Взаимодействие поликислот с модельными липидными мембранами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

□034847 13

БЕРКОВИЧ АННА КОНСТАНТИНОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИКИСЛОТ С МОДЕЛЬНЫМИ ЛИПИДНЫМИ

МЕМБРАНАМИ

02.00.06 - высокомолекулярные соединения, химические науки

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата хшмических наук

2 С КОЯ 2009

Москва - 2009

003484713

Работа выполнена в лаборатории функциональных полимеров и полимерных материалов кафедры высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук

Мелик-Нубаров Николай Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Чалых Анатолий Евгеньевич

доктор химических наук Литманович Андрей Аркадьевич

Ведущая организация: Институт химической физики им. H.H. Семенова

Российской академии наук

Защита диссертация состоится 9 декабря 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д.1, стр. 3, химический факультет, Лабораторный корпус «А», кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н.

Ui-'ûfôi^' Долгова A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Синтетические полимеры представляют значительный интерес для современной фармакологии и биотехнологии. Их используют при создании лекарственных форм направленного и пролонгированного действия для повышения терапевтической активности и снижения побочных эффектов. Однако применение полимеров невозможно без информации о поведении цепей в биологических системах и их взаимодействии с отдельными компонентами клетки. .

Липидный бислой является структурной основой любой клеточной мембраны, состоящей из сотен различных липидов. Большинство из них, в том числе фосфатидилхолин, являются цвиттер-иопами, хотя встречаются липиды, например кардиолипин, которые несут отрицательный заряд. Благодаря их присутствию биологические мембраны заряжены отрицательно, что обусловливает возможность взаимодействия с положительно заряженными полимерами. Механизм взаимодействия поликатионов с модельными и биологическими мембранами подробно изучен. В тоже время известно, что некоторые природные белки, которые содержат кислые аминокислотные остатки, например вирусные гемагглютинины, способны дестабилизировать мембрану эндосом и обеспечивать транспорт вируса в клетку. Известно также, что отдельные синтетические полианионы, такие как поли-(2-этилакриловая) или поли-(2-пропилакриловая) кислоты, в слабокислой среде вызывают растворение липидных мембран, что приводит к образованию смешанных липидно-полимераых ассоциатов. До настоящего времени механизмы связывания поликислот с биологическими и модельными мембранами остаются практически не изученными. Неясно также, каким образом химическая структура поликислоты влияет на проницаемость мембраны.

Целью работы явилось изучение взаимодействия поликислот различной химической природы с модельными липидными мембранами для установления связи между строением поликислот и характером этого взаимодействия, а также выяснение природы сил, способствующих погружению поликислот в липидный бислой.

Научная новнзна. В работе впервые продемонстрировано, что поликислоты различной химической природы способны связываться с фосфатидилхолино-выми мембранами в слабокислой среде, причем в основе связывания лежат электростатические взаимодействия. Установлено, что поликислоты, способные к образованию с липидами водородных связей или к участию в гидрофобных либо диполь-дипольных взаимодействиях, встраиваются в мембрану, образуя в ней гидрофильные поры. Выявлена важная роль дипольного потенциала в процессе заглубления поликислот в липидную мембрану.

Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты представляют интерес для понимания молекулярного механизма взаимодействия поликислот с липидными мембранами, что является основой для создания новых лекарственных форм, обладающих рН-чувствительностью и повышенной терапевтической активностью.

з

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XI и XII Всероссийских конференциях «Структура и динамика молекулярных систем» республика Марий-Эл, 2004 и 2005 год, соответственно; на мастерклассе «Lipids moving center stage» Королевской академии наук и искусств Нидерландов, Амстердам, Нидерланды, 2005 год; на Малом полимерном конгрессе, Москва, 2005 год; на II Конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», Санкт-Петербург, 2006 год; на 45м микросимпозиуме «Structure and dynamics of self-organized macromolecular systems», Прага, Чехия, 2006 год; на IV Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры XXI веку», Москва, 2007 год; на 6м конгрессе молодых ученых «YoungChem 2008», Краков, Польша, 2008 год.

Публикации. Материалы диссертации изложены в 15 печатных работах, из них 6 статей в российских и зарубежных журналах и 9 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 4 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 132 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность диссертационной работы и сформулированы её цели. Обзор литературы содержит информацию о структуре и свойствах биологических мембран, причём особое впимание уделено их проницаемости для различных соединений. Рассмотрены модельные системы, применяемые в настоящее время для исследования биологических мембран. Проанализированы сведения о взаимодействии полимеров с биологическими и модельными липид-ными мембранами, приведён краткий обзор физиологически активных неионо-генных полимеров и поликатионов. Подробно описаны особенности взаимодействия анионных полимеров с мембранными структурами и возможные области применения подобных комплексов. В экспериментальной части приводятся данные об объектах и методах исследования. В работе использовали полиакриловую (ПАК, Mw=5000), полиметакриловую (ПМАК, Mw=70000) и поли-L-глутаминовую (ПГ, Mw=16000) кислоты, натриевую соль полистиролсульфоновой кислоты (ПСС, Mw=96000), поливинилсульфат калия (ПВСК, Mw=15000), статистический сополимер акриловой кислоты и акриламида (П(АК-АА) ), коммерческий препарат ДНК, выделенной из молоков лосося, а также тройной статистический сополимер стирола, малеинового ангидрида и метакриловой кислоты состава 3:2:1 (сополимер Кёнига, М„=12000). Молекулярную массу сополимера определяли методами ГПХ и УФ-спектроскопии, а состав - потенциометрическим титрованием. Моноламеллярные липосомы со средним гидродинамическим диаметром около 100 им получали из яичного лецитина или смеси липидов путем обработки суспензии мультиламеллярных везикул ультразвуком. Для оценки связывания по-

4

лимеров с мембранами использовали методы центрифужной ультрафильтрации и квазиупругого светорассеяния. За образованием пор в мембранах следили по вытеканию флуоресцентного красителя или по появлению ферментативной активности протеолитического фермента трипсина, помещенного внутрь липосом. Величину и изменение дипольного потенциала мембран определяли с помощью потенциал-чувствительного флуоресцентного зонда, а также напрямую, измеряя потенциал лигшдного монослоя.

1. Связывание поликислот с модельными липидными мембранами

Многие фосфолипиды, в частности фосфатидилхолин (ФХ), имеют цвиттер-ионную природу. Протонирование части фосфатных групп в кислой среде придает липосомам избыточный положительный заряд. Известно, что фосфатная группа ФХ имеет рКа ~ 1.6, то есть при рН 4.2 в бислое содержится около 0.25% протонированных молекул ФХ. Последнее подтвердилось данными по измерению ¡¡-потенциала липосом из яичного лецитина (рис. 1), который принимал положительные значения при понижении рН и составлял около +2 мВ при рН 4.2. Дальнейшее уменьшение рН приводило к резкому росту С,-потеициала, что обуславливает возможность электростатического взаимодействия мембран, построенных из фосфатидилхолина, с поликислотами в слабокислой среде.

^-потенциал, мВ

Рис. 1. Зависимость ¿Г-потенциала ли-Q посом от рН среды. Измерения проводили в буферном растворе (5 мМцит-® О ф рат, Трис), который предварительно ------доводили введением Трис до требуемого значения рН.

б

6

рН

Прямым доказательством такого взаимодействия являются данные по рН-зависимости доли связанной с липосомами полиакриловой кислоты (рис. 2). С понижением рН степень связывания ПАК с ФХ-липосомами возрастает, а при рН < 3.5 осуществляется нацело.

Рис. 2. Зависимость доли ПАК, связанной с ФХ-липосомами от рН среды при экви-мольном соотношении поликислоты и фосфатидилхолина в системе. Буферный раствор тот же что в подписи к рис.1. Комплекс полимера с липосомами отделяли от раствора свободной ПАК методом центрифужной ультрафильтрации и оценивали концентра11ию несвязанной поликислоты по ее взаимодействию с доксоруби-цином при рН 6.5.

Взаимодействие ПАК с ФХ-липосомами сопровождается значительной агрегацией (рис. 3, кривая 1). Размер агрегатов возрастает с ростом содержания полимера в суспензии вплоть до 1,5-кратного его избытка, а дальнейшее увеличение относительного содержания ПАК приводит к снижению размеров. Важно, что при достижении 4-кратного избытка поликислоты измеряемая величина оказалась сопоставимой с размером интактных липосом (100 нм). Агрегация липосом развивается сразу после смешения компонентов, что свидетельствует о почти мгновенной адсорбции поликислоты на мембранах. Данные, полученные методом ультрафильтрации, свидетельствуют о том, что вплоть до соотношения сПА/с^х = 2.5 практически вся добавляемая ПАК оказывается связанной с липосомами.

Ссвл7С°

ПА ПА

1.0 ^

1 Г

0.5- 1 Т ' '

Ф

(Ш-.-■

3 4 5 6 7 рН

1500

г

I

а

<и

РЭ

га а.

1000

500

2,5 с3,0/С

пк фх

Рис. 3. Зависимость размера агрегатов от соотношения осново-молъных концентраций поликислот и ФХ: ПАК (1). ПМАК (2), ПСС (3). Буферный раствор: 5 мМ Трис-цитрат, рН 4.2 (Буфер А).

По мере добавления ПАК к ФХ-липосомам значение ^-потенциала частиц монотонно уменьшалось и составляло около -30 мВ в области концентраций, соответствующих более чем 3-кратному избытку поликислоты по отношению к ли-пиду (рис. 4 кривая 1), что также является аргументом в пользу адсорбции. Заметим, что при рН 4.2 каждая макромолекула ПАК, имеющая среднюю молекулярную массу 5000, несет в цепи не более четырех заряженных групп. Очевидно, что слабо заряженная поликислота должна адсорбироваться на мембране в виде статистического клубка, поскольку выигрыш в энтропии за счет высвобождения

б

весьма небольшого количества противоионов не достаточен для реализации кон-формации, обеспечивающей взаимодействие всех заряженных групп полимера с мембраной. По всей вероятности, именно это обстоятельство приводит к равномерному снижению ¡¡-потенциала везикул с ростом содержания ПАК в растворе, которое осуществляется вплоть до заполнения мембраны полимером.

Рис. 4. Зависимость потенциала частиц от соотношения осново-мольных концентраций поликислот и ФХ-липосом. Буфер А.

(¡)-ПАК,

(2) - ПМАК,

(3)-ПСС.

Влияние природы полианиона на его взаимодействие с липосомами изучали на примере линейных поликислот, различающихся природой заряженных групп, структурой основной цепи, степенью ионизации, гидрофобностью и способностью к образованию водородных связей (Табл. 1). Таблица 1. Свойства исследованных полимеров.

Полимер Степень ионизации при рН 4.2 Протоно-донорная способность, А Гидро-фобность, № (рН4.2) Я* Я'ка

ПАК 0.05 0.61 -0.35 1.2 0.06

ПМАК 0.025 0.61 -0.1 0.5 0.025

ПСС 1 0.47 -3.28 0.15 0.15

ДНК 0.7 0.19 -4.67 1.4 0.7

Сополимер Кёнига 0.4 0.96 0.4 0.125 0.05

ПГ 0.3 0.36 -3.2 2 0.6

ПВСК 1 0.44 -5.26 0.5 0.5

П(АК-АА) (2:8) - 0.61 -0.852 - -

Взаимодействие перечисленных в таблице поликислот с ФХ-липосомами приводило к ярко выраженной агрегации (см., например, рис. 3), а также значительному снижению ¡¡-потенциала (рис. 4). Исключение составил лишь сополимер АК-АА, который не вызывал агрегации и заметного понижения ^-потенциала.

¿.-потенциал, мы О

-15

-30

С /с

ПА ФХ

Таким образом, все поликислоты, независимо от их природы, оказались способными связываться с липидными мембранами, построенными из ФХ. Однако концентрация, соответствующая максимальной агрегации при рН 4.2 (R в Табл. 1) и точка перегиба на зависимости ¡¡-потенциала от количества добавленного полимера при этом значительно различались.

Можно было полагать, что величина R* отражает степень связывания поликислот с липосомами. Однако, не смотря на существенное различие параметра R , определенного в смесях ФХ-липосом с ПАК, ПСС и ПГ (Табл. 1), связывание этих полимеров с мембранами осуществлялось практически одинаково, причем введение указанных поликислот вплоть до эквивалента по отношению к количеству липида в системе сопровождалось переходом в агрегаты более 80 % полимера.

Если основываться на предположении об электростатическом характере взаимодействия полимеров с мембраной, необходимо учесть разницу в степени ионизации указанных поликислот при рН 4.2. Тем не менее, нормирование значений концентрации полимеров, соответствующих максимальной агрегации в системах, на степень ионизации поликислоты (R ха) не привело к выравниванию этого параметра. Кроме того, из сопоставления размеров и заряда частиц в системе следовало, что концентрация поликислот, вызывающая максимальную агрегацию везикул, соответствовала большим по модулю отрицательным значениям потенциала. Иными словами, введение слабых поликислот приводило к связыванию одноименно заряженных везикул в достаточно крупные агрегаты. Перечисленные данные указывают на существенный вклад водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий в образование агрегатов.

Аргументом в пользу такого предположения служат корреляция способности исследованных полимеров к образованию различных типов межмолекулярных взаимодействий и концентрации, соответствующей максимальной агрегации везикул, рассчитанной с учетом степени ионизации полимера при рН 4.2 (параметр R*xa).

Для оценки склонности полимера к гидрофобным взаимодействиям с мембраной использовали параметр IgD. представляющий собой коэффициент распределения мономерного звена между водой и октанолом при данном значении рН. Способность полимеров к образованию водородных связей характеризовали параметром А, который определяли из констант взаимодействия мономерного звена со стандартным набором акцепторов протона в четыреххлористом углероде при данном значении рН. Для расчета IgD и А использовали демонстрационную версию программного пакета ADME Boxes 2.0 («Sirius Analytical»).

Рост гидрофобности поликислоты приводил к уменьшению параметра R*xa (Рис.5а), т.е. для насыщения поверхности мембраны гидрофобным полимером необходимо меньшее количество заряженных групп полимера по отношению к ли-пиду. Относительно высокое значение коэффициента корреляции (- 0.85) указывает на существенное влияние гидрофобности полимера на его связывание с ли-посомальными мембранами. Аналогичную тенденцию наблюдали при сопоставлении протонодонорной способности поликислот с параметром R ха (Рис.5б). И в этом случае коэффициент корреляции был достаточно высок, -0.81. Это означает,

что с ростом склонности поликислоты к участию в гидрофобных взаимодействиях и образованию водородных связей насыщение связывающих центров на мембранах достигается при меньшей концентрации полимера.

(Чех 0,6

0,4

0,2

0-

е

7

(а) 0б

-2

1 <о5

0

|дй

Яа

0,6

0,4 0,2 0-

(б)

\

\

28

0,5

1,0 А

Рис. 5. Корреляция между параметром К у-а и гидрофобностью звена полианиона (а), или его способностью к образованию водородных связей А (б) для различных поликислот: I - ПАК; 2 - ПМАК; 3 - ПСС; 4 - ДНК; 5- Сополимер Кёни-га; б-ПГ; 7-ПВСК.

Таким образом, все исследованные поликислоты вызывали агрегацию везикул, причем связывание происходило за счёт не только электростатических сил, но и гидрофобных взаимодействий, а также водородных связей. Очевидно, что реализация ван-дер-ваальсовых взаимодействий и водородных связей требует заглубления полимера в липидную мембрану вплоть до области глицериновых остатков и даже жирнокислотных радикалов. Это обстоятельство делает правомерным и важным вопрос о том, влияет ли взаимодействие с поликислотой на проницаемость липидной мембраны.

2. Влияние поликислот на проницаемость липидных мембран

2.1. Взаимодействие поликислот с липосомами, содержащими флуоресцентный краситель пиранин

Влияние поликислоты на барьерные свойства липидных мембран исследовали с помощью рН-градиентных липосом, заполненных флуоресцентным рН-чувствительным индикатором пиранином (8-окси-1,3,6-трисульфопирен). Липо-сомы заполняли раствором пиранина с рН 9.0, а внешней средой служил буферный раствор с рН 4.2. Находящийся внутри липосом. пиранин интенсивно флуоресцирует, а при его выходе во внешнюю кислую среду интенсивность флуоресценции резко падает.

В отсутствие полимера наблюдали незначительное фоновое снижение интенсивности флуоресценции за время, сопоставимое со времепем эксперимента (рис. 6, кривая 1). Это означает, что липидная мембрана практически непроницаема для отрицательно заряженного гидрофильного красителя. При добавлении

поликислот сигнал резко уменьшался уже за время смешения, а затем происходил дальнейший спад интенсивности флуоресценции, как это представлено на рис.6 на примере ПАК (кривая 3). Скорость снижения флуоресценции при введении различных поликислот - ПМАК, ПСС, сополимера Кёнига и сополимера акриловой кислоты и акриламида - на начальном этапе существенно превосходила спад фоновых значений. Добавление к липосомам ДНК в малых концентрациях также способствовало снижению флуоресцентного сигнала, однако при повышении концентрации нуклеиновой кислоты выше соотношения Я*, изменения скорости снижепия флуоресценции не наблюдалось. В случае полиглутаминовой кислоты изменения скорости не происходило вовсе.

I/

1,00

0,75

Рис. 6. Кинетика уменьшения интен-... 1 сивности флуоресценции в растворе rtu-

_ 2 ранина, помещенного внутрь ФХ-—• 3 липосом (1), после добавления поли-L-лизина к анионным липосомам, содержащим краситель (2) и после добавления ПАК к указанным липосомам (3). Внутренний раствор содержал 0.5 мМ пиранин в буфере Б (0.3 M глицин, 0.1 M

—1.....""' гидроксид тетраметшаммония, рН

время, МИН 9.2), а внешний представлял собой буфер А, содержащий 0.39 M сахарозы.

Разумно полагать, что существенное уменьшение интенсивности флуоресценции ФХ-липосом при добавлении поликислоты обусловлено рассеянием света на образующихся агрегатах везикул, поскольку эффективность тушения резко увеличивалась с ростом концентрации поликислоты, соответствующей максимальной агрегации. Аналогичное падение интенсивности флуоресценции, сопровождаемое увеличением размеров частиц от 100 нм до нескольких микрон, наблюдали при добавлении поликатиона поли-Ь-лизина к заполненным пиранином анионным липосомам, состоящим из смеси (9:1) яичного ФХ и кардиолипина (рис. 6, кривая 2). Поскольку известно, что поли-Ь-лизин не нарушает целостности мембран анионных везикул, сопоставление вида кривых 2 и 3 на рис. 6 позволяет сделать вывод о том, что резкое снижение интенсивности флуоресценции в момент добавления полимера к везикулам обусловлено их агрегацией.

Дальнейший спад интенсивности флуоресценции пиранина, заключенного в липосомы, под действием поликислот удовлетворительно описывается биэкспо-ненциальным уравнением:

У ! h) = А ехр(-А:^) + A2 èxp(-k2t ) s (1)

где к\ и к2 - эффективные константы скорости вытекания пиранина, а параметры А] и Â2 отражают вклад «медленной» и «быстрой» стадии в общую скорость процесса. Поскольку константа скорости «медленной» стадии к2 оказалась сравнима с константой скорости фонового процесса (к0), для оценки влияния полимера на скорость вытекания пиранина использовали параметр кх/ко, характеризующий относительное ускорение снижения интенсивности флуоресценции под действием

полимера. С помощью нормированного предэкспопепциального множителя А]/(А1+А2) характеризовали вклад обусловленного полимером ускорения в общую скорость процесса.

Наблюдаемое в экспериментах снижение интенсивности флуоресценции пиранина может быть вызвано различными причинами, из которых основными, по-видимому, являются укрупнение и флотация липосомальных агрегатов, спонтанное вытекание пиранина и, наконец, выделение красителя из внутренней полости липосом под действием поликислоты:

^^ ^агрегации ^вытекания "^агрегации А|юн ^полимерные (2)

поры

Медленный спад флуоресценции определяется в основном спонтанным вытеканием пиранина из липосом, поскольку наклон конечного участка кинетических кривых был, как правило, близок наклону фонового (т.е. до добавления поликислоты) участка кривой. Тогда быстрая стадия является суперпозицией процессов укрупнения агрегатов и вытекания пиранина из внутренней полости липосом.

Большинство поликислот вызывали значительное увеличение скорости вытекания пиранина с ростом их содержания в растворе (рис. 7). Так, при адсорбции на липосомах ПАК (рис. 7а), ПСС (рис. 7в) и сополимера Кёнига (рис. 7д) скорость вытекания пиранина изменялась незначительно в интервале концентраций меньших Я, причем вклад «быстрой» экспоненты в общую скорость процесса был также невелик. Однако после достижения концентрации полимеров близких к Я и скорость снижения флуоресценции, и вклад вызванного полимером ускорения резко увеличивались. При этом в условиях насыщения поверхности липосом адсорбированным полимером (Спк/СФх >Я ) ПАК вызывала 250-кратное, ПСС -88-кратное, а сополимер Кёнига - 170-кратное ускорение снижепия флуоресценции. Поскольку в этих условиях данные полимеры вызывают лишь незначительную и довольно быструю агрегацию везикул (рис. 3), вызываемые ими эффекты можно объяснить образованием в мембранах гидрофильных пор, проницаемых для пиранина.

Существенное ускорение вытекания пиранина вызывал также сополимер П(АК-АА) (рис. 7ж). Как упоминалось ранее, этот сополимер вообще не вызывал агрегацию липосом, поэтому вызванное им ускорение падения флуоресценции следует отнести именно к образованию в мембране гидрофильных пор. В то же время, доля разрушенных липосом была невелика, поскольку вклад «быстрой» стадии в кинетику не превышал 0.4 даже в присутствии двукратного избытка этого сополимера по отношению к липиду.

и

а1/(а+а2)

200

100

100

а,/(а,+а2) 1,0

к/к, 40 20 0

(Д)

0,0 ^Сп/Сфх

а,/(а,+а2)

0,75

0,50 0,25

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0,, 1П

^П'^ФХ

к/к„

к/к„ 15 10 5

а/(а1+а2) '1,00

0,75 0,50 0,25

0,3 0,6 0,9 1,2 Сп/Сфх

к/к, 200

100

О

(г)

А/^+А,) -11,00

0,75 0,50 0,25

0.0 0,5 1,0 1,5Сп/а

ФХ

(д) к/кп

150 100 50 О

(е)

а,/(а,+а2) •11,0

0,5

0,0

0,0 0,5 1,0 1,5 с 1С

п ФХ

20 10 О

(ж)

я'

а1/(а1+а2) Рис. 7. Зависимость эффективной кон-1,0 станты скорости вытекания пирани-на (черные точки, левая ось ординат) и коэффициента А¡, нормированного на сумму А1+А2, (светлые точки, правая ось ординат) от соотношения ос-ново-мольных концентраций поликислот и ФХ. (а) ~ПАК, (б)-ПМАК, (в) д о - ПСС, (г) - ДНК, (д) - Сополимер Кё-2 Сп/СфХ нига, (е) - ПГлу, (ж) - сополимер АК-АА. Внутренний раствор - буфер Б; внешний - буфер А, содержащий 0.39 Мсахарозы

Существенно иной характер имели зависимости параметров к^ко и АДА1+А2) от концентрации ПМАК (рис. 76) и ДНК (рис. 7г). По мере увеличения концентрации этих поликислот в диапазоне 0<Сцк/СФх<К наблюдалось уменьшение эффективной константы скорости быстрого процесса, хотя глубина вызываемого полимером тушения была невелика. Об этом свидетельствует низкий вклад параметра А[ в указанном диапазоне концентраций. При этом по мере увеличения содержания этих полимеров вплоть до концентраций близких к 11 вклад «быстрой» стадии в наблюдаемую скорость процесса, т.е. параметр А^А^Аг), рос, а сама константа скорости этих процессов уменьшалась. Это объясняется тем, что по мере приближения концентрации полимера к Я размер агрегатов увеличивается, однако агрегативные процессы в основном успевают закончиться в первые секунды после добавления полимера и не вносят вклад в наблюдаемую скорость процесса. Наконец, после того, как концентрация полимера становится больше Я , агрегация развивается мгновенно и вносит незначительный вклад кинетику процесса. В этих условиях ПМАК вызывает 15-кратное ускорение снижения флуоресценции. Добавление ДНК в концентрациях выше II вообще не меняет скорости транспорта, причем в этих условиях вклад А? в общую скорость процесса близок к 0. Это означает, что адсорбция ДНК не влияет на проницаемость липидных мембран.

В отличие от этих полимеров, ПГлу совершенно не влияла на скорость снижения флуоресценции пиранина (рис. 7е). Добавление этой поликислоты вызывало скачок флуоресценции, однако в дальнейшем скорость снижения интенсивности флуоресценции пиранина была идентична скорости фоновых процессов.

Тот факт, что при концентрации поликислоты, соответствующей максимальной агрегации везикул, Я , наблюдается излом концентрационных зависимостей обоих параметров (рис. 7) указывает на то, что в этой точке происходит смена процесса, определяющего снижение интенсивности флуоресценции пиранина. Можно предполагать, что при низких концентрациях полимера (СцК/Сфх <11), агрегация развивается достаточно медленно, а размер образующихся агрегатов не очень большой (рис. 3). Поэтому агрегация не успевает закончиться в первые секунды после добавления полимера и потому вносит существенный вклад в наблюдаемую величину к,. Тогда ускорение снижения флуоресценции пиранина в этом диапазоне концентраций в основном должно определяться именно кинетикой агрегации везикул. Об этом косвенно свидетельствует низкий вклад параметра А) в общую скорость процесса в этом диапазоне концентраций. Дальнейшее увеличение концентраций поликислот приводит к насыщению поверхности липо-сом полимером, при этом агрегативные процессы развиваются в первые секунды после добавления полимера и заканчиваются к моменту начала регистрации кинетики. В результате после достижения концентрации Я спад флуоресценции пиранина должен в основном определяться его вытеканием из липосом.

Для подтверждения этих рассуждений мы напрямую определили долю пиранина, вышедшего во внешний раствор после добавления поликислот в концентрации, соответствующей максимальной агрегации везикул. Для этого липосомы инкубировали с поликислотами, а затем отделяли с помощью ГПХ на сефарозе

СЬ-4В от свободного пиранина. При этом липосомы элюировались в объеме, равном свободному объему колонки, а свободный пиранин выходил во втором пике.

Анализ вклада агрегативных процессов в скорость снижения флуоресценции пиранина в присутствии исследованных поликислот показал, что наибольшее влияние агрегация оказывает на кинетику тушения флуоресценции пиранина под действием наиболее гидрофобных полимеров - ПМАК (36.5%) и сополимера Кё-нига (16.5%). Для всех остальных поликислот этот вклад составляет около 10%.

Таким образом, мы впервые показали, что не только гидрофобные производные полиакриловой кислоты, но и многие другие поликислоты способны образовывать поры в липидных мембранах в слабокислой среде. При концентрациях, соответствующих насыщению поверхности везикул полимером, ПАК, ПСС, тройной сополимер стирола, малеинового ангидрида и метакриловой кислоты и ПМАК вызывают значительное увеличение проницаемости мембран по отношению к заряженному красителю пиранину. При этом наибольшее (почти 200-кратное) ускорение транспорта пиранина достигается при добавлении к липосо-мам полиакриловой кислоты. Можно заключить, что наибольшей способностью к образованию пор обладают полимеры, способные к образованию гидрофобных и водородных связей с липидными молекулами. В противоположность этому ДНК и ПГлу, характеризующиеся высокой гидрофильностью (большие отрицательные значения 1при рН 4.2), практически не влияют на проницаемость мембран во всем диапазоне концентраций.

Если поликислота не только склонна к образованию водородных и гидрофобных связей с мембраной, но и характеризуется значительной гибкостью основной цепи, может происходить, по всей видимости заглубление полимера в гидрофобную область мембраны с образованием в ней гидрофильных пор. В то же время вытекание ионного красителя из липосом под действием поликислот может быть следствием полного ее разрушения с образованием смешанных ли-пидно-полимерных мицелл. Именно такой механизм был ранее описан для гидрофобных производных акриловой кислоты - поли-(2-этилакриловой) и поли-(2-пропилакриловой) кислот. Способны ли гидрофильные поликислоты к образованию таких ассоциатов, или их заглубление в мембрану приводит к формированию гидрофильных пор?

2.2. Взаимодействие полиакриловой кислоты с липосомами, заполненными трипсином

Чтобы выяснить, приводит ли адсорбция гидрофильных поликислот на ли-посомах к разрушению везикул с образованием липидно-полимерных ассоциатов, или полимер формирует в мембране гидрофильные поры, не разрушая мембрану полностью, мы использовали систему, основанную на липосомах, заполненных белком. В качестве такого «индикаторного» белка был выбран протеолитический фермент трипсин (ЕС 3.4.21.4), стабильный в широком диапазоне рН. Трипсин -водорастворимый фермент, поэтому он локализуется в водной полости везикул и не встраивается в липидную мембрану.

Субстраты трипсина заряжены (в данной работе использовали этиловый эфир № бензоил-Ь-аргенипа (БАЭЭ))и, следовательно, также не способны проникать через липидную мембрану. Поэтому, когда трипсин находится внутри липосом, а

субстрат добавляется во внешний раствор, активность фермента не регистрируется. При разрушении бислоя с помощью ПАВ Тритона Х-100 (0.05%) наблюдается проявление ферментативной активности в системе. Большие размеры трипсина (молекулярная масса 25 кДа) и его высокая гидрофильность не позволяют предполагать возможность его проникновения через бислой. Можно ожидать, что если воздействие полиакриловой кислоты будет приводить к появлению каталитической активности фермента, то это будет указывать на появление пор в мембране, достаточных для проникновения субстрата внутрь липосом.

Как показано на рис. 8 (кривая 1), по мере увеличения содержания ПАК в образце активность фермента увеличивалась, причем добавление ПАК в концентрации, соответствующей половине липида, присутствующего в образце приводила к полумаксималыюму увеличению активности. После добавления 2-кратного избытка ПАК в образце регистрировалась каталитическая активность такая же, как и после полного разрушения липосом детергентом.

Каталитическая активность Рис. 8. Зависимость ферментативной актив-сотобилиэованных липосом НОсти трипсина, включенного в липосомы, от

концентрации ПАК. 10 мг/мл (12,6 мМ) липосом, заполненных 0,22 мМ раствором трипсина в буфере Б (1) или в том же растворе с добавкой 10 мМ бензамидина (2), инкубировали в течение 15 мин с ПАК в буфере А, а затем 300 мкл образца разбавляли 4 мл раство-

-100

| 80

§.60 I-

£ 40

20

.....;в1

I i g 3 4 5 ' Ра БАЭЭ в 100 мМ KCl и определяли актив-[пак]/[фх] ность трипсина по выделению кислоты.

Появление ферментативной активности в образце может свидетельствовать о разрушении липосом с образованием липидно-полимерных ассоциатов или о формировании в мембране малых пор, проницаемых для субстрата и продукта реакции, но не проницаемых для молекул фермента. Различить эти механизмы можно, заполнив липосомы раствором комплекса трипсина с его низкомолекулярным конкурентным ингибитором. В качестве такового нами был выбран бензамидин (бензолкарбоксимидамид), константа ингибирования которого равна 39 мкМ. Внутри липосом в присутствии 10 мМ бензамидина трипсин полностью инакти-вируется. При разрушении липосом происходит разбавление ингибитора в 10000 раз и его концентрация оказывается в 39 раз меньше К;, и ингибитор не влияет на ферментативную реакцию.

Оказалось, что при добавлении 0.05% Тритона Х-100 к липосомам, заполненным комплексом трипсина с бензамидином, появляется высокая каталитическая активность даже превышающая активность препарата, приготовленного аналогичным образом, но в отсутствие бензамидина. По всей видимости, это связано с тем, что бензамидин предотвращает автолитическое расщепление фермента в процессе приготовления липосом, в результате чего доля активного фермента в липосомах возрастает. С другой стороны, это свидетельствует о быстрой и полной

диссоциации комплекса фермент-ингибитор при разбавлении во внешнем растворе.

При добавлении ПАК к липосомам, заполненным комплексом трипсина с бензамндином, наблюдалось небольшое и достаточно медленное увеличение каталитической активности фермента. Даже после инкубации препарата с 5-кратным избытком ПАК по отношению к липиду в липосомах активность трипсина составляла около четверти активности липосом, солюбилизовашнлх Тритоном Х-100 (рис. 8, кривая 2). Это свидетельствует о том, что в результате адсорбции ПАК на поверхности липидных везикул солюбилизации мембран не происходит, а в них образуются небольшие по размерам поры. В этом случае ферментативный гидролиз субстрата кинетически лимитируется медленной диффузией бензамидина, субстрата и продуктов гидролиза через эти поры.

Можно было бы предполагать, что образованию пор в липидной мембране под действием ПАК способствует трансмембранный градиент рН. Используя ли-посомы, заполненные раствором трипсина с рН 4.2, мы показали, что образование пор в таких мембранах в присутствии ПАК также происходит, т.е. образование пор под действием ПАК не связано с трансмембранным градиентом рН, а обусловлено взаимодействием ПАК с мембраной в слабокислой среде.

Таким образом, исследование взаимодействия ПАК с липосомами заполненными трипсином позволило установить, что в отличие от гидрофобных поликислот, ПАК не способна солюбилизовать липосомы в слабокислой среде. При этом ее влияние на проницаемость липосомальных мембран выражается в образовании гидрофильных пор. Какие же силы заставляют полимер внедриться в ли-пидную мембрану и образовать в ней пору?

3.Значение дипольного потенциала для заглубления поликислоты в бислой

Ранее в литературе было изучено взаимодействие с мембранами лишь гидрофобных производных полиакриловой кислоты, причем в качестве основной движущей силы заглубления таких полимеров в мембрану рассматриваются гидрофобные взаимодействия с липидным бислоем. Для гидрофильных полимеров такой механизм невозможен.

Дипольный потенциал липидной мембраны, создаваемый совокупностью дипольных моментов сложноэфирных связей в области глицериновых остатков молекул лнпида и связанной внутри бислоя водой, оказывает значительное влияние на свойства биологических мембран, в частности па ориентацию и активность мембранных белков. Величииа дипольного потенциала составляет от 110 до 240 мВ для различных типов липидов: При этом особенность глицерофосфолипидных бислойных мембран заключается в том, что положительный конец результирующего диполя, направленного перпендикулярно к поверхности мембраны, обращен в сторону ее гидрофобной области.

Поскольку дипольный момент протонированных карбоксильных групп в поликислотах своим отрицательным концом обращеп в сторону атома кислорода, можно предположить, что дипольный момент звеньев полианиона будет способствовать его заглублению в бислой, за счёт заглубления незаряженных карбоксильных групп.

3.1. Влияние дипольных модификаторов на образование пор в мембранах под действием ПАК

Если предположение о диполь-дипольных взаимодействиях верно, изменение дипольного потенциала мембраны должно заметно сказываться на эффективности воздействия ПАК.

Наиболее простым способом изменения дипольного потенциала мембраны является введение в бислой специфических соединений, так называемых дипольных модификаторов. В качестве соединения, понижающего дипольный потенциал, мы использовали флорстин, а для повышения дипольного потенциала встраивали в мембрану 6-кетохолестанол.

к, мин 1.25,

1.00

0.75

0.50

0.00

(а)

0.01

0.02

Мольная доля флоретина

время, мин

Рис. 9. Зависимость наблюдаемой константы скорости вытекания пиранина под действием ПАК из липосом от мольной доли флоретина (а). Кинетика вытекания пиранина из липосом, состоящих из ФХ (1), его смеси (9:1) с 6-кетохолестанолом (2) и его смеси (9:1) с холестерином (3) (б). ПАК добавляли в эквимолярной концентрации по отношению к липиду (0.63 мМ). Липосомы заполнены 0.5 мМраствором пиранина в буфере Б, снаружи буфер А.

Как и предполагалось, добавление к липосомам флоретина приводило к заметному снижению скорости вытекания пиранина в присутствии полиакриловой кислоты (рис.9а). В случае же 6-кетохолестанола ожидаемого результата получить не удалось. При взаимодействии ПАК с липосомами, содержащими 10% 6-кетохолестанола, скорость вытекания пиранина оказались примерно на порядок меньше (рис. 96, кривая 2), чем в случае лецитиновых липосом (рис. 96, кривая 1).

6-кетохолестанол является близким структурным аналогом холестерина. Хорошо известно, что введение в мембрану небольших количеств холестерина приводит к значительному увеличению ее микровязкости, что может препятствовать внедрению полимера в бислой. На рис. 9 приведена кинетическая кривая вытекания пиранина из липосом, содержащих 10 % холестерина (кривая 3). Видно, что замедление процесса в случае липосом, содержащих холестерин и 6-кетохолестанол практически одинаково, что позволяет нам предполагать, что влияние данных соединений на микровязкость и структуру бислоя препятствует внедрению ПАК, тем самым отменяя эффект повышения дипольного потенциала.

Таким образом, полученные данные по влиянию дипольных модификаторов на вызываемое ПАК вытекание пирапина из липосом не позволяют сделать одно-

злачный вывод о значении дипольного потенциала для заглубления ПАК в ли-пидную мембрану. Тем не менее, результаты не противоречат этой гипотезе. В дальнейшем мы попытались оценить влияние ПАК на саму величину дипольного потенциала мембраны.

3.2. Влияние ПАК на флуоресцентные свойства потенциал-чувствительного зонда 1?Н-421

Для оценки изменений дипольного потенциала бислойной мембраны при ее взаимодействии с ПАК мы использовали потенциал-чувствительный флуоресцентный краситель ГШ-421. Известно, что соотношение интенсивностей флуоресценции этого зонда при длинах воли возбуждения 440 и 540 нм красителя, встроенного в бислой, К=144о /¡540, линейно возрастает с увеличением дипольного потенциала мембраны.

Находясь в водном окружении, 1111-421 образует агрегаты, в которых он практически не флуоресцирует. В присутствии липосом краситель перераспределяется в бислой, и интенсивность его флуоресценции значительно возрастает. Однако важно отметить, что в структуре 1Ш-421 третичной аминогруппы, рКа которой составляет 4.7 в водном растворе и 4.1 в бислое, поэтому поведение красителя в интересующих нас условиях, при рН 4.2 значительно отличается от такового при рН 7.0. Так, значение II при рП 4.2 составило 0.73, что значительно ниже, чем приведенное в литературе значение для лецитиновых липосом при рН 7.0 (1.372). Такое отличие вероятно связано с изменением структуры области полярных головок липидов при понижении рН, а значит изменение граничного потенциала мембраны также вносит вклад в значение К, поэтому его нельзя относить исключительно к изменению дипольного потенциала. В тоже время мы показали, что при добавлении к липосомам флоретина при рН 4.2 происходит линейное снижение значения Я.

Добавление ПАК к водному раствору красителя 1Ш-421 не меняет спектральные характеристики красителя, т.е. прямого взаимодействия поликислоты с красителем, по-видимому, не происходит. Добавление же ПАК к липосомам из яичного фосфатидилхолина приводило лишь к незначительному понижению Я от 0.73 до 0.69 (Рис. 10) В тоже время, в том случае, когда измерение проводили на липосомах, содержащих 10 % 6-кетохолестанола, значение Я составляло 0.89 в отсутствие полимера и снижалось до 0.75 при высокой концентрации ПАК.

Таким образом, оказалось, что в присутствии 6-кетохолестанола в мембране ПАК оказывает значительно большее влияние на спектральные характеристики потенциал-чувствительного зонда Ш1-421, чем в случае лецитиновых липосом, но практически не вызывает в этих условиях вытекания пиранина.

к

0,9 0,8 0,7 0,6

0,0

0,5

Рис. 10. Зависимость соотношения интенсивностей флуоресценции красителя Ш{-421, полученных при возбуждении на длине волны 440 и 540 нм, 11=1440 /Ьы, от молярного избытка ПАК по отношению к липиду в липосомах из ФХ (1) и в липосомах из смеси ФХ и 6-кетохолестанола (9:1) (2), буфер А, рН 4.2.

1,0

С(ПАК)/С(ФХ)

Обобщая данные результаты, можно предложить следующий механизм внедрения поликислоты внутрь бислоя. Если встроенная в мембрану молекула ПАК пронизывает бислой, ее воздействие на дипольный потенциал обоих монослоев мембраны должно быть одинаковым и противоположным по знаку, а значит, суммарное изменение дипольного потенциала будет незначительным (рис. 11а). Именно это наблюдается при взаимодействии ПАК с липосомами из яичного фосфатидилхолина. В том же случае, когда в мембране содержится 6-кетохолестанол или холестерин, дипольный потенциал повышен, а встраивание поликислоты затруднено за счет высокой микровязкости. В результате поликислота заглубляется лишь частично, в пределах одного монослоя (рис. 116). Такое предположение хорошо согласуется с тем, что в этом случае вытекания пиранина практически не происходит. При этом асимметричное расположение полимера в пределах бислоя должно приводить к значительному изменению дипольного потенциала, что также хорошо согласуется с экспериментальными наблюдениями (рис. 10)

Внешняя сторона

Внутренняя сторона

Рис. 11. Схема встраивания ПАК в липидный бислой, сформированный из ФХ (а) и содержащий

б-кетохолестанол или холестерин (б)

3.3. Влияние полиакриловой кислоты на свойства липидных монослоев

Чтобы подтвердить значение диполь-дипольных взаимодействий для встраивания ПАК в липидный бислой и количественно оценить изменение дипольного потенциала, мы изучили влияние ПАК на поверхностное давление (я) и поверхностный потенциал (ДУ) липидных монослоев. Для этого были получены изотермы сжатия и зависимости поверхностного потенциала от площади, приходящейся на полярную головку, для двух липидов дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и его аналога, содержащего простые эфирные группы - 1,2-ди-0-октадецил-те-глицеро-3-фосфохолина (ДОДФХ). При сжатии монослоя, сформированного из ДПФХ на поверхности буферного раствора с рН 4.2, наблюдалось монотонное увеличение как поверхностного

19

давления, так и поверхностного потенциала. При достижении поверхностного давления около 10 мН/м, соответствующего площади, приходящейся на полярную головку 60 А2, значение потенциала составило 400 мВ, что соответствует литературным данным для монослоя ДПФХ, сформированного при нейтральных значениях рН (около 350 мВ). При добавлении в субфазу полиакриловой кислоты в конечной концентрации 2 мМ, наблюдается увеличение поверхностного давления на 7-8 мН/м при среднем сжатии, это означает, что взаимодействие между липидом и ПАК приводит к расширению монослоя. Одновременно с этим адсорбция ПАК вызывала значительное понижение поверхностного потенциала (примерно на 170 мВ) во всем диапазоне давлений, указывая на значительный вклад дипольного потенциала в полимер-липидные взаимодействия.

ДПФХ

60 50 5 40

К 20 10 о

100 . ,120

А, А

600 500 400 ^300 <200 100

ш

20

40

60

ВО 100 120

А, А2

ДОДФХ

60-

50

5 40-

X 30

К 20

10

0

(В)

А, А'

120 2

600-

500-

СО 400-

5 300

>

< 200-

100

(Г)

100 „120 А, А2

Рис. 12. Зависимость поверхностного давления (а и в) и поверхностного потенциала (б и г) для монослоев, сформированных из ДПФХ и ДОДФХ от площади, приходящейся на молекулу липида в монослое в отсутствие (1) и в присутствии 2 мМ ПАК (2). Водная фаза - Буфер А

При сжатии монослоя сильнее 20 мН/м изотермы, полученные в присутствии ПАК и в ее отсутствие, совпадали, а на зависимости потенциала наблюдался при этом небольшой излом, что свидетельствует о вытеснении ПАК из монослоя при избыточном сжатий.

Взаимодействие ПАК с монослоем из ДОДФХ, не содержащего сложно-эфирных групп, приводило к увеличению поверхностного давления лишь на 2-4 мН/м, что в два раза меньше, чем в случае ДПФХ. Измеряемая величина поверхностного потенциала для такого монослоя была примерно на 200 мВ ниже, чем для монослоя из ДПФХ, а добавление ПАК снижало его приблизительно на 100 мВ, что также почти вдвое меньше, чем в случае ДПФХ. Известно, что дипольный потенциал мембран, построенных из липидов, не содержащих сложноэфирных групп, существенно понижен. Вероятно, именно поэтому ДАК слабее взаимодействует с монослоем из ДОДФХ.

Согласно теории Брокмана, поверхностный потенциал монослоя ДУ, измеряемый с помощью зонда Кельвина, может быть представлен в виде двух составляющих, одна из которых ДУ0 не зависит от концентрации липида в монослое, а вторая ей пропорциональна:

АУ = АГ0 + 12тг//± / А

>

где Цл. - "поверхностный дипольный момент", выраженный в миллидебаях (мД), а А - площадь, приходящаяся на одну полярную головку липида в А2/молекулу. Второй член данного выражения - это дипольный потенциал, независимый от поверхностного заряда, в то время как первый член определяется значением граничного потенциала. В таблице 3 приведены значения параметров уравнения (3), определенные для монослоев из ДПФХ и ДОДФХ в присутствии и отсутствие ПАК.

Таблица 2. Влияние ПАК на параметры монослоев из ДПФХ и ДОДФХ

ДУо, мВ И1, мД ЧМ*, мВ

ДПФХ 65+2 551±4 319±2

ДОДФХ 158+5 232+8 134+5

ДПФХ+ПАК 7.2+3.7 363+7 210+4

ДОДФХ+ПАК 141±4 140±7 81±4

Видно, что добавление ПАК приводит к изменению и граничного (за счет адсорбции заряженного полимера на поверхности) и дипольного (за счет внедрения полимера в область глицериновых остатков) потенциалов.

Таким образом, полученные данные доказывают, что диполь-дипольные взаимодействия незаряженных звеньев полимера с липидными мембранами и монослоями играют ключевую роль в заглублении поликислоты, приводящем к образованию в мембране гидрофильных пор.

выводы

1. Впервые обнаружено, что поликислоты различной природы эффективно взаимодействуют с фосфатидилхолиновыми мембранами в слабокислой среде. Связывание поликислот с липидными мембранами происходит за счет комплекса электростатических, гидрофобных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий, а также водородных связей, вклад которых определяется природой полимера.

2. Впервые показано, что заглубляться в бислой способны не только гидрофобные поликислоты, но и гидрофильные полимеры, склонные к образованию многоточечных водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий. При этом в липидных мембранах формируются гидрофильные поры, проницаемые для заряженных низкомолекулярных соединений.

3. Установлено, что движущей силой заглубления поликислот в липидный бислой являются диполь-дипольные взаимодействия между протонированными звеньями адсорбированного полимера и липидной мембраной.

Основные результаты диссертационной работы Беркович А.К. изложены в следующих публикациях:

1. Беркович А.К., Мелик-Нубаров Н.С. Взаимодействие полиакриловой кислоты с бислойными мембранами из фосфатидилхолина в слабокислой среде.// Биол. мембраны. 2005. Т. 22. № 4. с.370-377.

2. Беркович А.К., Орлов В.Н., Мелик-Нубаров Н.С. Взаимодействие полианионов с электронейтральными липосомами в слабо-кислой среде.// Высокомолек. соед. Сер. А. 2009. Т. 51. № 6. С. 972-982.

3. Беркович А.К., Мелик-Нубаров Н.С. Значение степени ионизации фосфолипидов и дипольного потенциала мембраны для ее взаимодействия с полиакриловой кислотой.// Структура и динамика молекулярных систем: Сб. Статей. Вып. XI: Ч. I. - Казань: КГУ им. В.И. Ульянова-Ленина. 2004. с.262-265.

4. Filippov A., Suleymanova A., Berkovich A. Effect of polyacrylic acid on phase state of lipids and dynamics in lipid/watcr system.// Appl. magn. reson. 2007. № 33. P. 311-322.

5. Рудакова M.A., Ишмухаметова B.A., Беркович A.K., Филиппов A.B. Влияние полиакриловой кислоты на диффузию воды через липидный бислой по данным ЯМР// Структура и динамика молекулярных систем: Сб. Статей. Вып. XIII. Ч. П.Уфа: ИФМК УНЦ РАН. 2006. - С. 166-171.

6. Семина И.Г., Сулейманова A.B., Беркович А.К., Юльметов А.Р., Филиппов A.B. Фазовое состояние систем фосфатидилхолин - полиакриловая кислота-вода по данным 3,Р ЯМР.// Структура и динамика молекулярных систем: Сб. Статей. Вып. XIII. Ч. II.-Уфа: ИФМК УНЦ РАН. 2006. - С. 200-203.

7. Беркович А.К., Мелик-Нубаров Н.С. Полианионы разрушают липидную мембрану в кислой среде. Тезисы XI Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем". Россия. Республика Марий-Эл. 28 июня -2 июля 2004 г. с. 34.

8. Беркович А.К., Мелик-Нубаров Н.С. Природа взаимодействия полианионов с мембранами, построенными из фосфатидилхолина. Тезисы XII Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем". Россия. Республика Марий-Эл. 27 июня -1 июля 2005 г, с. 27.

9. Berkovich А.К., Melik-Nubarov N.S. Interaction of polyacrylic acid with phosphatidylcholine liposomes in slightly acidic milieu. Academy masterclass "Lipids moving center stage" of Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences. The Netherlands. Amsterdam. 6 October 2005 r. Book of abstracts, p. 30.

10. Беркович A.K. Нарушение целостности модельной липидной мембраны под действием полианионов различной природы. Тезисы докладов конференции "Малый полимерный конгресс". Россия. Москва. 29 ноября - 1 декабря 2005 г. с. 63.

11. Беркович А.К., Мелик-Нубаров Н.С. Разрушение липидной мембраны под действием слабых и сильных поликислот. Тезисы II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах". Россия. Санкт-Петербург. 31 января - 2 февраля 2006 г.Частъ 2. с. 86.

12. Berkovitch А.К., Melik-Nubarov N.S. Polyacids as pH-sensitive permeabilizer of lipid membranes. Book of abstracts of 45th microsymposium "Structure and dynamics of self-organized macromolecular systems". Czech Republic. Prague. July 9-13. 2006. p. 93.

13. Беркович A.K., Веремеева П.Н., Мелик-Нубаров Н.С. Взаимодействие слабых и сильных поликислот с модельными липидными мембранами различного состава. Тезисы докладов Четвертой Всероссийской Каргинской Конференции "Найка о полимерах - 21-му веку". Россия. Москва. МГУ. 29 января - 2 февраля 2007. Т. 2. с. 368.

14. Berkovich А.К., Melik-Nubarov N.S. Polyacid induced permeabilization of lipid membranes, Book of abstracts of 6th congress of young chemists "YoungChem2008". Poland. Krakow. 15-19 October 2008. p. 93.

15. Berkovich A.K., Lukashev E.P., Melik-Nubarov N.S. Dipole potential as a driving force incorporation of poly(acrylic acid) into lipid membrane in slightly acidic medium. Book of abstracts of 7 congress of young chemists "YoungChem2009" Poland. Warsaw. 14-18 October 2009. p. 46.

Подписано в печать: 02.11.2009

Заказ № 2893 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.rn

1. Введение.5.

2. Обзор литературы.

2.1. Структура и свойства биологических мембран.'.

2.1.1. Развитие представлений и современные взгляды на структуру и функции биологических мембран.

2.1.2. Свойства липидного бислоя и составляющих его липидов.1.

2.1.3. Модельные системы для изучения свойств мембран.

2.1.4. Барьерные свойства мембран.

2.1.5. Электрические потенциалы липидного бислоя.

2.2 Влияние полимеров на структуру и проницаемость мембран.

2.2.1. Неионогенные амфифильные полимеры.1.

2.2.2. Поликатионы.

2.3. Полианионы.I1.'.'.'.'

3. Постановка задачи.'.:.'.J.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.1.

4.2.1. Формирование малых липосом.1.

4.2.2. Изучение связывания полианионов с липосомами.Л.ill.

4.2.3. Изучение агрегации липосом под действием полианионов.

4.2.4. Изучение заряда частиц.L.i.

4.2.5. Изучение влияния полианионов на проницаемость мембраны липосом для низкомолекулярных соединений.

4.2.6. Оценка изменения дипольного потенциала мембран.;.

4.2.7. Монослои.'.

5. Результаты и обсуждение.

5.1. Связывание поликислот с модельными липидными мембранами из фосфатидилхолина в слабокислой среде.

5.2. Влияние полианионов на проницаемость липидных мембран.

5.2.1. Взаимодействие поликислот с липосомами, заполненными флуоресцентным красителем пиранином.

5.2.2. Взаимодействие полиакриловой кислоты с липосомами, заполненными трипсином.

5.3. Дипольный потенциал мембраны как движущая сила заглубления поликислот в гидрофобную область липидного бислоя в слабокислой среде.

5.3.1. Влияние соединений, меняющих дипольный потенциал лйпидного бислоя.

5.3.2. Влияние ПАК на флуоресцентные свойства потенциалчувствительного зонда RH-421.

5.3.3. Влияние полиакриловой кислоты на свойства липидных монослоев.

Синтетические полимеры представляют значительный интерес для современной фармакологии и биотехнологии. Их используют при создании лекарственных форм направленного и пролонгированного действия, для повышения терапевтической активности и снижения побочных эффектов. Однако применение полимеров невозможно без информации об их взаимодействии с биологическими системами и их отдельными компонентами.

Липидный бислой является структурной основой любой клеточной мембраны и состоит из сотен различных липидов. Большинство из них, в том числе фосфатидилхолин, являются цвиттер-ионными. Однако часть липидов и гликолипидов, например фосфадитилсерин и протеогликаны, несут отрицательный заряд [1]. Благодаря их присутствию, биологические мембраны заряжены отрицательно, что обусловливает возможность их взаимодействия с положительно заряженными полимерами. Механизм взаимодействия с модельными и биологическими мембранами поликатионов подробно^ изучен. I

Известно, что адсорбция поликатионов на противоположно заряженных мембранах приводит к образованию кластеров анионных компонентов t в мембране [2; 3]. причем в такие кластеры вовлекаются не только липидные, но и белковые и протеогликановые компоненты [4, 5]. Показано, что некоторые поликатионы при этом могут образовывать в мембране поры, проницаемые для крупных молекул [5].

Взаимодействие поликислот с липидными мембранами исследовано в меньшей степени. В тоже время известно, что некоторые природные белки, например вирусные гемагглютинины, способные дестабилизировать мембрану I эндосом и обеспечивать транспорт вируса в клетку, содержат кислые аминокислотные остатки глутаминовой кислоты [6]. Известно, ,что( наличие именно этих остатков придает вирусным белкам способность образовывать поры в биологической мембране в слабокислой среде [7]. Это означает, что в природе существует механизм взаимодействия поликислот с липидными мембранами в слабокислой среде. Однако физико-химические предпосылки влияния кислотных групп на проницаемость липидных мембран неизвестны. В ряде работ было показано, что некоторые синтетические поликислоты, такие как поли-(2-этйлактиловая) и поли-(2-пропилакриловая) кислоты вызывают растворение липидных мембран в слабокислой среде с образованием смешанных' липидно-полимерных ассоциатов [8]. Предполагается, что ключевую роль в этом процессе играют гидрофобные взаимодействия. Проявление гидрофобных свойств алкилакриловыми кислотами в слабокислой среде обусловлено протонированйем ' j ■. ■' i кислотных групп в результате чего растворимость полимера в воде уменьшается, и происходит его погружение в мембрану. Этому способствует также высокое значение рКа указанных поликислот (около 5.5). [8] , ; :

Для пептидных последовательностей такой механизм мало вероятен, т.к. рКа глутаминовой кислоты, входящей в состав природных пептидов, составляет 2.4 и ее протонирование при попадании в клеточные эндосомы (рН~5); мало вероятно. Это указывает на то, что, помимо гидрофобных взаимодействий, должен существовать другой сильный фактор, способствующий взаимодействию поликислот с липидным бислоем. ,.УН- м.М;£,

Целью настоящей работы явилось изучение взаимодействия ■ поликислот различной химической природы с модельными липидными мембранами, исследование связи между строением поликислот и характером этого взаимодействия, а также природы сил, способствующих заглублению,поликислот в липидный бислой.

2. Обзор литературы

7. Выводы

1. Впервые обнаружено, что поликислоты различной природы эффективно взаимодействуют с фосфатидилхолиновыми мембранами в слабокислой среде. Связывание поликислот с липидными мембранами происходит за счет комплекса электростатических, гидрофобных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий, а также водородных связей, вклад которых определяется природой полимера.

2. Впервые показано, что заглубляться в бислой способны не только гидрофобные поликислоты, но и гидрофильные полимеры, склонные к образованию многоточечных водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий. При этом в липидных мембранах формируются гидрофильные поры, проницаемые для заряженных низкомолекулярных соединений.

3. Установлено, что движущей силой заглубления поликислот в липидный бислой являются диполь-дипольные взаимодействия между протонированными звеньями адсорбированного полимера и липидной мембраной.

6. Заключение

Таким образом, в данной работе мы показали, что различные поликислоты способны взаимодействовать с липидными мембранами из цвиттер-ионного липида фосфатидилхолина в слабокислой среде. Адсорбция поликислот на липидных мембранах происходит как за счет электростатических, так и за счет водородных и вандерваальсовых сил. Адсорбция поликислот в слабокислой среде происходит количественно вплоть до заполнения всей поверхности липосом. При этом все поликислоты вызывают образование агрегатов липидных везикул, размер которых проходит чрез максимум при повышении содержания в растворе поликислоты. Концентрация, соответствующая максимальной агрегации везикул зависит от степени ионизации поликислоты, ее способности к образованию водородных связей и гидрофобности. При этом поликислоты, способные образовывать с мембраной не только электростатические, но также водородные и Ван-дер-ваальсовые связи, вызывают образование в мембране пор, проницаемых для малых молекул. На примере полиакриловой кислоты было показано, что движущей силой этого заглубления является дипольный потенциал липидной мембраны.

1. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.:1997. 627с

2. Macdonald P.M., Crowell K.J., Franzin C.M., Mitrakos P., Semchyschyn D.J./ Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective.ll Biochem. Cell Biol. 1998. V. 76. P. 452-464.

3. Bernard E., Faucon J. F., Dufourcq J., Duchesneau L., Pezolet M./ Interaction of Basic Proteins with Charged Phospholipids Followed by Fluorescence, DSC, and Raman Spectroscopy JI Biophys J. 1982. V. 37. № 1. P. 61-62.

4. Kozlova N.O., Bruskovskaya I.B., Okuneva I.B., Melik-Nubarov N.S., Yaroslavov A.A., Kabanov V.A., Menger F.M./ Interaction of a cationic polymer with negatively chargedproteoliposomes.il Biochim Biophys Acta. 2001. V. 1514. № 1. P. 139-51.

5. Kopatz I., Remy J.-S., Behr J.-P./ A model for non-viral gene delivery: through syndecan adhesion molecules and powered by actin.ll J. Gene Med. 2004. V.6. P. 769— 776.

6. Korte Т., Epand R.F., Epand R.M., Blumenthal R./ Role of the Glu residues of the influenza hemagglutinin fusion peptide in the pH dependence of fusion activity.// Virology. 2001. V. 289. № 2. P. 353-361.

7. Thomas J.L., Barton S.W., Tirrell D.A./ Membrane Solubilization by a Hydrophobic Poly electrolyte: Surface Activity and Membrane Binding.// Biophys. J. 1994. V. 67. P. 1101-1106.

8. Gobley M./ Recherches chimiques sur le cerveau// J. Pharm. Chim. 1874. Vol.20, p. 161-164.

9. Osterhout W.J.V./ Some Fundamental Properties of Cellular Physiology.// 1927. Yale University Press. New Haven

10. Overton E./ Ueber die allgemeinen osmotischen Eigenschaften der Zelle, ihre vermutlichen Ursachen und ihre Bedeutung fur die Physiologie.ll 1899. Vjschr. Naturforsch. Ges. Zurich. 44:88.

11. Langmuir I./ The constitution and fundamental properties of solids and liquids. II. Liquids.ll 1917. J. Am. Chem. Soc. Vol. 39. P. 1848-1906.

12. Gorter E.; Grendel FJ On Biomolecular Layers of Lipid on the Chromacytes of the Blood.// J. Exp. Med. 1925. Vol. 41. P. 439.

13. Danielli J. F., Davson H./ A contribution to the theory ofpermeability of thin films.// J. Cell Сотр. Physiol. 1935. vol. 5. p. 495-508.

14. Singer S.J., Nicholson G.L./ The fluid mosaic model of cell membranes.// Science. 1972. Vol. 175. P. 720-731.

15. Spector A.A., Yorek М.А./ Membrane lipid composition and cellular function.// J. Lipid Res. 1985. Vol. 26. P. 1015-1035.

16. Subczynski W.K., Wisniewska A./ Physical properties of lipid bilayer membranes: relevance to membrane biological functions// Acta Biochim. Pol. 2000. Vol. 47, P.613-625

17. Galla H.J., Hartman W., Theilen U., Sackmann EJ On two-dimensional passive random walk in lipid bilayers and fluid pathways in Biomembranes/7 J. Membrane Biol. 1979. Vol. 48. P. 215-236.

18. Tocanne J.-F., Teissie J./ Ionization of phospholipids and phospholipids-supported interfacial lateral diffusion of protons in membrane model systems./ Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1031, P.l 11-142.

19. Brockman HJ Dipole potential of lipid membranes./7 Chem. Phys. Lipids. 1994. Vol. 73. P.57-79.

20. Рубин А.Б. Биофизика. Книга вторая. 1987. М.: Высшая Школа, 303с.

21. Oradd G., Lindblom GJ Lateral diffusion studied by pulsed field gradient NMR on oriented lipid membranes./7 Magn. Reson. Chem. 2004. V. 42, № 2. P. 123-131.

22. Lindblom G./ In Advances in Lipid Methodology.// The Oily Press: Dundee. 1996. P. 133.

23. Mueller P., Rudin D.O., Ti Tien H., Wescott W. C.I Reconstitution of Cell Membrane Structure in vitro and its Transformation into an Excitable System.// Nature 1962. Vol. 194, P. 979-980.

24. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. М.:Мир. 1980. с.188-197

25. Walter A., Gutknecht J. / Permeability of small nonelectrolytes through lipid bilayer membranes. // J. Membr. Biol. 1986. V.90. P. 207-217.

26. MacDonald R.C./ Effects of unstirred layers or transport number discontinuities on the transient and steady-state current-voltage relationships of membranes.// Biochim. Biophys. Acta. 1976. Vol. 448. P.193-198.

27. Wilson M.A., Pohorille A./ Mechanism of unassisted ion transport across membrane bilayers.H J. Am. Chem. Soc. 1996. V.118. P. 6580-6587.

28. Hauser H., Oldany D., Phillips М.С./ Mechanism of ion escape from phosphatidylcholine and phosphatidylserine single bilayer vesicles.// Biochemistry. 1973. V. 12. P. 4507-4517.

29. Gutknecht J./ Proton/hydroxide conductance through lipid bilayer membranes.// J. Membrane Biol., 1984. V. 82, P.105-112.

30. Evtodienko V.Y., Kovbasnjuk O.N., Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S./ Effect of the alkyl chain length of monocarboxylie acid on the permeation through bilayer lipid membranes.// Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1281. P. 245-251.

31. Jackson M.J. Weak electrolyte transport across biological membranes. General principles in membrane physiology. Ed. by Thomas Andreoli. New York and London: Plenum Medical Book, 1987, P. 235-236.

32. Sackmann E./Biological Membranes Architecture and Function. // Handbook of Biological Physics, Ed. by R. Lipowsky and E. Sackmann, V. 1, Elsevier Science, 1995. P. 1-64.

33. Paula S, Volkov A.G., Van Hoek A.N., Haines Т.Н., Deamer D.W./ Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. // Biophys. J. 1996. V. 70. P. 339-348.

34. Bordi F., Cametti C., Motta A. / Ion Permeation Across Model Lipid Membranes: A Kinetic Approach, //J. Phys. Chem. B. 2000. V. 104. P. 5318-5323.

35. Paula S., Volkov A.G., Deamer D.W. / Permeation of halide anions through phospholipid bilayers occurs by the solubility-diffusion mechanism.llBiophys. J. 1998. V. 74. P. 319-327.

36. Sandre O., Moreaux L., Brochard-Wyart F. / Dynamics of transient pores in stretched vesicles II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 10591-10596.

37. Wilson M.A., Pohorille A. I Mechanism of unassisted ion transport across membrane bilayers II J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 6580-6587.

38. Syganov, A., von Kitzing, E. / (Invalidity of the Constant Field and Constant Currents Assumptions in Theories of Ion Transport II Biophys. J. 1999. V. 76. P. 768— 781.

39. Чизмаджев Ю.А./ Как сливаются биологические мембраны //Сор. Образов. Ж. 2001. Т. 7. С. 4-9.

40. Chernomordik L.V., Melikyan G.B., Chizmadzhev Y.A. / Biomembrane fusion: a new concept derived from model studies using two interacting planar lipid bilayers. II Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 906. P. 309-352.

41. Melikov K.C., Frolov V.A., Shcherbakov A., Samsonov A.V., Chizmadzhev Y.A., Chernomordik L.V. / Voltage-induced nonconductive pre-pores and metastable single pores in unmodified planar lipid bilayer. II Biophys. J. 2001. V. 80. P. 1829-1836.

42. Marrink S J., Jahnig F., Berendsen HJ. / Proton transport across transient single-file water pores in a lipid membrane studied by molecular dynamics simulations. II Biophys. J. 1996. V.71.P. 632-647.

43. Jansen M., Blume A. I A comparative study of diffusive and osmotic water permeation across bilayers composed of phospholipids with different head groups and fatty acyl chains.//Biophys. J. 1995. V. 68. P. 997-1008.

44. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Ermakov Y.A., Kabanov V.A./ Reversibility of structural rearrangements in lipid membranes induced by adsorption-desorption of a polycation. //Membr. Cell Biol. 1997. V. 10. 683-688.

45. Perkins W.R., Cafiso D.S./ Characterization of H+/OH- currents in phospholipid vesicles.il J. Bioenerg. Biomembr. 1987. V. 19, P.443-455.

46. Nagle J.F./ Theory of passive proton conductance in lipid bilayers.ll J. Bioenerg. Biomembr. 1987. V. 19. P. 413-426.

47. Deamer D.W./ Proton permeation of lipid bilayers.ll J. Bioenerg. Biomembr., 1987. V. 19. P. 457-479.

48. Andelman D. Electrostatic Properties of membranes: the Poisson-Boltzmann theory. V. 1. Chapter 12 in Handbook of Biological Physics. Ed. by R. Lipowsky and E. Sackmann. Amsterdam: Elsevier. 1995. P. 603-641.

49. McLaughlin SJ Experimental tests of the assumptions inherent in Gouy-Chapmen theory of the aqueous diffuse double layer!I In: Physical Chemistry of transmembrane ion motions. Ed. by G. Spach. Amsterdam. Elsevier. 1983. P. 69-76.

50. Winiski A.P., McLaughlin A.C., McDaniel R.V., Eisenberg M., McLaughlin SJ An experimental test of the discreteness-of charge effect in positive and negative lipid bilayers.ll Biochemistry. 1986. V. 25. P. 8206-8214.

51. Hartsel S.C., Cafiso, D.S./ A test of discreteness-of charge effects in phospholipids vesicles: measurements using paramagnetic amphiphiles.l7 Biochemistry. 1986. V. 25. P. 8214-8219.

52. McLaughlin SJ Electrostatic potentials at membrane-solution interfaces.il Current Topics in Membrane Transport. 1977. V. 9. P. 71-144.

53. Clarke R. J./ The dipole potential of phospholipids membranes and methods for its detection.ll Adv. Colloid Int.Sci. 2001. V. 89-90. P. 263-281.

54. Y.A. Liberman, V.P. Topaly./ Permeability of biomolecularphospholipid membranes for fat-soluble ions.ll Biofizika. 1969. V. 14. P. 452.

55. D.A. Hay don, V.B. Myers/ Surface charge, surface dipoles and membrane conductance.!I Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 307. P. 429-443.

56. Muderhwa J.M., Brockman H.L./ Lateral lipid distribution is a major regulator of lipase activity. Implication for lipid-mediated signal transduction JI J. Biol, Chem. 1992. V. 267. P. 24184-24192.

57. Smaby J.M., Brockman H.L./ Surface dipole moments of lipids at the argon-water interface. Similarities among glycerol-ester-based lipids.II Biophys. J. 1990. V. 58, P. 195-204.

58. Lamarche F., Techy F., Aghion J., Leblank R.M./ Surface pressure, surface potential and ellipsometric study of Cytochrome с binding to dioleoylphosphatidylcholine monolayer at the air-water interface.// Colloids Surf. 1988. V. 30. P. 209-222.

59. Henckl W.M., Thompson M., Mohwald H./ Fluorescence and electron microscopic study lectinpolysaccharide and immunochemical aggregation at phospholipids Langmuir-Blodgett monolayers.1'/ Langmuir. 1989. V. 5. P. 390-394.

60. Трубецкая M.B., Антоненко Ю.Н., Тропша A.E., Ягужинский Л.С./ Иод-содержащие гормоны как дипольные модификаторы липидных мембран.!! Биофизика. 1984. Т. 29. С. 801-805.

61. Antonenko Y.N., Rokitskaya T.I., Kotova Е.А./ Effect of dipole modifiers on the kinetics of sensitized photoinactivation of gramicidin channels in bilayer lipid membranes./! Membr. Cell Biol. 1999.V. 13. № 1. P. 111-120.

62. Peterson U., Mannock D.A., Lewis R.N., Pohl P., McElhaney R.N., Pohl Е.Е./ Origin of membrane dipole potential: contribution of the phospholipid fatty acid chains.ll Chem Phys Lipids. 2002. V. 17. P. 19-27.

63. Pohl EE, Peterson U, Sun J, Pohl P./ Changes of intrinsic membrane potentials induced by flip-flop of long-chain fatty acids.H Biochemistry. 2000. V. 39. №7. P. 18341839.

64. Krylova O.O., Melik-Nubarov N. S., Badun G.A., Ksenofontov A.L., Menger F. M., Yaroslavov А.А./ Pluronic L61 accelerates flip-flop and transbilayer doxorubicin permeation.!! A European Chemistry Journal. 2003. V. 9. №16. P. 3930-3936.

65. Крылова О. О., Дёмина Т.В., Мелик-Нубаров Н.С./ Влияние блок-сополимеров алкшеноксидов на проницаемость липидных мембран: возможные причиныбиологической активности.// Доклады Академии Наук. Химия. 2001. Т. 380. С. 267-271.

66. Kiylova О. O.; Pohl P./ Ionophoric Activity of Pluronic Block Copolymers.// Biochemistry. 2004. V. 43. № 12. P. 3696-3703.

67. Hinderberger D., Spiess H.W., Jeschke G./ Dynamics, site binding, and distribution of counterions in polyelectrolyte solutions studied by electron paramagnetic resonance spectroscopy Л J. Phys. Chem. B. 2004. V. 108. № 12. P. 3698-3704.

68. Manning G.S., Ray J./ Counterion condensation revisited.// J. Biomol. Struct. Dyn. 1998. V. 16. P. 461-476.

69. Laroche G., Dufourc E.J., Pezolet M., Dufourcq J./ Coupled changes between lipid order and polypeptide conformation at the membrane surface. A 2H-NMR and Raman study of polylysine-phosphatidic acid systems.// Biochemistry. 1990. V. 29. P. 64606465.

70. Laroche G., Carrier D., Pezolet M./ Study of the effect of poly(L-lysine) on phosphatidic acid and phosphatidylcholine/phosphatidic acid bilayers by Raman spectroscopy J/ Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6220-6228.

71. Carrier D., Pezolet M./ Investigation of polylysine-dipalmitoylphosphatidylglycerol interactions in model membranes.// Biochemistry. 1986. V. 25. P. 4167-4174.

72. Hammes G.G., Schullery S.E./ Structure of macromolecular aggregates. II. Construction of model membranes from phospholipids and polypeptides.// Biochemistry 1970. V. 9. P. 2555-2563.

73. Ikeda Т., Yamaguchi H., Tazuke S./ Phase separation in phospholipid bilayers induced by biologically active polycations.il Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1026. P. 105-112.

74. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Kabanov V.A./ Reversibility of structural rearrangements in the negative vesicular membrane upon electrostatic adsorption/desorption of the polycation.il Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1560. P. 1424.

75. Barenholz Y., Hirsch-Lerner D./ Probing DNA-cationic lipid interactions with the fluorophore trimethylammonium diphenyl-hexatriene TMADPH.II Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1370. P. 17-30.

76. Franzin C.M., Macdonald P.M./ Polylysine-induced 2H NMR-observable domains in phosphatidylserine/phosphatidylcholine lipid bilayers.ll Biophys. J. 2001. V. 81. P.3346-3362.

77. Mitrakos P., Macdonald P.M./ Polyelectrolyte molecular meight and electrostatically-induced domains in lipid bilayer membranes.ll Biomacromolecules 2000. V. 1. P. 365-376.

78. Mitrakos P., Macdonald P.M./ DNA-induced lateral segregation of cationic amphiphiles in lipid bilayer membranes as detected via 2H NMR.II Biochemistry. 1996. V.35.P. 16714-16722.

79. Mitrakos P., Macdonald P.M./ Nucleotide chain length and the morphology of complexes with cationic amphiphiles: 31P-NMR observations Л Biochim. Biophys. Acta 2000. V. 1463. P. 355-373.

80. Macdonald P.M., Crowell K.J., Franzin C.M., Mitrakos P., Semchyschyn D.J./ Poly electrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective.!I Biochem. Cell Biol. 1998. V. 76. P. 452-464.

81. Glaser M./ Characterization and formation of lipid domains in vesicles and erythrocyte membranes.il Comments Mol. Cell. Biophys. 1992. V. 8. P. 37-51.

82. Wada A./ The a-helix as an electric macro-dipole.H Adv. Biophys. 1976. V. 9. P. 163.

83. Novellani M., Santini R., Tadrist LJ Experimental study of the porosity of loose stacks of stiff cylindrical fibres: influence of the aspect ratio offibres Л Eur. Phys. J. B. 2000. V. 13. P. 571-578.

84. Yaroslavov A.A., Kul'kov V.E., Polinsky A.S., Baibakov B.A., Kabanov V.A./ Polycation causes migration of negatively charged phospholipids from the inner to outer leaflet of the liposomal membrane.!7 FEBS Lett. 1994. V. 340. P. 121-123.

85. Yaroslavov A.A., Efimova A.A., Lobyshev V.I., Ermakov Y.A., Kabanov V.A./ Reversibility of structural rearrangements in lipid membranes induced by adsorption-desorption of a polycation.!! Membr. Cell Biol. 1997. V. 10. P. 683-688.

86. Kozlova N.O., Bruskovskaya I.B., Melik-Nubarov N.S., Yaroslavov A.A., Kabanov V.A./ Catalytic properties and conformation of hydrophobized. alpha-chymotrypsin incorporated into a bilayer lipid membrane.// FEBS Lett. 1999. V. 461. P. 141-144.

87. White J, Kielian M, Helenius A./ Membrane fusion proteins of enveloped animal viruses.// Q. Rev. Biophys. 1983. V. 16. P. 151-195.

88. Parente RA, Nir S, Szoka Jr. F.C./pH-dependent fusion of phosphatidylcholine small vesicles. Induction by a synthetic amphipathicpeptide.// J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 4724-4730.

89. Subbarao NK, Parente RA, Szoka FC, Nadasdi L, Pongracz КJ pH-Dependent Bilayer Destabilization by an Amphipathic Peptide.// Biochemistry 1987. V. 26. P.2964-2972.

90. Seki K., Tirrell D.A. /pH-Dependent Complexation of Pоly(aerylie acid) Derivatives with Phospholipid Vesicle Membranes.// Macromolecules 1984. V. 17. P. 1692-1698.

91. Thomas J., Devlin B.P., Tirrell D.A./ Kinetics of membrane micellization by the hydrophobic polyelectrolyte poly-(2-ethylacrylic acid).I I Biochim. Biophys. Acta 1996. V. 1278 P. 73-78.

92. Thomas J.L., Tirrell D.A./ Polymer-induced leakage of cations from dioleoylphosphatidylcholine and phosphatidylglycerol liposome.ll J. Control. Release 2000. V. 67. P. 203-209.

93. Chung, J. C.; Gross, D. J.; Thomas, J. L.; Tirrell, D. A.; Opsahl-Ong, L. R./ pH-Sensitive, Cation-Selective Channels Formed by a Simple Synthetic Polyelectrolyte in ArtificialBilayer Membranes.il Macromolecules 1996. V. 29. № 13. P. 4636-4641.

94. Meyer O., Papahadjopoulos D., Leroux J.C. / Copolymers ofN-isopropylacrylamide can triggerpHsensitivity to stable liposomes.// FEBS Lett. 1998. V. 421P. 61- 64.

95. Kono K., Zenitani K., Takagishi Т./ Novel pH-sensitive liposomes: liposomes bearing a poly(ethylene glycol) derivative with carboxyl groups.// Biochim. Biophys. Acta 1994. V. 1193. P. 1-9.

96. Мальцева E.A., Антоненко Ю.Н., Мелик-Нубаров Н.С., Ягужинский JI.C./ Влияние синтетических амфифилъных полианионов на транспорт ионов через плоскую бислойную липидную мембрану.// Биол. мембраны. 2002, Т. 19. С. 347-350.

97. Yessine М.А., Leroux J.C. / Membrane-destabilizing polyanions: interaction with lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules.il Advanced Drug Delivery Rev. 2004. V. 56. P. 999- 1021.

98. Hoffman A.S., Stayton P.S., Bulmus V., Chen G., Chen J., Cheung C., Chilkoti A., Ding Z., Dong L., Fong R., Lackey C.A., Long C.J., Miura M., Morris J.E., Murthy N., Nabeshima Y., Park T.G.,. Press O.W, Shimoboji Т., Shoemaker S., Yang H.J., Monji N.,

99. Nowinski R.C., Cole C.A., Priest J.H., Harris J.M., Nakamae K., Nishino Т., Miyata Т./ Really smart bioconjugates of smart polymers and receptor proteins./ J. Biomed. Mater. Res. 2000. V. 52. P. 577- 586.

100. Drummond D.C., Zignani M., Leroux J.C./ Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery Л Prog. Lipid Res. 2000. V. 39 P. 409- 460.

101. Konig T, Kocsis B, Meszaros L, Nahm K, Zoltan S, Horvath I./ Interaction of a synthetic polyanion with rat liver mitochondria.// Biochim Biophys Acta. 1977. V. 462. №2. P.380-389.

102. New R.R.C. Liposomes: a practical approach. New York. 1990.

103. Kamp F., Hamilton J. A J pH gradients across phospholipid membranes caused by fast flip-flop of un-ionized fatty acids Л Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. V. 89. №23. P. 11367-11370.

104. Clarke R.J., Kane D.J./ Optical detection of membrane dipole potential: avoidance of fluidity and dye-induced effects.// Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1323. №2. P. 22339.

105. Gregor H.P., Luttinger L.B., Loebl Е.М./ Titration of Polyacrylic Acid with Quaternary Ammonium Bases.// J. Am. Chem. Soc. 1954. V. 76. № 22. P. 5879-5880.

106. Mandel M., Leyte J., Stadhouder M./ The Conformational Transition of Poly(methacrylic acid) in Solution.// J. Phys. Chem. 1967. V. 71. № 3. P. 603-612.

107. Энциклопедия полимеров. M.: Советская энциклопедия. 1977. Т.З С. 41.

108. Printz М.Р., von Hippel Р.Н./ On the Kinetics of Hydrogen Exchange in Deoxyribonucleic Acid. pH and Salt Effects.// Biochemistry. 1968. V. 7. P. 3194-3206.

109. Garrett E.R., Guile R.L./ Potentiometric Titrations of a Polydicarboxylic Acid: MaleicAcid-Styrene Copolymer.HI. Am. Chem. Soc. 1951. V. 73. P. 4533-4535.

110. Зезин А.Б., Кабанов В.А./ Новый класс комплексных водорастворимых полиэлектролитов Л Успехи химии. 1982. № 51, С. 1447-1483.

111. Goldstein L., Levin Y., Kachalski E./ A Water-insoluble Polyanionic Derivative of Trypsin. Kinetic Behavior of the Bound Trypsin. // Biochemistry. 1964. V. 3. P. 19131919.

112. Rice S.A., Nagasawa M. Polyelectrolyte solutions, a theoretical introduction. London-New York: Academic Press. 1961. 568 p.

113. Leo A., Hansch С./ Linear free energy relations between partitioning solvent systems.ll J. Org. Chem. 1971. V. 36. P. 1539-1544.

114. Kah M., Brown C.D./ LogD: lipophilicity for ionisable compounds.il .Chemosphere. 2008. V. 72. № 10. P. 1401-1408.

115. Abraham M.H., Whiting G.S., Doherty R.M., Shuely W.J./ Hydrogen bonding. Part 13. A new method for the characterisation of GLC stationary phases—the laffort data set JI J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 1990. V. 8. P. 1451-1460.

116. Kamlet M.J., Abboud J.L., Taft R.W./ The Solvatochromic Comparison Method. 6. The ж* Scale of Solvent Polarities./П. Am. Chem. Soc. 1977. V. 99. P. 6027-6038.

117. H. You, D.A. Tirrell/ Photoinduced, Poly electrolyte-Driven Release of Contents of Phosphatidylcholine Bilayer Vesicles Л h Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 4022-4023.

118. Dtizgttnes N., Wilschut J./ Fusion assays monitoring intermixing of aqueous contents. //Methods. Enzymol. 1993. P. 3-14.

119. Clarke R.J., Schrimpf P., Schoneich M./ Spectroscopic investigations of the potential-sensitive membrane probe RH421.II Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1112. P.142-152.

120. Clarke R.J./ Effect of lipid structure on the dipole potential ofphosphatidylcholine bilayers.ll Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1327. P. 269-278.

121. Gawrisch К., Ruston D., Zimmerberg J., Parsegian A., Rand R.P., Fuller N./ Membrane dipole potentials, hydration forces, and the ordering of water at membrane surfaces.!I Biophys. J. 1992. V. 61. P. 1213-1223.

122. Krylov A.V., Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Yaroslavov A.A., Antonenko Y.N./ Kinetically different populations of O-pyromellityl-gramicidin channels induced by poly-L-lysines in lipid bilayers.H J.Membr.Biol. 2002. V. 189. P. 119-130.

123. Chang L.-C., Lin C.-Y., Kuo M.-W., Gau C.-S./ Interactions of Pluronics with phospholipid monolayers at the air-water interface.!У J. Colloid Interface Sci. 2005. V. 285. P. 640-652.

124. Cho Y. W., Kim J.-D., Park К./ Polycation gene delivery systems: escape from endosomes to cytosol.il J. Pharm. Pharmacol. 2003. V. 55. P. 721-734.