Характеристика биотехнологических дисперсных систем методами магнитного резонанса тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

пб ОД

У ^ Ч»Ц и • •

На правах рукописи

РОДИН ВИКТОР ВАСИЛЬЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ДИСПЕРСНЫХ СИСТЕМ МЕТОДАМИ МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА

02.00.1! - Коллоидная хи!.ь 02 00.06 - Химия высокомолекулярных ннений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА- 1997

Работа выполнена в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова

Научный консультант: доктор химических наук профессор В.Н.Измайлова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А. Е. Чалых.,

доктор химических наук, профессор И.А.Василенко

доктор биологических наук, профессор В.К.Мазо

Ведущая организация: Российский Государственный Химико-технологический Университет им.Д.И.Менделеева

Зашита состоится " " 1997 года в 7 ^чаеоя на заседай

Диссертационного Совета Д 063.41.05 при Московской Государствен! Академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: 1175' Москва, пр.Вернадского, д.86, МИТХТ им. М.В.Ломоносова

С диссертацией можно ознакомитьтся в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносов по адресу: 119831, Москва, Г-435, М.Пироговская ул., д.1а.

Автореферат разослан О/ _ 199.7

Ученый секретарь ~ п Диссертационного Совета ---- И.А.Грицкова

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕ.НЫ.

Бурное развитие нозон и современные направления классической биотехнологии ставят перед специалистами по коллоидной химии задачи исследования бпотехнологически.х дисперсных систем. которые широко реализуются на различных

технологических стадиях или. являются формой готового продукта Поскольку вода является дисперсионной средой большого числа подобных систем, для управления их свойствами особую „к~уольчость имеют исследования с использованием методов магнитного резонанса. Кроме того, методы магнитного резонанса дозволяют детально изучить процессь: формирования и факторы стабилизации таких дисперсий.

Использование методов магнитного резонанса позволяет существенно дополнить системные характеристики классических биотехнологических дисперсий. Прежде всего это относится к оценке состояния стабилизатора и компонентного состава межфазных адсорбционных слоев (MAC) в эмульсиях, стабилизированных ja счет структурно-механического барьера. Для дисперсных систем па основе интерполимерных комплексов (ИПК) ка í% носителем лекарственных веществ в препаратах пролонгированного действия взжнеишк.чи вопросами являются получение количественных оценок межмолекулярных ¿.аимпаействии 1в системах полимер-полимер, полимер-вода, полимер-лекарственное вещество} и закономерностей регулируемом доставки активных компонентов.

Высокая эффективность методов магнитного резонанса позволяет существенно продвинуться в разработке актуальных вопросов, связанных с эксплуатацией и повышением качества ряда биотехнологических дисперсий. К ним относятся: повышение устойчивости клеточных суспензий к экстремальным факторам воздействия (низкие температуры, циклы замораживания-высушивания, низкие влажности и другие), управление ДНК-мембранными контактами (при разработке генных лекарственных средств), целенаправленное использование солей-плавителей в технологии приготовления плавленых сыров (управление структурными переходами с целью получения продуктов с;; ? а и. tb и ц е с к о г о назначения)

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью работы является систематическое исследование методами магнитного резонанса состояния стабилизатора и компонентного состава межфазных

стабилизирующих слоев в эмульсиях, целостности ИПК и особенностей взаимодействия в полимерных матрицах, процессов разрушения и факторов стабилизации липидных бислоев клеточных мембран, а также изучение механизмов образования ДНК-мембранных контактов для разработки научных основ повышения устойчивости биотехнологических дисперсий к экстремальным факторам воздействия и улучшения свойств носителей биологически активных веществ и при создании лекарственных препаратов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Для различных программ низкотемпературных воздействий, моделирующих основные стадии технологического цикла обработки биопрепаратов, обнаружено повышение устойчивости лиофильных коллоидных систем (везикул) при введении дисахаридов (трегалозы и сахарозы). Предложен механизм стабилизации бислоя мембран, заключающийся в вытеснении дисахаридами молекул воды с поверхности бислоя и предотвращении кристаллизации воды вблизи его поверхности. Полученные ЯМР-данные позволили оценить нарушения мембран при различных режимах замораживания биотехнологических клеточных систем.

Методами радиоспектроскопии установлены функциональные изменения крови (активирование процессов окисления липидов и изменения водопроницаемости мембран эритроцитов) в условиях стрессовых воздействий, а также снятие этих эффектов под действием адаптогенных препаратов.

Выявлено изменение распределения молекул воды по подвижности в процессах инактивации спор в препаратах и высушенных образцах концентратов клеточной биомассы.

Впервые показано, что клатратообразование ксенона в воде при давлении -0.2 МПа и температуре -275 К сопровождается образованием дисперсных систем, в которых частицы дисперсной фазы представлены разветвленной решеткой кристаллогидратов с характеристическими размерами ~1-ь10 мим. Показано, что на концентрацию дисперсной фазы влияют добавки третбутилового спирта и макромолекул белков. Предложен способ замораживания клеточных систем, альтернативный низкотемпературным режимам обработки.

Методами магнитного резонанса показано, что устойчивый контакт ДНК или полинуклеотидов с бислойной липидной мембраной (БЛМ) зависит от липидного состава бислоя и присутствия ионов магния. Выявлена степень возмущения молекул в бислое при образовании тройных комплексов.

Впервые ксмпifKc ЯМР-.методов (ЯМР-релаксация, ЯМР-высокого разрешения, CP'MAS ЯМР-епектроскопия и метод импульсного градиент«») использован для характеристики различных типов ИПК в водных дисперсиях, а также в мягких (гели) и твердых (таблетки) лекарственных формах Выявлена связь структуры ИПК кичетнчсскнин характеристиками активного компонента в лекарственных препаратах. По данным времен релаксации и коэффициентов еамодиффузии водь: а гелях релкосшитой полиакриловой кислоты (ПАК) показано, что подвижность молекул воды в рецептурах мягких лекарственных форм определяется соотношением пропиленгликоля и триэтаколамина.

Впервые на примере межфазных адсорбционных слоев (MAC) желатины, формирующихся на границе раздела бензол-водный раствор желатины в условиях сильной стабилизации эмульсий за счет структурно-механического барьера по Ребиндеру показано включение бензола в состав MAC. Получены данные о конформационном переходе желатины (клубок-коллагеноподобная спираль) при образовании MAC.

В рамках модели ЯМР-релаксзиии воды в гетерогенных системах определено распределение воды в белковой структуре сычужных сыров и в связнодиспереной системе плавленых сыров.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Практическое значение имеют разработанные способы стабилизации биоколлоидных дисперсий (везикулы, клетки) добавками диеахаридов (сахароза, трегалоза) или с помощью дисперсий клатратов ксенона Предложен экспресс-метод (на основе ЯМР-парамагнитного допинга) оценки клеточных повреждений (нарушений мембранной проницаемости) при двучэтапном замораживании микрорганизмов.

Разработаны принципы экспресс-анализа крови при стрессовых воздействиях с помощью методов магнитного резонанса

На основе метода CP/MAS разработан способ определения структуры ИПК из комплементарных полимеров в твердых лекарственных формах. При подборе водорастворимых компонентов алч мягких лекарственных форм предлагается использовать данные времен релаксации и коэффициентов самодиффузии как по.<роляютие обнаружить противоположное влияние добавок (I' ооп и л ei !гл и коль к триэтаноламин в гелях редкосшитой ПАК) на подвижность молекул воды

Практическое значение для фармакологии, офтальмологии, пищевой промышленности и производства кино-фотоматериалов имеют результаты изучения устойчивых эмульсий.

стабилизированных синтетическими или природными полимерами (редкосшитой ПАК или желатиной). Показаны: управление состоянием воды, анализ многокомпонентное™ MAC, а также кокформационного состояния и структуры стабилизирующей пленки биополимера.

Полученные данные по распределению воды в структуре сычужных и плавленых сыров позволили уточнить механизм плавления и имеют практическую важность как для контроля процесса получения плавленых сыров, так и для надежного подбора солей-плавителей на предприятиях молочной промышленности.

АВТОР ЗАЩИЩАЕТ:

1. Результаты системной характеристики комплексом ЯМР-методов различных типов ИПК в водных дисперсиях, а также в мягких (гели) и твердых (таблетки) лекарственных формах. Метод контроля стабильности ИПК в твердых формах. Характеристики взаимодействия лекарственное вещество-полимерная матрица и подвижности воды в мягких лекарственных формах.

2. Специфическое изменение воды в эмульсиях типа масло/ вода, стабилизированных редкосшитой ПАК в зависимости от объемной доли масляной фазы. Включение в состав MAC компонента масляной фазы, конформационный переход желатины (стабилизатора) при формировании MAC.

3. Закономерности изменения бислойных мембран, установленные методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, в различных программах низкотемпературного воздействия. Стабилизирующее действие дисахаридов. Оптимизированные режимы замораживания.

4. Образование дисперсных систем кристаллогидратов ксенона в воде, закономерности изменения состояния воды в них в присутствии добавок различной природы. Разработанный новый способ замораживания клеточных культур, альтернативный низкотемпературному замораживанию.

5 Подходы методов магнитного резонанса в изучении свойств мембран эритроцитов и белков плазмы крови при стрессе и изменения подвижности воды при инактивации спор в условиях низкой влажности биотехнологических дисперсий.

6. Установленные методами магнитного резонанса закономерности, определяющие связывание ДНК и полинуклеотидов с БЛМ.

7. Закономерности изменения свойств воды в дисперсной системе сыров при их плавлении. Особенности образования структур плавленого сыра как концентрированных эмульсий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались и обсуждались на Всесоюзном семинаре "Изменение структуры и свойств волы и водных систем под влиянием физико-химических воздействий" 'Киев. 1980), на Всесоюзном отраслевом совещенип "Методы радиоспектроскопии в биофизике клетки" (Оболенск, I'.'S'i). и;; 1 -ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва. 1982), на 5-и и б и Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 19S4, 1938). 2-й Всесоюзной конференции гго теоретическим и прикладным вопросам криобиологии (Харьков, 1984), на 2-й Всесоюзной конференции по анабиозу (Рига, 1984), конференциях Молодых ученых химического факультета МГУ (Москэа, 1984, 1985), научной конференции Казанского института биологии (Казань, 1985), Международном симпозиуме по гидратации биополимеров (Пущино, 1988), на 5-й конференции Молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), 2-м и 7-ом Всесоюзных симпозиумах "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1981, 1989). Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения м и кроо чологическ их средств защиты растений" (Велигож, 1989), Всесоюзно;: отраслевой конференции "Методы радиоспектроскопии ч биотехнологии" (Оболенск, 1990V 4-й Всесоюзной конференции "Водорастворимые полимеры и их применение" (Иркутск, 1991), 9-м Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Звенигород, 1991). на Всесоюзной конференции 'Современные направления рзззития биотехнологии" (Москва. 1991), Международной школе-семинаре "Современные проблемы физической химии макромолекул" (Москвя-Пущино. 1991), на Российской научной конференции "Создание лекарственных средств" (Купавна, 1992), на Международном научном семинаре "Достижения 'Н-ЯМР спектроскопии мозга" (Оксфорд, 1992), на 15-й и 16-й Международных конференциях по магнитному резонансу 8 биологических системах (Израиль. 1992: Голландия, 1994), на 11-й и 12-й конференциях Международного общества магнитного резонанса (Берлин, 1992; Нью-Йорк, 1993), на 10-й .Международной конференции Европейского общества магнитного piMoiunca г> медицине и биологии (Рим, Италия, май 1993), на Международной конференции "Liposomes as Biomiroetics" (Рим. Италия, июнь 1993), на 13-й Европейской конференции по химии поверхностей (Киев, 1994), на 10-м и 11-м Международных симпозиумах по поверхностно-активным веществам в растворе (Каракас, Венесуэла, 1994; Иерусалим, Израиль. 1996). на Песковских чтениях (Москва, РГХТУ им. Д.И.Менделеева, 1994), на Ломоносовских чтениях (Москва, МГУ им. М.В.Ломоносова,

s

апрель 1994), на научной конференции "Коллоидная химия в странах СНГ" (Москва, июнь 1994), на научной сессии физико-химии поверхностно-активных веществ научного совета по коллоидной химии и физико-химической механике (Санкт-Петербург, апрель 1995), на Международной мемориальной (памяти Зимкина) конференции по фотографической желатине (Казань, 1995), на Международной конференции "Вшсо11о1(1-95" (Киев, 1995), на 11-й Международной конференции по Поверхностным силам (Москва, июнь 1996), на 13-й Международной конференции Европейского общества магнитного резонанса в медицине и биологии (Прага, Чехия, сентябрь 1996), на 7-й Международной конференции по коллоидной химии (Эгер, Венгрия, сентябрь 1996), на семинарах лаборатории коллоидной химии и кафедры коллоидной химии химического факультета МГУ.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 72 работы.

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ автора являлось основополагающим на всех стадиях работы и состояло в формировании научного направления, постановке задач и целей исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов и механизмов, выполнении эксперимента и формулировании выводов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, б глав, выводов и библиографии из 291 ссылки. Работа изложена на 278 страницах, содержит 16 таблиц и 52 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1.1 .Методы магнитного резонанса, используемые в работе. 1) ЯМР -релаксация. Измерение времен спин-спиновой (То -последовательность импульсов 90°-т-180°, либо серия Карра-Парселла-Мейбума-Гилла (КПМГ)) и спин-решеточной релаксации (Т|- последовательность импульсов 90°-т-90°); определение молекулярной подвижности (вращательной и трансляционной); температурные зависимости Т( и Тг- Оценка конформационных и структурных переходов. Измерение коэффициентов самодиффузии О (методика импульсного градиента магнитного поля). Оценка распределения воды в дисперсных системах.

2) ЯМР-метод "парамагнитного допинга" (добавки ионов парамагнитных металлов). Разделение вкладов внутри- и

о

внеклеточной воды, оценка "водопроницаемости мембран и взаимодействий компонентов различном природы с БЛМ. 3) ЯМР-высокого разрешения в жидкостях (на ядрах !Н. i3C, 31Р) Измерение химических сдвигов, интенсивности и ширины линии. Оценка образования комплексов и конформационных переходов.

4) ЯМР-высокого разрешения в твердом теле (CP-MAS ЯМР-спектроскопия) Измерение ширины и формы линии, расщепление сигналов. Характеристика комплексообразования в твердых телах

5) Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) с регистрацией сигналов свободных радикалов, ионов металлов и спиновых меток. Оценка концентраций металл-ссленлащих белков при различных формах окисления : структура воды, межмолекулярные взаимодействия биополимеров. Микроокружение зондов в мембранах.

Дополнительно использовались методы: ИК-спектроскопия, турбодиметрия, дифференциально-сканирующая калориметрия.

1.2. Объекты исследования.

1.2.1. Везикулы - замкнутые бислойные липидные мембраны (БЛМ) Везикулы из яичного лецитина, а также везикулы из днмнрчстоилфосфлткдилхолина (ДМФХ) и дипальмитоил-фоефаткдил.\ал»на (ДПФХ) получали по стандартным методикам в ¿иле дисперсии в роде Изучены 1) особенности образования контактов везикул с неспецифическои и специфической ДНК (тим\ сной, плазмидной и из нуклеопротеидов спермы лосося), а также с аналогами ДНК - Полинуклеотидачи (полиадениловая [поли-А| и полиуридиловая |поли-У| кислоты); 2) влияние на стабильность БЛМ различных режимов низкотемпературного воздействия; 3) ингибирование дисахаридзми (трегалоза, сахзроэа) разрушения БЛМ при низкотемпературных воздействиях. 1.2 2 Микроорганизмы ; суспензии клеток бактерий E.colL, споры Bacillus thuringiensis, препараты на их основе (дендробациллин, лепидоцид). Использованы для изучения ряда экстремальных воздействий на целостность БЛМ и клеточных оболочек (замораживание, оттаивание, высушивание, концентрирование, низкие влажности). Использованы также при разработке нового способа замораживания биотехнологических структур в дисперсиях клатратоа ксенона

! 2 3 Дисперсии клатратов ксенона 8 воде. Исследованы условия образования дисперсий, регулирование степени связывания воды добавками третбутилового спирта (ТБС) и бел к ов. Использованы для разработки альтернативного низкотемпературным воздействиям способа "замораживания" биосистем выше 0°С.

1.2.4. Интерполимерные комплексы (ИПК) - как полимерные матрицы для лекарств пролонгированного действия. Изучены ИПК: полиметакриловая кислота-полиэтиленгликоль (ПМАК-ПЭГ). полиакриловая кислота-ПЭГ (ПАК-ПЭГ), ПМАК-полидиметиламино-этилметакрилат (ПМАК-ПДМАЭМ). Изучены ИПК в твердых фазах, а также индивидуальные полимерные компоненты в водных растворах. Изучены особенности взаимодействия полимерной матрицы (ПМАК-ПЭГ) с лекарственными веществами (ЛВ) (теофиллин и аминазин). Изучены носители ЛВ для мягких лекарственных форм: редкосшитая ПАК в присутствии добавок триэтаноламина (ТЭА) и пропиленгликоля (ПГ), а также в условиях формирования эмульсий типа масло/вода при диспергировании редкосшитой ПАК, воды и вазелинового масла (ВМ).

1.2.5. Эмульсии масло/вода. Изучено образование MAC биополимеров на жидких границах раздела фаз углеводород (бензол) - раствор желатины и компонентный состав MAC в условиях сильной стабилизации прямых эмульсий за счет структурно-механического барьера по Ребиндеру.

1.2.6. Плазма крови и эритроциты. С целью регистрации биохимических процессов, возникающих в результате экстремальных воздействий на организм, анализировали кровь мышей (контроль и после перегрузок вращения). Изучена роль адапто-генных препаратов (аскорбиновая и у-аминомасляная кислоты).

1.2.7. Сыры (сычужные и плавленые). Изучено изменение состояния воды в процессе плавления белкового каркаса сычужных сыров с солями-плавителями (триполифосфат натрия, лимоннокислые натрий и калий).

2. ОБРАЗОВАНИЕ ДИСПЕРСИЙ ГАЗОГИДРАТОВ (КЛАТРАТОВ) КСЕНОНА ПО ДАННЫМ МЕТОДА ЯМР-РЕЛАКСАЦИИ.

2.1. Клатраты ксенона в воде. Некоторые газы, в том числе инертные, образуют клатратные соединения "включения" при температурах выше 0°С и относительно невысоких давлениях (0.10.5 МПа) за счет стерического эффекта гостевых молекул. Показано, что образование газовых гидратов сопровождается процессами, во многом сходными с наблюдаемыми при замораживании: появляется твердая фаза, а растворенные вещества вытесняются в жидкую, при этом подвижность молекул воды снижается. В зависимости от условий атомы ксенона занимают определенное число малых (0.48-0.52 нм) и больших (0.59-0.69 нм) полостей, определяя тем самым "жесткость" клатратной решетки и стабилизируя льдоподобную структуру воды. При статическом способе получения клатратов (выдерживание избытка воды под

давлением газа 0 1-0 3 МПа при температуре 278 К) образуется система "мягкой " кг.гтргтнои решетки: -70% жидкой"воды и -30% кристаллического "клатратного" льда). Показано, что спад свободной индукции (ССИ) в водных системах с клатратами ксенона имеет две компоненты (з отличие от однокомпонентного ССИ протонов в исходной воде с То -2.0-2.5 с), которые отнесены к протонам клатратов (Т;. =10 мкс) и жидкой волы (То ~ 0.7-! О с). Результаты свидетельствуют о понижении подвижности молекул воды в клатратных структурах примерно на пять порядков Оценка состояния газовых гидратов я воде (степени неоднородности системы, формирующейся при клатрэтообразозании) проведена методом спин-спиновой релаксации в рамках модели пористых сред, заполненных жидкостью, или твердых частиц в жидкости [Glasse!, Lee; Манк). Градиент магнитного поля вблизи поверхности частицы описывается уравнением: G » it 5H0(xv,s - Xv,m)/ro (1), где Н0 - внешнее однородное поле, %v,s - удельная магнитная восприимчивость твердой частицы, Xv,m " удельная магнитная восприимчивость жидкой среды (для воды Xv.m = -0.72»10"6 см3/г, для ксенона Xs.s - -0.5!»¡0"fi см3/г), ru - радиус частицы. Скачок поля на границе раздела фаз вода-кристаллы клатратов ксенона в \словиях эксперимента составлял ~(3 8-5.7МО"' Гс При возникновении градиента магнитного поля G в последовательности КПМГ время спин*спиновой релаксации Тгк после образования клатратов представляется как: TL>h = (Т2о)/! 1+(1 3)у2 D Сг? т~ TL>01 - (2). где у - гиромагнитное отношение для протонов, D-коэффициент самодиффузии зоды; т - время между lS0°-.vn импульсами в последовательности КПМГ; Т20 - время спин-спиновой релаксации воды до образования клатратов. С учетом экспериментальных данных для Ток и Тг0 (при т =0.1-г1 мс) выражение для величины градиента магнитного поля принимает вид: G2 к 3/(y2 D х2 Т2о) - (3). Комбинация (1)- (3) позволяет оценить размеры частиц клатратов ксенона: -1-10 мкм. Использование зависимости длины свободного пробега "х" (среднеквадратичного трансляционного смещения молекул воды) от коэффициента трансляционной самодиффузии D воды при измерении T¿ в зависимости от т подтвердило справедливость вышеприведенных оценок клатратных неоднородностей. Таким образом, можно заключить, что "мягкая" клатратная решетка представляет собой тонкодисг.ерсную систему, частицы дисперсной фазы в которой представлены клатратами ксенона, диспергированными в жидкой воде. Образование дисперсных систем газовых гидратов ранее не рассматривалось. В связи с этим, при оценке

возможностей использования клатратов ксенона для стабилизации биоколлоидных систем основное значение приобретает изучение факторов, определяющих свойства и структуру дисперсий ксенона. Модифицирующее влияние на дисперсии клатратов ксенона изучали при формировании клатратов в растворах ТБС и глобулярных белков.

2.2. Клатраты ксенона в растворах ТБС.

На основании работ по изучению аномального поведения водных растворов ТБС при малых концентрациях (менее 0.1 мол.доли): флуктуаций концентраций, скачков теплоемкости, диэлектрической релаксации предполагалось, что молекулы ТБС, неполярная часть которых не превышает размеров полостей клатратной решетки воды, формируют клатратные структуры. Это свойство позволяет исследовать особенности клатратообразования ксенона в присутствии ТБС. Поскольку данные по изучению клатратообразования ТБС в воде методами магнитного резонанса отсутствовали, представляло интерес сначала охарактеризовать эту двухкомпонентную систему методами ЯМР-релаксации и ЯМР-высокого разрешения. Исследования проведены в широкой области концентраций ТБС от 0 до 1 мол.доли в интервале температур 278292 К. Использованные подходы позволили регистрировать индивидуальные вклады групп СНз и ОН.

В области малых концентраций спирта (до 0.16 мол.доли) снижение времени спин-решеточной релаксации (Т[) групп ОН более чем в 4 раза (Рис. 1) служит указанием на образование клатратной структуры ТБС в воде. Зависимость энергии активации переориентации молекул воды от концентрации ТБС (по температурным зависимостям Ti и Тг сигналов ОН-групп) имеет экстремальный характер с максимальным значением Еа=39.8 кДж/моль при концентрации спирта 0.05 мол.доли. Аналогичный характер носит зависимость энергии активации от концентрации ТБС, построенная на основании общего пула протонов водных растворов ТБС. С учетом зависимости энергии активации переориентации СНз групп спирта (рис.1) можно заключить, что основное снижение подвижности в клатратных структурах ТБС-вода связано с молекулами воды. Полученные результаты подтверждают, что в этой области концентраций ТБС (0.05-0.07 мол.доли) образуются наиболее прочные клатратные ячейки из молекул воды. При хТбс=0.17 мол.доли в смесях ТБС-DгО был обнаружен минимум коэффициента самодиффузии, характеризующий низкую трансляционную подвижность молекул ТБС в водных комплексах (5-6 молекул воды на 1 молекулу ТБС).

ю

C-itofim

Рис.1. Зависимости времеп сшш-решегточной релаксации Tt (с) протонов групп CHj (1-3) н ОН (4-7) при 278 (4). 2S3 (1. 5), 287

(2, б) и 292 К (3, 7) я виергии ахтизлцки переориентации групп CHj (8) и ОН (9) от хокцентрацкн слзкрта з смеси TBC-HDO.

Рис.2, Температурные

зависимости времен спин-решеточной релаксации Т( (мс) быстрой компоненты (1) и времен спин-спиновой

релаксации Tj (мс) средней компоненты (2) для протонов полимера в растворах ПМАК-DjO (0.7 M); степень ионизации а "O.S.

Полученные результаты подтвердили концентрационное изменение устойчивости гидратных комплексов ТБС: при 0.05 мод. доли ТБС -наиболее прочные клатратные ячейки, при 0.16 мол доли - дестабилизация клатратных структур с образованием ассоциатов клатратов; при дальнейшем увеличении концентрации ТБС в системе исчезают упорядоченные структуры. ЯМР-данные позволяют также заключить, что при образовании клатратных структур вода-ТБС в системе всегда присутствуют свободные молекулы воды и спирта.

Клатратообразование ксенона в водных растворах ТБС изучено при концентрации спирта ~ 0.05-0.06 мол.доли. В этих условиях .в двух компонентной системе образуются наиболее стабильные пираты ТБС При выдерживании смесей ТБС-водз под давлением ксенона 1 МПа при температуре 277 К в трехксмпонектной системе обнаружено образование смешанных клатратных комплексов. Исследование ЯМР-релаксации протонов в системе ТБС-ксенон-вода в диапазоне температур 273-288 К обнаружило отсутствие свободных молекул воды и спирта. Около 55% " всех молекул воды входит в клатратные структуры,

характеризующиеся временами спин-решеточной релаксации -17 мс (~13%) и ~55 мс (~42%), а остальные 45% - соответствуют молекулам воды в клатратах ксенона (Т2 ~ 10-15 мкс). Фаза свободной воды (с временами релаксации порядка 1 с или выше) отсутствует в трехкомпонентной клатратной системе при повышении температуры вплоть до 288 К. когда начинается плавление любых клатратных комплексов ксенона. Полученные результаты раскрывают механизм управления свойствами газовых гидратов (ингибирование структурообразования в концентрированных дисперсиях) и обосновывают эмпирический способ введения добавок спиртов для предотвращения образования газогидратов, нарушающих транспорт природного газа.

2.3. Клатраты ксенона в водных растворах биополимеров и суспензиях клеток.

Образование смешанных клатратов ксенона было изучено также в растворах белков и суспензиях клеток. Клатраты ксенона существенно изменяют структуру и свойства жидкой воды: они как бы "замораживают" дисперсную систему при температурах выше 0°С, тем самым делая ее устойчивой к экстремальным факторам воздействия. В присутствии ксенона молекулы воды вблизи поверхности белковой глобулы могут быть перестроены в гидратные микрокристаллы. Показано, что это происходит прежде всего в областях "клатратоподобных" участков воды, где не требуется значительных перестроек водородных связей. Для исследованных белков (сывороточный альбумин, яичный альбумин, лизоцим и рибонуклеаза) максимальная клатрато-образующая способность в системе ксенон-вода-белок была выявлена для рибонуклеазы, поверхность глобулы которой по числу гидрофобных групп в 1.7 раза превышает ее внутреннюю часть. Количественное определение клатратообразования ксенона в водных растворах глобулярных белков предложено использовать при тестировании поверхности белковых глобул для выявления гидрофобных областей. При образовании клатратов ксенона в растворе белка доля жидкой воды уменьшается, что сопровождается увеличением концентрации белка, коррелирующим с увеличением скорости продольной и поперечной релаксации протонов воды. Кривые сигналов спинового эха протонов растворов сывороточного альбумина, как и при образовании клатратов ксенона в них, разлагались на 3 компоненты, характеризующиеся тремя различными значениями Т-2-

Методом ЯМР "парамагнитного допинга" при изучении клатратообразования ксенона в суспензиях бактериальных клеток обнаружено, что клатраты ксенона образуются, в основном, во

внеклеточной среде. В результате этого повышалась ос.молярность внеклеточной среды, что приводило к сжатию и дегидратации клеток. Показано. что ксенон увеличивает водопроницаемость мембран бактериальных клеток. Результаты согласуются с литературными сведениями о влиянии анестетических газоз на проницаемость мембран Изменяя содержание ксенона и его клат-¡>3 708 в дисперсиях клеток возможно регулировать проницаемость клеточных мембран (в условиях кристаллизации воды), вероятность образования внутриклеточного льда и. соответственно, устойчивость или повреждение клеток при их охлаждении.

3. СВОЙСТВА ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ В РАСТВОРАХ И

ТВЕРДОФАЗНЫХ СТРУКТУРАХ ПРИ ОБРАЗОВАНИИ ИНТЕРПОЛИМЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ КАК ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ.

3.1. Молекулярная динамика полиэлектролитов и их комплексов в растворах.

3.1.1. Полиметакриловая и полиакриловая кислоты.

Взаимодействие с полиэтилен гликолем.

Интерполимерные комплексы (ИПК) как продукт реакции между двумя комплементарными полимерами часто выступают в качестве полимерных носителей различных биологически активных соединений (Зезин. Кабанов. Паписов, Кеменова! и используются при разработке препаратов пролонгированного действия. Носители получают, как правило, с использованием поликарбоновых кислот (ПМАК или ПАК) и ПЭГ Молекулярно-динамические характеристики ПАК и ПМАК в водных системах и ИПК этих поликислот с ПЭГ получены с помощью методов ЯМР-релаксации.

Для ПАК на температурной зависимости Tj в координатах Аррениуса обнаружен минимум вблизи -303 К. Соответствующие температурные зависимости Tj протонов ПМАК в области 270-330К не обнаружили аномалий при степенях ионизации (а) от 0 до 0.5. Однако, при а=0 5 обнаруживается излом на температурной зависимости компоненты Тг основной полимерной цепи ПМАК вблизи -290 К (Рис 2), что позволяет определить для ПМАК два значения энергии активации переориентации макромолекул' Еа| = 6 ! 1 кДж/моль (290-315 К) и Е,2 = 46 05 кДж/моль (270-289 К). При «=0 5 агрегации. ПМАК не происходит, однако структурный температурный переход сопровождается (как и в случае ПАК) перераспределением населенности обеих компонент Т^ протонов полимера. Обнаруженное уменьшение амплитуды сигнала свободной индукции (сокращение доли короткой компоненты

полимера) после 90°-го импульса обуславливается снижением подвижности макромолекул и возрастанием межмолекулярного торможения развернутых полимерных цепей ПМАК. При этом часть сигнала протонов ПМАК "вытеснялась" в область "мертвого времени" релаксометра (Тг~10 мкс). Область медленных движений макромолекул ПМАК определяется температурным поведением коротких Тг-компонент протонов полимера. При а=0 на температурной зависимости быстрой компоненты Тг наблюдается минимум при -308 К, а при а=0.5 - излом вблизи ~290 К. Температурные измерения компонент времен ЯМР-релаксации Т[ и Тг обнаруживают изменение степени агрегации и конформационного состояния макромолекул при ионизации поликислот (рис.2). Поликислоты претерпевают конформационные изменения при варьировании степени ионизации и в ИПК (данные ЯМР высокого разрешения на 'Н и 13С).

Изучение ЯМР-параметров ПМАК и ПАК в комплексе с ПЭГ обнаружило, что кривые спада поперечной и восстановления продольной намагниченности в образцах ПЭГ-ПМАК-Д2О или ПЭГ-ПАК-Д2О разлагались на три экспоненциальные компоненты, одна из которых отражает состояние протонов воды и протонов обмена, а две другие - отнесены к протонам полимерных цепей и характеризуют их быстрые и медленные движения. Молекулярная подвижность макромолекул ПЭГ в дейтерированной воде близка к подвижности макромолекул в водных растворах ИПК. Снижение времен релаксации и изменение энергий активации Еа в области Т<306 К (например, по данным Т2) от 23.1 кДж/моль до 18.04 кДж/моль и 18.2 кДж/моль при переходе к смешанным полимерным системам с ПАК и ПМАК, соответственно, связано с повышением вязкости системы.

Характеристики внутренних движений макромолекул в системах поликислота-ПЭГ-вода по данным методов ЯМР-релаксации указывают на растворение или распад ИПК. Этот вывод подтвержден методом 'Н и |3С-ЯМР-высокого разрешения в растворах. Установлено также, что конформационное состояние ПМАК в ИПК зависит от условий растворения ИПК. 3.1.2. Взаимодействие ПМАК и ПДМАЭМ.

Согласно работам Зезина, Кеменовой, Кабанова для создания макромолекулярных дозирующих систем используются нестехиометрические ИПК, стабилизированные ионными связями (например, композиционный полимерный носитель из ПМАК (м.м.=250 ООО) и полидиметиламиноэтилметакрилата (ПДМАЭМ. м.м.=70 ООО). Особенности структуры таких ИПК и кинетика их образования зависят от концентрации реагентов.

При низких концентрациях компонентов (< 0.01 о-м/л) в результате реакции образуется равновесный ИПК с максимальным числом иктерполимерных солевых связей, тогда как при больших концентрациях компонентов (0.01-0.03 о-м/л) возникает неравновесный (с большой долей дефектов) ИПК, представляющий собой сетчатый полимер. В связи с особой ролью воды в структуре сетки ИПК при высвобождении лекарственного вещества (ЛВ) из полимерной матрицы растзоры комплексов ПМАК-ПДМАЭМ были охарактеризованы методами ЯМР-релаксации. В образцах ИПК обнаружена тяердосЬазная компонента сигнала свободной индукции (ССИ). населенность которой аозрастала от 20 % до 40 % при изменении концентрации ИПК в растворе от 5.86 до 22 3 % Этот сигнал обусловлен протонами с сильно заторможенной подвижностью, характерной для узлов сетки ИПК и двутяжных участков связанных комплементарных макромолекул. Релаксационные данные (Т| и Tj от концентраций комплекса ПМАК-ПДМАЭМ в растворе) свидетельствуют об изменении подвижности молекул воды и соответствуют релаксационному механизму: l/T2=I/T2W +пь/(т +Т2ь) (4),

где I -премя снин-с пиновой релаксации протонов свободной воды, Т,п, - время спин-спиновой релаксации протонов связанной воды, пь - число молекул связанной воды, т -время обмена между свободным и связанным состояниями Температурные зависимости времен релаксации ИПК выявили различные типы движений молекул волы, преобладающие в определенном температурном интервале (ниже и выше 20°С) Энергии активации, соответствующие каждому температурному интервалу, указывают на разную степень переориентации молекул воды в системе, соответственно, ниже и выше 20°С.

Обнаруженные изменения свойств растворителя (воды)

зависят от структуры сетки ИПК и выступают факторами

регулирования высвобождения ЛВ из полимерной матрицы.

3.2. Структура и свойства интерполимерных комплексов в

твердых фазах.

3.2.1. ИПК ПМАК-ПЭГ.

Конденсированное состояние ИПК (ПМАК-ПЭГ) изучено методом ;3C-CP/MAS ЯМР. Показано, что свойства ИПК как полимерных носителей зависят от способа их получения, а также тстачовлено. что структурные особенности ИПК обуславливают чмиег.гческие зависимости высвобождениия ЛВ из полимерной матрицы. Такие зависимости составляют основу для решения задачи регулируемой доставки лекарственных веществ (Чучалин. Кеменова]. В ИПК двух комплементарных полимеров (ПМАК и

ПЭГ) отчасти утрачиваются исходные свойства ПМАК и ПЭГ и приобретается комплекс новых, уникальных свойств.

Спектры 13С-СР/МА5 твердых образцов ИПК ПМАК-ПЭГ характеризуются следующими сигналами (Рис.3): в области химических сдвигов 20+30 м.д. - сигналы от атомов углерода СН3-групп, в области - 40-!-85 м.д.- от углеродных атомов, относящихся к группам -С-СН2-С-, -С- и -0-СН2- (сигнал ПЭГ). 13С-СР/А1А5 ЯМР-спектр ПМАК в области частот 175н-205 м.д. обнаруживает синглет, соответствующий карбоксильному углероду, а ЯМР-спектры ИПК ПМАК-ПЭГ вместо синглета характеризуются раздвоенным пиком (Рис.3 и Рис.4). Количественная информация о доле связанных и свободных карбоксильных групп получена на основе модельных исследований расщепления сигналов

карбоксильных углеродов (Рис.4, таблица 1).

Таблица 1. Анализ двойных резонансных сигналов СООН-групп в спектрах CP/MAS твердых ИПК ПМАК-ПЭГ.

Пик Хим.сдвиг Интенсивность Ширина L/G отношение Площадь пика

(N) (м.д) (0-100) (Гц) (0-1) (Si, %)

1 195.40 42.0 332.08 0.05 19.1

2 190.53 100.2 599.04 0.05 80 9

1-/0 отношение учитывает фактор лоренцовой (Ь) и гауссовой (О) формы лннин; Ширина анализируемой области: 3384.06 Гц, 44.84 м.д., (левая граница - 16747 7в Гц, 221.92 м.д.; правая граннца -13363.72 Гц, 177.078 м д )

На рис.4 правая часть пика отражает образование водородных связей. Долю карбоксильных групп ПМАК, образующих водородные связи с ПЭГ, оценивали по соотношению площадей, соответствующих левой и правой частям двойного пика карбоксильных групп ПМАК. Согласно таблице 1, доля СООН-групп, образующих водородные связи в ИПК, в 4 раза превышает долю свободных карбоксильных групп. Эти данные совместно с результатами изучения ИПК в растворах позволяют сделать вывод об определяющей роли водородных связей в стабилизации ИПК.

Определены условия образования эквимольных комплексов ПМАК-ПЭГ. Если в смеси содержатся в избытке макромолекулы ПЭГ, образуются ИПК с составом, близким к эквимольному и в ИПК регистрируется • увеличение доли связанных карбоксильных групп. Исследование ИПК ПМАК-ПЭГ при изменении молекулярной массы ПЭГ от 200 до 35000 методами потенциометрического титрования и 13С -CP/MAS ЯМР обнаружило, что при достаточно

Рис.-l. Апроксимащю экспериментального спектра (a) CP/MAS твердых ИПК ПМАК-ПЭГ в области химических сдвигов СООН-групл модельной кривой (6) и ее разложение на сумму двух сигналов: 1 - свободные СООН-груплы; 2- СООН-гругшы ПМАК, связанные в ИПК ПМАК-ПЭГ водородными связями с макромолекулами ПЭГ. Справа: схема интерполимерного комплекса между ПМАК и ПЭГ: А- двутяжиые последовательности из пар звеньев цепей ПМАК и ПЭГ, образовавших водородные связи. В - петли, включающие разобщенные звенья ПМАК и ПЭГ.

200

195

190

185

К.Я.

высокой молекулярной массе ПЭГ состав ИПК приближается к эквимольному. По-видимому, эквимольное соотношение ПМАК и ПЭГ в ИПК является оптимальным для формирования его свойств как полимерного носителя JIB.

По данным метода CP/MAS ЯМР обнаружено, что применение различных способов синтеза полимерных композиций приводит к получению ИПК, отличных по своей структуре, что определяет различие скоростей высвобождения ЛВ из композиции ИПК-ЛВ. 3.2.2. Структура и свойства макромолекул редкосшитой ПАК и поливинилпирролидона (ПВП) в твердой фазе.

ПВП широко используют в медицинской практике для создания лекарств пролонгированного действия или в качестве коллоидной основы при приготовлении системы плазмозаменителей для реализации метода переливания крови.

С помощью методов ЯМР высокого разрешения в твердом теле (CP/MAS) впервые изучены особенности взаимодействия ПВП с поликарбоновыми кислотами (на примере редкосшитой ПАК) (Рис.5). В области химических сдвигов 13С ~180 м.д. обнаружен сигнал СООН-группы. В области 40-80 м.д. наблюдается сигнал СН-групп полимерной цепи редкосшитой ПАК. Сигнал карбоксильного углерода макромолекул ПВП обнаруживается при -175 м.д., тогда как углеродные сигналы метиленовых групп основной полимерной цепи, а также сигналы атомов углерода вблизи азотного атома и метиленовых углеродов пирролидонового кольца регистрируются в области 15-50 м.д. В области 175-180 м.д. для образцов ИПК регистрируются два сигнала, из которых сигнал с пониженной амплитудой (~180 м.д.) был обусловлен свободными СООН-группами, остающимися в комплексном препарате ПВП-редкосшитая ПАК. На основании определения вкладов водородных связей в ИПК можно заключить, что ИПК ПАК-ПВП имеет менее упорядоченную структуру, чем ИПК ПМАК-ПЭГ. 3.3. Особенности взаимодействия ЛВ пролонгированного действия с полимерной матрицей ИПК (ПМАК-ПЭГ).

На примере ИПК ПМАК-ПЭГ методами ЯМР-высокого разрешения (в жидкости и твердых образцах) изучены особенности взаимодействия с ЛВ в зависимости от структуры полимерной матрицы и природы лекарственного компонента.

Изучена кинетика высвобождения теофиллина из ИПК различной структуры при постоянном составе комплексов. Кинетические зависимости проанализированы в рамках модели двухстадийного диффузионного процесса [Кеменова|. Показано, что скорость высвобождения стерически включенного в матрицу JIB определяется структурой ИПК. Таким образом харак-

1S

"Та "" " ¿5» Ги

и

Рис.5. "С-СР/МАБ ЯМР-спектры (75 Мгц) твердых образцов индивидуальных полимеров (1- редкосшитая полиакриловая кислота, 2-ПВП) и ИПК ПВП-редкоспштая ПАК (3). Звездочками отмечены

боковые полосы от вращешш.

теристики структуры ИПК и кинетические данные по высвобождению ЛВ из комплекса, позволяют сделать вывод о возможности регулирования структуры ИПК, а следовательно продолжительности пролонгированного действия ЛВ, за счет изменения доли связанных карбоксильных групп в комплексе ПМАК-ПЭГ.

Взаимодействие аминазина (Ам) с поликислотами, включая ПМАК, осуществляется за счет солевых связей с карбоксилат-ионами, а также гидрофобных взаимодействий, поскольку Ам является дифильным соединением.

Особенности взаимодействия Ам с ИПК исследовали методами ЯМР ('Н и 13С) при формировании нерастворимой полимерной матрицы при различном содержании аминазина в растворе. При титровании ИПК ПМАК-ПЭГ раствором Ам+СГ образуются осадки, для которых обнаружены тройные комплексы ПМАК-ПЭГ-аминазин. ЯМР-сигналы протонов аминазина не перекрывались с сигналами ПМАК (1-2.5 м.д.), ПЭГ (3.6 м.д.) и растворителя (ДМСО) (2.5 м.д.). Исследование продуктов реакции - тройных комплексов ПМАК-ПЭГ-Ам обнаружило уменьшение содержания ПЭГ в ИПК с увеличением концентрации Ам, о чем свидетельствует снижение интегральной интенсивности ЯМР-сигнала полиэтиленгликоля. На основании ЯМР-данных сделан вывод о конкуренции Ам и ПЭГ за места связывания с ПМАК.

4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК И ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ С БИСЛОЙНЫМИ ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ В ДИСПЕРСИЯХ ФОСФОЛИПИДНЫХ ВЕЗИКУЛ.

Полезную информацию для решения задач генной инженерии и создания ЛВ направленного действия можно получить при изучении коллоидно-химических закономерностей, определяющих взаимодействия ДНК и ее аналогов - двуспиральных полинуклеотидов - с фосфолипидными мембранами везикул.

Турбидиметрическое титрование дисперсий везикул ДНК или полинуклеотидами позволило оценить степень связывания этих компонентов с БЛМ. В качестве экспериментального параметра использован параметр а=О600/Оо600, где Ооб0° - оптическая плотность исходной дисперсии везикул, а Э600 - оптическая плотность системы при введении добавок. Показано, что интенсивность взаимодействия зависит от липидного состава БЛМ: более высокое значение параметра а в дисперсиях яичного ФХ по сравнению с синтетическим ДПФХ. Введение ионов магния во всех системах приводило к резкому усилению взаимодействия ДНК и двуспиральных полинуклеотидов с БЛМ.

Для более детального исследования методами ЯМР высокого разрешения ('Н и 31Р) была выбрана система: дисперсия везикул яичного фосфатидилхолина (ФХ) и дуплекс поли А: поли У. Все основные протонные сигналы ЯМР-спектров фосфолипидных везикул лежат в более сильном поле, чем сигнал воды (-4.6 м.д.).

тогда как протонные сигналы молекул поли-А и полк-У (протоны оснований и некоторые протоны рибозного фрагмента) регистрируются левее сигнала воды (Рис.6). ■ В 'Н-ЯМР спектрах поли-У обнаружены характерные сигналы при ~5.8 м.д. (протоны при С-5 и С-1') и ~7.75 м.д. (протоны при С-6). Образование двойной спирали дуплексов поли-А:У сопровождается дилоль-дипольным уширением и исчезновением спектров ЯМР- высокого разрешения. Спектры 3|Р-ЯМР дисперсий везикул в присутствии дуплекса полинуклеотидоо представляли собой наложение спектров индивидуальных систем, указывая на незначительное взаимодействие полинуклеотида с БЛМ. Картина резко изменялась при введении в систему ионов магния: исходные сигналы уширялись и сдвигались в область более высокого поля, что свидетельствует об образованиии тройных комплексов полинуклеотид-БЛМ-ионы А^2]1" Количественное измерение химических сдвигов позволило заключить, что подвижность как молекул липидов бислоя мембраны, так и полянуклеотидов заметно снижается. По-видимому, катионы магния образуют ионные мостики между фосфорными участками поверхности ФХ-везикул и фосфатными группами полиА'У Схема тройных комплексов показана на рис.7.

Для характеристики контактов липидного бислоя с полинуклеотидами в дополнение к ЯМР-данным приведены результаты исследования с использованием спин-меченных жирных кислот, содержащих свободно-радикальные метки в различных положениях (при полярной головке, а также вблизи 5-, 12- и 16-го атомов углерода ацильных остатков). Выявлены изменения фосфолипидного бислоя, вызванные взаимодействиями с полинуклеотидами: при образовании тройных комплексов регистрируются возмущения приповерхностных групп

фосфолипидного бислоя (вплоть до 5-го углеродного атома ацильных участков жирных кислот).

Обнаруженные особенности взаимодействий в тройных комплексах подтверждены методами ИК-спектроскопии и ДСК.

5. ИЗМЕНЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК БИОКОЛЛОИДНЫХ СИСТЕМ ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ ПО ДАННЫМ МЕТОДОВ РАДИОСПЕКТРОСКОПИИ.

Несмотря на чрезвычайную важность исследований воздействия экстремальных условий на организм, изменения на клеточном уровне мало изучены, что связано прежде всего с экспериментальными трудностями регистрации количественных изменений и процессов, происходящих при этом. Результаты работы.

-А

С»)

|1пМ| I1

»/--^

ЛМ

а г 1 к* .

/

Рис.6. 'Н-ЯМР-спектры (400 Мгц) везикул из ДМФХ (а) в присутствии полинуклеотидов. Для этих смесей выделены и представлены отдельно спектры ЯМР полинуклеотидов: (6) полиУ, (в) полиА при комнатной температуре. Концентрация липидов в ДгО - 7.5 мг/мл. Концентрация полинуклеотидов 10'2 М.

(СН^гИ'-СИгСНгО СИгСК-СН,-0-Р-0

о-с с-о

I I

СИ. СН,

/ /

СН, сн,

ЦСНА 11СНД

си, сн,

сн, сн,

о-сн,... о с^-о

Рис. 7. Взаимодействие между БЛМ везикул и полинуклеотидами в присутствии ионов магния.

6

представленные в разделах 1-4, позволяют заключить, что методы ЯМР могут дать необходимую информацию для характеристики изменений клеточных мембран в условиях экстремальных

воздействий. Данный раздел исследований включает изучение дисперсий везикул и микроорганизмов, а также компонентов крови в условиях экстремальных воздействий. В качестве экстремальных воздействий использованы различные режимы замораживания (везикулы и микроорганизмы), а также низкие влажности (микроорганизмы) и перегрузки вращения (анализ крови животных после соответствующего воздействия).

5.1. Ответная реакция крови мышей на перегрузки вращения.

Кровь - это типичная коллоидная система, свойства которой

определяются концентрацией белков в плазме и состоянием мембран эритроцитов. За изменением основных параметров крови под влиянием экстремальных воздействий следили с помощью методов ЭПР и ЯМР. Установлено снижение водопроницаемости для мембран эритроцитов при перегрузках вращения (данные ЯМР). В то же время, методом ЭПР обнаружено усиление обменных процессов, коррелирующее с увеличением концентрации гемоглобина в крови и активацией процессов

свободнорадикального окисления липидов мембран клеток. Глубину окислительно-восстановительных процессов оценивали по

интенсивности характеристических ферментативных реакций белков церулоплазмина (супероксиддисмутазная и ферроксидазная активности) и траксферрина (ферроксидазная активность), регистрируй сигналы порфириновых колец (§=2.00 ) и ионов Ге3+ (§-4.3). В специальных опытах было показано, что введение в кровь животных аскорбиновой кислоты (витамин С) и у-аминомасляной кислоты (ГАМК) непосредственно перед наложением стрессовых условий приводило к подавлению окислительно-восстановительных процессов под их влиянием. Эти результаты раскрывают механизм действия данных веществ в качестве адалтогенных препаратов.

5.2. Изменения БЛМ в процессах замораживания и высушивания.

Основными повреждающими факторами при криопроцедурах являются - образование кристаллов льда, разрывающих клетки

механически, а также воздействие гиперконцентрированных растворов. Изучение этих явлений в биотехнологических дисперсиях с использованием обычных биохимических методов затруднено. Методы ЯМР предоставляют возможность изучения Повреждающих факторов как в реальных клеточных системах, так и с использованием модельных мембран (фосфолипидных везикул). Один из подходов предотвращения повреждений (нарушения барьерных свойств мембран при дегидратации - замораживании и

высушивании) может быть связан со стабилизацией гидратной поверхности мембран углеводами типа сахарозы и трегалозы.

В диссертации получены данные по влиянию дисахаридов на устойчивость БЛМ к низкотемпературным воздействиям при использовании 2-х программ низкотемпературной обработки: 1) дисперсии везикул в тяжелой воде или в растворах дисахаридов замораживали до -30°С (погружением образцов в баню из ацетона с сухим льдом) и отогревали при комнатной температуре. 2) дисперсии везикул замораживали прямым погружением в жидкий азот (-196°С) и высушивали из замороженного состояния. На рис.8 сравниваются ЯМР-спектры исходных дисперсий везикул со спектрами образцов, прошедших циклы "замораживание-оттаивание" и "замораживание-высушивание-регидратация". В результате этих режимов исходные резонансные сигналы ФХ-везикул полностью исчезали. Отсутствие хорошо разрешенных спектров, характерных для везикул с изотропным движением, указывает на деструкцию и потерю устойчивости бислоя в этих условиях. В присутствии дисахаридов низкотемпературные воздействия не приводят к изменению интенсивности резонансных линий. По-видимому, локализация молекул дисахаридов вблизи полярных головок связана с формированием защитного слоя, предотвращающего разрушающее действие кристаллов льда на БЛМ при замораживании везикул.

Предложен способ повышения устойчивости БЛМ введением в систему перед замораживанием ряда углеводов.

5.3.Оценка клеточных повреждений при замораживании.

В разделе 5.2 было показано, что отрицательное воздействие низких температур прежде всего связано с деформацией и разрушением БЛМ при образовании льда. Для предотвращения подобных повреждений клеток подбирают защитные вещества или оптимизируют режимы процесса охлаждения.

Методом импульсного ЯМР исследованы процессы разрушения бактериальных клеток при двухэтапном способе замораживания до температуры жидкого азота (с температурой остановки вблизи -20°С). О повреждении клеточных мембран при этом судили по проникновению ионов Мп2+ из внеклеточной среды внутрь клеток, измеряя методом ЯМР объем клеток (Ра) и время обмена молекул воды через мембрану (та). Этим методом было показано, что при охлажении до ~ -20+-35°С (временная остановка) повреждение мембран клеток наступает в результате их дегидратации при образовании внеклеточного льда. В то же время, при прямом охлаждении до -196°С скорость кристаллизации

*Г(сн3)з

■ ^.»чЛ»! „I. . В

О м.д.

Яеахаркх

и.д.

Рис, 8. 'Н-ЯМР спектры везикул из фосфатидилхолива в (1) ив

растворах трегалозы (2). Т=20°С. Частота резошшса 270 Мгц. Химические сдвиги измерены в м.д. относительно внутреннего зталота ДСС. Концептрация липида 100 мг/'мл. 1а- исходная суспензия везикул; 16-после заморажнвапкя-оттаиваяия; 1в - после высушинания-регидратации. Концентрация трегалозы -200 мМ. 2г- исходная суспензия везикул с дисахаридом. 2д- после замораживания-оттаивания, Справа от спектров представлены схемы состояния везикул в воде и в присутствии дисахаридов.

внутриклеточной водь; превышает диффузионый поток воды из клетки Определяющую роль в клеточных повреждениях при размораживании играет перекристаллизация микрокристаллов льда, В диссертации показано, что метод ЯМР-релаксации с добавками парамагнитных ионов во внеклеточной среде может быть использован для получения информации о нарушении барьерных свойств и повреждении клеточных мембран при подборе

оптимальных режимов замораживания бактерий. Замораживание микробных клеток до температуры жидкого азота предпочтительно проводить с остановкой в области -20°С, так как в этом случае снижается доля разрушенных мембран (барьера проницаемости), что уменьшает вероятность внутриклеточной кристаллизации.

5.4. Состояние воды в дисперсиях микроорганизмов при низких влажностях.

Информация о состоянии воды в образцах клеток, спор и препаратов на их основе при малах влажностях необходима при оценке их свойств и сохранения активности. Остаточная вода в препаратах с низкой влажностью играет важную роль в инактивации спор. Методами ЯМР и ЭПР дан анализ состояния воды в концентрированных микробных суспензиях (КБК), спорах (СП) и препаратах на их основе (дендробациллине - ДНБ).

На кривых зависимостей Т2 от температуры в координатах Аррениуса для длинной компоненты ССИ протонов образцов СП, КБК и ДНБ обнаруживаются изломы при 0+-13°С. В то же время, величина Т2 короткой компоненты (порядка 20-^40 мкс) практически не изменяется с понижением температуры, то есть не наблюдается изменения подвижности протонов сухого остатка и прочно связанных адсорбированных молекул воды. Полученные данные указывают на то, что при влажностях образцов ~8-15 % с понижением температуры происходит лишь перераспределение 'воды между фракциями с различной подвижностью, а "жидкая пленка" сохраняется. Нелинейное поведение ЯМР-характеристик связано с присутствием парамагнитных примесей. Энергии активации Еа переориентации молекул воды равны: 15.67, 7.4 и 9.22 кДж/моль, соответственно для КБК, СП и ДНБ. Для образцов СП характерна низкая степень обмена молекул воды с внеспоровой средой и слабое изменение подвижности молекул воды с понижением температуры. Сравнение препаратов с одинаковой влажностью обнаружило большую подвижность молекул воды в образцах очищенных спор при низких температурах и меньшую степень обмена таких молекул со средой. Показано, что анализ компонентного состава и оценку влажности препаратов на стадиях хранения, транспортировки или практического использования более корректно проводить в области низких температур (~ -15+-50°С), при которых парамагнитный вклад в релаксацию незначителен.

5.5. Состояние воды и свободные радикалы в бактериальных средствах защиты растений при низких температурах.

Методами ЯМР-релаксации и ЭПР-спектроскопии изучено состояние воды и интенсивность свободнорадикальных процессов в препаратах концентрированного лепидоцида. Препарат включает в

себя споры Bacillus thuriengiensis, наполнитель (каолин) и другие добавки Сигнал свободной индукции протонов в изученных препаратах разлагается на две экспоненциальные компоненты с временами спин-спиновой релаксации Тод -0.36 мс и Тзв а35 мкс с населенностями их протонных фракций Рд»9% и Ра~80 %. В то же время, восстановление продольной намагниченности описывается одной экспоненциальной компонентой с временем спин-решеточной релаксации Ti«130 мс. Между РА и данными термо-гразиметрического анализа влажности (в диапазоне 3*12 %) наблюдалась линейная зависимость с коэффициентом корреляции 0.80, что позволило отнести эту компоненту к протонам молекул воды. При понижении температуры до -33°С значения Рд и Тод монотонно уменьшались примерно в 3 раза, а величина Т| возрастала в 2 раза. На основе этих данных был сделан вывод, что величина РА соответствует при 0°С связанной воде э препарате, которая не замерзает при дальнейшем понижении температуры.

Спектры ЭГ1Р сухого лепидоцида характеризуются неразрешенной линией с шириной около 30 Гс и g -фактором = 2 005 Эта линия является суперпозицией двух сигнзлов : от каолина и сухой биомассы. Распылительно высушенная биомасса в отсутствие каолина характеризуется сигналом свободных радикалов с концентрацией 6 3 хЮ12 спинов/г (g=2.0053 и ДН=15 Гс). Изучение влияния различных режимов сушки на ЭПР-спектры исследуемых препаратов выявило, что при лиофильной сушке свободных радикалов образуется примерно в два раза меньше (3 ^ 10'- спинов/ г), а величина Тол в Г5 раза меньше, чем для образцов, приготовленных распылительным способом. По-пидимому полученные результаты можно объяснить тем, что при лиофильной сушке влага находится в более прочно связанном состоянии, а токсическое действие кислорода ограничено низкой температурой высушивания. При распылительной сушке инициация свободнорадикальных процессов наиболее выражена на заключительной стадии процесса в зоне промежуточных злажкостей биомассы (0 3-s-O 1 г Н;0/ г сухого веса).

6. ХАРАКТЕРИСТИКА СВЯЗНОДИСИЕРСНЫХ СИСТЕМ МЕТОДАМИ МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА.

6.1. Золь-гель переход и конформационое состояние желатины в межфазных адсорбционных слоях на жидких границах раздела фаз.

Гелеобразование всегда связано с конформационными изменениями макромолекул, приводящими к уменьшению

растворимости полимера. Ранее было показано, что увеличение взаимодействия полимер-полимер и рост числа контактов между их цепями в системе желатина-вода свидетельствует об ускорении при высоких концентрациях белка процесса гелеобразования с вытеснением части связанной воды.

Характеристики межмолекулярных взаимодействий и состояния макромолекул желатины на межфазных границах раздела фаз до сих пор остаются малоизученными, в то же время, они важны для детализации механизма стабилизации дисперсных систем.

С целью изучения молекулярного механизма образования межфазных адсорбционных слоев (MAC) биополимеров на жидких границах раздела фаз углеводород-раствор биополимера в работе методом 'Н-ЯМР-высокого разрешения были изучены эмульсии м/в, которые получали при диспергировании бензола в растворах желатины. Отнесение линий в спектрах 'Н ЯМР водных растворов желатины (рис.9) представлено в таблице 2. С понижением температуры наблюдается снижение интегральных интенсивностей для всех линий. По убыли интенсивности сигналов можно судить о доле молекул желатины, претерпевших переход в коллагеноподобную спираль. В спектрах ЯМР эмульсий бензола, стабилизированных желатиной при тех же концентрациях и температурах, при которых макромолекулы желатины имеют конформацию клубка (315 К)' или несовершенной коллагено-• подобной спирали (296 К), наблюдалось полное исчезновение сигналов желатины, что указывает на конформационный переход макромолекул желатины типа клубок-коллагеноподобная спираль в межфазном слое. Результаты свидетельствуют о выделении частиц новой фазы и образовании геля в тонком межфазном слое (происходит золь-гель переход) с толщиной до 30 нм. В результате этих процессов доля подвижных сегментов желатины практически стремится к нулю. Обнаружено, что в протонных спектрах ЯМР эмульсий выделяются два сигнала (7,45 и 6,75 м.д.), один из которых обусловлен фазой бензола внутри капель, а другой, несколько уширенный, скорее всего обусловлен протонами бензола, солюбилизированного желатиной в MAC. Низкая интегральная интенсивность и уширение второго сигнала при 315 К могут быть обусловлены солюбилизацией отдельных молекул CeHg вблизи гидрофобных полостей молекул желатины в адсорбционном слое. При 313-333 К желатина имеет конформацию клубка, и бензол хорошо солюбилизируется в ее растворах.

Метод ЯМР позволяет получить оценки конформационного состояния биополимерных стабилизаторов, структурных переходов в MAC, а также компонентного состава MAC.

типы в ргО концентрации 0.25% при 298 К (а) и 335 К (Б). pD 5.0.

Таблица 2. Идентификация линий желатины в спектре ЯМР высокого разрешения (раствор желатины в D20). с*=0.25%. pD 5.0.

>* ОйАЛСП ХМ*. CJU*T*. ЛмынокысАст Tun op«m>i*o» [ Имтегрмми штмсммостъ ори 1С Hvrerp***««* нитсысмйОстк ари 335 К

1 Ü9 eu.Ast.UM 5.016 3.449

2 из rCH, 1.770 10U

} 14 Ала СИ, J.SJ0 U34

4 1.6-1.7 «f Лмэ 11« J.4H»

S U Про,Шт 9-n-fCH, 10Л9 11.702

6 Ii й» Пифо З.Ш4 3.W6

7 170 Ас* Р-СН, 1.09« >ла

1 IM Яжг ICH, 1.071 ¡.се»

9 3-2 & Гм ьсн. ЮЬ IJW ш

¡0 342 Про S-CH, 4.071

11 3.91 Ги Пшра о-СИ, тсн 10. «7 Н-ЗН

ij 7.2J Фсц Т«р С-ЬС-i 0»7J 0.907

6.2. Молекулярная динамика и самодиффузия воды в гелях редкосшитой полиакриловой кислоты в присутствии некоторых добавок.

При создании гелеобразных форм медицинских препаратов применяются сшитые природные или синтетические полимеры. Одна из возможных гелевых систем, разрешенных для использования в фармакологической промышленности, включает в себя: редкосшитую ПАК, пропиленгликоль (ПГ), ЛВ и воду. Для оптимизации рН и других параметров в систему вводятся различные добавки, которые, как правило, проявляют свойства ПАВ. Очень важным представляется изучение самодиффузии молекул растворителя и макромолекул, а также их изменение в присутствии добавок ПАВ. В работе представлены результаты изучения методами ЯМР (времена релаксации Т] и Тг) и импульсного градиента магнитного поля (коэффициенты самодиффузии) свойств водных гелей редкосшитой ПАК в присутствии низкомолекулярных добавок (Таблицы 3, 4).

Таблица Времена спин-спиновой релаксации протонов Т> (с) и коэффициентов самодиффузии D (см"/с) воды при разных соотношениях спирг/вода в системах : (I) Н,0-С,Н50Н; (II) D:O-C=Hs0H; (III) редкосшитая ПАК-ТЭА-Н:0-С,Н$ОН.

Соотношение этиловый с1шрг/вода Соб.%) (I) (II) (III)

Ъ. с D10s,cmVC Т;, с D- 105,с,ч~/с Т., с D 10S,CM' с

20/80 40/60 60/40 1.72 1.44 1.40 1.5 1.0 0.85 3.03 2.78 2.22 0.S3 0.67 0.65 (.55 1.39 1.42 0.90

Добавки редкосшитой ПАК и ТЭА (триэтаноламин) незначительно понижали значения Тг и О (табл.3) протонов молекул воды. Уменьшение значений Э соответствует более медленным трансляционным движениям молекул спирта по сравнению с молекулами воды. Для гелей редкосшитой ПАК в ОгО спад сигналов спинового эха обычно разлагался на три компоненты с временами спин-спиновой релаксации Тг (Тг' ~1.16 с, То"~80 мс, Т2'"~2 мс). Некоторое сходство в поведении дейтерироэанных водных растворов ПАК и системы ОгО-редкосшитая ПАК предполагает, что участки полимерной цепи редкосшитой ПАК (дающие основной вклад в компоненту с временем релаксации Т;> ~ 80 мс) между сшивками имеют подвижность, близкую к подвижности в несшитых макромолекулах. Медленная компонента Тг (-1.16 с) а системе ПАК-БгО обусловлена протонами воды и

обмениваемыми с ними протоками полимера, тогда как быстрая компонента Т-2 (~80 мс) характеризует подвижность цепей полимера. Суммарный коэффициент диффузии подвижных протонов равен -0.8-10"5 см2/с, что в 3 раза ниже значения коэффициента диффузии протонов чистой воды (~(2.3-5-2.4)-10'5 см2/е). Введение в систему молекул ТЭА приводит к увеличению времени Тз медленной компоненты (до 15 с) и сокращению быстрой компоненты Тг (до 43 мс), что указывает на возрастание подвижности прогонов свободной воды и замедление вращательных движений протонов сетки полимера, приводящих к высвобождению воды. Таким образом, доля свободной воды в системе возрастает. Снижение величины Э в 2 раза (от 0.8-10'5 до 0.4-10"5 см2/с) указывает на то, что молекулы ТЭА взаимодействуют с молекулами свободной воды, ограничивая их трансляционную подвижность.

В системе ПГ-ЬгО с увеличением содержания ПГ от 20 до 60% величина Б снижается в 3 раза (от 0.6-10"5 до 0.2-10*5 см2/с). Для 4-х компонентной системы редкосшитая ПАК-ТЭА-ОгО-ПГ зызелень; 2 компоненты спин-спиновой релаксации Тг- Данные свидетельствуют о противоположном влиянии молекул ПГ и ТЭА на подвижность и связывание .молекул воды, что согласуется с существующими представлениями о структуре и свойствах воды в присутствии аналогичных добавок. При исследовании систем редкосшитая ПАК-ТЭА-этанол-ПГ-НоО обнаружено уменьшение значений и коэффициента самодиффузии О, причем более сильное при концентрациях ПГ 40-60% (по сравнению с водно-спиртовыми растворами Г1Г без добавок). Эти данные свидетельствуют о формировании комплексов молекул ПГ и спирта, которые однако в присутствии редкосшитой ПАК не приводят к ограничению самодиффузии воды вблизи полимерной сетки геля. Методом импульсного градиента показано, что механизм квазиограниченной диффузии не характерен для молекул воды в гелях.

При введении в гели редкосшитой ПАК вазелинового масла (ВМ) возникают устойчивые эмульсии типа масло/вода (такие системы перспективны для разработки мягких лекарственных форм) Эмульсин характеризуются двумя компонентами времени Т> и одно;! компонентой Т], причем минимальное значение этих величин наблюдается при концентрации ВМ ~5%(Таблица 4) Населенность медленной компоненты Тз (А') достаточно хорошо коррелировала с долей воды, вводимой в систему при приготовлении образцов, и была обусловлена, в основном, протонами молекул воды. По-видимому, 5%-я добавка ВМ соответствует такому содержанию вводимого углеводорода, когда условия "слабого возмущения" структуры акрилового полимера еще

Таблица 4.

Времена сгага-спиповой (Тг,с) и спин-рсшеточпой (Ti.c) релаксации протопоп отдельных фракций и их населенностей (А, %) и гелях редкосшитой ПАК с 2% ТЗА в присутствии ВМ. Частота резонанса 90 Mгц. Температура 20°С.

Концентрация ВМ (о6.%) TV А' Ъ" А" т,

О 1.76 100.0 - 0 2.00

2 1.70 96.1 0.150 4.0 1.S0

5 1.43 93.2 0.200 6.8 1.31

10 1.7S S9.0 0.074 10.9 1.63

20 1.72 83.0 0.091 17.0 1.74

сохраняются и, в то же время, сильно ограничено вращение молекул воды. Система такого состава характеризуются пониженной вращательной подвижностью молекул воды при слабом изменении трансляционной (снижение О при добавках масла не превышало 10%). В то же время, добавление того же количества масла, но в сочетании с ПАВ (твин-80), приводило к заметному понижению не только Тг водной компоненты, но и к уменьшению коэффициента самодиффузии В (на 30%: до величины О и1.6-10"5 см2/с).

Совместное использование методов импульсного градиента магнитного поля и ЯМР-релаксации позволило оценить молекулярную подвижность и коэффициенты самодиффузии воды в гелях редкосшитой ПАК в присутствии различных добавок, а также отметить особенности межмолекулярных взаимодействий всех компонентов системы. Показано, что формирование эмульсий типа масло/вода при диспергировании редкосшитой ПАК, воды и ВМ сопровождается изменением соотношения вкладов вращательной и трансляционной подвижности молекул воды и снижением подвижности цепей полимера вследствии их участия в стабилизации капель масла в эмульсиях.

6.3. Состояние воды в дисперсных системах сыров при их плавлении.

Эффективность использования методов магнитного резонанса в исследовании устойчивых эмульсий (разделы 6.1 и 6.2) позволила подойти к детальной оценке структурных изменений при плавлении сычужных сыров. Как исходный, так и конечный продукты являются связнодисперсными системами. С точки зрения физико-химической механики сычужный сыр относится к гелям, сетка которых образована молекулами белка, компоненты масла и воды хаотически распределены в ячейках геля. По современным представлениям, плавленые сыры представляют собой концентрированные'эмульсии (типа масло/вода), стабилизирован-

ные белком. Изменение структуры связнодисперсной системы прежде всего сопровождается изменением распределения воды в гетерогенной системе.

В связи с этим была поставлена задача изучения распределения золы в сычужных и плавленых сырах методом ЯМР-релаксации. Образцы плавленых сыров были получены при нагревании образцов зрелых сыров с солями-плавителями (использованы триполифосфат натрия, лимоннокислые натрий и калий). При измерении ССИ протонов во всех образцах сыров была обнаружена компонента Т» с временем релаксации ~10-15 мке, отвечающая скорее всего за протоны молекул белков и прочно связанной воды. Все образцы обнаружили две компоненты времени релаксации То (28-32 мс и 100-180 мс, для сычужных и 14-32 мс и 170-300 мс для плавленых сыров, соответственно). Кроме того, в плавленых сырах обнаружена и более короткая компонента (~2-6 мс), которая отсутствует в сычужных сырах. Оценка вклада неоднородностей в измеряемые величины Т2 и появление "геометрической" мульти-эксппнемаиэльности были проанализированы в рамках модели (Мачк. Лебовка], связывающей диффузионный путь молекул воды за время, сразнимое с временем релаксации То. В рамках выбранной молели были определены различные (по размеру) типы микрообластей волы Содержание воды, отвечающей основной компонент^ во всех сырах (Т* - 14-32 мс), колеблется в диапазоне 82-^92% Этот тип боль;, согласно выбранной модели, локализуется з микрообластях с размерами от 3,6 до 7.1 мкм. Воду данных .микрообластей .можно считать иммобилизованной между элементами пространственной белковой структуры. Компоненте с временем То ~170-300 мс отвечают наиболее крупные микрокапли (36*60 мкм), выступающие как дефекты пространственной структуры. Содержание таких областей повышено в сычужных сырах (7-15%), тогда как в плавленых сырах их доля уменьшается в зависимости от характеристик сырья и природы соли-плавителя в 2-5 раз. Компонента (То ~ 2.6-4.0 мс), отсутствующая в сычужных сырах, имеет населенность от 7 до 14%, отвечает в плавленых сырах за микрообласти ~ 1.3-2 3 мкм и указывает на возможное дополнительное диспергирование воды при плавлении, сопровождающее диспергирование пространственной сетки белкового каркаса В рамках данной модели распределения воды в структуре сычужных и плавленых сыров лимоннокислые натрий и калий оказывали примерно одинаковое воздействие на систему при плавлении. Результаты подтверждают предположение о структурных перестройках связнодисперсных систем сыров с переходом от сетки геля к концентрированным эмульсиям. ЯМР-данные указы-

вают на важную роль аниона при плавлении, что должно определять подбор солей-плавителей. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования метода ЯМР-релак-сации для характеристики степени созревания и качества сыра.

ВЫВОДЫ.

1. Комплексом методов магнитного резонанса (ЯМР-релаксация, ЯМР-парамагнитного допинга, ЯМР-высокого разрешения в жидкости, ЯМР-высокого разрешения в твердом теле, импульсный градиент и ЭПР) получены характеристики состояния воды и макромолекул в биотехнологических дисперсиях (клатратах и клеточных суспензиях, гелях и эмульсиях, везикулах и полимерных матрицах) и установлены факторы регулирования их свойствами.

2. Показано, что "мягкая" клатратная решетка клатратов ксенона в воде представляет собой тонкодисперсную систему, в которой частицами дисперсной фазы являются кристаллогидраты ксенона с характерными размерами — 1 -f-10 мкм, объемная доля которых регулируется добавками веществ различной природы. Разработан альтернативный низкотемпературным режимам способ замораживания биопрепаратов в дисперсиях клатратов.

3. Разработаны научные основы использования методов 'магнитного резонанса (ЯМР-релаксация, 'Н и !3С ЯМР высокого разрешения в жидкости и ,3С CP/MAS ЯМР в твердом теле) для оптимизации структуры ИПК, служащих полимерной матрицей для создания лекарств пролонгированного действия. Показана зависимость эффекта пролонгирования от особенностей взаимодействия лекарственного вещества с полимерной матрицей. В системах ПМАК-ПЭГ-аминазин специфическое взаимодействие лекарственного вещества с ПМАК приводит к образованию тройных комплексов.

4. Разработан системный подход с использованием методов ЯМР для изучения реакций на клеточном уровне при экстремальных воздействиях (низкие температуры, остаточные влажности, перегрузки вращения). В различных режимах низкотемпературного воздействия происходит деформация и разрушение бислойной липидной мембраны из-за образования микрокристаллов льда. Установлен защитный эффект и предложен механизм стабилизирующего действия добавок дисахаридов (трегалоза, сахароза) на устойчивость бислойных липидных мембран при низкотемпературных воздействиях.

5. Проведена оценка взаимодействия ДНК и ее аналогов (полинуклеотидов) с лигшдной бислойной мембраной (везикулы). Установлено, что устойчивый контакт биополимер-мембрана характерен лишь для двуспиральных полинуклеотидов. Показана специфическая роль ионов магния в образовании ионных мостиков в тройных комплексах.

6. Показано, что в условиях сильной стабилизации эмульсий за счет структурно-механического барьера по Ребиндеру (в качестве стабилизатора использована желатина) формирование межфазного адсорбционного слоя сопровождается конформационным переходом стабилизатора (клубок - коллагеноподобная спираль) и образованием сетки геля. Установлено, что бензол входит в состав межфазного адсорбционного слоя.

7. Методами ЯМР-релаксации и импульсного градиента магнитного поля показано, что долю подвижной и связанной воды в многокомпонентных гелях редкосшитой полиакриловой кислоты можно регулировать соотношением пропиленгликоля и три чтанолашна. Обнаруженный эффект определяет условия формирования эмульсий типа масло/зода при диспергировании редкосшитой ПАК, воды и вазелинового масла, используемых при создании мягких лекарственных форм.

8 С учетом интерпретации данных ЯМР-релаксации (изменение жидко;') воды в гетерогенных системах) построена модель распределения воды в структуре сычужных и плавленых сыров, что служит научным обоснованием оптимальной технологии получения плавленых сыров (контроль структуры, качества и состояния продукта в процессе плавления).

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Родин В.В., Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. ЯМР-релаксация а смеси вода-третичный бутиловый спирт.// Химия и технология воды. -1980. -Т.2, №6. -С.505-508.

'2. Родин В.В., Архангельский А.Н., Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. Исследование гидратов ксенона в водных растворах белков методом ЯМР-релаксации.// Магнитный резонанс в биологии и медицине: Тезисы докл. 2-го Всесоюз.симпоз. -М.: Черноголовка, 1981 -С.115-116 3 Родин В.В , Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. Структурирование водных растворов белков клатратами ксенсна. ,// 1-й Всесоюз биофизич. съезд: Тезисы докл. -М., 1982. -Т.1. -С.86. 4. Родин В В., Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. Состояние воды в суспензиях клеток Е.соИ с клатратами ксенона по данным ЯМР-релаксации.//! Всесоюз. биофиз. съезд: Тезисы докл.-М„ 1982.-Т.2.-С.9.

5. Родин В.В., Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. Структура водных растворов белков в присутствии клатратов ксенона. / / Криобиология и криомедицина. -1984. -Вып.14. -С. 3-7.

6. Родин В.В., Архангельский А.Н., Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. Получение клатратов ксенона в воде и исследование их свойств импульсным методом ЯМР.//Криобиол. и криомед.-1984.-Вып.!4.-С.8-11.

7. Родин В.В., Новиков И.А., Рыжов В.Г., Волков В.Я. Состояние системы ДНК-связанная вода-ксенон при отрицательных температурах: ЯМР-данные. /'/ 5-я Всесоюз. конф. по спектр, биополимеров: Тезисы докл. -Харьков: ИРЭ, 1984. -С.188-189.

8. Волков В.Я., Родин В. В., Исангалин Ф.Ш. Образование клатратов ксенона как метод иммобилизации молекул воды в клеточных суспензиях. // Экспериментальный анабиоз: Тезисы докл. 2-й Всесоюз.конф. по анабиозу. - Рига, 1984. -С.51-52.

9. Родин В.В., Волков В.Я., Исангалин Ф.Ш. "Замораживание" бактериальных суспензий при положительных температурах клатратами ксенона. Данные метода ЯМР. // Механизмы криоповрежления и криозащиты биологических объектов: Тезисы докл. 2-й Всесоюз.конф. -Харьков, 1984. -Т.1. -С.199.

10. Родин В.В., Исангалин Ф.Ш., Волков В.Я. Исследование методом ЯМР системы биополимер-вода в присутствии клатратов ксенона. // 5-я Всесоюз. конф. по спектр, биополимеров: Тезисы докл. -Харьков: ИРЭ, 1984. -С. 187-188.

11. Родин В.В. Система ДНК-связанная вода-ксенон при отрицательных температурах по данным метод а ЯМР. // •Деп.ВИНИТИ. -30.08.84, № 6054-84. - М., 1984. - Т.2. - С.334-337.

12. Родин В.В. Взаимодействие клатратообразователей с биологическими объектами.//Сб. трудов конференции Казанского института биологии: 1985.-Казань: Деп.ВИНИТИ. -1985. N 4029-85. -С.1-5.

13. Родин В.В., Волков В.Я., Исангалин Ф.Ш. Образование клатратов ксенона в суспензиях клеток E.coli по данным метода "парамагнитного допинга".// Биофизика,-I986.-T.31, №2. -С.274-277.

14. Родин В. В., Куракина A.A., Волков В.Я. Метод ЯМР в оценке некоторых свойств бактериальных клеток на стадиях культивирования. //Сборник трудов ВНИИ прикладной микробиологии. Оболенск.-!987, инв.№2855. -С. 1-9.

15. Родин В.В., Волков В.Я. Исследование методом ЯМР бактериальных суспензий после воздействия инертного газа. Режим декомпрессии. // М.: Деп. ВНИИСЭНТИ. -07.07.87, № 393 МБ. -С. 1-13.

16. Родин В.В., Куракина A.A. Свойства микроорганизмов на стадиях роста.Физико-химический подход к их оценке.//М.: Деп.ВНИИСЭНТИ. -07.07.87, № 395 МБ.-С. 1-30.

17. Волков В.Я., Родин В.В. Клеточные повреждения при одно- и двух-этапном замораживании.//М.:Деп.ВНИИСЭНТИ.-1988, N 472-МБ.-С. 1-6.

18. Волков В.Я., Родин В.В., Артюхин В.И., Ко рнюшина ТП. Стабилизация липидных везикул молекулами сахароз при

замораживании и высушивании. //6-я конф. по спектроскопии биополимеров' Тезисы докл.-Харьков: ИРЭ, 1988 -С.73-75. 19. Родин В В., Моисеева Е.В. Стресс и адаптогены: проницаемость мембран эритроцитов и свойства белков плазмы крови мышей по данным методов ЯМР. // 5-я конф. Молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии' Тезисы локл.-М.:Пущино. 1988. -С.19-20. ¿0 Родин В.В., Волкова Л.А., Исангалин Ф Ш. Изучение свободных радикалов и состояние воды в бактериальных средствах защиты растений. // Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений: Материалы Всесоюз.конф.(16-18 мая 1989 г., Ве,:;;гож).-М.: Медбиоэкономика. 1989. -С.97.

21. Родин В.В. Воинова И.И., Волков В.Я., Волкова Л.А., Моисеева Е.В., Дозморов И.М., Сотникова Л.И. Эритроциты крови мышей при перегрузках вращения и в присутствии ГАМК по данным метода ЯМР. -М.- Деп.ВИНИТИ.-17.02.89. -1989, № 1022-В89. -С.1-13.

22. Родин В.В. ЯМР-метод оценки клеточных повреждений оболочек бактерий при замораживании.// Вопросы биотехнологии: Антибиотики и витамины для животноводства.-М.: ВНИИСЭНТИ, 1989, 4.1. -С.45-49.

23. Родин В.В., Моисеева Е.В., Волков В.Я., Волкова Л.А. Влияние стресса и аааптогенов на проницаемость мембран эритроцитов и свойства белков плазмы крови мышей по данным методов радиоспектроскопии. // Магнитный резонанс в биологии и медицине: Те?,псы 7-го Всесоюз си.чпоз (май 1989 г -Звенигород) -М , 1989. -С.125. 21 Родин В В., Новиков И А , Волков В.Я. Влияние ксенона на систему ДНК связанная вода по данным метода импульсного ЯМР.// Кркобилогия -1989, N4. -С.35-38.

25 Исангалин Ф.Ш., Родин В.В., Волкова Л.А. Состояние воды в бактериальных средствах защиты растений г:о данным методов радиоспектроскопии.// Методы магнитной радиоспектроскопии в оно технологии: Материалы отраслевой конференции (23-25 окт 1990 г,-Оболенск).-М.: Минмедпром, 1990.-С.43.

26 Родин В В., Воннова И.И., Волков В.Я., Волкова Л.А., Моисеева

Е В , Дозморов И.М , Исследование плазмы крови мышей при перегрузках вращением, сочетанных с введением аскорбиновой кислоты и ГАМК, методом электронного парамагнитного резонанса.// Космическая биология и авиакосмич. медицина.-1990.-Т.24, N5. -С.57-58. 27. Родин В.В., Джанумов Д.А., Рогожина Л.В. Витамин Вз и особенности его изучения з продуктах микробиологического синтеза. / / Биотехнология - медицине и народному хозяйству (Технология получения и применения биопрепаратов) -М.: Медбиоэкономика.-1990 -Т.2 -С.99-105. 28 Родин В В , Джанумов Д.А., Рогожина Л.В. Адсорбция пантотената кальция из водных растворов и смесей с продуктами микробиосинтеза. Сорбция молекул на активированном угле / / М.: Деп. ВНИИСЭНТИ.-1990, N 1790-МВ. -С.1-10.

29. Родин В.В., Джанумов Д.А., Рогожина Л.В. Смеси витамина Вз с продуктами микробиологического синтеза. // Методы магнитной

ч 1

радиоспектроскопии в биотехнологии: Материалы отраслевой конференции (23-25 окт.1990 г.-Оболенск).-М.: Минмедпром. 1990.-С.40.

30. Родин В.В., Лиознер А.Л., Джанумов Д.А., Колышкина Н.А. Характеристики синтетических пептидов ВИЧ по данным метода ЯМР //Современные направления развития биотехнологии: Тезисы докладов Всесоюз.конференции. -М., 1991.-С.32.

31. Родин В.В., Исангалин Ф.Ш., Волкова Л.А. Споры и концентраты Bacillus thurlagiensis по данным методов радиоспектроскопии.// Деп. ВНИИСЭНТИ.-М. -1991, N 491-МБ. -С.1-12.

32. Родин В.В., Харенко А.В., Кеменова В.А., Джанумов Д.А. Полимерные носители препаратов пролонгированного действия по данным методов радиоспектроскопии.//Современные направления развития биотехнологии: Тезисы докл. Всесоюз.конф .-М., 1991.-С.76.

33. Родин В.В., Харенко А.В., Кеменова В.А. Исследование интерполимерных комплексов: ЯМР-данные.//Водорастворимые полимеры и их применение: Тез.докл. 4-й Всесоюз. конф. -Иркутск, 1991. -С.144.

34. Жданов Р.И., Родин В.В., Щепкин В.Д., Кувичкин В.В., Волков В.Я., Артемова Л.Г. 'Н- и 31Р-ЯМР-слектроскопия в исследовании липид-нуклеиновых взаимодействий. // Современные направления развития биотехнологии: Тезисы докладов Всесоюз. конференции. -М. -I99l.-C.20

35. Родин В.В., Харенко А.В., Кеменова В.А. Образование интерполимерных комплексов по данным ЯМР.// Синтетические полимеры медицинского назначения: Материалы Всесоюз.конф.(Звенигород, 1991).-М.,-¡991.

36. Rodin V.V., Aiekseev K.V., Kemenova V.A. NMR-study of IPC: Interactions in systems with cross-linked polymers. / / International school-■workshop "Modern problems in physical chemistry of macromolecules": Abstracts. -Pushchino. -1991. -P.157.

37. Алексеев K.B., Родин В.В., Гинзбург О.С., Клевина Е.А. Влияние пропиленгликоля на проницаемость мембран.// Создание лекарственных средств: Тезисы докл. Всесоюз.конф.-М., 1992.-С.210.

38. Rodin V.V., Moiseeva E.V., V'olkova L.A. Erythrocytes and blood plasma of mice under stress.// XVth Intern. Confer, on Magn. Reson. in biological systems (July 1992- Izrael): Abstracts. -Jerusalem, 1992. -P.047.

39. Rodin V.V. NMR in studies of molecular anaesthesia of brain.// International Workshop "Advances of 'H-NMR spectroscopy of brain" (18-22 December, 1992 - Oxford, England): Proceedings. -Oxford, 1992. P.096.

40. Rodin V.V., Kharenko A.V., Kemenova V.A., Aiekseev K.V. N'MR-studies for long action drugs.// International Workshop "Advances of 'H-NMR spectroscopy of brain"( 18-22 December, 1992- Oxford, England): Proceedings. -Oxford, 1992. P.093.

41. Rodin V.V., Kharenko A.V., Kemenova V.A. Interpolymer complexes as carriers for drugs:NMR-data.//XVth Intern. Conference on Magn. Reson. in biological systems (July 1992- Israel): Abstracts. -Jerusalem, 1992.-P.048.

42. Rodin V.V., Kharenko A.V., Sakharov B.V., Kemenova V.A. Interpolymer complexes at long action preparation.// 11th Annual Meeting of Society for Magn.Reson. in Medicine (August 1992, Berlin, Germany ): Procedings (Works in Progress).-Berlin, 1992. -P.1348.

43 Rodin V.V., Novikov I.A., Volkov V.Ya. Structural variation in DNA-bound water-xenon system.// XVth International Conference on Magn. Reson. in biological systems (July 1992- Jerusalem, Israel): Abstracts. -Jerusalem, 1992. -P.046.

44. Zhdanov R.I., Volkova l-.A., Petrov A.I., Arternova L.G., Rodin V.V. Phospholipid liposomes carrying nucleic acids on their surface for functional gene delivery in gene therapy. // Liposomes as Biomimetics: Abstracts. -Consiglio Nazionale delle Ricerche. Rome, IDHRCCS. -University of Rome Tor Vergata, 1993. -P.017.

45. Rodin V.Y., Kharenko A V, Aksenova N.I., Kemenova V.A. IPC-

reactions with boilogicai active substances: NMR data. / / 12nd Annua! Meeting of Society for Magn.Reson. in Medicine (August ¡993, New York, USA): Proeedings. -N.Y., 1993. -P. 1211.

46. Rodin V.V., Kharenko A.V., Kemenova V.A. IPC-properties and structure at drug outing.// 12nd Annual Meeting of Society for Magn,Reson. in Medicine (August 1993, New York, USA): Proeedings. -N.Y., 1993. -P.1019.

47. Rodin V.V., Zhdanov R.I., Artemova L.G. A model of DNA-contacts: PC-vesicies with polynucleotides: by NMR. //10th Annual Sei. Meeting of European Society for Magn. Reson. in Medicine and Biology: Proceedings of ESMRM. -Rome, Italy.-1993. -P.531

to Rodin V.V., Izmaiiova V.N'. Conformational Transitions in Gelatine at Formation of Emulsions.//iOth intern. Sympos. on Surfactants in Solution (Caracas, Venezuela. June 26-30, 1994): Abstracts.- Caracas.-1994. -P.106

49 Rodin V.V., Kharenko A V., Sakharov B.V., Kemenova V.A. Molecular Dvnamics of [PC by NMR-re!axation. PMAA-PdMAEM.// European Exper. Conf. on Magii Reson. (1994 - Finland): Abstracts. -1994. Oulu. -P.097.

50 Rodin V.V,, Izmailova V N Stability of Phosphatidylcholine Vesicles at Extreme Effects //10th Intern, Symposium on Surfactants in Solution (Caracas, Venezuela, June 26-30, 1994): Abstracts.- Caracas.-1994. -P.129.

51. Rodin V.V., Izmaiiova V.N. NMR-method in study of biocolloid structures. // 13th European Chemistry of Interfaces Conference (Kyiv, Ukraine, September 11-16, 1994): Abstract.- Kiev: Institute for Surface Chemistry, NAS of Ukraine.-1994.-P.015

52. Rodin V.V., Izmailova V.N. Interactions of Phospholipid Vesicles with Biomolecules. // 10th International Symposium on Surfactants in Solution (Caracas, Venezuela, June 26-30, 1994): Abstracts,- Caracas.-1994. -P.I26.

53. Zhdanov R I , Volkova L.A., Rodin V.V. Lipid Spin Labeling and NMR

Study of Interaction Between Polyadenylic Acid: Polyuridylic Acid Duplex and Egg Phosphatidylcholine Liposomes. Evidence for Involvement of Surface Groups of Bilayer. Phosphoryi Groups and Metal Cations // Appl. .Magn Reson. -1994 -Vol.7, N1 .-P. 131-146.

54. Родин В.В., Измайлова В.Н. Межфазные адсорбционные слои желатины на жидких границах раздела фаз по данным метода ЯМР. / / Коллоидный журнал. -1994.-Т.56, N1. -С.91-96.

55. Rodin V.V., Izmailova V.N. Interactions of PhL-vesicles with sugar's molecules. Stability to extreme effects. // XVIth international Conference

on Magn. Reson. in biological systems (July 1994- Veldhoven, The Netherlands): Abstracts. -Veldhoven, 1994.

56. Родин В.В., Харенко А.В., Сахаров Б.В., Кеменова В.А., Аброскина О.Н., Куракина А.А. Молекулярная динамика полиэлектролитов и их комплексов по данным методов ЯМР. / / Коллоидный журнал. -1994. Т.56, N1. -С.84-90.

57. Rodin V.V., Zhdanov R.I., Artemova L.G. Interaction of Phosphatidylcholine Vesicles with Polynucleotides as a Model of DNAMembrane Contacts revealed by NMR. / / Keystone Symposia: Frontiers of NMR (1994 -Santa Fe, New Mexiko).- Abstracts. 1994. USA. P.039.

58. Родин В. В., Измайлова В.Н. Влияние дисахаридов на устойчивость везикул из фосфатидилхолина к низкотемпературным воздействиям по данным метода ЯМР. // Коллоидн. журн.-1994.-Т.56, №6. -С.833-839.

59. Rodin V.V., Izmailova V.N. NMR-approaches on transmitters and conformational transitions in protein-water-hydrocarbon system. / / Proceedings of Workshop on Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy of Muscle ( Liverpool -29 June-1 July, 1994).U.K. -1994.

60. Rodin V.V., Izmailova V.N. The formation of emulsions. Conformational transitions in gelatine.// XVIth intern. Conf. on Magn. Reson. in biological systems (July 1994- The Netherlands): Abstracts. -Veldhoven, 1994.

61. Родин В. В., Измайлова В.Н. Липид-нуклеиновые взаимодействия в дисперсиях фосфолипидных везикул по данным методов ЯМР. / / Коллоидн. журн.-1995.-Т.57, №2. -С.231-239.

62. Izmailova V.N., Yampolskaya G.P., Rodin V.V., Tarasevich B.N. Gelation of Gelatin at Interfaces // Internationa! Zimkin Memorial Conference on Photografic Gelatin (June 24 - July 1, 1995): Abstracts. -Kazan, Tatarstan, Russia.-1995.-P.8.

63. Zhdanov R.I., Rodin V.V., Izmailova V.N., Volkova L.A. Phospholipid vesicles and polynucleotides: NMR and ESR studies of Surface Interactions. // International Symposium on Micelles, Microemulsions and Microlayers: Quarter Century Progress- New Gorizons (August 28-30, 1995, Florida, USA). -University of Florida, 1995. -P.58.

64. Rodin V.V., Izmailova V.N. NMR method in study of interfacial adsorption layer of gelatin. // Colloids & Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. -1996. -Vol.106. -P.95-102.

65. Измайлова B.H., Родин В.В., Нусс П.В. Поверхностные и объемные свойства растворов третичного бутилового спирта в воде. // Коллоидн. журн. -1996. -Т.58. №5. -С.616-622.

66. Родин В.В., Харенко А.В., Кеменова В.А. Структура и свойства интерполимерных комплексов как полимерных носителей биологически активных соединений.// Коллоидн. журн. -1996. -Т.58, N 5.-С.671-679.

67. Rodin V.V., Izmailova V.N., Kharenko A.V., Kemenova V.A. IPC as Carriers for Biomolecules. NMR in Study of Long Action Drugs.// 11th International Symposium on Surfactants in Solution (Jerusalem, Israel, June 9-13, 1996): Abstracts.- Jerusalem.-1996. -P.184.

68. Rodin V.V., Izmailova V.N., Nuss P.V. NMR-Approaches in Colloid Chemistry. Surface Properties and NMR-Data for System of tert-Butyl

Alcohol-Water. // ilth international Symposium on Surfactants in Solution-(Jerusalem, Israel, June 9-13. 1996): Abstracts - Jerusalem. 19% -P.207

69. Izmailova V.N., Yampolskaya G.P., Tulovskaya Z.D., I.evachev S.M., Derkach S.R., Rodin V.V., Pelekh V.V , Bacharvnnd H, Tarasevich B.N. Rheological and structural properties of interfaciai adsorption layers and emulsions stability, // Ilth International Conference "Surface Forces" (June 25-29, 1996) -Moscow, Russia.- P.52.

70. Rodin V.V., Izmailova V N , Kharenko A V.. Alekseev K.V IPC Interactions at Long Action Drugs. Properties and Molecular Dynamics/ /I3iii Annua! Meeting of European Society for Magnetic Resonance in .Medicine and Biology (Prague, 1996)- AusUucti. Prague -1996.-P.251.

71. Измайлова B.H., Родин В.В., Нусс П.В. Поверхностные и объемные свойства воды в растворах бутилового, гексилового и третбутилового спиртов. // VII Научно-техническая конференция МГТУ: Тезисы докл.-Мурманск. -1996. -С.166.

72. Rodin V.V., Izmailova V.N. Biocolioids' properties by radiospectroscopy methods.//7th Conference on Colloid Chemistry in the memoriam of Aladar Buzagh (Eger, Hungary): Abstracts. -Hungary. -1996. L.50.