных потенциалов БЛМ измеряли методом компенсации внутримембранного поля (КВП) с использованием второй гармоники емкостного тока (Соколов, B.C., Кузьмин, В.Г., 1980). Измерение осуществлялось с помощью автоматической установки с использованием фазочувствительного усилителя DSP-7265 («Signal Recovery», США), который управлялся компьютером через приборный интерфейс GPIB («Measurement Computing», США) с помощью разработанной авторами метода программы.

Электрофоретическую подвижность липосом, ц, измеряли коммерческим прибором "Zetasizer-2" («Malvern Instr.», UK), использующим метод корреляционного светорассеянния.

Результаты исследований и их обсуждение

Исследование взаимодействия побочных продуктов цикла зрительного родопсина с БЛМ.

Задача имеет большое значение для выяснения механизмов развития патологических изменений сетчатки глаза, к которым, прежде всего, относится возрастная макулярная дегенерация эпителиальных клеток. Ключевая роль в развитии возрастной дегенерации сетчатки принадлежит липофуециновым гранулам или "пигменту старости", накапливающимся с возрастом в клетках ретинального пигментного эпителия. Липофусциновые гранулы не являются инертными внутриклеточными включениями (инертными «шлаками»), а обладают фотоактивностью. При действии видимого света липофусциновые гранулы способны генерировать активные формы кислорода: супероксидные радикалы и синглетный кислород. Было показано, что липофусциновые гранулы выступают в качестве эффективных фотосенсибилизаторов окисления липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты. Липофусцин - гетерогенный комплекс, состоящий из

смеси белков, липидов и ряда флуорофоров, поглощающих свет в синей области спектра. Одними из основных флуорофоров являются бис-ретинилиден этаноламин (сокращенное название А2Е) и его окисленная форма (эпокси-А2Е) (рис.1), которые мы исследовали в данной работе

А2Е ероху-А2Е

Рис.1. Структура А2Е и эпокси-А2Е.

Сначала изучалось встраивание А2Е в БЛМ. Оно регистрировалось по изменению граничного потенциала БЛМ методом КВП или по электрофоретической подвижности липосом. Типичные кинетики изменения разности граничных потенциалов при введении А2Е в раствор с одной стороны БЛМ изображены на рис 2. Видно, что при введении А2Е в раствор, происходил рост потенциала и выход его на стационарное значение. Этот потенциал связан с появлением положительного заряда на поверхности мембраны вследствие адсорбции на ней А2Е.

Рис.2 Кинетики изменения граничного потенциала при адсорбции А2Е и последующем включении света (А) и чередовании условий свет-темнота (Б). Водный раствор содержал 10 мМ KCl, 1 мМ HEPES, рН=7,0.

Величину этого заряда мы определяли с помощью измерения электрофоретической подвижности липосом, образованных из липида, в который было добавлено определенное количество А2Е.

Чтобы можно было сравнить данные, полученные на липосомах, с данными, полученными методом КВП, мы сформировали несимметричные мембраны, один из монослоев которых состоял из DPhPC, а другой состоял из смеси липида (DPhPC) с определенной долей А2Е. Разность граничных потенциалов Дсрь, измеренных на таких мембранах, совпадала с поверхностным потенциалом Дф5 (см. рис.3, А). Учитывая, что плоскость, в которой измеряется поверхностный, находится в водном растворе на некотором расстоянии от BJIM (т.н. «плоскость скольжения», а плоскость, где измеряется граничный потенциал методом КВП - внутри мембраны вблизи ее гидрофобной области, совпадение потенциалов, измеренных этими методами, означает, что плоскость расположения зарядов адсорбированных молекул А2Е расположена на поверхности мембраны вблизи границы раздела с водой. Полученная на рисунке 3, А зависимость позволяет по величине потенциала определить содержание А2Е в мембране, даже если А2Е добавляется в водный раствор (рис.3, Б).

% 20

5 10 15 20 %А2Е

1 2 3

А2Е, мкМ

Рис.3. А. Зависимость поверхностного и разности граничных потенциалов от содержания А2Е в липидах. Черные кружки получены из измерений электрофоретической подвижности липосом сформированных из смеси DPhPC с А2Е в молярном отношении, указанном на горизонтальной оси. Каждая точка представляет собой среднее из 2-3 измерений на одном препарате липосом. Белые кружки показывают результаты измерения разности граничных потенциалов асимметричных БЛМ, сформированных методом Монталла-Мюллера из двух монослоев, первый из которых состоял из DPhPC, а второй - из смеси этого липида с А2Е.

Водный раствор содержал 10 мМ KCl, 1 мМ HEPES, рН=7,0. Б. Зависимость величины адсорбционного потенциала от концентрации А2Е в водном растворе. Условия те же.

Для изучения фотоэффектов мы использовали способ встраивания А2Е через водный раствор. Бислойную липидную мембрану формировали из раствора DPhPC в декане, после чего в один из отсеков вводили спиртовый раствор А2Е. После окончания адсорбции включали постоянное освещение мембраны. На рис.2 представлены две типичные записи изменений граничного потенциала при адсорбции А2Е из раствора и последующем освещении. Под действием непрерывного освещения потенциал сначала возрастал, а затем уменьшался (рис. 2, А). Если во время роста потенциала свет выключали, потенциал сначала продолжал расти с большей скоростью, а затем выходил на стационарный уровень. Последующее включение света приводило к уменьшению потенциала (рис. 2, Б).

Уменьшение потенциала под действием света можно объяснить образованием эпокси-А2Е, который, будучи менее липофильным, чем исходный А2Е, десорбируется с поверхности мембраны. Это подтверждают эксперименты, в которых исследовалась адсорбция эпокси-А2Е. Растворы А2Е предварительно освещали видимым светом в присутствии кислорода, что приводило к образованию эпоксидов. В результате облучения в течение различного времени: 1ч. 30 мин. и 2ч. 40 мин были получены две смеси с разным соотношением А2Е и его эпокси-форм. Они различались по спектрам поглощения, которые представлены на рисунке 4 А вместе со спектром исходного А2Е. Кинетика адсорбции и фотоиндуцированного изменения потенциала этих образцов, а также, для сравнения - исходного А2Е, приведена на рисунке 4,Б.

0.40

0.00

0.20

0.80

0.60

S 40

60- Б

300

400

500

600

-50 0 50 100 150 200 250

Длина

t, мин

волны, нм

Рис. 4. Спектры поглощения (А) и изменение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции (Б) для нативного А2Е (1), подверженного облучению 1ч.ЗО мин.(2), и подверженному облучению 2ч. 40 мин (3).

Как видно из рисунка, адсорбция образцов, предварительно экспонированных светом (кривые 2 и 3), дает меньший адсорбционный потенциал, чем исходный препарат А2Е (кривая 1). Чем больше была длительность предварительного облучения, тем меньше было изменение граничного потенциала. Освещение БЛМ приводило к дальнейшему уменьшению граничного потенциала, которое, по-видимому, вызвано дальнейшим образованием эпокси-форм А2Е в мембране и их десорбцией с ее поверхности.

Причины возрастания потенциала на начальных стадиях освещения (рис.2) не вполне ясны. Можно предположить, что освещение мембраны вызывает образование промежуточной формы окисления А2Е, которая затем превращается в эпокси-форму. Увеличение потенциала при образовании промежуточной формы окисления А2Е под действием света может быть вызвано либо увеличением плотности заряда на поверхности мембраны, либо изменением дипольного потенциала. Для того, чтобы проверить, происходит ли изменение дипольного потенциала, адсорбция А2Е и фотоэффекты изучались в растворах с различной ионной силой фонового электролита. Увеличение ионной силы раствора должно приводить к экранированию заряда и уменьшению поверхностного потенциала, но не может влиять на дипольный потенциал. Поскольку мы показали, что адсорбция А2Е приводит к увеличению поверхностного заряда мембраны, то, как и ожидалось, стократное увеличение ионной силы привело к значительному уменьшению поверхностного потенциала, вызванного адсорбцией. Фотопотенциал в растворах с высокой ионной силой также уменьшился, причем в той же пропорции, что и потенциал адсорбции. Из этого можно заключить, что увеличение граничного потенциала при освещении в присутствии А2Е вызвано увеличением суммарного поверхностного заряда молекул адсорбированного пигмента, а не дипольного потенциала.

Изучение адсорбции классических ФС на примере фталоциаиинов.

Второй раздел посвящен изучению адсорбции различных аналогов фталоцианина, отличающихся по числу сульфогрупп и ассоциированному иону металла (рис.5) на мембранах различного липидного состава. Это исследование позволило определить роль гидрофобных и ковалентных взаимодействий в адсорбции ФС на липидной мембране.

Рис. 5 Структура фталоцианинов. В нашей работе «Ме» - А1, Zn либо №.

На первом этапе работы мы выясняли влияние на адсорбцию иона металла, ассоциированного в молекуле фталоцианина. В эксперименте использовали А1Рс54, 2пРсБ4, №Рс84.

Из кинетики изменения потенциала после добавления 100 мкМ А1Рс54 и 100 мкМ 2пРс5., (рис. 6) к мембране, сформированной из ОРЬРС, видно, что оба фталоцианина адсорбируются на мембране и индуцируют появление на ее поверхности отрицательного заряда.

■А 80

ш 60

/ п 9-< 1 40

Ц----Ь 20

Л МеЦсв, , !Кар . 0

0 20 40 60 80 100

1, мин

100 200 МеРсЭ., мкМ

Рис 6. А Кинетика изменения граничного потенциала при адсорбции 2пРс84 (1) и А1Рс84 (2) на фосфолипидной БЛМ и эффект ИаР. Б Зависимость граничного потенциала от концентрации 2пРс84 (1), А1Рс84 (2) и №Рс84 (3).

Последующая добавка фторида натрия (10 мМ) практически полностью убирала изменение граничного потенциала Дфь, вызванного адсорбцией А1Рс84 (рис. 6, А (2)), но лишь незначительно уменьшала значение изменение граничного потенциала, наблюдаемое после добавки 7пРс84 (рис.6, А (1)). Эти результаты согласуются с данными, полученными ранее, демонстрирующими ингибирование фторидом связывания А1Рс84 с искусственной, клеточной мембранами и белками. Сродство, то есть степень связывания с БРЬРС мембраной, было выше для 7пРс$4 чем для А1Рс$4, что видно из зависимостей изменения граничного потенциала Дфь от концентрации фталоцианинов в растворе (рис. 6, Б). Аналогичные измерения, выполненные с №Рс84 показали, он практически не связывается с БЛМ из ОРЬРС (рис. 6, Б (3)).

Если БЛМ сформирована из липидов, не содержащих фосфатных групп, связывания с ней фталоцианинов не происходит. Это иллюстрирует рисунок 7, где показана кинетика изменения Дфь, при добавке 100 мкМ А1Рс84 или 7пРс84 к мембране, сформированной из глицерилмоноолеата (ОМО). Отсутствие сколь-либо значительного изменения граничного потенциала указывает на то, что как А1Рс84, так и 2пРс84 не связываются с мембраной, сформированной из вМО. Способность адсорбироваться на БЛМ из фосфолипидов и отсутствие адсорбции на БЛМ из вМО являются уникальными свойствами фталоцианинов. Для других соединений, например, бенгальского розового, присутствие в составе БЛМ фосфолипидов не является необходимым условием для их адсорбции, что демонстрирует кинетика изменения потенциала на БЛМ из вМО на рис.7. В совокупности эти эксперименты свидетельствуют о том, что связывание фталоцианинов с БЛМ происходит благодаря образованию координационной связи между атомом металла и фосфатными группами мембранообразующих липидов. Фторид конкурирует с фосфолипидом за образование связи с атомом металла, что объясняет уменьшение адсорбционного потенциала после добавки 1ЧаР.

^ мин

Рис 7. Связывание бенгальского розового, А1Рс84 и 2пРс54 с БЛМ из ОМО, измеренного по разности граничных потенциалов. Водный раствор содержал ЮОтМКО, 10 тМ Нереэ, рН 7,75.

Как было показано ранее (Рокитская, Т.И. и др., 2000) связывание фталоцианинов с липидной мембраной является необходимым фактором для фотодинамического воздействия на мишени, локализованные в или на мембране. Это было доказано на примере фотодинамической инактивации ионных каналов, образуемых пентадекапепдидным грамицидином А ^А) в липидной мембране. Примечательно, что результаты наших экспериментов по изучению адсорбции фталоцианинов на БЛМ полностью согласуются с результатами работы, выполненной рабочей группой Антоненко Ю.Н., по фотоинактивации грамицидиновых каналов ^А) этими же фталоцианинами. Из записи элетрических токов сквозь БЛМ, индуцированных gA, было замечено, что освещение видимым светом БЛМ вызывает уменьшение тока в присутствие фотосенсибилизаторов, причем наиболее эффективным оказался цинковый фталоцианин, в то время как с никелевым фиалоцианином фотоинактивации грамицидиновых каналов не наблюдалось. Увеличение концентрации хлорида калия в случае экспериментов на ОРЬРС мембране никак не сказывалось на фотоинактивации грамицидиновых каналов А1Рс54, но добавка фторида калия полностью убирала фотоэффект. При проведении подобных экспериментах на мембранах из йМО, фотоактивность А1Рс$4 полностью отсутствовала, в то время как добавка к системе красителя бенгальского розового восстанавливала фотоинактивацию грамицидиновых каналов.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что адсорбция фталоцианинов на БЛМ в значительной степени определяется координационной связью между атомом металла в молекуле фталоцианина и фосфатом в молекуле липида в составе БЛМ.

Кроме атома металла в молекуле фталоцианинов, граничный потенциал, образуемый при их адсорбции на БЛМ, зависел также от числа сульфогрупп в их молекуле (рис.8).

120 100 80 60 40 . 20 о -20 -40 -60

■ 1 А1РсБ2 / '

■у / :

т—

1Е-6 С, М

Рис 8. Зависимость граничного потенциала от концентрации фталоцианинов. А1Рс81, А1Рс82 (А), А1Рс83, А1Рс84 (В). Водный раствор содержал ЮОтМКС!, 10 тМ Иерея, рН 7,75.

По мере уменьшения числа сульфогрупп в молекуле фталоцианина возрастает вклад дипольной составляющей граничного потенциала, возникающего при адсорбции фталоцианина на БЛМ. В случае моносульфированного фталоцианина граничный потенциал оказывается чисто дипольным. Если сравнить наши данные по эффективности адсорбции разносульфированных А1Рс8„, где п варьировал от 1 до 4 с данными по фотоинактивации gA этими же фталоцианинами (Рокитская, Т.И. и др., 2000), то мы так же обнаруживаем четкую корреляцию.

В случае тетрасульфированного фталоцианина (рис. 9), потенциал зависел от ионной силы, причем потенциал, измеренный нами на БЛМ методом КВП, совпадал с ¿¡-потенциалом, измеренным в тех же условиях на липосомах (Рокитская, Т.И. и др., 2000). Это доказывает, что потенциал возникает в диффузном электрическом слое вследствие появления на поверхности мембраны заряда, вызванного адсорбцией молекул фталоцианина. Оказалось, что зависимости потенциала от концентрации фталоцианина в растворе при разных значениях ионной силы (рис. 9) могут быть описаны теорией Гуи-Чепмена в предположении, что на поверхности БЛМ происходит адсорбция 4-валентных анионов. Для этого использовалось уравнение, связывающее суммарный заряд адсорбированных молекул фталоцианина на поверхности БЛМ ст с их концентрацией в растворе Са (изотерма адсорбции Генри):

zF<Ph

о = гКСае RT и уравнение Гуи-Чепмена:

JS£C0RTci \2RT)

где с/ - концентрация раствора КС1, е, £о, - диэлектрическая проницаемость водного

раствора и вакуума, Л - газовая постоянная Т - абсолютная температура (299К),Р - число

Фарадея, г - заряд иона.

Параметр К устанавливает отношение между концентрацией А1Рс84 в воде с его концентрацией на поверхности мембраны. Его значение 200 Кл см моль"1 было найдено с помощью аппроксимации экспериментальных данных теоретическими кривыми методом наименьших квадратов.

AlPcS., мкМ

Рис 9. Влияние ионной силы на потенциал адсорбции AlPcS4 фталоцианина. Пустые кружки - 0,01 М KCl, заштрихованные кружки - 0,1 М KCl. Стандартные отклонения каждой точки изображены вертикальными чертами и рассчитывались по минимум пяти экспериментам на каждую точку.

Изучение транспорта синглетного кислорода через БЛМ.

В третьем разделе представлена работа по изучению фотодинамического окисления флоридина и транспорта синглетного кислорода через мембрану.При выяснении механизма разрушения клеток при применении фотосенсибилизаторов в медицине важным вопросом является определение доступности компонентов клетки для синглетного кислорода, образующемуся при возбуждении фотосенсибилизатора. Очевидно, что эффективность фотосенсибилизаторов зависит от проницаемости мембраны для синглетного кислорода, что недостаточно изучено из-за недостатка методов определения проницаемости. В настоящей работе предложен метод определения проницаемости мембраны для синглетного кислорода по степени асимметрии фотодинамической реакции разрушения мишеней, расположенных по обе стороны мембраны. Если фотосенсибилизатор находится на одной границе мембраны, синглетный кислород, образующийся при его возбуждении, может поражать мишень на той же стороне мембраны. Если мишень находится с противоположной стороны мембраны, скорость ее разрушения зависит от проницаемости мембраны для синглетного кислорода, которая таким образом может быть измерена по различию скорости окисления мишеней на противоположных границах мембраны.

Эта идея была реализована в работе (Sokolov, V.S. and Pohl, Р 2008) на примере фотодинамической реакции окисления флорицина, который является аналогом широко известного дипольного модификатора флоретина, но в отличие от него не способен проникать через мембрану (Соколов, В.С и др., 1984). Известно, что электронейтральные молекулы флорицина, адсорбируясь на БЛМ, создают на ее границе дипольный скачок потенциала, который можно измерить методом КВП (Соколов, B.C. и др., 1984). При введении флорицина в раствор с одной стороны БЛМ возникает разность граничных потенциалов (рис. 10). Одностороннее добавление в ячейку фталоцианина также приводило к появлению разности граничных потенциалов (см. раздел 2). Граничные потенциалы, создаваемые флорицином в отсутствие фталоцианина, так же как фталоцианином в отсутствие флорицина, при освещении не менялись. Однако, если в ячейке присутствовали одновременно фталоцианин и флорицин, то освещение приводило к уменьшению граничного потенциала, созданного флорицином. Фотоэффекты были различными в зависимости от того, находились ли флорицин и фталоцианин в одном отсеке ячейки (цис-фотоэффект), или в разных отсеках (трансфотоэффект). На рисунке 10 показана типичная кинетика транс-фотоэффекта, наблюдаемого на мембране, сформированной методом Мюллера-Рудина.

0 - Л флорицин

-20 -

-40 - темнота

-60 - AIPcS( 1

-80 - свет | |

О 50 100 150

t, мин

Рис.10. Кинетика изменения граничного потенциала, наблюдаемого при так называемом транс-фотоэффекте на мембране, сформированной методом Мюллера-Рудина, диаметр отверстия 1, 5 мм. Водный раствор содержал lOOmMKCl, 10 mM Hepes, pH 7,75.

В транс-конфигурации молекулы фталоцианина и флоридина не могут непосредственно взаимодействовать друг с другом, поскольку находятся на противоположных границах мембраны и не могут проникать через нее. Поэтому транс-фотоэффект можно объяснить, только предположив, что в реакции разрушения флорицина участвуют молекулы синглетного кислорода, образующиеся при освещении фталоцианина и способные проникать через мембрану. Предположение об участии в реакции синглетного кислорода подтверждается экспериментами. Было показано, что фотоэффект подавляется азидом натрия, который является тушителем синглетного кислорода. Более сильным ингибитором оказался убихинон Q2. На БЛМ, сформированной из смеси фосфатидилхолина с убихиноном, фотоэффект в трансконфигурации ослаблялся, причем величина ослабления была эквивалентна ослаблению освещения в десять раз (Sokolov, V.S. and Pohl, Р, 2008). Возможно, убихинон оказался столь эффективным потому, что он является липидорастворимым соединением и способен тушить синглетный кислород внутри мембраны, в то время как азид натрия является водорастворимым соединением и реагирует с синглетным кислородом преимущественно в водном растворе. В цис-конфигурации, где синглетный кислород не должен проникать через мембрану, чтобы реагировать с флорицином, убихинон не ослаблял фотоэффект. Количественно фотоэффект был измерен по относительной скорости изменения граничного потенциала в момент начала освещения R и по предельному изменению потенциала V при бесконечной длительности

освещения. Эти параметры определялись с помощью аппроксимации зависимости граничного потенциала от времени суммой двух экспонент.

d(Pb

Экспериментальные данные были объяснены с помощью модели фотодинамических реакций с участием флорицина и синглетного кислорода. Окисление флорицина на поверхности БЛМ приводит к образованию продукта, молекула которого имеет отличающиеся от флорицина дипольный момент и константу диссоциации. Продукт выходит из мембраны в раствор, а убыль флорицина на БЛМ компенсируется его адсорбцией из раствора. Модель позволила получить выражения для начальной скорости Я и предельной (при бесконечной скорости окисления) амплитуды Уцт фотоэффекта:

составляющие дипольного момента флорицина и продукта, Кд и КР - константы их диссоциации, Н - концентрация ионов водорода. Из этих формул видно, что величина фотоэффекта и его зависимость от pH находятся в соответствии с дипольными моментами флорицина и продукта, а также их констант диссоциации.

Оценка проницаемости БЛМ для синглетного кислорода, Рю, в соответствии с (SokoIov,V.S. and Pohl,P 2008) проводилась по формуле:

где ['ОД и ['02]2 - концентрации синглетного кислорода по одну и другую стороны мембраны. У-поток 'Ог сквозь мембрану.

В эксперименте определялось отношение скоростей окисления флорицина с двух сторон БЛМ, которое пропорционально отношению концентраций синглетного кислорода на границах:

где кр -скорость реакции, 'Ог концентрация синглетного кислорода, цА и цР нормальные

['02]i = Ü* l]02]t Rrtm,'

Исключить ['02]; и ['02]2 удалось, рассмотрев уравнение диффузии Б и тушения 1«} синглетного кислорода в воде около БЛМ. Пусть концентрация синглетного кислородах в растворе ['02](л:) является функцией координаты х -расстояния от границы мембраны. Тогда уравнение выглядит следующим образом,

Уравнение дополняется граничными условиями - закон Фика у поверхности БЛМ и нулевая концентрация ['02] на бесконечном расстоянии от БЛМ:

J - -D-

и ['02](*L = 0.

Из решения уравнения следует, что

Эти уравнения позволили получить простое выражение для оценки проницаемости БЛМ для синглетного кислорода

Р -ЛК.

ГУ

Из наших экспериментов было получено, что RcJRtrans Ä 3. Если использовать для оценки известные значения kq 3 х 105 с"1 (Rodgers, M.A.J, 1982; Krasnovsky, A.A., 1998) и D 4.75 х 10"5 см2 с"1 (Fischkoff, S., 1975), то Рю ~ 2 см/с.

Полученное значение проницаемости оказалось значительно ниже проницаемости БЛМ для обычного кислорода, которая, согласно данным, полученным методом ЭПР, составляет около 210 - 230 см/с (Subczynski, W. К., 1989; Dzikovski, В. G., 2003). Возможно это различие связано с тем, что синглетный кислород не только проникает через мембрану, но и подвергается тушению. Однако, как показали наши дальнейшие исследования, полученная

оценка оказалась заниженной, поскольку не учитывает, что как флорицин, так и продукт его окисления способны к латеральному обмену с окружающим мембрану тором.

Об участии латерального обмена свидетельствует обнаруженная нами зависимость фотоэффекта от размеров мембраны. Мы показали, что если сформировать мембрану методом Монталла на отверстии с диаметром около 0,1 мм, транс-фотоэффект пропадает, а цис-фотоэффект остается (рис.11).

| 0,10

0,05-

0,00

Цис

I.. 1

Транс Цис Транс

Рис.11 Сопоставления величин цис- (1,3) и транс-эффектов(2,4) в экспериментах на мембранах, сформированных методом Монталла (1,2) и мембранах, сформированных методом Мюллера-Рудина (3,4).

Главное отличие Монталловских мембран от мембран, сформированных методом Мюллера-Рудина в том, что в них отсутствует растворитель - декан. Чтобы проверить, влияет ли на фотоэффекты наличие растворителя, были сформированы «сухие» мембраны методом Мюллера-Рудина, которые не содержали декан. Для этого использовался раствор липидов в гексадекане, который не попадает в бислой, а концентрируется в области тора. Оказалось, что транс-фотоэффекты в таких мембранах также наблюдаются. Таким образом, исчезновение транс-фотоэффектов можно объяснить лишь малыми размерами Монталловских мембран (0,1 мм) по сравнению с Мюллеровскими (0,7-2,5 мм). Влияние размеров мембран на величину фотоэффекта было изучено в экспериментах на мембранах, сформированных методом Мюллера на отверстиях разного диаметра. Результаты представлены на рисунке 12. Видно, что величина транс-фотоэффекта практически линейно зависит от емкости мембраны, по величине которой можно судить о площади.

Впервые возможность латерального обмена между бислоем и тором была продемонстрирована в работе (Benz, 1973), где было показано, что удельная проводимость мембран при встраивании в них валиномицина из водного раствора зависела от площади. При больших отверстиях (более 3 мм) эта зависимость выходила на насыщение, и только в этих условиях (насыщения) величина проводимости определялась равновесным распределением валиномицина между мембраной и водой, при котором латеральным обменом можно было пренебречь. В случае же экспериментов на отверстиях, не превышающих 1,5 мм, которые использовались в наших экспериментах, латеральный обмен существенен.

Рис.12. Зависимость величины фотоэффекта от емкости мембраны, то есть, по сути, от «рабочего» размера отверстия.

В работе Benz, 1973, была выдвинута гипотеза, что латеральный обмен происходит вследствие непрерывного обновления липидного бислоя на границе с тором, в котором участвуют фосфолипиды. В наших экспериментах оказалось возможным это проверить, если использовать в качестве мишени синглетного кислорода ненасыщенные липиды. Для этого были сформированы несимметричные мембраны, один из монослоев которых состоял из DPhPC, а другой из DOPC. Известно, что в окислении может участвовать только липиды, содержащие ненасыщенные связи, поэтому окисление могло происходить только в монослое, содержащем ненасыщенный липид DOPC, и не происходило в другом монослое, сформированном из насыщенного липида DPhPC.

-20-1-1-1-1-1-

0 20 40 60 80 100

t, МИН

Рис. 13. Окисление ненасыщенных липидов. (1) Цис-сторона мембраны: DOPC(66%) и DOPE(33%), транс-сторона: DPhPC, (2) Цис-сторона мембраны: DPhPC, транс-сторона: DOPC(66%) и DOPE(33%). Водный раствор: 100 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7.5

Сначала добавляли фталоцианин со стороны монослоя DOPC (рис.13, кривая 1) мембраны и наблюдали его адсорбцию по изменению граничного потенциала. Затем освещали систему и наблюдали монотонное изменение потенциала, знак которого соответствовал положительному заряжению мембраны со стороны того монослоя, где находились ненасыщенные липиды. Рост потенциала можно объяснить тем, что при освещении появляются сшивки двойных связей липидов по свободнорадикальному механизму под действием синглетного кислорода, генеририруемого возбужденной молекулой фталоцианина. Так же, как и с флорицином, проводили два типа экспериментов: в одном фталоцианин находился со стороны монослоя DOPC, в другом со стороны насыщенного DPhPC. Оказалось, что фотоэффект наблюдался только в первом случае (кривая 1 на рисунке 13) и практически отсутствовал во втором (кривая 2). Таким образом, как в экспериментах с флорицином, так и с ненасыщенными липидами, «транс»-фотоэффект отсутствовал. Эти результаты означают, что с обеими мишенями причина отсутствия транс-фотоэффекта может быть одна и та же, а именно, продукты окисления мишени не удается обнаружить из-за того, что они исчезают вследствие латерального обмена между липидным биелоем и тором.

Синглетный кислород может проникать только через бислой, но не через тор, толщина

которого (порядка миллиметра) превышает длину его свободного пробега. Поэтому в условиях

наблюдения транс-фотоэффекта фотодинамические реакции происходят только на

поверхности бислоя, но не тора, где есть адсорбированные молекулы мишени. В этом случае из-за латерального обмена между бислоем и тором происходит отток продуктов окисления в тор и замена их на нативные молекулы мишени. Поскольку латеральный обмен происходит на границе между бислоем и тором, его эффективность зависит от размеров мембраны. В случае, если мембрана имеет очень маленький диаметр, латеральный обмен настолько эффективен, что не позволяет наблюдать фотоэффект, поскольку скорость образования продуктов окисления в бислое оказывается значительно ниже скорости их замены на нативные молекулы из тора.

В случае цис-фотоэффекта фотодинамические реакции окисления могут происходить на поверхности как бислоя, так и тора, поскольку он проницаем для света, а на его поверхности, как и на поверхности мембраны, находятся молекулы фотосенсибилизатора и мишени. В этом случае латеральный обмен ни к чему не приводит, так как поверхность тора содержит те же продукты окисления мишени, что и бислой. Тогда и усиление латерального обмена на мембранах малого размера не приводит к ослаблению фотоэффекта. Именно поэтому диаметр мембраны влияет только на транс-фотоэффекты, но не на цис-фотоэффекты.

Из данных экспериментов следует, что заниженная оценка проницаемости мембраны для синглетного кислорода связана с тем, что наша мембрана имела недостаточно большой диаметр, поэтому транс-фотоэффект занижался из-за латерального обмена продуктов окисления между бислосм и тором. Зависимость величины фотоэффекта от размеров мембраны не обнаружила насыщения, поэтому оценить проницаемость мембраны для синглетного кислорода в условиях, когда латеральным обменом можно пренебречь, не удалось. Таким образом, в результате проведенного исследования удается получить только нижнюю оценку этой проницаемости, то есть ее величина больше, чем 2 см/с. Более точную оценку данным способом можно получить только если удастся найти мишень с большей чувствительностью для синглетного кислорода, для которой эффектом латерального обмена можно будет пренебречь в экспериментах с реальными размерами мембраны.

ВЫВОДЫ

1) Изучено встраивание побочного продукта цикла зрительного родопсина А2Е в мембрану. Показано, что изменение граничного потенциала при встраивании А2Е в мембрану происходит в диффузном слое около мембраны, что говорит о том, что заряженная группа А2Е расположена вблизи границы раздела мембраны с раствором.

2) Показано, что граничный потенциал изменяется при освещении А2Е на поверхности мембраны в результате окисления А2Е кислородом с образованием нескольких

продуктов. Один из продуктов является гидрофильным и десорбируется с поверхности мембраны. По этой причине мембранная фототоксичность А2Е оказывается существенно более слабой, чем у известных фотосенсибилизаторов.

3) Изучена адсорбция на БЛМ различных аналогов фталоцианинов, различающихся числом сульфогрупп и атомом металла в центре молекулы. Показано, что адсорбция тетрасульфированных фталоцианинов происходит благодаря координационной связи атома металла с фосфатной группой фосфолипидов. Эффективность адсорбции разных аналогов фталоцианина коррелирует с их эффективностью как фотосенсибилизаторов.

4) Показано, что граничный потенциал, возникающий при адсорбции фталоцианинов, зависит от числа сульфогрупп в молекуле. В случае тетрасульфированного фталоцианина потенциал возникает в диффузном электрическом слое и может быть описан теорией Гуи-Чепмена. По мере уменьшения числа сульфогрупп в молекуле фталоцианина возрастает вклад дипольной составляющей граничного потенциала. В случае моносульфированного фталоцианина граничный потенциал оказывается чисто дипольным.

5) Изучено окисление флорицина синглетным кислородом, образующимся при фотовозбуждении фталоцианинов на поверхности мембраны с помощью регистрации изменений граничного потенциала при освещении. Окисление происходило не только в том случае, когда фотосенсибилизатор и мишень были расположены на одной границе мембраны (цис-фотоэффект), но и в том случае, когда они находились на противоположных границах мембраны (транс-фотоэффект), благодаря транспорту синглетного кислорода через мембрану. Показано, что транс-фотоэффект зависит от размеров БЛМ, из-за латерального обмена флорицина и продуктов его окисления между липидной мембраной и окружающим ее тором.

6) Обнаружено изменение граничного потенциала при фотоокислении липидов в несимметричных БЛМ, один из монослоев которых содержит насыщенные, а другой ненасыщенные липиды. Показано, что данный фотоэффект имеет место только в случае, если фотосенсибилизатор адсорбирован со стороны монослоя, содержащего ненасыщенные липиды.

7) Сделана оценка проницаемости мембраны для синглетного кислорода, основанная на сравнении скоростей окисления флорицина с двух сторон мембраны, величина проницаемости оказалась не менее 2 см/с. Эта оценка представляет собой только нижний предел, поскольку на величину фотоэффекта оказывает влияние латеральный обмен продуктов окисления мишени синглетным кислородом между липидным бислоем и тором.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соколенко, Е. А., Соколов, А. В., Финогенова, О. А., Соколов, В. С., Донцов, А. Е. Влияние продуктов фотолиза зрительного родопсина на бислойные липидные мембраны. 2, 458-459. 2004. Воронеж. 111 Съезд биофизиков России. 24-6-2004.

2. Sokolenko, Е. A., Sokolov, V. S., Sokolov, А. V., Finogenova, О. A., Dontsov, А. Е., Ostrovsky, M. A. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes. Eur.Biophys.J. 34[6], 772. 2005.

3. Sokolenko, E. A., Sokolov, V. S., Sokolov, A. V., Finogenova, O. A., Dontsov, A. E., Ostrovsky, M. A. Interaction of bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes. 236. 2005. 8lh International Frumkin Symposium "Kinetics of electrode processes", Moscow, 18 Oct - 22 Oct 2005. 18-10-2005.

4. Sokolov, V. S., Ayuan, A. G., Lenz, A. A., Sokolenko, E. A., Wiesner, В., Pohl, P. Membrane diffusion of singlet oxygen: bare lipid bilayers versus membranes reconstituded with aquaporin-1. Eur.Biophys.J. 34[6], 653. 2005.

5. Соколов,B.C., E.A.Соколенко, А.В.Соколов, О.А.Финогенова, А.Е.Донцов, and М.А.Островский. 2005. Взаимодействие бис-ретинилиден этаноламина (А2Е) с бислойными липидными мембранами в темноте и при действии света. Биологические мембраны 22:361-369.

6. Pashkovskaya,A.A., E.A.Sokolenko, V.S.Sokolov, E.A.Kotova, Y.N.Antonenko. 2007. Photodynamic activity and binding of sulfonated metallophthalocyanines to phospholipid membranes: Contribution of metal-phosphate coordination. Biochim. Biophys. Acta 1768:2459-2465.

7. Sokolenko, E. A., Pashkovskaya, A. A., Kotova, E. A., Sokolov, V. S., Antonenko, Yu. N. Interaction of sulfonated metallophthalocyanines with bilayer lipid membranes: photochemical activity versus adsorption on the membrane surface. Biophysical Journal. 2007.

8. Sokolov,V.S., E.A.Sokolenko, D.V.Filinsky, Yu.A.Ermakov, O.D.Lopina, H.-J.Apell. 2007. Electrostatic potentials created by membrane fragments with Na,K-ATPase adsorbed on lipid membranes. Eur. Biophys. J. 36:S88.

9. Sokolov,V.S., E.A.Sokolenko, A.V.Sokolov, A.E.Dontsov, Y.A.Chizmadzhev, M.A.Ostrovsky. 2007. Interaction of pyridinium bis-retinoid (A2E) with bilayer lipid membranes. J. Photochem. Photobiol. 86:177-185.

10. Соколов,B.C., Е.А.Соколенко, Д.В.Филинский, Ю.А.Ермаков, О.Д.Лопина, X.-Ю.Апель. 2007. Электрические потенциалы, возникающие при адсорбции фрагментов мембран с Na,K,ATP-a3oii на липидных бислоях. Биологические мембраны 24:333-347.

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата физико-математических наук, Соколенко, Елена Александровна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

§ 1. Основы фотодинамического воздействия. Классические фотосенсибилизаторы

1.1 Фотодинамическое воздействие сенсибилизаторов на клеточную мембрану.

1.2 Применение фотосенсибилизаторов в медицине. Основы метода фотодинамической терапии.

1.3 Использование фталоцианинов при ФДВ.

§ 2. Активные кислород-содержащие соединения - образование и биологическое действие в клетке

2.1 Кислород в живой клетке.

2.2 Активные формы кислорода.

§ 3. Патология зрительного цикла родопсина

3.1 Общие сведения о возрастной патологии зрительного цикла. Роль А2Е.

3.2 Влияние встраивания А2Е на стабильность мембраны.

3.3 Фотохимические свойства А2Е.

§ 4. Липидные бислои и граничные потенциалы

4.1. Бислоиная липидная мембрана как модель клеточной мембраны.

4.2 Методы измерения граничных потенциалов липидных бислоев.

4.3 Дипольные модификаторы.

4.4 Использование БЛМ для моделирования фотодинамических реакций. 57 Постановка задачи 60 Материалы и методы

1. Формирование мембран.

2. Экспериментальная установка, используемая в методе КВП.

3. Установка, используемая в электрокинетическом методе.

Результаты исследования и их обсуждение

§ 1. Изучение взаимодействия побочного продукта зрительного цикла родопсина А2Е с БЛМ.

1.1 Изучение встраивания А2Е в липидные мембраны.

1.1.1 Оценка площади, занимаемой молекулами Л2Е в лип идиом бислое, по данным электрокинетических измерений в суспензии липосом

1.1.2 Оценка степени погружения заряженной группы в 69 липидный матрикс.

1.2. Изучение Фотоэффектов в системе БЛМ/А2Е, БЛМ/эпокси-А2Е.

1.2.1 Кинетика адсорбции А2Е на БЛМ, и фотоиндуцированное 70 изменение граничного потенциала.

1.2.2 Влияние тушителей синглетного кислорода (NaN3) 76 и антиоксидантов (Butylated hydroxytoluene).

§ 2. Изучение механизма адсорбции металлофталоцианинов на БЛМ.

2.1 Влияние атома металла фталоцианина на его адсорбцию на БЛМ.

2.2 Влияние ионной силы раствора.

2.3 Влияние числа сульфогрупп в молекуле фталоцианина.

§ 3. Фотодинамическое окисление флорицина и транспорт синглетного кислорода через мембрану.

3.1. Оценка проницаемости БЛМ для синглетного кислорода по асимметрии реакции окисления флорицина на противоположных границах мембраны

3.2. Латеральный обмен флорицина и продуктов его окисления между бислоем и тором.

Введение диссертация по химии, на тему "Межфазные потенциалы, возникающие при фотосенсибилизированных окислительных реакциях на поверхности БЛМ"

Окисление жизненно важных молекул в мембране активными формами кислорода, образующимися при фотовозбуждении фотосенсибилизаторов (ФС), лежит в основе метода фотодинамической терапии раковых заболеваний. По схожему механизму происходит деградация мембранных структур зрительной системы продуктами, образованными в результате метаболизма зрительного родопсина [53]. Наибольшее значение в этих процессах имеет синглетный кислород, первичной мишенью которого в клетках являются мембранные белки и липиды [35]. Несмотря на интенсивные исследования, которые проводятся в течение ряда лет, многие аспекты, касающиеся фотодинамического окисления компонентов мембраны активными формами кислорода, образующимися в присутствии ФС, остаются неизученными. В частности, недостаточно изучено связывание мембраны с ФС, а также проницаемость мембраны для кислорода и его короткоживущих активных форм: синглетного и супероксидного радикалов. Изучение механизмов фотодинамических реакций на уровне организмов или отдельных клеток затруднено из-за сложности их строения. Поэтому представляется целесообразным проводить исследования на искусственных модельных системах, наиболее изученной из которых является БЛМ. В течение ряда лет на БЛМ проводились исследования, в которых исследовались фотодинамические реакции разрушения встроенных в мембрану молекул - мишеней активными формами кислорода (АФК), образующимися при освещении БЛМ с ФС. При этом использовались мишени, которые создают индуцированную проводимость БЛМ. Разрушение таких мишеней регистрировалось с помощью электрических измерений по уменьшению проводимости БЛМ при освещении в присутствии фотосенсибизаторов.

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия ФС с мембранами, а также фотодинамических окислительных реакций на поверхности мемраны. В ней применены электрохимические методы, позволяющие измерять межфазные скачки потенциалов на границе мембраны с водой. Применение этих методов, а также накопленная в течение многих лет методика исследования адсорбции заряженных и дипольных молекул на поверхности БЛМ, позволили изучить механизмы связывания ФС с БЛМ, а также фотодинамических окислительных реакций, в частности, сделать оценку проницаемости БЛМ для синглетного кислорода.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§1. Основы фотодинамического воздействия. Классические фотосенсибилизаторы.

Заключение диссертации по теме "Электрохимия"

выводы

2) Показано, что граничный потенциал изменяется при освещении А2Е на поверхности мембраны в результате окисления А2Е кислородом с образованием нескольких продуктов. Один из продуктов является гидрофильным и десорбируется с поверхности мембраны. По этой причине мембранная фототоксичность А2Е оказывается существенно более слабой, чем у известных фотосенсибилизаторов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автору хотелось бы выразить благодарность и искреннюю признательность научному руководителю Валерию Сергеевичу Соколову, без всесторонней помощи и поддержки которого данная работа не была бы завершена. Автор выражает самую искреннюю признательность Юрию Александровичу Чизмаджеву за постоянное внимание и неоценимую поддержку в работе над диссертацией. За всестороннюю помощь, постоянное внимание и плодотворные дискуссии по проблемам данной работы хотелось бы выразить особую благодарность Финогеновой Ольге Александровне. Автор также признателен Юрию Александровичу Ермакову за ценные замечания и советы в процессе подготовки диссертации. Особенную благодарность хотелось бы выразить Ленцу Александру Александровичу. Так же хотелось бы поблагодарить весь коллектив лаборатории биоэлектрохимии, особенно Константина Павлова, Соколова Алексея, Батищева Олега и Князева Дениса. За содействие и ценные советы в вопросах А2Е и зрительного родопсина хочется поблагодарить коллектив лаборатории М.А. Островского, в первую очередь, ее руководителя - академика РАН Михаила Аркадьевича Островского, а также Александра Евгеньевича Донцова и Татьяну Борисовну Фельдман.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе для регистрации адсорбции и фотодинамических реакций на БЛМ был применен электрохимический подход. Данный подход позволил решить ряд задач.

Во-первых, изучен механизм взаимодействия побочных продуктов зрительного родопсина с БЛМ. Изучена их адсорбция и их способность к автоокислению, то есть служить мишенью для АФК, генерируемых самим продуктом под действием света.

Во-вторых, были изучены классические фотосенсибилизаторы, используемых при ФДТ раковых клеток, такие, как фталоцианины. Изучен механизм их адсорбции на БЛМ. Заключительная часть работы посвящена изучению такого важного параметра как проницаемость мембраны для АФК. От ее величины зависит доступность компонентов клеточной мембраны для АФК и в конечном итоге эффективность фотосенсибилизаторов, применяемых в фотодинамической терапии. Для определения проницаемости БЛМ для синглетного кислорода нами был предложен подход, основанный на сравнении скорости окисления молекул - мишеней на противоположных сторонах мембраны. Мишенью служила амфифильная молекула флорицина, которая адсорбируется на одной из границ мембраны и не способна проникать сквозь нее. Скорость разрушения флорицина определялась по изменению создаваемого им дипольного потенциала на границе мембраны с водой. К сожалению, оказалось, что на измеряемую в эксперименте скорость окисления флорицина оказывает существенное влияние латеральный обмен как самого флорицина, так и продуктов его окисления между липидным бислоем и окружающим его тором. Это привело к существенному занижению оценки проницаемости мембраны для синглетного кислорода, фактически, удалось установить не саму проницаемость, а только ее нижний предел. Тем не менее, в работе сделан важный шаг вперед и установлен критерий, который позволяет определить эффективность латерального обмена: для того, чтобы этим эффектом можно было пренебречь, необходимо, чтобы скорость окисления мишени не зависела от размеров мембраны. Это можно сделать либо увеличивая размер мембраны, либо увеличивая скорость окисления, например, найдя другую мишень, способную к окислению с большей скоростью.

Подход, основанный на измерении разности граничных потенциалов БЛМ, может быть использован также для создания тест-системы, позволяющий оценить эффективность различных ФС. Известно, что она определяется способностью ФС встраиваться в мембрану и квантовым выходом синглетного кислорода. Менее очевидным является влияние липидного окружения и положения молекулы фотосенсибилизатора в мембране на его эффективность. Данный подход позволяет выяснить роль этих факторов, сравнивая скорости фотодинамического разрушения мишеней в присутствии различных фотосенсибилизаторов на БЛМ с различным липидным составом.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата физико-математических наук, Соколенко, Елена Александровна, Москва

1. Абидор И.Г., Айтьян С.Х., Черный В.В., Черномордик Л.В., Чизмаджев Ю.А. Измерение внутримембранного скачка потенциала потенциодинамическим методом // Доклады АН СССР 1979. - Т. 245. - С. 977-981.

2. Болдырев А.А . Окислительный стресс и мозг // Соросовский образовательный журнал -2001.-Т. 7.-С. 21-28.

3. Alvarez О., Latorre R. Voltage-dependent capacitance in lipid bilayers made from monolayers //Biophys. J. 1978. - V. 21. - P. 1-17.

4. Andersen O.S., Finkelstein A., Katz I., Cass A. Effect of phloretin on the permeability of thin lipid membranes // J. Gen. Physiol 1976. - V. 67. - P. 749-771.

5. Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. Generation of potential in bilayer lipid membranes as a result of proton-transfer reactions in the unstirred layers // J. Bioenergetics and Biomembranes 1982. - V. 14. - P. 457-465.

6. Apel K., Hirt H. Reactivc oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction // Annu. Rev. Plant Biol. 2004. - V. 55. - P. 373-399.

7. Apell H.J., Bamberg E., Alpes H. Dicarboxylic acid analogs of gramicidin A: dimerization kinetics and single channel properties // J. Membr. Biol. 1979. - V. 50. - P. 271-285.

8. Arend O., Wciter J.J., Goger D.G., Delori F.C. In vivo fundus fluorescence measurements in patients with age related macular degeneration. // Ophthalmologe 1995. - V. 92. - P. 647653.

9. Auler H., Banzer G. Untersuchung uber die Rolle der Porphyrine bei geschwulstkranken Menschen und Tieren // Z. Krebsforsch. 1942. - V. 53. - P. 65-68.

10. Babakov A.V., Ermishkin L.N., Liberman E.A. Influence of electric field on the capacilty of phospholipid membranes. //Nature 1966. - V. 210. - P. 953-955.

11. Ben Hur E., Malik Z., Dubbelman T.M., Margaron P., АН H., Van Lier J.E. Phthalocyanine-induced photohemolysis: structure-activity relationship and the effect of fluoride //

12. Photochem. Photobiol. 1993. - V. 58. - P. 351-355.

13. Ben Shabat S., Parish C.A., Hashimoto M., Liu J.H., Nakanishi K., Sparrow J.R. Fluorescent pigments of the retinal pigment epithelium and age-related macular degeneration //Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2001. - V. 11. - P. 1533-1540.

14. Ben Shabat S., Parish C.A., Vollmer H.R., Itagaki Y., Fishkin N., Nakanishi K., Sparrow J.R. Biosynthetic studies of A2E, a major fluorophore of retinal pigment epithelial lipofuscin // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 7183-7190.

15. Benz R., Frohlich O., Lauger P. Influence of membrane structure on the kinetics of earner-mediated ion transport through lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta 1977. - V. 464. - P. 465-481.

16. Benz R., Frohlich O., Lauger P., Montal M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers // Biochim. Biophys. Acta 1975. - V. 394. - P. 323334.

17. Benz R., Stark G., Janko K., Lauger P. Valinomycin-mcdiated ion transport through neutral lipid membranes: influence of hydrocarbon chain length and temperature // J. Membr. Biol. -1973.-V. 14.-P. 339-364.

18. Bermann M., Schutt F., Holz F.G., Kopitz J. Does A2E, a retinoid component of lipofuscin and inhibitor of lysosomal degradative functions, directly affect the activity of lysosomal hydrolases? // Exp. Eye Res. 2001. - V. 72. - P. 191-195.

19. Cantrell A., McGarvey D.J., Roberts J., Sarna Т., Truscott T.G. Photochemical studies of A2-E // J. Photochem. Photobiol. В 2001. - V. 64. - P. 162-165.

20. Carius W. Studies of nonlinear electrical effects of model membranes // Biophys Struct. Mech. 1977. - V. 3. - P. 327-328.

21. Cseh R., Benz R. The adsorption of phloretin to lipid monolayers and bilayers cannot be explained by langmuir adsorption isotherms alone // Biophys. J. 1998. - V. 74. - P. 13991408.

22. Dartsch P.C., Wunderlich K., Ben Hur E. Aluminium phthalocyanines-induced photolysis of human vascular wall cells in culture and the effect of fluoride on photodynamic action // Coron. Artery. Dis. 1994. - V. 5. - P. 851-855.

23. De S., Sakmar T.P. Interaction of A2E with model membranes. Implications to the pathogenesis of age-related macular degeneration // J. Gen. Physiol 2002. - V. 120. - P. 147-157.

24. Delori F.C., Dorey C.K., Staurenghi G., Arend O., Goger D.G., Weiter J.J. In vivo fluorescence of the ocular fundus exhibits retinal pigment epithelium lipofuscin characteristics // Invest Urol. 1995. - V. 36. - P. 718-729.

25. Delori F.C., Fleckner M.R., Goger D.G., Weiter J.J., Dorey C.K. Autofluorescence distribution associated with drusen in age-related macular degeneration // Invest Urol. -2000.-V. 41.-P. 496-504.

26. Diamond I., Granelli S.G., McDonagh A.F., Nielsen S., Wilson C.B., Jaenicke R. Photodynamic therapy of malignant tumours // Lancet 1972. - V. 2. - P. 1175-1177.

27. Dougherty T.J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumors // Photochem. Photobiol. 1987. - V. 45. - P. 879-889.

28. Dubbelman T.M., Van Steveninck J. Photodynamic effects of hematoporphyrin-derivative on transmembrane transport systems of murine L929 fibroblasts // Biochim. Biophys. Acta -1984.-V. 771.-P. 201-207.

29. Duprat F., Guillemare E., Romey G., Fink M., Lesage F., Lazdunski M., Honore E. Susceptibility of cloned K+ channels to reactive oxygen species // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1995. - V. 92. - P. 11796-11800.

30. Dzikovski B.G., Livshits V.A., Marsh D. Oxygen permeation profile in lipid membranes: comparison with transmembrane polarity profile // Biophys. J. 2003. - V. 85. - P. 10051012.

31. Eldrcd G.E., Miller G.V., Stark W.S., Feeney-Burns L. Lipofuscin: resolution of discrepant fluorescence data // Science 1982. - V. 216. - P. 757-759.

32. Ermakov, Yu, Sokolov, V. S., Boundary potentials of bilayer lipid membranes: methods and interpretations . In: Tien, H. T. and Ottova, A., Planar lipid bilayers (BLMs) and their applications, Elsevier, 2003, 109-141.

33. Красновский, А. А. мл. 1990. Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. ВИНИТИ, Москва.

34. Красновский А.А.мл. Фософоресцентный анализ синглетного молекулярного кислорода в фотохимических системах. // Биологические мембраны 1998. - Т. 15. - С. 530-548.

35. Feeney-Burns L., Neuringer М., Gao C.L. Macular pathology in monkeys fed semipurified diets // Prog. Clin. Biol. Res. 1989. - V. 314. - P. 601-622.

36. Ferraudi G., Arguello G.A., Ali H., Van Lier J.E. Types I and II sensitized photooxidation of aminoacid by phthalocyanines: a flash photochemical study // Photochem. Photobiol. -1988. -V. 47.-P. 657-660.

37. Figge F.H.J., Weiland G.S., Manganiello O.J. Cancer detection and therapy. Affinity of neoplastic, embryonic, and traumatized tissues for porphyrins and metalloporphyrins // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1948. - V. 68 . - P. 640-641.

38. Fischkoff S., Vanderkooi J.M. Oxygen diffusion in biological and artificial membranes determined by the fluorochrome pyrene // J Gen. Physiol 1975. - V. 65. - P. 663-676.

39. Fishkin N., Jang Y.P., Itagaki Y., Sparrow J.R., Nakanishi K. A2-rhodopsin: a new fluorophore isolated from photoreceptor outer segments // Org. Biomol. Chem. 2003. - V. l.-P. 1101-1105.

40. Foote C.S. Mechanisms of photosensitized oxidation. There are several different types of photosensitized oxidation which may be important in biological systems // Science 1968. -V. 162.-P. 963-970.

41. Franklin J.C., Cafiso D.S. Internal electrostatic potentials in bilayers: measuring and controlling dipole potentials in lipid vesicles // Biophys. J. 1993. - V. 65. - P. 289-299.

42. Girotti A.W. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems // Photochem. Photobiol. 1990. - V. 51. - P. 497-509.

43. Grossweiner L.I., Patel A.S., Grossweiner J.B. Type I and type II mechanisms in the photosensitized lysis of phosphatidylcholine liposomes by hematoporphyrin // Photochem. Photobiol. 1982. - V. 36. - P. 159-167.

44. Haydon D.A., Hladky S.B. Ion transport across thin lipid membranes: a critical discussion of mechanisms in selected systems // Q. Rev. Biophys 1972. - V. 5. - P. 187-282.

45. Henderson B.W., Owczarczak В., Sweeney J., Gessner T. Effects of photodynamic treatment of platelets or endothelial cells in vitro on platelet aggregation // Photochem. Photobiol. 1992. - V. 56. - P. 513-521.

46. Hladky S.B. The energy barriers to ion transport by nonactin across thin lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta 1974. - V. 352. - P. 71-85.

47. Holz F.G., Schutt F., Kopitz J., Eldred G.E., Kruse F.E., Volcker H.E., Cantz M. Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin // Invest Urol. 1999. - V. 40. - P. 737-743.

48. Маркин B.C., Портнов В.И., Симонова M.B., Соколов* B.C., Черный B.B. Теория переноса ремантадина- и его аналогов через мембраны внутриклеточный сдвин рН неперемешиваемые слои и мембранные потенциалы // Биологические мембраны -1987.-Т. 4.-С. 502-523.

49. Маркин, В. С., Чизмаджев, Ю. А. 1974. Индуцированный ионный транспорт. Наука, Москва.

50. Островский М.А. Молекулярные механизмы повреждающего действия света на структуры глаза и системы защиты от такого повреждения // Успехи биологической химии 2005. - Т. 45. - С. 173-204.

51. Jastrow Н., Vollrath L. Anatomy online: presentation of a detailed WWW atlas of human gross anatomy—reference for medical education // Clin. Anat. 2002. - V. 15. - P. 402-408.

52. Kanofsky J.R., Sima P.D., Richter C. Singlet-oxygen generation from A2E // Photochem. Photobiol. 2003. - V. 77. - P. 235-242.

53. Koolman J., Roehm K.H. 2005. Color atlas of biochemistry .

54. Kunz L., Stark G. Photodynamic membrane damage at the level of single ion channels // Biochim. Biophys. Acta 1997. - V. 1327. - P. 1-4.

55. Kunz L., Stark G. Photodynamic membrane damage st the level of single ion channels // Biochim. Biophys. Acta 1998. - V. 1327. - P. 1-4.

56. Kunz L., Zeidler U., Haegele K., Przybylski M., Stark G. Photodynamic and radiolytic inactivation of ion channels formed by gramicidin A: oxidation and fragmentation. // Biochemistry 1995.-V. 34.-P. 11895-11903.

57. Latorre R., Hall J.E. Dipole potential measurements in asymmetric membranes // Nature -1976.-V. 264.-P. 361-363.

58. Lesslauer W., Richter J., Lauger P. Some electrical properties of bimolecular phosphatidyl inositol membranes //Nature (London) 1967. - V. 213. - P. 1224-1226.

59. Levy J.G. Photosensitizers in photodynamic therapy. // Semin. Oncol. 1994. - V. 21. - P. 410.

60. Lipson R.L., Baldes E.J., OLSEN A.M. The use of a derivative of hematoporhyrin in tumor detection//J Natl. Cancer Inst. 1961.-V. 26. - P. 1-11.

61. MacDonald R.C., Barigham A.D. Comparison of double layer potentials in lipid monolayers and lipid bilayers membranes // J. Membrane Biol. 1972. - V. 7. - P. 29-53.

62. Malkov D.Y., Sokolov V.S. Fluorescent styryl dyes of the RH series affect a potential drop on the membrane/solution boundary // Biochem. Biophys. Acta 1996. - V. 1278. - P. 197204.

63. Maulik N., Engelman R.M., Rouson J.A. Ischemic preconditioning reduces apoptosis by upregulating Anti-death gene Bcl-2 // Circulation. 1999. - V. 100 . - P. 369-375.

64. McLaughlin, S., Electrostatic Potentials at Membrane-Solution Interfaces. In: Current Topics Membranes and Transport, ed. by Bronnen, F. and Kleinzeller,A. New York, 1977, 71-144.

65. McLaughlin S.G., Szabo G., Eisenman G., Ciani S.M. Surface charge and the conductance of phospholipid membranes //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1970. - V. 67. - P. 1268-1275.

66. Melnik E., Latorre R., Hall J.E., Tosteson D.C. Phloretin-induced changes in ion transport across lipid bilayer membranes // J. Gen. Physiol 1977. - V. 69. - P. 243-257.

67. Meyer-Betz F. Untersuchung uber die biologische (photodynamische) Wirkung des Hamatoporphyrins und anderer Derivate des Blut- und Gallenfarbstoffs // Dtsch. Arch. Klin. Med. 1913. - V. 112. - P. 476-503.

68. Molday L.L., Rabin A.R., Molday R.S. ABCR expression in foveal cone photoreceptors and its role in Stargardt macular dystrophy // Nat. Genet. 2000. - V. 25. - P. 257-258.

69. Montal M., Mueller P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and study of their electrical properties. // PNAS USA 1972. - V. 69. - P. 3561-3566.

70. Mueller P., Rudin D.O., Tien F.T., Wescott W.C. Methods for the formation- of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution7/ J. Phys. Chem. , 1963. - V.67. - P. 534-535.

71. Muller P.J., Wilson B.C. Photodynamic therapy of malignant primary brain tumours: clinical effects, post-operative ICP, and light penetration of the brain // Photochem. Photobiol. 1987. - V. 46. - P. 929-935.

72. Muller R.U., Finkelstein A. The effect of surface charge on the voltage-dependent conductance induced in thin lipid membranes by monazomycin // J. Gen. Physiol 1972. - V. 60.-P. 285-306.

73. Симонова M.B., Черный B.B., Донат E., Соколов B.C., Маркин B.C. Граничные потенциалы на бислойной мембране в присутствии ремантадина. Анализ трех методов измерения //Биологические мембраны 1986. - Т. 3. - С. 846-857.

74. Niedre М., Patterson M.S., Wilson B.C. Direct Near-infrared Luminescence Detection of Singlet Oxygen Generated by Photodynamic Therapy in Cells In Vitro and Tissues In Vivo // Photochemistry and Photobiology 2002. - V. 75. - P. 382-391.

75. Соколов B.C., Кузьмин В.Г. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока // Биофизика 1980. - Т. 25. -С. 170-172.

76. Соколов B.C., Черный В.В., Маркин B.C. Измерение скачков потенциала при адсорбции флоретина и флорецина на поверхности липидных мембран методом компенсации внутримембранного поля // Биофизика 1984. - Т. 29. - С. 424-429.

77. Соколов B.C., Черный В.В., Симонова М.В., Маркин B.C. Распределение потенциала на границе мембрана/раствор при адсорбции амфифильных ионов // Биологическиемембраны 1990. - Т. 7. - С. 872-884.

78. Стожкова И.Н., Мирский В.М., Сито Т.В. Фотосенсибилизированное разрушение бислойной липидной мембраны в присутствии диметилового эфира гематопорфирина //Биологические мембраны 1991. - Т. 8. - С. 412-418.

79. Стожкова И.Н., Черный В.В., Соколов B.C. Транспорт диметилового эфира гематопорфирина через бислойную липидную мембрану // Биологические мембраны -1995.-Т. 12.-С. 200-207.

80. Стожкова И.Н., Черный В.В., Соколов B.C., Ермаков Ю.А. Адсорбция гематопорфиринов на плоской бислойной мембране // Биологические мембраны -1997. Т. 14.-С. 310-323.

81. Nseyo U.O., Dougherty T.J., Sullivan L. Photodynamic therapy in the management of resistant lower urinary tract carcinoma // Cancer 1987. - V. 60. - P. 3113-3119.

82. Ohki S., Sauvc R. Surface potential of phosphatidylserine monolayers. 1. Divalent ion binding effect. // Biochim. Biophys. Acta 1978. - V. 511. - P. 377-387.

83. Paardekooper M., De Bruijne A.W. Van Steveninck J., Van den Broek P.J. Inhibition of transport systems in yeast by photodynamic treatment with toluidine blue // Biochim. Biophys. Acta 1993.-V. 1151.-P. 143-148.

84. Parish C.A., Hashimoto M., Nakanishi K., Dillon J., Sparrow J. Isolation and one-step preparation of A2E and iso-A2E, fluorophores from human retinal pigment epithelium // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1998. - V. 95. - P. 14609-14613.

85. Passechnik V.I., Hianik T. Elastic properties of the bilayer membranes in the direction perpendicular to the membrane plane // Kolloidn. Zh. 1977. - V. 38. - P. 1180-1185.

86. Pawlak A., Rozanowska M., Burke J.M., Sarna Т., Simon J.D. Role of A2E in photoreactivity of lipoftiscin granules // Invest Urol. 2002. - V. 43. - P. U1301-U1301.

87. Pickar A.D., Benz R. Transport of oppositely charged lipophylic probe ions in lipid bilayer membranes having various structures // J. Membrane Biol. 1978. - V. 44. - P. 353-376.

88. Pohl P., Rokitskaya T.I., Pohl E.E., Saparov S.M. Permeation of phloretin across bilayer lipid membranes monitored by dipole potential and microelectrode measurements // Biochim. Biophys. Acta 1997. - V. 1323. - P. 163-172.

89. Policard A. Etudes sur les aspects offerts par des tumeurs experimentales examines a la lumiere de Wood // CR Soc. Biol. 1924. - V. 91. - P. 1423-1424.

90. Pooler J. Light-induced changes in dye-treated lobster giant axons // Biophys. J. 1968. - V. 8.-P. 1009-1026.

91. Pooler J.P. The kinetics of colloid osmotic hemolysis. II. Photohemolysis // Biochim. Biophys. Acta 1985. - V. 812. - P. 199-205.

92. Pooler J.P., Valenzeno D.P. The role of singlet oxygen in photooxidation of excitable cell membranes //Photochem. Photobiol. 1979. - V. 30. - P. 581-584.

93. Pottier R., Truscott T.G. The photochemistry of haematoporphyrin and related systems // Int. J Radiat. Biol. Relat Stud. Phys. Chem. Med. 1986. - V. 50. - P. 421-452.

94. Reddi E., Lo C.G., Biolo R., Jori G. Pharmacokinetic studies with zinc(II)-phthalocyanine in tumour-bearing mice // Br. J Cancer 1987. - V. 56. - P. 597-600.

95. Reszka K., Hartley J.A., Lown J.W. Photosensitization by selected anticancer agents // Biophys Chem. 1990. - V. 35. - P. 313-323.

96. Reyes J., Motais R., Latorre R. Phloretin and phloretin analogs: mode of action in planar lipid bilayers // J. Membrane Biol. 1983. - V. 72. - P. 93-103.

97. Rezk B.M., Haenen G.R., van der Vijgh W.J., Bast A. The antioxidant activity of phloretin: the disclosure of a new antioxidant pharmacophore in flavonoids // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 295. - P. 9-13.

98. Ricchelli F., Jori G., Moreno G., Vinzens F., Salet C. Factors influencing the distribution pattern of porphyrins in cell membranes // J Photochem. Photobiol. В 1990. - V. 6. - P. 6977.

99. Roberts W.G., Berns M.W. In vitro photosensitization I. Cellular uptake and subcellular localization of mono-L-aspartyl chlorin e6, chloro-aluminum sulfonated phthalocyanine, and photofrin II // Lasers. Surg. Med. 1989. - V. 9. - P. 90-101.

100. Rodgers M.A.J., Snowden P.T. Lifetime of singlet oxygen in liquid water as determined by time resolved infrared luminescence measurements. // J. Am. Chem. Soc. 1982. - V. 104. -P. 5541-5543.

101. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A. The interaction of phthalocyanine witlh planar lipid bilayers. Photodynamic inactivation of gramicidin channels // FEBS Lett. 1993. -V. 329.-P. 332-335.

102. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A. Photodynamic inactivation of gramicidin channels:a flash- photolysis study // Biochim. Biophys. Acta 1996. - V. 1275. - P. 221-226.

103. Rokitskaya T.I., Block M., Antonenko Y.N., Kotova E.A., Pohl P. Photosensitizer binding to lipid bilayers as a precondition for the photoinactivation of membrane channels // Biophys. J 2000. - V. 78. - P. 2572-2580.

104. Schweitzer C,, Schmidt R. Physical mechanisms of generation and deactivation of singlet oxygen// Chem. Rev. 2003. - V. 103. - P. 1685-1757.

105. Shaban H., Gazzotti P., Richter C. Cytochrome с oxidase inhibition by N-retinyl-N-retinylidene ethanolamine, a compound suspected to cause age-related macula degeneration // Arch. Biochem. Biophys. 2001. - V. 394. - P. 111-116.

106. Shapovalov V.L., Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Krokhin O.V., Antonenko Y.N. Effect of fluoride anions on gramicidin photoinactivation sensitized by sulfonated aluminum phthalocyanines // Photochem. Photobiol. 2001. - V. 74. - P. 1-7.

107. Skulachev V.P. Programmed death in yeast as adaptation? // FEBS Lett. 2002. - V. 528. -P. 23-26.

108. Sokolov V.S., Block M., Stozhkova I.N., Pohl P. Membrane Photopotential Generation by Interfacial Differences in the Turnover of a Photodynamic Reaction // Biophys. J. 2000. -V. 79.-P. 2121-2131.

109. Sokolov V.S., Pohl P. Membrane transport of singlet oxygen monitored by dipole potential measurements // Biophys. J. 2009. - V. 96. - P. 77-85.

110. Sonoda M., Krishna C.M., Riesz P. The role of singlet oxygen in the photohemolysis of red blood cells sensitized by phthalocyanine sulfonates // Photochem. Photobiol. 1987. - V. 46. -P. 625-631.

111. Sparrow J.R., Cai B. Blue light-induced apoptosis of A2E-containing RPE: involvement of caspase-3 and protection by Bcl-2 //Invest Urol. 2001. - V. 42. - P. 1356-1362.

112. Sparrow J.R., Fishkin N., Zhou J., Cai В., Jang Y.P., Krane S., Itagaki Y., Nakanishi K. A2E, a byproduct of the visual cycle // Vision Res. 2003. - V. 43. - P. 2983-2990.

113. Sparrow J.R., Parish C.A., Hashimoto M., Nakanishi К. A2E, a lipofuscin fluorophore, in human retinal pigmented epithelial cells in culture // Invest Urol. 1999. - V. 40. - P. 29882995.

114. Sparrow J.R., Zhou J., Cai B. DNA is a target of the photodynamic effects elicited in A2E-laden RPE by blue-light illumination // Invest Urol. 2003. - V. 44. - P. 2245-2251.

115. Spikes J.D. Phthalocyanines as photosensitizers in biological systems and for the photodynamic therapy of tumors // Photochem. Photobiol. 1986. - V. 43. - P. 691-699.

116. Stark W.S., Miller G.V., Itoku K.A. Calibration of microspectrophotometers as it applies to the detection of lipofuscin and the blue- and yellow-emitting fluorophores in situ // Methods Enzymol. 1984. - V. 105. - P. 341-347.

117. Starkus J.G., Rayner M.D., Fleig A., Ruben P.C. Fast and slow inactivation of sodium channels: effects of photodynamic modification by methylene blue // Biophys. J. 1993. - V.65.-P. 715-726.

118. Stuhmer W., Aimers W. Photobleaching through glass micropipettes: sodium channels without lateral mobility in the sarcolemma of frog skeletal muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1982. - V. 79. - P. 946-950.

119. Subczynski W.K., Hyde J.S., Kusumi A. Oxygen permeability of phosphatidylcholine-cholesterol membranes //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1989. - V. 86. - P. 4474-4478.

120. Szabo G. Dual mechanism for the action of cholesterol on membrane permeability // Nature- 1974.-V. 252.-P. 47-49.

121. Tappeiner, H, V., Jodbauer, A. 1907. Die sensibilisierende wirkung fluoreszierender Substanzen. Vogel FCW, Leipzig.

122. Tarr M., Arriaga E., Valenzeno D. Progression of cardiac potassium current modification after brief exposure to reactive oxygen // J Mol. Cell Cardiol. 1995. - V. 27. - P. 1099-1109.

123. Tarr M., Valenzeno D.P. Modification of cardiac ionic currents by photosensitizer-generated reactive oxygen // J Mol. Cell Cardiol. 1991. - V. 23. - P. 639-649.

124. Valenzeno D.P. Photomodification of biological membranes with emphasis on singlet oxygen mechanisms // Photochem. Photobiol. 1987. - V. 46. - P. 147-160.

125. Wainwright M. J. Antimicrob. Chemother. 1998. - V. 42. - P. 13-28.

126. Wang C.C., Bruner L.J. Lipid-dependent and phloretin-induced modifications of dipicrylamine adsorption by bilayer membranes // Nature 1978. - V. 272. - P. 268-270.

127. Watson B.D., Haynes D.H. Structural and functional degradation of Ca2+:Mg2+-ATPase rich sarcoplasmic reticulum vesicles photosensitized by erythrosin В // Chem. Biol. Interact.- 1982.-V. 41. -P. 313-325.

128. Yoon M., Cheon Y., KimD . Absorption and fluorescence spectroscopic studies on dimerization of chloroaluminum (III) phthalocyanine tetrasulfonate in aqueous alcoholic solutions // Photochem. Photobiol. 1993. - V. 58. - P. 31-36.

129. Чизмаджев, Ю. А., Черномордик, JI. В., Пастушенко, В. Ф., Абидор, И. Г., Электрический пробой бислойных липидных мембран. В сборнике Ионные каналы и их модели. Серия Итоги науки и техники. Биофизика мембран. Москва, Наука, 1982, 161-266.